CN110684668B - 一种降低养殖过程中铅污染的盐生杜氏藻养殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种降低养殖过程中铅污染的盐生杜氏藻养殖方法，其包括如下步骤：(1)温棚养殖阶段；(2)室外养殖阶段；(3)盐藻洗盐；(4)喷雾干燥制得成品盐藻粉。本发明通过室内养殖与室外养殖相结合，并选用合适的池膜，结合合适的洗盐参数控制，能够克服自然环境对盐藻干粉铅含量的影响，获得的盐藻干粉铅含量能够满足标准要求(小于1.0mg/kg)；提高了盐藻干粉的经济价值，降低后续处理成本。

Description

一种降低养殖过程中铅污染的盐生杜氏藻养殖方法
技术领域：
本发明涉及一种盐生杜氏藻养殖方法，特别是涉及一种降低养殖过程中铅污染的盐生杜氏藻养殖方法。
背景技术：
盐生杜氏藻(Dunaliella Salina)简称盐藻，属绿藻纲，团藻目，杜氏藻属，是在高光照、高盐度卤水环境中生长的单细胞绿藻，是唯一能在高浓度卤水中生长的具有可观经济价值的藻类生物，其在特殊环境下天然胡萝卜素转化富集量可以达到生物总量的10％以上。盐藻养殖是医疗、保健、化妆、高档饵料等领域获取纯天然胡萝卜素的主要手段。应用现代先进工艺方法从盐藻中提取蛋白质、多糖、氨基酸、食用色素、不饱和脂肪酸等天然有效成分在生物化工和大健康领域具有广阔的应用前景。在盐藻工厂化大规模开放培养过程中，盐藻藻液常因沙尘、降雨等自然环境因素影响，造成盐藻干粉重金属铅含量严重超标(盐藻干粉铅含量应小于1.0mg/kg，需要经后续降铅或其他提取工艺进行处理，相应降低了其经济价值，不利于企业降本增效，同时也会增加后续提取加工的成本。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种降低养殖过程中铅污染的盐生杜氏藻养殖方法。
本发明的目的由如下技术方案实施：一种降低养殖过程中铅污染的盐生杜氏藻养殖方法，其包括如下步骤：(1)温棚养殖阶段；(2)室外养殖阶段；(3)盐藻洗盐；(4)喷雾干燥制得成品盐藻粉；
(1)温棚养殖阶段：取对数生长期藻种接种于室内养殖池的藻液中，室内盐藻藻液养殖盐度为12-14°Bé，在温棚内培养至藻液密度达到30-50万/ml时，转至室外养殖池培养，室内养殖池与室外养殖池内均铺设池膜；
(2)室外养殖阶段：将从温棚内转移出的藻液在室外培养至胡萝卜素的质量百分含量不小于6g/m3时，进行盐藻采收，其中，室外盐藻藻液养殖盐度为16-18°Bé；
(3)盐藻洗盐：将采收的盐藻加纯净水搅拌进行洗盐操作，添加纯净水的质量为盐藻质量的6-10倍，然后进行离心分离；
(4)喷雾干燥制得成品盐藻粉：将离心分离后得到的盐藻进行喷雾干燥，制得成品盐藻粉。
进一步，所述池膜为高密度聚乙烯(HDPE)膜。
进一步，所述步骤(1)中，接种密度为1.0×104cell/mL。
本发明的优点：本发明通过室内养殖与室外养殖相结合，并选用合适的池膜，结合合适的洗盐参数控制，能够克服自然环境对盐藻干粉铅含量的影响，获得的盐藻干粉铅含量能够满足标准要求(小于1.0mg/kg)；提高了盐藻干粉的经济价值，降低后续处理成本。
具体实施方式：
用于实施例1-3及对比例1-10的藻种选育方法：
一、藻种的选育
藻种：盐生杜氏藻Dunaliella salina来自中国由海洋大学海洋生命学院单克隆筛选的藻种。
1、培养器具的消毒
把藻种选育过程中所需的器具如培养皿、试管、玻璃棒等在干燥箱中160℃下灭菌2小时，备用。
2、培养液的配制
将1L配置好的培养液放入压力灭菌锅，在121℃高压灭菌20分钟。
3、接种藻液的配制
取待选藻液10mL，用标准培养液无限稀释至每滴藻液中含2—5个藻细胞，放入试管中备用。
4、固体培养基的制备
把配制好的标准培养液中按比例加入1.5％琼脂，100℃加热，待琼脂完全溶化后，将培养基放入压力灭菌锅，在121℃高压灭菌20分钟。取出，在无菌条件下，以20mL的量分别倒入灭过菌的培养皿中、冷凝。
5、固体培养基表面的接种
待各培养皿中的培养基凝固且表面温度达37℃时，用吸管吸取稀释后的接种藻液，分别在各皿培养基表面均匀滴3——5滴，用手轻轻摇动培养皿，使藻液均匀分布于固体培养基表面。
6、把接种后的各培养皿置于室温25——28℃，有自然光照射的室内环境中，进行藻种的固体培养。
7、群落分离
固体培养20——30天后，肉眼可见在培养基表面形成一个个分散的、绿色的藻体群落。把培养皿移入显微镜下观察，挑选藻体大小均匀的单个群落，移入标准的液体培养基中，进行培养。
8、液体初级扩大培养
在实验室内依次用25、50、100、250mL锥形瓶，对新选育的藻群在标准的培养液环境中进行逐渐扩大培养，使其达到一定的密度，及一定的体积(约100——200mL).
