SE443996B - Sett att framstella en substans som uppvisar bakteriostatisk aktivitet genom odling av beggiatoa ncib 11 418 - 11 425 - Google Patents

Description

}0 U0 IÄUUWIU V Aix-les-Bains i Frankrike. Anordningen består av en vertikal betongmur, vilken vid sitt krön är försedd med en takränna. Det varma källvattnet, vilket tillföras genom en rörledning från den helt närliggande källan, utledes i takrännan och strömmar utefter murens väggar. Flnckar av barêgine med dimensioner av storleks- ordningen cm fäster sig vid betongens ojämnheter. En gelatinös film av barêgine tillväxer med utgående från de fästa flockarna och uppsamlas periodiskt genom rivning av muren med en hård bors- te. Temperaturen hos vattnet och i den lokal, i vilken muren är installerad är nära utträdestemperaturen från källan, dvs cirka H3-47°C. Utbytet av produktionen är ytterst lågt. Det visar sig vara cirka 5 g torrvikt av barêgine per m2 och månad. Vidare är det utsatt från variationer av olika faktorer, vilka är beroende av de meteorologiska betingelserna.

Barêgine har gjorts till föremål till mikrobiologiska och biokemiska undersökningar. Dessa har bevisat metabolismen av H28 och svavelhaltiga föreningar, men har icke klargjort orsaken till de terapeutiska egenskaperna hos barêgine. Bland de många mikroorganismer som identifierats i barêgine nämnes ofta Beggiatoa. De sällsynta isoleringar av Beggiatoa som är kända genom publikationer har dock aldrig genomförts med utgående från barêgine, utan med utgående från slam och avloppsvatten. Vidare har dessa isoleringar visat sig vara långvariga och besvärliga, och odlingen av de isolerade mikroorganihmerna har endast givit mycket låga utbyten, bland annat på grund av deras ömtålighet och deras mycket höga vattennalt. Som karakteristiskt kan bedö- mas ett publicerat värde av 1,2 g färskvikt av mikroorganismer bildade under H8 h vid 28°C och utan omblandning per liter av ett odlingsmedium som innehåller 2 g Jästextrakt, 0,1 g natriumacetat samt aktiv katalas.

Föreliggande uppfinning skall möjliggöra en räntabel fram- ställning i industriell skala av en substans som uppvisar en bak- teriostatisk aktivitet som är analog med den hos barêgine.

Sättet enligt föreliggande uppfinning kännetecknas av att en mikroorganism av typen Beggiatoa odlas i ett vattenhaltigt näringsmedium under aeroba betingelser och under omblandning, och att biomassan och/eller odlingsmediet tillvaratages.

Det har i praktiken visat sig, att en biomassa av mikro- organismer av typen Beggiatoa och till och med det medium, i vil- ket den har framställts uppvisar en bakteriostatisk aktivitet.

H0 3 /7UCÖ60'Ö Det har likaledes visat sig, att mikroorganismens ömtâlighet icke utgör ett hinder för dess intensivodling i kraftigt omrörd miljö, och att den förökar sig även om de trådar som den bildar söndras till ett flertal fragment. Det är därför som det till och med är fördelaktigt att homogenisera en ympkultur av mikroorganismer av typen Beggiatoa innan den inympas i odlingsmediet.

Det är med avsikt som här och i det följande av föreliggan- de beskrivning användes uttrymæt"mikroorganism av typen Beggiatoa" i stället för “mikroorganism av släktet Beggiatoa". Släktet Beggiatoa tillhör klassen av "gliding bacteria", ordningen Myxobacterales, och familjen Beggiatoaceae (jämför Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Eighth Edition, Waverly Press, Baltimore, USA, l97ß, sid ll2-llü). Som kan utläsas ur detta verk, vilket utgör en auktoritet inom detta område, är klassificeringen av mikroorganismerna av detta släkte något osä- ker på grund av det ringa antal säkra informationer som förelig- ger. Det vore olämpligt att begränsa síg till en så bestämd vetenskaplig term som "släkte" mot bakgrund av osäkerheten i klassificeringen av de ifrågavarande mikroorganismerna. Med ut- trycket "mikroorganism av typen Beggiatoa" avses följaktligen här att innefatta trâdformiga bakterier som är karakteristiska för svavelhaltiga jordar och vatten, och vars ofärgade trådar är rörliga genom glidning och är utbildade av celler i kedja, såsom de bakterier som är klassificerade inom släktet Beggiatoa.

