JP7376186B2 - リパーゼ産生株およびその適用 - Google Patents
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Description
本発明は、リパーゼ産生株（菌株）およびビタミンＡパルミテートの酵素的合成におけるその適用（応用、使用）に関するものであり、工業用微生物分野の技術に属する。
ビタミンＡパルミテートは、最も一般的に使用され、広く使用されているビタミンＡシリーズ製品の１つで、ビタミンＡパルミテートは、正常な視覚機能を維持することができるだけでなく、さまざまな代謝活動に参加して、生物の健康を維持することもできる。一般的に、添加剤として食品、化粧品、医薬品などの添加剤として使用されている。現在、ビタミンＡパルミテートは、主に化学的方法と酵素的方法で合成されている。化学的方法によるビタミンＡパルミテートの合成は、環境汚染や機器の腐食などの問題があるが、酵素的方法によると、汚染が少なく、時空間収率が高く、コストが低くなる。したがって、ビタミンＡパルミテートの酵素的方法による合成技術に関する研究が盛んになっている。
枯草菌のリパーゼには、主にＬｉｐＡとＬｉｐＢが含まれ、多くの研究では、ＬｉｐＡが長鎖脂肪酸を加水分解できることが示されている。ＬｉｐＡは蓋構造（盖子）がなく、分子量が小さいため、最小のα／β折り畳み構造の加水分解酵素の１つと考えられている。構造比較によると、ＬｉｐＡの構造は南極カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼＢの構造と非常に類似しているのに対し、現在の酵素的方法によるビタミンＡパルミテートの合成方法では主にＮｏｖｏｚｙｍｅｓ ４３５（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ｌｉｐａｓｅ Ｂ）固定化酵素が使用されているが、その酵素は高価であり、工業生産と応用のためのコストが高すぎる。麻エビペーストは、主に麻エビを塩で約１ヶ月間自然発酵させたもので、タンパク質、キチン、脂肪が豊富で、中国や東南アジアでよく使われている調味料となっている。麻エビペーストの微生物多様性と組成は非常に複雑であり、リパーゼ産生株のスクリーニングに適している。現在のところ、麻エビペーストからリパーゼ産生株をスクリーニングし、この菌株を使用して有機相全細胞形質転換法を開発し、ビタミンＡパルミテートを生産したという報告はない。
本発明の第１の目的は、リパーゼ産生株を提供することである。
本発明の上記技術的目的を実現するために、本発明で採用される技術的な解決策は以下のとおりとなっている。
その分類名は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＳ１８０２というリパーゼ産生株で、中国典型培養物保蔵中心（China Center for Type Culture Collection）に保存されており、住所は中国武漢市武漢大学、保存番号はＣＣＴＣＣ Ｍ２０１８２６２、保存日付は２０１８年５月１０日となっている。
上記の菌株は、常熟工科大学の発酵工学センターで自然発酵させた麻エビペーストから分離され、得られた。
本発明の枯草菌ＣＳ１８０２の物理化学的性質は以下のとおりとなっている。
形態学：スクリーニング培地で１日間成長させると、明らかなコロニーを形成することができる。コロニーの形状は不規則またはしわがあり、グラム陽性菌で、棒状となっている。
培養特徴：最適な成長温度は約３０℃で、好気性であり、最適成長ｐＨは約７となっている。
本発明の別の目的は、ビタミンＡパルミテートの酵素的方法による合成における上記菌株の適用を提供することである。
本発明は、全細胞形質転換法を使用することによって、ビタミンＡパルミテートを生成するための使用方式を提供し、具体的には、以下のステップが含まれている。
（１）ＣＳ１８０２株を牛肉抽出物ペプトン液体培地に接種し、振とう培養する。
（２）ステップ（１）で培養した菌株を発酵培地に入れて振とう発酵させ、発酵液を遠心分離し、沈殿物を捨て、上清液、すなわち発酵済の菌液を採取する。
（３）発酵した菌液を遠心分離し、菌体を有機相系に植菌して発酵させ、ビタミンＡパルミテートを生成する。
