CA1123355A

CA1123355A - Procede de production d'une substance presentant une activite bacteriostatique

Info

Publication number: CA1123355A
Application number: CA338,662A
Authority: CA
Inventors: Francois Maillard; David Shepherd
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA
Priority date: 1978-11-01
Filing date: 1979-10-29
Publication date: 1982-05-11
Also published as: GR73004B; FI65448C; IL58451A0; JPH0336517B2; GB2034687A; BE879360A; FI65448B; DE2941310C2; FR2440403A1; IT7950674A0; US4419449A; AU5226479A; AT365234B; JPS56109589A; MX5937E; SE7908516L; DE2941310A1; IL58451A; DK149781B; DK431979A

Abstract

Procédé de production d'une substance présentant une activité bactériostatique. On cultive un microorganisme du type Beggiatoa dans un milieu nutritif aqueux, en conditions aérobies, sous agitation , et l'on recueille la biomasse et/ou le milieu de culture.

Description

~12~3~i5 La présente invention a pour objet un procédé de production d'une substance presentant une activité
bactériostatique.
Plusieurs sources thermales sulfureuses europeennes contiennent des microorganismes qui forment,lorsqu'ils s'accumulent dans un endroit où le courant est faible, une substance gelatineuse blanche à gris clair qui a reçu le nom de "barégine", en reference aux eaux thermales de Barèges, station thermale française des Byrenaes. La baregine peut être definie comme une association de diverses bacteries fixant l'~ydrogène sulfureux, adaptees à des temperatures elevees, dont certaines sont capables de sécreter un mucilage dans lequel l'ensemble est enrobé. On rencontre dans la barégine autant d'eléments morts que vivants.
Les propriétés therapeutiques de la baregine ont ete reconnues depuis longtemps et elle a eté utilisée très tôt pour le traitement d'affections rhumatismales par massage, ainsi que pour soigner certaines maladies cutanées. Elle est entrée dans la composition de produits cosmétiques pour les soins de la peau.
Sa production et sa récolte ont fait l'objet de brevets portant surtout sur la culture en conditions naturelles, par differents procédés de ruissellement de l'eau de sourceS Un procédé similaire est utilise actuellement aux Thermes Nationaux d'Aix-les-Bains en France. Le dispositif consiste en un mur vertical en beton muni à son sommet d'une gouttière; ~'eau thermale, amenée par canalisation de la source toute proche, se déverse dans la gouttière et ruisselle le long des parois du mur. Les flocons de barégine présentant des dimensions de l'ordre du cm s'accrochent aux aspérités de béton. Un film gelatineux de baregine croît à
partir des flocons accrochés et est recolte periodiquement par grattage du mur avec une brosse dure. La temperature de l'eau et du local où est installe ce mur est voisine de la temperature d'emergence à la source, à savoir environ 43-47C. Le rendement de la production est extrêmement faible. Il se monte à environ ~F

1123;~5 S g de poids sec de baregine par m et par mois. De.plus, il est soumis aux variations de divers facteurs dépendant des conditions métérologiques.
La baregine a fait l'objet d'études microbiologiques et biochimiques. Celles-ci ont mis en évidence le métabolisme de l'H2S et des composés soufrés mais n'ont pas élucidé
l'origine des propriétés thérapeutiques de la barégine. Parmi les nombreux microorganismes identifiés dans la barégine, le Begqiatoa est souvent cité. Cependant, les rares isolements de Begqiatoa connus par des publications n'ont jamais été
effectués a partir de barégine mais ~ partir de boues et d'eaux usees. De plus, ces isolements se sont avérés longs et difficiles et la culture des microorganismes isolés n'a donné que des rendements très faibl-es étant donné, entre autres, leur fragilité et leur très forte teneur en eau.
On peut considérer comme caractéristique une valeur publiée de 1,2 g de poids frais de microorganismes produits en 48 h ~ 28C, sans agitation, par litre d'un milieu de culture contenant 2 g d'extrait de levure, o,l g d'acétate de sodium ainsi que de la catalase active.
La presente invention doit permettre une production rentable a l'echelle industrielle d'une substance presentant une activite bactériostatique analogue a celle de la barégine.
Le procedé selon la présente~invention est caractérisé
par le fait que l'on cultive un microorganisme du type Begqiatoa dans un milieu nutritif aqueux, en c~nditions aérobies, sous agitation, et l'on recueille la biomasse et/ou le milieu de culture.
On a constate en effet qu'une biomasse de microorganisme du type Begqiatoa et meme le milieu dans lequel on l'a produite présentent une activité bactériostatique. On a constaté
egalement que la fragilite du microorganisme n'est pas un obstacle à sa culture intensive en milieu vigoureusement agite et qu'il se multiplie même si les filaments qu'il forme sont brises en de nombreux fragments. C'est ainsi que l'on a ~, ,; ., , ;.; ~:

