SU1090263A3 - Способ получени биомассы микроорганизмов типа @ ,обладающей бактериостатической активностью - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ ТИПА BEGGIATOA, ОБЛАДАЮЩЕЙ БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ , заключающийс  в том, что клетки ьшкроорганизмов штамма Beggiatoa NCIB 114-18, NCIB 114t9, NCIB 11420, NCIB 11421, NCIB 11422, NCIB 11423, NCIB 11424 или NCIB 11425 гомогенизируют, гомогенат культивируют в аэробньк услови х при З0с 16-24 ч при рН 6,6 в жидкой питательной среде и отбирают биомассу и/или культуральную жидкость .

Description

СП Изобретение относитс  к микробио логической промышленности и касаетс  получени  биомассы микроорганизм . обладающих бактериостатической акти ностью. Цель изобретени  - создание способа получени  биомассы микрооргани мов типа Beggiatoa, обладающей бактериостатической активностью. Указанна  цель достигаетс  тем, что в способе получени  биомассы микроорганизмов типа Beggiatoa, обладающей бактериостатической активностью , клетки микроорганизмов штам ма Beggiatoa NCIB 11418, NCIB 11419 NCIB 11420, NCIB 11421, NCIB 11422, NCIB 1Г423, NCIB 11424 или NCIB 1J42 гомогенизируют, гомогенат культивируют в аэробных услови х при 16-24 ч при рН 6,6 в жидкой питательной среде и отбирают биомассу и/или культуральную жидкость, Микроорганиз типа Beggiatoa получают предпочтительно из барежин Дл  вьщелени  штамма помещают образец барежина на агар-агаровую питательную среду, вьщерживают 6-16 ч при 5-50Рс, отдел ют участок со сво бодными от загр знений нит ми микроорганизма типа Beggiatoa, помещаю этот участок на ту же питательную среду инкубируют, отдел ют и пересаживают 2-3 раза, Вьзделено восемь штаммов, депонированных в Национальной коллекции пpo шшпeнныx бактерий (NCIB) в Абер дине, Шотланди , под номерами NCIB 11418-11425. Агар-агарова  питательна  среда содержит 1-4 г экстракта дрожжей и 10-20 г агара на 1 л воды. Способ осуществл етс  следующим образом. Культуру микроорганизма типа Beggiatoa гомогенизируют и культивируют в жидкой питательной среде, содержащей 1-4 г экстракта дрожжей 0,1-0,3 г хлористого кальци  и 0,21 г ацетата натри  или аммони  на 1 л воды. Дл  предохранени  культуры в процессе культивировани  в среду . можно добавить 5-20 МЕ/мг каталазы. Культивирование ведут при t 5-36 ч при рН 6-8. Предпочтительно культивирование провод т в течение 8-10 ч при 30-40 С и нейтральном рН. Полученный целевой продукт можно лиофилизировать. 1. Зьщеление штаммов, Пример , вз того из НациоХлопь  свежего нальной водолечебницы Эй-ле-Беин, барежина помещают в центр чашки Петри , содержащей среду, приготовленную по рецепту: Экстракт дрожжей ( Дифко), г2 Агар (Бакто-Дифко ) , г Отфильтрованна  термальна  вода, Дистиллированна  вода, мл 4aiilKy Петри помещают на 30 ч в сушильный шкаф при . Потом содержимое изучают под микроскопом при слабом увеличении, чтобы обнаружить присутствие характерной спиралевидной структуры Beggiatoa, про вл ющеес  по скольз щей подвижное ти этих микроорганизмов, некоторые из которых видны невооруженным глазом. Микроскопический анализ обнаруживает также участки с кажущимис  свободными от загр знени  нит ми Beggiatoa. Один из таких участков вырезают стерильным скальпелем и нанос т на чистую пластинку агара такого же состава, как в первом случае . При этом поверхность с нит ми Beggiatoa кладут на чистую поверхность новой пластинки агара. Инкубацию вновь продолжают 24 ч при 30°С. Операцию вырезани , пересадки и инкубации повтор ют еще два раза. В результате получают чистую культуру Beggiatoa, Пример 2. Консерваци  штаммов . Описанным в примере 1 образом вьщел ют восемь штаммов. Они отличаютс  друг от друга диаметром нитей, скоростью их скольжени  и формой образовавЩихс  на агаре колоний. Они успешно консервируютс  трем  paзличны ш методами: кратковременным, средней длительности и длительным. 