（２）ステップ（１）で培養した菌株を発酵培地に入れて振とう発酵させ、発酵液を遠心分離し、沈殿物を捨て、上清液、すなわち発酵済の菌液を採取する。
（３）発酵した菌液を遠心分離し、菌体を有機相系に植菌して発酵させ、ビタミンＡパルミテートを生成する。
さらに、振とう培養および発酵培養の温度は３０℃となっている。
さらに、発酵培地の組成は次のとおりである。
トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ／Ｌ，、オリーブオイルエマルジョン１２ｍＬ／Ｌ。前記オリーブオイルエマルジョンの調製方法としては、オリーブオイル乳化剤ＰＶＡとオリーブオイルを３：１の体積比で混合させ、超音波で乳化させる。
トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ／Ｌ，、オリーブオイルエマルジョン１２ｍＬ／Ｌ。前記オリーブオイルエマルジョンの調製方法としては、オリーブオイル乳化剤ＰＶＡとオリーブオイルを３：１の体積比で混合させ、超音波で乳化させる。
さらに、前記有機相系は、１：１の質量比に従って有機溶媒にビタミンＡとパルミチン酸を溶解する。前記ビタミンＡとパルミチン酸の濃度は１０～２５ｇ／Ｌ、好ましくは１５ｇ／Ｌである。前記有機溶媒は好ましくはｎ－ヘキサンを使用する。
さらに、菌体を有機相系に植菌して、０．５～２時間、好ましくは１時間発酵させる。
本発明は、ビタミンＡパルミテートの酵素的方法による合成に使用できる枯草菌を提供する。その菌株は、伝統的な天然発酵食品に由来し、食品産業で幅広い適用の見通しが見込まれている。その菌株は、牛肉抽出物ペプトン固形培地でよく成長し、培養と保存が容易で、全細胞形質転換法により、１５ｇ／ＬのビタミンＡとパルミチン酸基質濃度の条件下で、ビタミンＡパルミテートの収量は１５．３５ｍｇ／ｍＬで、転換率は７６．７５％となっている。
本発明に関わる生物学的材料は、その分類名が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＳ１８０２で、中国典型培養物保蔵中心（China Center for Type Culture Collection、以下ＣＣＴＣＣと略称する）に保存され、その住所は中国武漢市武漢大学であり、保存番号はＣＣＴＣＣ Ｍ２０１８２６２、保存日付は２０１８年５月１０日となっている。
具体的な実施形態
実施例１
本実施例は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＳ１８０２のスクリーニング、精製、および同定方法を記載している。
本実施例は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＳ１８０２のスクリーニング、精製、および同定方法を記載している。
スクリーニングのサンプルは、連雲港海娃食品株式会社の麻エビペーストである。２５ｇのエビペーストを秤量し、このエビペーストと２２５ｍＬの生理食塩水て細菌懸濁液を調製し、その濃度をそれぞれ１０－１、１０－２、１０－３と１０－４倍に希釈する。細菌懸濁液ストック溶液、１０－１倍、１０－２倍、１０－３倍、及び１０－４倍に希釈されたそれぞれの菌液を一次スクリーニング培地に塗布し、３０℃で１～２日間成長させた後に、成長の良い単一コロニーを選び、一次スクリーニング培地に線を引いて分離させる。一次スクリーニング培地で生成されたその周りに透明な円が明らかに付いた単一コロニーを選び、それを二次スクリーニング培地に接種し、３０℃、２００ｒ／ｍｉｎでシェーカー上で１～２日間培養する。
一次スクリーニング培地：ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、トリブチリン２ｍＬ／Ｌ、寒天粉末２０ｇ／Ｌ、そして１０００ｍＬに定容する蒸留水。
二次スクリーニング培地：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ／Ｌ、オリーブオイルエマルジョン１２ｍＬ／Ｌ、そして、１０００ｍＬに定容する蒸留水。オリーブオイルエマルジョンの調製方法は以下の通りである。すなわち、オリーブオイル乳化剤ＰＶＡとオリーブオイルを３：１の体積比で混合し、超音波で乳化する。