Företrädesvis erhålles mikroorganismen av typen Beggiatoa genom att isoleras från barêgine.~ Det har visat sig att en så- dan isolering är möjlig vid genomförande på ett speciellt sätt, och att de stammar som den möjliggör att erhålla kan odlas och just uppvisar en bakteriostatisk aktivitet. Det har slutligen visat sig att även problemet med deras bevarande kan finna till- Ä fredsställande lösningar.

För isolerande av en stam kan ett prov av barêgine anbring- as på ett agarhaltigt näringsmedium och inkuberas i 5-36 timmar E vid en temperatur av 25-5D°C, varefter en zon utskäres, i vilken à trådarna av en mikroorganism av typen Beggiatoa är fria från föroreningar, denna zon anbringas på ett agarhaltigt näringsme- dium som är identiskt lika med det första, och processerna med inkubering, utskärning och återympning upprepas 2-3 gånger.

På detta sätt har isolerats 8 stammar, vilka deponerats den 12 juli 1978 i den nationella samlingen av industriella bak- 1,=,..¿;,¿*f s." -ffå'“-='lffiüfßfïï~ts.Qrir; ...fan m; c -;.~,~ i-m , 50 NO lÅi-'UUÜ6U"J terier (NCIB) i Aberdeen, Skottland, och som har erhållit numren NCIB llü 18 till llß Zš. Föreliggande sätt kan därför genomföras med exempelvis minst n av dessa 8 stammar.

Företrädesvis är det agarhaltiga näringsmedium som använ- des för isoleringen sammansatt av l-4 g jästextrakt och 10-20 g agar per liter vatten.

Likaledes innehåller det föredragna vattenhaltiga närings- mediet för odlingen l-N g jästextrakt, 0,1-0,3 g kalciumklorid ~ och 0,2-l g natriumacetat eller amoniumacetat per liter vatten.

För att skydda odlingen kan även katalas sättas till mediet, exempelvis i en mängd av 5-20 internationella enheter (IE) per ml.

Mikroorganismen kan odlas vid en temperatur av 20-50°C under -36 timmar och vid ett pH av 6-8. Lämpligen genomföres odlingen vid en temperatur av 30-H0°C under 8-10 timmar och vid neutralt pH.

Den substans som uppvisar en bakteriostatisk aktivitet och som erhålles medelst sättet enligt föreliggande uppfinning kan användas som sådan för massage av huden, eller som bestånds- del i exempelvis en kosmetisk produkt för huden. Biomassan kan bevaras i torkad form. Den torkas lämpligen genom frystorkning på grund av sin ömtålighet och sin låga torrsubstanshalt.

Uppfinningen åskådliggöres närmare av de följande exemplen, vilka har illustrerande betydelse. Namnet "Beggiatoa" användes där systematiskt, och är att förstå som innefattande uttrycket "mikroorganism av typen Beggiatioa“.

Exempel l (isolering av stammar) En flock av färsk barêgine, tagen från Thermes Nationaux d'Aix-les-Bains anbringas vid centrum av en petri-skål, innehål- lande 20 ml agarhaltigt medium, berett med följande sammansätt- ning: Jästextrakt (Difco) 2 g Agar (Bacto-Difco) 15 g Fíltrerat källvatten från Aix 100 ml Destillerat vatten 900 ml Skälen placeras upp och ned i en ugn vid 30°C under 30 timmar. Den undersökes sedan med mikroskop med låg förstoring för påvisande av närvaron av spiralformiga strukturer som år karakteristiska för Beggiatoa och som uppkommer genom dessa mik- Vissa är till och med Den mikroskopiska undersökningen vi- roorganismers rörlighet genom glidning. synliga för obeväpnat öga. nu., ' 1,, V t 50 ss NO lfwvwuäu w sar likaledes områden, i vilka trådarna av Beggiatea synes vara fria från föroreningar. Ett av dessa områden utskäres med ste- ril skalpell och anbringas på en platta av färsk agar med sama sammansättning som den föregående, varvid beaktas att den yta som innehåller trådarna av Beggiatoa anbringas mot den färska ytan av den nya agarplattan. Inkubering genomföres på nytt vid 30°C under 2N timmar. Processen med utskärning, återinympning och in- kubering upprepas ytterligare två gånger, varvid en ren kultur av Beggiatoa erhålles.