2.1,Метод кратковременной консервации . Пластинку хран т в холодильнике при 4°С, герметизиру  чашку Петри. Штамм перемещают каждые дес ть дней, ибо, агар склонен к высыханию, 2.2.Консерваци  средней длительности . Готов т полужидкую среду следующего состава: Экстракт дрожжей , г2 Хлористый кальций, г О 1 Ацетат натри , г Агар, г Отфильтрованна  термальна  вода, После стерилизации в среду добав л ют грибковую каталазу в количеств 10 международных единиЦ/л. Раствор каталазы предварительно стерилизуют в холодном состо нии на миллипорист фильтре К размером икpocкoпичecкиx пор 0,22 мкм. Небольшой кубик, агара содержащи Beggiatoa, помещают в трубку с 10 м среды. Инкубацию ведут при 30 С. Beggiatoa развиваетс  в верхней части трубки. Tpy6j y можно держать три недели при 30 С. Потому культур перемещают из расчета 0,1 мл на трубку. 2.3. Метод длительного хранени . Готов т в течение 24 ч культуру в перемешиваемой среде так, как описа но в примере 1. Потом центрифугирую Осадок промывают стерильным раствором Рингера, выморсшивают и лиофили зируют. Состав может хранитьс  несколько мес цев в холодильнике в хорошо закрытом сосуде. После регидратации фрагменты нитей способны к развитию. Пример 3. Культивирование штаммов. 3.1. Прививка. Вырезают небольшо кубик агара с 5 мм размером грани из пластинки, полученной так, как было описано в примере 1. Один куби помещают в 500 мл колбу, содержащую 100 мл следующей среды: Экстракт дрожжей , г4 Хлористый кальций , г0,2 Ацетат аммони , т1 От4«льтрованна  термальна  вода, мл1000 Эта среда имеет рН 6,6. Колбу помещают на орбитальную мешгшку, вращающуюс  со скоростью 150 об/мин при радиусе вращени  1,25 см. Здесь колба остаетс  в течение 16 ч при температуре .. Полученную культуру гомогенизируют с помощью мещалки в течение 1530 мин в стерильных услови х. Гомогенизированна  культура будет слу«ить прививкой. 3.2.Культивирование. 5 мл описанной выше прививки помещают в 500 МП колбу, содержащую 100 мл той же среды, котора  была использована дл  получени  прививки. Колбу подвергают инкубации в течение 24 ч при на орбитальной мешалке. Получают 0,8 г сухого вещества Beggiatoa на 1 л культуры. Повтор   операцию с различными штаммами № 11418-11425 и, варьиру  услови  в дoпycти lыx пределах, получают выходы, колеблющиес  от 0,5 до 2 г Beggiatoa в сухом виде на 1 л культуры. 3.3.Регулирование роста. Каждые 2 ч берут образец культуры и гомогенизируют их с помощью мешалки. На спектрофотометре определ ют оптическую плотность при 600 нм. Гомогенизированный образец осаждаетс  очень медленно и это обеспечивает надежное считывание результатов. Таким образом подтверждаетс  пр ма  зависимость роста от числа клеток. 3.4.Определение сухого веса. Классический метод сушки в печи не дает результатов, вследствие высокого содержани  воды. Поэтому приходитс  сушить не менее 400 мл культуры путем лиофилизации. 3.5.Определение бактериостатической активности. Beggiatoa  вл етс  строго азробным микроорганизмом, и концентрагщ  кислорода в опытных трубках дл  него недостаточна. Опыт провод т в колбах, размешива , повыша  этим снабжение кислородом. Готов т три серии колбочек емкостью 50 мл, содержащих кажда  по 18 мл питательного бульона. Колбы первой и второй серий инокулируют каждую с 4 мл 24-часовой культурой патогенного штамма. Используют три патогенных штамма: Pseudomonas aeruginosa АТСС 10145, Esehericfiia coli АТС 11755 и Staphylococcus aureus АТСС 12600 Образцы бактериостатического продукта готов т, центрифугиру  культуру , полученную согласно примеру 3-п, 2, но в течение 8 ч. Центрифугированную биомассу гомогенизируют и перевод т в суспензию в объеме физиологического раствора, равного объему всплывающего при центр«фугировании раствора. Физиологический раствор, содержащий биомассу и всплывающий материал, дел т каждый на образцы в 2 мл.