一次スクリーニング培地プレートから細菌のループを選び、スライド上の水滴と混合し加熱する。クリスタルバイオレットで一次染色し、ヨウ素溶液で酵素染色し、エタノールで脱色し、サフラニンで対比染色した後、顕微鏡で細菌を調べたところ、その細菌はグラム陽性菌であった（図１）。
本菌株の物理化学的性質は次のとおりである。
形態学的性質：スクリーニング培地で１日間成長させると、明らかなコロニーを形成することができる。コロニーの形状は不規則またはしわがあり、グラム陽性菌で、棒状となっている。
生理学的および生化学的特徴：７％ＮａＣｌで生育、クエン酸塩の利用、オキシダーゼ、接触酵素、ＶＰアッセイ、およびデンプン加水分解はすべて陽性で、スクロース、マルトース、ラムノース、ラフィノース、グルコース、マルトース、Ｎ－アセチルアミノおよびコロイド状キチンなどの炭素源が利用できる。
培養の特徴：最適な成長温度は約３０℃で、好気性であり、最適成長ｐＨは約７となっている。
前記菌株の１６ＳｒＤＮＡ部分について、配列を決定し、ＢＬＡＳＴを比較した。その後、ＭＥＧＡ５．１によってＮＪ系統樹を構築して分析した結果、その１６Ｓ ｒＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のとおり、系統樹は図２に示すとおりとなっており、それによって、枯草菌として同定された。微生物保存手順の同定と保存を経て、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＳ１８０２として分類され命名された。その保存番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０１８２６２となっている。
実施例２
本実施例は、オリーブオイルの発酵によるリパーゼの生産におけるＣＳ１８０２株の適用を具体的に記載している。
本実施例は、オリーブオイルの発酵によるリパーゼの生産におけるＣＳ１８０２株の適用を具体的に記載している。
（１）ＣＳ１８０２株を牛肉抽出物ペプトン液体培地に接種し、３０℃で１８～２４時間振とう培養する。
（２）ステップ（１）で培養した菌株を、２％の接種量で発酵培地に入れ、３０℃で１４～２４時間振とう培養する。発酵液を遠心分離し、沈殿物を捨て、上清を回収した。リパーゼの酵素活性の測定値は、２１４．３Ｕ／Ｌであった。
（２）ステップ（１）で培養した菌株を、２％の接種量で発酵培地に入れ、３０℃で１４～２４時間振とう培養する。発酵液を遠心分離し、沈殿物を捨て、上清を回収した。リパーゼの酵素活性の測定値は、２１４．３Ｕ／Ｌであった。
発酵培地の組成は、前記二次スクリーニング培地と同じである。
リパーゼ酵素活性の測定方法は以下のとおりである。発酵液を３０００ｒで１０分間遠心分離し、上清をテストするサンプルとして取り、テストするサンプルと、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された検出抗体を、リパーゼ抗体でプレコートされたコーティングマイクロウェルへ順次入れ、３７℃で１時間インキュベートし、充分に洗浄する。基質３，３’、５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）で着色し、ＨＲＰ触媒作用によって青色に転換され、酸の作用によって最終的な黄色に転換された。ＯＤ値は４５０ｎｍの波長でマイクロプレートリーダーにより測定し、サンプル活性は標準曲線から計算した。標準製品は、純粋なリパーゼで調製された０、１．５、３、６、１２、２４Ｕ／Ｌ酵素溶液である。酵素活性は３７℃で、１時間あたりタンパク質１ミリグラムあたりの基質を分解することによって生成される１μｍｏｌ脂肪酸の酵素量を１つの酵素活性単位Ｕに定義されている。リパーゼＥＬＩＳＡ検出試薬テストキットは武漢純度生物科技有限公司から購入されている。
実施例３
本実施例は、ビタミンＡパルミテートの生成におけるＣＳ１８０２株の全細胞形質転換の適用を具体的に記載している。
本実施例は、ビタミンＡパルミテートの生成におけるＣＳ１８０２株の全細胞形質転換の適用を具体的に記載している。
（１）ＣＳ１８０２株を牛肉抽出物ペプトン液体培地に接種し、３０℃で１８～２４時間振とう培養する。