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11233~

même avantage à homogeneiser un inoculum du microorganisme du type Beg~iatoa avant d'en ensemencer le milieu de culture.
C'est intentionnel~ement que l'on utilise ici et dans la suite du présent expose l'expression "microorganisme du type Beggiatoa" plutôt que "microorganisme du genre Beggiatoa".
Le genre Beggiatoa ~tient à la classe des "gliding bacteria", ordre des myxobacterales, famille des Beqgiatoaceae" (cf Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, EighthEdition~
Waverly Press, Baltimore, U.S.A., 1974, pages 112-114). Comme on peut le lire dans ce dernier ouvrage qui fait autorite en la matière, la classification des microorganismes de ce genre est quelque peu sujette à caution etant donné le petit nombre d'informations sures à disposition. }1 serait inopportun de se limiter à un terme scientifique aussi précis que le "genre" lorsqu'on conna~t la precarite de la classification des microorganismes en question. Par l'expression "microorganis-me du type Beggiatoa" il faut donc comprendre ici des bacteries filamenteuses caractéristiques des sols et des eaux sulfureuses dont les filaments incolores sont mobiles par glissement et sont formés de cellules en cha$ne, telles que les bacteries classees dans le genre Begglatoa par exemple.
De preference, on obtient le microorganisme du type _eggiatoa en l'lsolant de la barégine. On a constate qu'un tel isolement est possible en s'y prenant d'une certaine manière et que les souches qu'il permet d'obtenir sont cultivables et présentent précisément une activité bactériostatique.
On a constaté enfin que même le problème de leur conservation peut trouver des solutions satisfaisantes.
Pour isoler une souche, on peut deposer un echantillon de baregine sur un milieu nutritif gelose, incuber 5 ~ 36 h à une temperature de 25 a 50C, decouper une zone où les filaments d'un microorganisme du type Beggiatoa sont libres de contaminants, deposer cette zone sur un milieu nutritif gélosé identique au premier et repeter les operations d'incubation, decoupage et repiquage 2 à 3 fois.

.

~L233~5 C'est ainsi que l'on a isolé les 8 souches déposées le 12 juillet 1978 a la collection nationale de bactéries industrielles (NCIB) d'Aberdeen en Ecosse et qui ont reçu les No NCIB 114 18 ~ 114 25. On peut donc mettre en oeuvre le présent procédé avec au moins l'une de~ces huit souches, par exemple.
De préférence, le milieu nutritif gélosé utilisé pour l'isolement est composé de l à 4 g d'extrait de levure et 10 à 20 g d'agar par litre d'eau.
De m8me, le milieu nutritif aqueux préféré pour la culture contient 1 a 4 g d'extrait de levure, 0,1 a 0,3 g de chlorure de calcium et 0,2 a 1 g d'acétate de sodium ou d'ammonium par litre d'eau. Pour protéger la culture, on peut aussi ajouter de la catalase au milieu, ~ raison de 5 à 20 unités internationales (UI) par ml, par exemple. On peut cultiver le microorganisme à une température de 20 à 50C
durant S a 36 h, à un pH de 6 a 8. De preférence, on le cultive a une température de 30 à 40C durant 8 a 10 h, à
pH neutre.
La substance presentant une activité bactériostatique obtenue par le procédé selon la présente invention peut être utilisée telle quelle pour des massages cutanes, ou comme composant d'un produit cosmétique pour la peau, par exemple.
La biomasse peut être conservée sous forme séchée. On la seche de preference par lyophilisation étant donné sa fragilite et sa faible teneur en matière sèche.
Les exemples ci-apras, donnés à titre d'illustration, permettront de mieux comprendre la nature et la portée de la presente invention. Le nom "Beqqiatoa" y est systématique-ment utilise a la place et doit y 8tre compris dans le sens de l'expression "microorganisme du type Beggiatoa".