9、性状测定，鉴别优劣
取10mL经初级扩养的藻液，测定其藻种密度、纯度及胡萝卜素含量，并根据所测数据比较各组藻种的生长速度及单个藻体胡萝卜素含量、纯度等性状。
10、筛选优良藻种
根据比较结果，选择生长速度快，胡萝卜素含量高及镜检藻体大小均匀的藻种作为优良种。
11、规模扩养
把优选出的藻种逐渐移到更大的容器中，继续进行扩大培养，直到能够提供保种室接种的藻液量。
二、保种
1、室内保种
把选育出的优良藻种取一小部分保存在实验室内的250mL锥形瓶中。保存过程中需控制的指标如下：
pH值：7.0——9.0
盐度：12——14Be′
温度：5——10℃
光照：5000——10000lux
OD560nm:0.5——1，当OD>1时，用新鲜的灭菌的培养液稀释使其达到要求值。
搅拌：每日早、午、晚各一次，剧烈摇动各锥形瓶，使藻种均匀分布。
日常观测：定期检测藻种纯度、密度，并在显微镜下观察藻液情况，包括藻种颜色、均匀程度、污染状况等，如发现异常，采取相应措施。
2、室外保种
把选育好的优良藻种大部分接种于保种室的一级保种池中进行保存(一级保种池专门用于藻种保存)。保存过程中需控制的指标如下：
pH值：7——9
盐度：16——18Be′
温度：15——25℃
光照：5000——10000lux
搅拌：白天开搅拌
胡萝卜素：6g/m3,密度：(20万/ml)超出此范围，则打出部分藻液，再用新鲜培养液稀释到规定值。
日常观测：定期检测藻种密度、胡萝卜素含量，并在显微镜下观察藻液情况，包括藻种颜色、均匀程度、污染状况等，如发现异常及时处理。
用于以下实施例及对比例的藻液：来自兰太生产基地的饱和卤水(比重1.20，pH6.03.)与井水配制的同浓度的培养液。藻液深度20cm，藻液中一次性添加营养盐：尿素0.2mmol/L，KH2P04 0.1mmol/L，NaHCO3 2mmol/L，柠檬酸铁0.01mmol/L。
实施例1：一种降低养殖过程中铅污染的盐生杜氏藻养殖方法，其包括如下步骤：
(1)温棚养殖阶段：取对数生长期藻种接种于室内养殖池的藻液中，接种密度为1.0×104cell/mL；室内盐藻藻液养殖盐度为12-14°Bé，在温棚内培养至藻液密度达到30-50万/ml时，转至室外养殖池培养，室内养殖池与室外养殖池内均铺设池膜；池膜为高密度聚乙烯(HDPE)膜。
(2)室外养殖阶段：将从温棚内转移出的藻液在室外培养至胡萝卜素含量不小于6g/m3时，进行盐藻采收，其中，室外盐藻藻液养殖盐度为16-18°Bé；
(3)盐藻洗盐：将采收的盐藻加纯净水搅拌进行洗盐操作，添加纯净水的质量为盐藻质量的10倍，然后进行离心分离；
(4)喷雾干燥制得成品盐藻粉：将离心分离后得到的盐藻进行喷雾干燥，制得成品盐藻粉。
实施例2：一种降低养殖过程中铅污染的盐生杜氏藻养殖方法，其包括如下步骤：
(1)温棚养殖阶段：取对数生长期藻种接种于室内养殖池的藻液中，接种密度为1.0×104cell/mL；室内盐藻藻液养殖盐度为12-14°Bé，在温棚内培养至藻液密度达到30-50万/ml时，转至室外养殖池培养，室内养殖池与室外养殖池内均铺设池膜；池膜为高密度聚乙烯(HDPE)膜。