（２）ステップ（１）で培養した菌株を発酵培地に入れ、接種量を２％とし、３０℃で１４～２４時間振とう培養する。発酵液を遠心分離し、沈殿物を捨て、上清を取る。
（３）発酵された菌液を３０００ｒ／ｍｉｎで５分間遠心分離し、菌体を５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌで有機相系（ビタミンＡ：パルミチン酸＝１０ｇ：１０ｇ、１Ｌのｎ－ヘキサンに溶解する）に入れ、２時間発酵後にビタミンＡパルミテートの含有量を測定し、転換率を計算する。図３から、菌体の添加量が２５ｇ／Ｌの場合、形質転換効率が５５．７％と最も高く、ビタミンＡパルミテートの含有量が１１．１４ｍｇ／Ｌであることがわかる。
（２）ステップ（１）で培養した菌株を発酵培地に入れ、接種量を２％とし、３０℃で１４～２４時間振とう培養する。発酵液を遠心分離し、沈殿物を捨て、上清を取る。
（３）発酵された菌液を３０００ｒ／ｍｉｎで５分間遠心分離し、菌体を５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌで有機相系（ビタミンＡ：パルミチン酸＝１０ｇ：１０ｇ、１Ｌのｎ－ヘキサンに溶解する）に入れ、２時間発酵後にビタミンＡパルミテートの含有量を測定し、転換率を計算する。図３から、菌体の添加量が２５ｇ／Ｌの場合、形質転換効率が５５．７％と最も高く、ビタミンＡパルミテートの含有量が１１．１４ｍｇ／Ｌであることがわかる。
発酵培地の組成は、前記二次スクリーニング培地と同じである。
ビタミンＡパルミテートの測定方法は、高性能液相法であり、外部標識法を用いて定量化する。クロマトグラフィー条件は、クロマトグラフィーカラム：Ａｌｌｔｅｃｈ Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ、４．５μｍ）、移動相：１００％メタノール、検出器：島津１０Ａ ＵＶ検出器、検出波長：３２７ ｎｍ、流速：１ｍＬ／ｍｉｎとなっている。
転換率の計算式は次のとおりである。
実施例４
本実施例は、ビタミンＡパルミテートの生成におけるＣＳ１８０２株の全細胞形質転換の適用を具体的に記載している。
本実施例は、ビタミンＡパルミテートの生成におけるＣＳ１８０２株の全細胞形質転換の適用を具体的に記載している。
（１）ＣＳ１８０２株を牛肉抽出物ペプトン液体培地に接種し、３０℃で１８～２４時間振とう培養する。
（２）ステップ（１）で培養した菌株を発酵培地に入れ、接種量を２％とし、３０℃で１４～２４時間振とう培養する。発酵液を遠心分離し、沈殿物を捨て、上清を取る。
（３）発酵された菌液を３０００ｒ／ｍｉｎで５分間遠心分離し、菌体を５ｇ／Ｌで有機相系（ビタミンＡ：パルミチン酸＝１０ｇ：１０ｇ、１Ｌのｎ－ヘキサンに溶解する）に入れ、０．５ｈ、１ｈ、１．５ｈ、２ｈ、２．５ｈ、３ｈ発酵後にビタミンＡパルミテートの含有量を測定し、転換率を計算する。図４から、菌体の添加量が２５ｇ／Ｌの場合、１時間転換後の形質転換効率が７３．６％と最も高く、ビタミンＡパルミテートの含有量が１４．７２ｍｇ／Ｌであることがわかる。
（２）ステップ（１）で培養した菌株を発酵培地に入れ、接種量を２％とし、３０℃で１４～２４時間振とう培養する。発酵液を遠心分離し、沈殿物を捨て、上清を取る。
（３）発酵された菌液を３０００ｒ／ｍｉｎで５分間遠心分離し、菌体を５ｇ／Ｌで有機相系（ビタミンＡ：パルミチン酸＝１０ｇ：１０ｇ、１Ｌのｎ－ヘキサンに溶解する）に入れ、０．５ｈ、１ｈ、１．５ｈ、２ｈ、２．５ｈ、３ｈ発酵後にビタミンＡパルミテートの含有量を測定し、転換率を計算する。図４から、菌体の添加量が２５ｇ／Ｌの場合、１時間転換後の形質転換効率が７３．６％と最も高く、ビタミンＡパルミテートの含有量が１４．７２ｍｇ／Ｌであることがわかる。
実施例５
本実施例は、ビタミンＡパルミテートの生成におけるＣＳ１８０２株の全細胞形質転換の適用を具体的に記載している。
本実施例は、ビタミンＡパルミテートの生成におけるＣＳ１８０２株の全細胞形質転換の適用を具体的に記載している。
（１）ＣＳ１８０２株を牛肉抽出物ペプトン液体培地に接種し、３０℃で１８～２４時間振とう培養する。