Exempel 2 (bevarande av stammarna) Ett tiotal stamar isoleras på det sätt som beskrivits i exempel 1. De skiljer sig från varandra genom diametern av de- ras trâdar, deras hastighet för glidningen och formen av deras kolonier på agar. De kan med framgång förvaras på tre olika sätt, beroende på om förvaringen avser kort, medellång eller lång tid. 2.1) kort tia: plattan förvaras i kylskåp vid M°c under iakttagande av att petri-skålen är tätad. Stammen överföres var tionde dag, eftersom agarn har en benägenhet att torka.. 2.2) medellång tid: ett halvflytande medium framställes med följande sammansättning: Jästextrakt 2 g CaCl2 0,1 g Natriumacetat 0,5 g Agar 2 g Fíltrerat vatten från varm källa l000 ml Efter sterilisering av mediet sättes till det svampkata- las i en mängd av 10 IE/ml. Katalaslösningen har i förväg ste- riliserats genom filtrering i kyla genom ett milliporfilter med mikroskopiska porer av 0,22 pm.

En liten kub av agar som innehåller Beggiatoa anbringas i ett rör som innehåller 10 ml medium, och det hela inkuberas vid }O°C. Beggiatoa utvecklas i den övre delen av röret. Röret kan lämnas i 5 veckor vid 30°C. Odlingen överföres därefter i en mängd av 0,1 ml per rör. 2.3) lång tidf en odling beredes under zh timmar i om- blandat medium på det sätt so beskrivas i exempel 3, samt centrifugeras. Bottensatsen tvättas med steril Ringers lösning, varefter den fryses och frystorkas. Den förvaras ett flertal månader i kylskåp i väl tillslutet kärl. Efter rehydratisering kan fragmenten av trådar utvecklas. - t _ -._...,mma.n,@Äw x 'w 1 :gggffl .;,,;.;;_e,..¿ §,,;,-,,¿,_,Å. y HD ct Exempel 2 (odling av stammar) 2.1. Ymgkultur En liten kub av agar med 5 mm kantlängd utskäres från en platta, framställd på sätt som beskrives i exempel l. Kuben an- bringas i en 500 ml kolv, innehållande l00 ml av följande mediumz- Jäatextrakt R g Kalciumklorid 0,2 5 Ammoniumacetat l g Filtrerat vatten från varm källa 1000 ml Detta medium uppvisar ett pH av 6,6. Kolven anbringas på en roterande skakapparat med varvtalet l50 r/min vid en svängninga- vag av 1,25 cm, och lamnas dar 1 16 timmar vid 3o°c. Den erhåll- na odlingen homogeniseras medelst en blandare Sorvall-Omnimixer under 15-50 sekunder under sterila betingelser. Den homogenise- rade odlingen utgör ympkulturen. 2.2. Odling ml av den enligt ovan erhållna ympkulturen satsas i en 500 ml kolv, innehållande 100 ml av samma medium som använts för framställning av ympkulturen. Kolven inkuberas under ZN timmar vid 30°C på den roterande skakapparaten. 0,8 g torrsubstans av Beggiatoa erhålles per liter odling. Vid upprepande av proces- sen med olika stammar och variation av betingelserna inom de tillåtna gränserna erhålles utbyten som ligger mellan cirka 0,5 och 2 g torr Beggiatoa per liter odling. .3. Kontroll av tillväxten Den konventionella, nefelometriska metod som användes för bakterieodlingar är icke användbar för Beggiatoa på grund av dess tillväxtsätt i flockar, utan anpassas till det speciella fallet. Prover uttages av odlingen varannan timme och homogeni- seras medelst blandaren Sorvall-Omnimixer. Deras optiska densi- tet vid 600 nm avläsas i en apektrofotometer. Det homogenisera- de provet sedimenterar endast mycket långsamt och möjliggör en tillförlitlig avläsning. På detta sätt erhålles en indikation på tillväxten i direkt relation med antalet celler.