EXEMPLE l (isolement des souches) . . . ~
Un flocon de baregine fraîche prelevée au Thermes Nationaux d'Aix-ies-Bains est déposé au centre d'une bo;te -` 112335S

de Petri contenant 20 ml de milieu gelosé preparé selon la recette suivante :
Extrait de levure (Difco) 2 g Agar tBacto-Difco) 15 g Eau thermale d'Aix filtrée 100 ml Eau distillée 900 ml On place la boIte à l'envers dans une étuve à 30C
durant 30 h. On l'examine alors au microscope, ~ faible grossis-sement, pour detecter la presence de structures en spirales caracteristiques du Beqgiatoa et résultant de la mobilite par glissement de ces microorganismes. Certains sont même visibles l'oeil nu. L'examen microscopique revèle egalement des zones dans lesquelles les filaments de Beggiatoa semblent libres de contaminants. On decoupe une de ces zones au scalpel sterile et on la depose sur une plaque d'agar vierge de meme composition que la première, en prenant soin de deposer la surface contenant les filaments de Beggiatoa contre la surface vierge de la nouvelle!plaque d'agar. On incube à nouveau ~ 30C durant 24 h.
On répète l'operation de decoupage, repiquage et incubation deux fois encore. On obtient une culture pure de Beg~iatoa.
EXEMPLE 2 (conservation des souches) On isole une dizaine de souches de la manière décrite à l'exemple 1. Elles diffèrent les unes des autres par le diamatre de leurs filaments, leur vitesse de glissement et la forme de leurs colonies sur agar. On les conserve avec succès de trols manières différentes selon qu'il s'agit du court, du moyen ou du long terme.

2.1.) à court terme : On conserve la plaque au réfrigerateur à 4C, en ayant soin d'etancheifier la boîte de Petri. On transfère la souche tous les dix jours, car l'agar a tendance à secher.
2.2.) à moYen terme : On prepare un milieu semi-liquide presentant la composition suivante :

~23355 Extxait de levure 2 g CaC12 0,1 g Acétate de sodium 0,5 g Agar 2 g Eau thermale filtrée 1000 ml Après stérilisation du milieu, on y ajoute de la catalase fongique, ~ raison de 10 UI/ml. On a stérilisé au préalable la solution de catalase par filtration à froid sur un filtre Millipore à pores microscopiques de 0,22 ~.
On dépose un petit cube d'agar contenant le Beggiatoa dans un tube contenant 10 ml de milieu. On incube à 30 C.
Le Begqiatoa se développe dans la partie supérieure du tube.
On peut laisser le tube 3 semaines à 30C. On transfère ensuite la culture à raison de 0,1 ml par tube.
2.3.) a long terme : On prépare une culture de 24 h en milieu agité de la manière décrite à l'exemple 3. On la centrifuge. On lave le culot à la solution de Ringer stérile.
On congèle et on lyophilise le culot. On le conserve plusieurs mois au réfrigérateur, dans un récipient bien fermé. Dès réhydratation, les fragments de filaments sont capables de se développer.
EXEMPLE 3 ~Culture des souches)

3.1. Inoculum On découpe un petit cube d'agar de 5 mm de côté dans une plaque obtenue de la manière décrite à l'exemple 1. On le dépose dans un flacon de 500 ml contenant 100 ml du milieu suivant :
Extrait de levure 4 g Chlorure de ca~cium 0,2 g Acétate d'ammonium 1 g Eau thermale filtrée 1000 ml Ce milieu présente un pH de 6,6. On place le flacon sur un agitateur orbital tournant ~ 150 tours/mn pour un rayon de giration de 1,25 cm. On l'y laisse 16 h ~ 30C. On homogénéise ~ ~ `