（２）ステップ（１）で培養した菌株を発酵培地に入れ、接種量を２％とし、３０℃で１４～２４時間振とう培養する。発酵液を遠心分離し、沈殿物を捨て、上清を取る。
（３）発酵された菌液を３０００ｒ／ｍｉｎで５分間遠心分離し、菌体を２５ｇ／Ｌで異なる基質濃度、即ちビタミンＡとパルミチン酸の濃度が、それぞれ５ｇ：５ｇ、１０ｇ：１０ｇ、１５ｇ：１５ｇ、２０ｇ：２０ｇと２５ｇ：２５ｇである有機相系に入れ、１Ｌのｎ－ヘキサンに溶解し、１時間発酵後にビタミンＡパルミテートの含有量を測定し、転換率を計算する。図５から、菌体の添加量が２５ｇ／Ｌの場合、有機相系がビタミンＡ：パルミチン酸＝１５ｇ：１５ｇで、１Ｌの培地に溶解して、１時間転換後の形質転換効率が７６．７５％と最も高く、ビタミンＡパルミテートの含有量が１５．３５ｍｇ／Ｌであることがわかる。
（２）ステップ（１）で培養した菌株を発酵培地に入れ、接種量を２％とし、３０℃で１４～２４時間振とう培養する。発酵液を遠心分離し、沈殿物を捨て、上清を取る。
（３）発酵された菌液を３０００ｒ／ｍｉｎで５分間遠心分離し、菌体を２５ｇ／Ｌで異なる基質濃度、即ちビタミンＡとパルミチン酸の濃度が、それぞれ５ｇ：５ｇ、１０ｇ：１０ｇ、１５ｇ：１５ｇ、２０ｇ：２０ｇと２５ｇ：２５ｇである有機相系に入れ、１Ｌのｎ－ヘキサンに溶解し、１時間発酵後にビタミンＡパルミテートの含有量を測定し、転換率を計算する。図５から、菌体の添加量が２５ｇ／Ｌの場合、有機相系がビタミンＡ：パルミチン酸＝１５ｇ：１５ｇで、１Ｌの培地に溶解して、１時間転換後の形質転換効率が７６．７５％と最も高く、ビタミンＡパルミテートの含有量が１５．３５ｍｇ／Ｌであることがわかる。
Claims (12)
- 枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＳ１８０２に分類され命名された、保存番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０１８２６２であることを特徴とするリパーゼ産生株。
- 請求項１に記載の前記菌株の、酵素的方法によるビタミンＡパルミテートの合成への使用。
- 全細胞形質転換法によってビタミンＡパルミテートを合成することを特徴とする請求項２に記載の使用。
- （１）ＣＳ１８０２株を牛肉抽出物ペプトン液体培地に接種し、振とう培養するステップと、
（２）ステップ（１）で得られた培養菌株を発酵培地に入れて振とう発酵させ、上清、すなわち菌液を採取するステップと、
（３）発酵された菌液を遠心分離し、菌体を有機相系に入れて発酵させ、ビタミンＡパルミテートを生成するステップと、
を備えていることを特徴とする請求項２または３に記載の使用。 - 前記ステップ（２）の前記発酵培地の組成が、
トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ／Ｌ、オリーブオイルエマルジョン１２ｍＬ／Ｌ、
であることを特徴とする請求項４に記載の使用。 - 前記オリーブオイルエマルジョンの調製方法は、オリーブオイル乳化剤ＰＶＡとオリーブオイルを体積比３：１で混合し、超音波で乳化させることを特徴とする請求項５に記載の使用。
- 前記ステップ（３）の前記有機相系が、ビタミンＡとパルミチン酸を１：１の質量比で有機溶媒に溶解していることを特徴とする請求項４に記載の使用。
- 前記ビタミンＡおよび前記パルミチン酸の濃度がそれぞれ１０～２５ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項７に記載の使用。
- 前記ビタミンＡおよび前記パルミチン酸の濃度がそれぞれ１５ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項８に記載の使用。
- 前記有機溶媒がｎ－ヘキサンであることを特徴とする請求項７に記載の使用。
- 前記ステップ（３）において、菌体を有機相系に入れて、０．５～２時間発酵させることを特徴とする請求項４に記載の使用。
- 前記ステップ（３）において、菌体を有機相系に入れて、１時間発酵させることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
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