}.U. Bestämning av torrvikten Den konventionella torkningen i ugn ger icke reproducerba- ra resultat för Beggiatoa. Detta beror troligen på dess mycket höga vattenhalt. Av denna orsak torkas icke mindre än N00 ml odling genom frystorkning för att reproducerbara resultat skall erhållas. ,» -:>~“'§_»-.~°~.<:«š«»¿..'ß<_.,fs-fí'=«.' f .-_ -.. ~._- sam s. fw» ett, NO 3.5. Bestämning av den bakteriostatiska aktiviteten Den konventionella metoden för bedömning av den bakterío- statiska aktiviteten enligt Public Health Laboratory Service Committee, beskriven i British Med. J. N08 (1965), ger icke till- fredsställande resultat i detta speciella fall, eftersom prov- ningen genomföres i rör. I själva verket är Beggiatoa mycket strängt aerob, och den syrehalt som föreligger i ett provrör är otillräcklig. Metoden får därför anpassas, och arbetet genomfö- res i kolvar, vilka omskakas för att öka syreöverföringen.

Tre serier kolvar om 50 ml framställes, var och en inne- hållande 18 ml näringsbuljong (Nutrient Broth Difco). Kolvarna i den första och den andra serien inympas vardera med 0,4 ml av en odling under 2N timmar av en patogen stam. Tre patogena stammar användes, nämligen Pseudomonas aeruginosa ATCC l0lN5, Eschericia coli ATCC ll75S och Staphylococcus aureus ATCC 12600.

Prover av den bakteriostatiska produkten framställes ge- nom centrifugering av en odling, erhållen på sätt som beskrivits i exempel 3.2., men under endast 8 timmar. Den centrifugerade biomassan homogeniseras och suspenderas i en volym av fysiolo- gisk saltlösning, lika med den volym vätskefas som erhålles från centrifugeríngen. Den fysiologiska lösning som innehåller bio- massan och vattenfasen från centrifugeringen uppdelas var och en i prover om 2 ml.

Till kolvarna i den första serien sättes 2 ml av den fysio- logiska lösning som innehåller den homogeniserade biomassan. Till kolvarna i den andra serien sättes 2 ml av den fysiologiska lös- ningen enbart. Till kolvarna i den tredje serien, vilka icke in- ympats med en patogen, sättes 2 ml av den fysiologiska lösningen, innehållande den homogeniserade biomassan.

Kolvarna inkuberas vid 37°C på en roterande skakapparat.

Deras optiska densitet mätes vid 600 nm efter 16 timmar. Mät- ningarna av de optiska densiteterna i motsvarande kolvar av se- rierna l, 2 och 3 ger parametrarna A respektive B och C. Skill- naden A-C, minskad från B och sedan dividerad med B och multipli- cerad med 100, ger den bakteriostatiska aktiviteten hos biomassan i procentuell inhibering.

Samma sätt användes för bestämning av den bakteriostatiska aktiviteten hos vätskefasen, varvid till kolvarna i den första och den tredje serien sättes 2 ml vätskefas i stället för 2 ml fysiologisk saltlösning som innehåller den homogeniserade biomas- a-...~..:i¿,,;:.:_ _. . t, san.

Resultaten sammanfattas i följande tabell: Patogen Biomassans aktivitet Vatskefasens aktivitet (Z inhibering) (5 inhibering) P. aeruginosa 70 hl S. aureus 100 H5 E. coli 70 ll Exempel 4 (jämförelse) För jämförelse bestämmas på samma sätt som angivits i exempel 3.5. den bakteriostatiska aktiviteten hos naturlig barêgine. Efter 16 timmars inkubering visar sig en procentuell inhibering av 100, 83 och 96 I gentemot P. aeruginosa, respekti- ve S. aureus och E. coli. Med andra ord innebär detta, att den bakteriostatiska aktiviteten hos biomassan enligt föreliggande uppfinning är nästan lika stark som den hos barêgine. Detta ut- gör ett anmärkningsvärt resultat vid beaktande av att den förelig- gande biomassan kan framställas med ett gott utbyte i industriell skala, medan barêgine endast kan erhållas långsamt och i mycket små mängder. Vidare är aktiviteten hos vätskefasen enligt före- liggande uppfinning icke utan intresse, ehuru den är lägre.