В колбы 1-ii серии добавл ют 2 мл физиологического раствора, содержащего гомогенизированную биомассу. В колбы 2-н серии добавл ют по 2 мл одного только физиологического раствора .

В колбы 2-й серии, не инокулированные патогенным материалом, добавл ют 2 мл физиологического раствора, содержащего гомогенизированную биомассу .

Колбы инкубщ)уют при 37°С на орбитальной мешалже и измер ют оптическую плотность при 600 им спуст  16 ч. В результате измерени  оптичес 15 КОЙ ПЛОТНОСТИ: соответствующих колбо чек серии 1,2   3 огар-ед-ел ют соответствующие параметры А, В и С. Раз ность А-С, вычтенна  из В, потом разделенна  на В и умноженна  на 10 определ ет бактериостатическую акти ность биомассы в процентах ингибировани . Таким же образом определ ют бакт риостатическую активность всплывающего материала, причем в колбочки первой и третьей серий, сод ержащие биомассу, вмест о 2 ип физиологическ го раствора добавл ют 2 мл всплывше го гомогенизированного материала. Полученные результаты сведены в табл. 1. Пример 4 (сравнительный). Дл  сравнени , методом описанным в примере 3, п. 5 определ ют бактерио статическую активность натурального барежина. % ингибировани  составил спуст  16 ч инкубации дл  P.aeruginosa , S.aureus и E.coli соответственно 100, 83 и 96. Иными словами, бактериостатическа  активность биомассы по данному изобретению оказалась почти такой же сильной, как у барежина. Пример 5 (штаммы NCIB 1141 11425). Штаммы были вьщелены так, как это описано в примере 1. В табл. 2 указана оптическа  плотность этих штаммов, полученна  спуст  5, 10 и 24 ч после культивировани  каждого штамма в услови х, описанных в примере 3, п. 2 и бактериостатическа  активность получен ной биомассы по отношению к трем ггатогснным штаммам P.aeruginosa, S.aureus и r.ccli. Морф|.хпоги . Штамм NCIB 1КИ8. На агаре: образует кпуггмые изолированные колонии , диаметром 8-15 мм с белым цент ром и прозрачными кра ми, при рассмотрении в микроскопе (х 100): - колони  образована хороню видимыми спирал ми, окруженными уплотненным материалом-, в жидкой культуре: однородна  культура, при рассмотрении в микроскопе (х 100): длинные нити 80 1,8 мкм, иногда образованные короткими хорошо заметн1 1М11 бациллами агрегаци  отсутствует , очень мало преломл 10гщ1х включений.