-la culture obtenue à l'aide d~un melangeur SOrvall-omnimixer durant 15 a 30 s en conditions steriles. La culture homogénéisée constitue l'inoculum.
3.2. Culture On introduit 5 ml de l'inoculum ci-dessus dans un flacon de 500 ml contenant 100 ml du même milieu que celui--utilisé pour préparer l'inoculum. On incube le flacon 24 h a 30C sur l'agitateur orbital. On obtient 0,8 g de matiare sèche de Beggiatoa par litre de culture. En répétant l'opération avec diverses souches et en variant les condi~ions dans les limites permises, on obtient des rendements compris entre environ 0,5 et 2 g de Beggiatoa sec par litre de culture.
3.3. Contrôle de la croissance La méthode classique de néphélométrie appliquée aux cultures bacteriennes n'est pas utilisable pour le Be~lgiatoa à cause de son type de croissance en flocons. On l'adapte au cas particulier. On prélève des échantillons de culture toutes les 2 h,eures et on les homogenéise au mélangeur Sorvall-Omni-mixer. On lit leur densite optique à 600nm sur un spectrophoto-mètre. L'echantillon homogeneise ne sedimente que très lentement et permet une lecture fiable. On obtient ainsi une indication sur la croissance en relation directe avec le nombre de cellules.
3.4. Determination du poids sec Le sechage classique au four ne donne pas des resultats reproductibles pour le Beggiatoa.C'est vraisembla--blement dû à sa teneur en eau très elevee. C'est pourquoi, afin d'obtenir des resultats reproductibles, on ne s~che pas moins de 400 ml de culture par lyophilisation.
3.5. Determination de l'activite bacteriostatique La methode classique d'evaluation de l'activite bactériostatique du Public Health Laboratorv Service Committe~, decrite dans le British Med. ~. 408 (1965) ne donne pas des resultats satisfaisants dans le cas particulier, du fait que ~2~3S5 le test se fait en tubes. En effet, le Beqgiatoa est très strictement aérobie et la concentration d'oxygène règnant dans un tube à essais est insuffisante. On adapte donc la méthode et l'on travaille en flacons agités pour augmenter le trans-fert d'oxygène.
On prepare trois series de flacons de 50 ml contenant chacun 18 ml de bouillon nutritif (Nutrient Broth Difco). On inocule les flacons de la lère et de la 2ème serie avec chacun 0,4 ml d'une culture de 24 h d'une souche pathogène. On utilise trois souches pathogènes, à savoir Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145,Eschericia coii A~CC 11755 et StaehYlococcus aureus ATCC 12600.
On prepare des échantillons de produit bactériosta-tique en centrifugeant une culture obtenue de la manière decrite à l'exemple 3, chiffre 2, mais en 8 h seulement.
La biomasse centrifugee est homog8n8isee et remise en suspension dans un volume de solution physiologique egal au volume de surnageant restant de la centrifugation. La solution physiologique contenant la biomasse et le surnageant sont chacun divises en échantillons de 2 ml.
Aux flacons de la lère serie on ajoute 2 ml de solution physiologique contenant la biomasse homogeneisée.
Aux flacons de la 2ème s~erie on ajoute 2 ml de solution physio-logique seule. AUx flacons de la 3ème serie, qui n'ont pas ete inoculés avec un pathogane, on ajoute 2 ml de solution physiologique contenant la biomasse homogéneisee.
On incube les flacons à 37C sur un agitateur orbital.
On mesure leur densité optique à 600 nm après 16 h.Les mesures de densites optiques des flacons correspondants des series 1,2 et 3 fournissent les paramètres respectifs A,B et C. La difference A-C soustraite de B puis divisee par B et multipliee par 100 donne l'activite bacteriostatique de la biomasse en %
d'inhibition.
On procède de lameme manière pour determiner l'activite bacteriostatique du surnageant, en ajoutant aux flacons de la lère et de la 3ème série 2 ml de surnageant au lieu de 2 ml de solution physiologique contenant la biomasse ~: ;' ' . ~ '.

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li2~3~5 . g homogenéisee.
Les résultats sont regroupés dans le tableau ci-dessous :

Agent pathogène Activite bicmasse Activite surnaseant . (% inhibition) (% inhlbition) P. aeru~inosa70 41 S. aureus 100 45 E. coli 70 11 Exemple 4(comparatif) A titre de comparaison, on détermine de la manière décrite à l'exemple 3, chiffre 5, l'activité bactériostatique de la barégine naturelle. On trouve, en % a'inhibition, après 16 h d'incubation, 100%, 83 % et 96 % vis-à-vis respectivement de P. aeruginosa, S. aureus et E. coli. En d'autres termes, l'acti~ité bactériostatique de la biomasse selon la presente invention est presque aussi forte que celle de la baregine.
C'est un résultat remarquable si l'on considère que la présente biomasse peut être produite avec un bon rendement à l'échelle industrielle, alors que la baregine ne peut s'obtenir que lentement et en tras faibles quantités. L'activite du surnageant selon la presente invention, quoique moindre, ne manque pas d'interêt non plus.