Exempel 5 (stammar NCIB) 8 stammar har isolerats på sätt som beskrives i exempel 1, och deponerades den 12 juli 1978 i National Collection of Industrial Bacteria (NCIB) Aberdeen, Skottland, och har som an- givits i det föregående erhållit numren NCIB llü 18 till llß 25.

Dessa stammar kan karakteriseras av sina tillväxtegenskaper, sin morfologi som odling på agar och i vätskemedium, liksom även av sin bakteriostatiska aktivitet.

I följande tabell angives den optiska densiteten hos od- lingar som erhållits efter 5, 10 och Zß timmar vid odling av var och en av dessa stammar på sätt som angivits i exempel 3.2, de erhållna biomassorna efter 2% timmar, samt den bakteriostatiska aktivitet hos de biomassor som erhållits efter 8 timmars odling gentemot de tre patogena stammarna P. aeruginosa, S. aureus och E. coli. De morfologiska egenskaperna angives därefter separat för varje stam.

/JS/0~IlU"“u 9 Stam Optisk densitet Biomassa (g Aktivitet NCIB efter efter efter torrsuba- (Z inhiberi ) nr 5 h 10 h Zß h tant/1) P.aeruginosd S.aureu:FE.coli 114 18 0,237 0,71} 0,58) 0,91 100 76 100 llü 19 0,552 0,621 0,51ß 0,95 100 96 14 110 20 0,147 0,ÜU7 0,709 0,95 100 96 NU nu 21 0,169 o,uo2 o,6n6 0,95 100 98 100 nu 22 0,289 0,561: 0,305 o,7s 68 89 au 1114 23 o,36o 0396 0,378 0,69 73 87 25 llü zh 0,217 0,757 0,587 0,59 57 80 27 llü 25 0,395 0,931 0,833 1,11 100 91 90 Morfologiska egenskaper: NCIB 11“ 18: På agar: Bildar stora, isolerade kolonier med diametern 8-15 mm och med ett vitt centrum och genomskinliga kanter. Undersökning i mikroskop (100 x): Kolonin är utbildad av väl synliga spiraler, vilka är tätt hoprullade.

I vätskemedium: Homogen kultur. Mikroskopisk undersökning (H00 x): långa trådar 80 x l,8 um, bildade bland annat av korta, väl dis- tinkta baciller. slutningar.

N IB llü 19: På agar: Bildar vita, isolerade kolonier med R-8 mm diamaær och diffusa kanter. från koloniens centrum, men uppnår icke kanterna. Mikroskopisk undersökning (100 x): koloniernas kanter är utbildade av trådar i täta spiraler.

I vätskemedium: Romogen odling.

Ingen aggregation. Mycket få ljusbrytande inne- Tjocka stråk sträcker sig radiellt i stjärnform Mikroskopisk undersökning (400 x): isolerade, mycket korta trådar med måtten 3,6 x 0,9 um, uppdelade av mycket tydliga åtsnörningar.

Bildar aggregat.

NCIB 1116 _2_(_)_: På agar: Bilda-isolerade, platta och opaka kolonier med 2-5 mm diameter och med fransiga kanter. Hikroskopisk undersökning (100 x): kolonierna består av fragment av trådar som bildar dåligt utvecklade spiraler.

Inga ljusbrytande inneslutningar. v- i vätskemedíum: Homogen odling. Mikroskopisk undersökning (400 x): H0 I>uoU|u'o inga trådar. Långa baciller med måtten 9 x 1,9 um och innehål- lande några ljusbrytande inneslutningar.

NCIB llü 21: På agar: Bildar separata kolonier med N-7 mm diameter och diffusai kanter, mycket liknande dem hos stammen NCIO 11% 19, men vitare..