Штамм NCI.B 11419. На агаре: образует изолированные белые колонии диаметром 4-8 мм с размытыми кра ми; радиально, знездообразно распростран ютс  толстые нити, идущие от, центра колонии, но не достигаю1цие краев: при рассмотрении в микроскопе (х 100) кра  колонии образованы сжатыми спиралевидными нит ми: в жидкой культуре: гомогенна  культура , при рассмотрении в микроскопе (х 100): изолированные, очень короткие нити 3,6 -0,9 мкм, разделенные очень четко сужени ми; преломл ющих включений нет, наблюдаютс  агрегаты. Штамм NCTB11420. На агаре: образует плоские, изолированные непрозрачные колонии диаметром 2-5 мм с фестонными кра ми при рассмотрении в микроскопе (х 100): колонии образованы из фрагментов нитей, образующих плохоразвитые спирали, в жидкой культуре: однородна - культура, при рассмотрении в микроскопе (х 400):.нити отсутствуют длинные бациллы 9-1,4 мкм с небольшим количеством, преломл ющих включений. Штамм NCIB 11421. На агаре: образует отдельные колонии диаметром 4-7 мм с размытыми кра ми, подобные колони м, образуемым штаммом NCIB 11419, но более белые, кра  колоний прозрачные: при рассмотрении в ьдакроскопе (х 100): нет видимых спиралей в жидкой культуре: гомогенна  культура, при рассмотрении в микроскопе (х 400): картина близка  к наблюдаемой дл  штамма 1l420i нити отсутствуют: длинные бациллы 18- 1,4 мкм, содержащие некоторое количество преломл ющих включений. Агрегаты отсутствуют. Штамм NCIB 11422. На агаре: никогда не образуетс  изолированных колонийJ покрыв.1ет всю поперхрюсть прозрачными мокоиднымм нит ми при рассмотрении и мтгкроскопс (х 100): нити образованные многими фнламентами в жидкой культуре; . однородна  культура представл ет собой на шестом часу несколько маленьких агрегатов, при рассмотрении в микроскопе (х 400): длинные раздельные нити размером от 90 . 1,4 до 1,4 -1,8 мкм, нити разделены на длинные единицы четко видными сужени миf очень мало преломл ющих включений. Штамм NCIB 11423. На агаре: напоминает штамм NCIB 11422; изолиро ванных колоний нет, видны плотные микоидные нити; при рассмотрении в микроскопе (х 100): нити более четко определены, поскольку они образованы из большего числа филаментов; в жидкой культуре: имеет форму крупных хлопьев (агрегатов), при рассмотрении в микроскопе (х 400): филаменты значительно более короткие, чем у штамма 11422 и разделены четко выраженными суже ни ми на сегменты, длина 9-10 18 м очень быстро, спуст  5ч, по вл ют с  преломл ющие включени . Штамм NCIB 11424. На агаре: напоминает штамм NCIB 11423, изолированные колонии отсутствуют: микоидные нити при рассмотрении в микроскопе (х 100): нити, образова ные большим количеством филаментов в жидкой культуре: образуютс  круп ные хлопь  (агрегаты)} при рассмот рении в микроскопе (х 400): длинны филаменты 140 1,8 мк, образующие длинные, пучки; видимые сужени  отсутствуют: запоздалое развитие

Таблица 2 ( спуст  10 ч) преломл ющих включений . Штамм 11425. На агаре: образует непрозрачные изолированные колонии размером 2-6 мм в диаметре, при рассмотрений в микроскопе (х 100): колонии , образованные из изолированных клеток, создающих сжатые спирали: в жидкой культуре: однородна  культура- при рассмотрении в микроскопе (х 400): однородные короткие филаменты 4 1,4 мк, мало преломЛЯНИЩ1Х включений. Использование изобретени  позвол ет получать биомассу в промышленном масштабе, тогда как барежина в естественных услови х Лолучаетс  очень медленно и в малых количествах , что не позвол ет удовлетворить потребности медицины и косметической промьшшенности. Таблица 1 Ингибирование патогенных микроорганизмов Активность (% ингибиПатогенный ровани ) агент биомассы всплывшего материала P.aerugino-7041 S.aureus10045 E.coli7011

0,91 0,95 0,95 0,95 0,75

1090263

114230,360 0,496 0,378

114240,217 0,737 0,587

114250,395 0,981 0,838

10 Продолжение табл, 2

73 87 25

57 80 27

100 91 90

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ ТИПА BEGGIATOA, ОБЛАДАЮЩЕЙ БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ, заключающийся в том, что клетки микроорганизмов штамма Beggiatoa NCIB 114Ί8,

   NCIB 11419, NCIB 11420, NCIB 11421, NCIB 11422, NCIB 11423, NCIB 11424 или NCIB 11425 гомогенизируют, гомогенат культивируют в аэробных условиях при 30 G 16-24 ч при pH 6,6 в жидкой питательной среде и отбирают биомассу и/или культуральную жидкость.

   § ω с >