~11233~5 E X E M P L E 5 (souches NCIB ) 8 souches ont été isolées de la manière décrite à
l'exemple 1, déposées le 12 juillet 1978 à la National Collection of Industrial Bacteria ~NCIB) à ~berdeen en Ecosse et ont reçu comme lndiqué plus haut les Nos NCIB 114 18 à
11~.25. Ces souches peuvent être caractérisées par leurs qualités de croissance, leur morphologie en culture sur agar et en milieu liquide ainsi que leur activité
bactériostatique.
Le tableau ci-dessous donne la densité optique des cultures que l'on a obtenues après S h, 10 h et 24 h.en cultivant chacune de ces souches de la manière décrite ~ l'exemple 3 chiffre 2, les biomasses obtenues après 24 h~ainsi que l'activité bactériostatique des biomasses obtenues après 8 h de culture, vis-à-vis des trois souches pathog~nes P. aeruginosa,S. aureus et E. Coli.
Les morphologies sont indiquées ensuite séparement pour chaque souche.

. . _ . . ~
_ _ Denslt~ oFtlque Blcmasse (g ALtivlt~
No.NCIB apra~ 5 h apras 10 h apras 24 h matlare sache~l~ (~ lnhlbltlon) P. aeruqlnosa 5. aureus ~ Cbll 114 18 0,2~7 0,713 ` 0,583 0,91 100 76 100 114 19 0,352 0,621 0,514 0,95 100 96 7~

114 20 0,147 0,447 0,709 0,9S 100 96 44 114 21 0,160 0,402 0,646 0,95 100 98 100 114 22 0,289 0,364 0,305 0,75 68 89 84 114 23 0,360 0,496 0,378 0,69 73 87 25 .
Il~ 2~ 0,217 0,737 0,567 0,59 57 30 27 11~ 25 0,395 0,981 0,838 1,11 100 91 90 : ~ :

2~3~;~

Morphologies Sur aqar : Forme de grandes colonies isolées, de 8 ~ 15 mm de diametre, avec un centre blanc et des bords translucides.
Examen au microscope (x 100) : La colonie est formée de spirales bien visibles enroulées de maniere serrée.
en culture liquide : Culture homogane. Examen au microscope (x 400) : Longs filaments de 30 x 1,8~formés parfois de bacll-les courts bien distlncts. Pas d'agrégation. Très peu d'inclusions réfractiles.

Sur agar : Forme des colonies blanches isolées de 4 à 8 mm de diamètre avec des bords diffus. Des cordons épais s'étendent radialement, en etoi~e , depuis le centre de la colonie mais n'atteignent pas les bords. Examen au microscope (x 100) :
Les bords de la colonie sont formés de filaments en spirales serrées.
en culture liauide : Culture homogène. Examen au microscope (x 400) : Filaments isolés très courts de 3,6 x 0,9~ divisés par des constrictions très nettes. Pas d'inclusions réfractaires. Forme des agrégats.

sur aqar : Forme des colonles isolées plates et opaques de 2 à 5 mm de diamètre avec des bords à frange. Examen au microscope (x 100) : Colonies constituées de fragments de filaments formant des spirales mal développées.
en culture liquide :Culture homogene. Examen au microscope ( x 400) : Pas de filaments. Longs bacilles de 9 x 1,4 contenant quelques incluslons réfractiles.

sur agar : Forme des colonles séparées de 4 à 7 mm de diamètre avec des bords diffus, tres semblables a celle de la souche NCIB 114 19 mais plus blanches. Les bords des colonies sonttranslucides.
Examen au microscope (x 100) : Pas de spirales visibles.