Koloniernas kanter är genomskinliga. Mikroskopisk undersökning (100 x): inga synliga spiraler.

I vätskemedium: Homogen odling. Mikroskopisk undersökning (400 X)= utseende, liknande det hos stammen NCIB llß 20. Inga trådar, långa baciller med måtten 18 x 1,0 um och innehållande några ljusbrytan- de inneslutningar. Inga aggregat.

NCIB llfl 22: På agar: Bildar aldrig isolerade kolonier. Täcker hela ytan med genomskinliga, svampliknande stråk. Míkroskopisk undersökning (100 x;: stråken bildade av ett flertal trådar.

I vätskemedium: Homogen odling, vilken uppvisar några små aggre- gat från den sjätte timmen. Mikroskopisk undersökning (“00 x): långa, separata trådar med måtten 90 x l,ü-1,8 um. Trådarna upp- delade i långa enheter av tydliga åtsnörningar. Mycket få ljus- brytande inneslutningar.

NCIB llü 25: På agar: Liknar stammen NCIB llß 22.

Täta och bättre synliga, svampliknande stråk. dersökning (100 x): mera distinkta stråk, eftersom de består av ett större antal trådar.

I vätskemedium: Bilder stora flockar (aggregat). undersökning (N00 x): mycket kortare trådar än dem hos stammen NCIB llü 22 och uppdelade i segment genom mycket tydliga átsnör- ningar. Längd 9-10 x 1,8 pm. Ljusbrytande inneslutningar upp- träder mycket snabbt, från efter 5 timar.

NCIB llß 20: På agar: Liknar stammen NCIB llü 23.

Svampliknande stråk. Mikroskopisk undersökning (100 x): bildade av ett stort antal trådar.

I vätskenedium: Bilder stora flockar (aggregat). Mikroskopisk un- dersökning (ROO x): långa trådar med måtten lü0 x 1,8 un, vilka bildar långa knippen. Sen utveckling, efter l0 h, av ljusbrytande inneslutningar.

Inga isolerade kolonier.

Hikroskopisk un- Mikroskopisk Inga isolerade kolonier. stråken Inga synliga åtsnörningar.

NCIB llü 25: På arar: Bildar isolerade, opaka kolonier med 2-6 mm diameter. ,@ ~ew.h%- 7908516_3 {_ É ll Mikroskopisk undersökning (100 x): koloníerna består av trådar, bildade av isolerade celler och formade som täta apiraler. F I väcskemedium: Homogen ødlíng. Mikroakopísk undersökning (“00 X)=f homogena, korta trådar med måtten N x 1,ü um. Eng: antal ljus- brytande ínneslutníngar.

Så 3% «

Claims (2)

1. »wvvau v 'd Qatentkrav I. Sätt att framställa en substans med bakteriostatisk aktivitet, k ä n n e t e c k n a t därav, att mikroorganism- stammcn Beggiatoa NCIB Il 418, NCIB ll 419, NCIB ll 420, NCIB ll 421, NCIB ll 422, NCIB ll 423, NCIB ll 424 eller NCIB Il 425 odlas i ett vattenhaltigt näringsmedium, som per liter vatten innehåller l-4 g jüstextrakt, 0,!-0,3 g kalciumkloríd och 0,2-I g natrium- eller ammoniumacetat, vid en temperatur av 20-SOOC och ett pH-värde av 6-8 under en tid av 5-36 timmar, och att biomassan och/eller odlingsmcdiet tillvaratages. k ä n n e t e c k n a t därav,

2. Sätt enligt krav \, att mikroorganísmen odlas vid en temperatur av 30-4000, vid neut- ralt pH-värde och under 8-10 timmar. 'zhå-.trawarfl a, r-“ålèfly-»låia-a-í; :2.l.ß-.:.^~« . :år _ -ï V-:z i. ä* å! , ,,, á.. .,_. wllvøeái-w» ïsnte» tmi,_,,fiï,_,¿i_,.,,,r_z,_.,g;¿,-.-,al V,=*,,;.,~..»,,~, 1,2; ,