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en culture liquide : Culture homogène. Examen au microscope (x 400) : Image semblable à celle presentee par la souche NCIB 114 20. Pas de filaments, longs bacilles de 18 x 1,4 contenant quelques inclusions refractiles.
Pas d'agregats.

sur agar : Ne forme jamais de colonies isolees. Couvre toute la surface avec des cordons translucides myco~des. Examen au microscope (x 100) : Cordons formés de plusieurs filaments.
en culture liquide : Culture ~homogè~e presentant quelq'ues petits agrégats dès la sixième heure. Examen au microscope (x 400) :
Longs filaments séparés de 90 x 1,4 ~ 1,8 ~ . Filaments divises en longues unités par des constrictions nettes. Très peu d'inclusions r~fractiles.

sur agar : Semblable à la souche NCIB 114 22. Pas de colonies isolées. Cordons myco~des denses et mieux visibles. Examen au microscope (x 100) : Cordons plus distincts parce que constitués d'un plus grand nombre de filaments.
en culture li~uide : Forme de gros flocons (agregats). Examen au microscope ( x 400) : Filaments beaucoup plus courts que ceux de la souche ~CIB 114 22 et divises en segments par des constrictions très nettes. Longueur de 9 - 10 x 1,8~ .
Des inclusions'réfractiles apparaissent très vite, dès après 5h.

sur agar : Semblable à la souche NCIB 114 23. Pas de colonies isolées. Cordons myco~des. Examen au microscope (x 100) :
Cordons formés d'un grand nombre de filaments.
en culture liquide : Forme de gros flocons (agrégats). Examen au microscope ( x 400) : Longs filaments de 140 x 1,8~ qui forment de longs faisceaux. Pas de constrictions visibles.
Développement tardif, après 10 h, d'inclusions réfractiles.

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1i233~5 sur agar : Forme des colonies isolées opaques de 2 à 6 mm de diamètre. Examen au microscope ( x 100) : Colonies constituees de filaments faits de cellules isolées et formant des spirales serrees.
en culture liquide : Culture homogène. Examen au microscope (x 400) : Filaments homoganes courts de 4 x 1,4 ~. Peu d'inclusions réfractiles.

Claims

R E V E N D I C A T I O N S

1. Procédé de production d'une substance présentant une activité bactériostatique, caractérisé par le fait que l'on cultive un microorganisme du type Beggiatoa dans un milieu nutritif aqueux, en conditions aérobies, sous agitation , et l'on recueille la biomasse et/ou le milieu de culture.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
par le fait que l'on obtient le microorganisme du type Beggiatoa en l'isolant de la barégine.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé
par le fait que , pour isoler une souche, on dépose un échantillon de barégine sur un milieu nutritif gélosé, on incube 5 à 36 h à une température de 20 à 50°C, on découpe une zone où les filaments d'un microorganisme du type Beggiatoa sont libres de contaminants, on dépose cette zone sur un milieu nutritif gélosé identique au premier et l'on répète les opérations d'incubation, découpage et repiquage 2 à 3 fois.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
par le fait que le microorganisme du type Beggiatoa est au moins l'une des 8 souches NCIB 114 18 à NCIB 114 25.

5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
par le fait qu'avant d'ensemencer le milieu nutritif aqueux avec un inoculum du microorganisme du type Beggiatoa on homogénéise l'inoculum.

6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
par le fait que l'on cultive le microorganisme à une température de 20 à 50°C durant 5 à 36 h , à un pH de 6 à 8.

7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
par le fait que l'on cultive le microorganisme à une tempéra-ture de 30 à 40°C durant 8 à 10 h, à pH neutre.

8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
par le fait que l'on recueille la biomasse et qu'on la lyophilise.

9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
par le fait que le milieu nutritif aqueux contient 1 à 4 g d'extrait de levure, 0,1 à 0,3 g de chlorure de calcium et 0,2 à 1 g d'acétate de sodium ou d'ammonium par litre d'eau.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé
par le fait que l'eau est une eau thermale sulfureuse.

11. Procédé selon la revendication 3, caractérisé
par le fait que le milieu nutritif gélosé est composé de 1 à 4 g d'extrait de levure et 10 à 20 g d'agar par litre d'eau.

12. Substance présentant une activité bactérios-tatique obtenue par le procédé selon la revendication 1 ou ses équivalents chimiques manifestes.