(2)室外养殖阶段：将从温棚内转移出的藻液在室外培养至胡萝卜素的质量百分含量不小于6g/m3时，进行盐藻采收，其中，室外盐藻藻液养殖盐度为16-18°Bé；
(3)盐藻洗盐：将采收的盐藻加纯净水搅拌进行洗盐操作，添加纯净水的质量为盐藻质量的8倍，然后进行离心分离；
(4)喷雾干燥制得成品盐藻粉：将离心分离后得到的盐藻进行喷雾干燥，制得成品盐藻粉。
实施例3：一种降低养殖过程中铅污染的盐生杜氏藻养殖方法，其包括如下步骤：
(1)温棚养殖阶段：取对数生长期藻种接种于室内养殖池的藻液中，接种密度为1.0×104cell/mL；室内盐藻藻液养殖盐度为12-14°Bé，在温棚内培养至藻液密度达到30-50万/ml时，转至室外养殖池培养，室内养殖池与室外养殖池内均铺设池膜；池膜为高密度聚乙烯(HDPE)膜。
(2)室外养殖阶段：将从温棚内转移出的藻液在室外培养至胡萝卜素的质量百分含量不小于6g/m3时，进行盐藻采收，其中，室外盐藻藻液养殖盐度为16-18°Bé；
(3)盐藻洗盐：将采收的盐藻加纯净水搅拌进行洗盐操作，添加纯净水的质量为盐藻质量的6倍，然后进行离心分离；
(4)喷雾干燥制得成品盐藻粉：将离心分离后得到的盐藻进行喷雾干燥，制得成品盐藻粉。
对比例1：一种降低养殖过程中铅污染的盐生杜氏藻养殖方法，其与实施例1的区别在于，盐藻洗盐步骤中，添加纯净水质量为盐藻质量的14倍，其余步骤及参数均相同。
对比例2：一种降低养殖过程中铅污染的盐生杜氏藻养殖方法，其与实施例1的区别在于，盐藻洗盐步骤中，添加纯净水质量为盐藻质量的5倍，其余步骤及参数均相同。
对比例3：一种降低养殖过程中铅污染的盐生杜氏藻养殖方法，其与实施例1的区别在于，盐藻洗盐步骤中，添加纯净水质量为盐藻质量的15倍，其余步骤及参数均相同。
对比例4：一种降低养殖过程中铅污染的盐生杜氏藻养殖方法，其与实施例1的区别在于，没有盐藻洗盐步骤，其余步骤及参数均相同。
对比例5：盐生杜氏藻养殖方法，其包括如下步骤：
(1)第一养殖阶段：取对数生长期藻种接种于室外养殖池的藻液中，接种密度为1.0×104cell/mL；盐藻藻液养殖盐度为12-14°Bé，培养至藻液密度达到35-50万/ml时，进行第二养殖阶段，采用的养殖池为土池。
(2)第二养殖阶段：培养至胡萝卜素含量不小于6g/m3时，进行盐藻采收，其中，该阶段盐藻藻液养殖盐度为16-18°Bé；
(3)喷雾干燥制得成品盐藻粉：将采收的盐藻进行离心分离，将离心分离后得到的盐藻进行喷雾干燥，制得成品盐藻粉。
对比例6：盐生杜氏藻养殖方法，其包括如下步骤：与对比例5的区别在于，养殖池铺设美国TPO池膜，其余步骤及参数与对比例5完全相同。
对比例7：盐生杜氏藻养殖方法，其包括如下步骤：与对比例5的区别在于，养殖池铺设意大利TPO池膜，其余步骤及参数与对比例5完全相同。
对比例8：盐生杜氏藻养殖方法，其包括如下步骤：与对比例5的区别在于，养殖池铺设意大利PVC池膜，其余步骤及参数与对比例5完全相同。
对比例9：盐生杜氏藻养殖方法，其包括如下步骤：与对比例5的区别在于，养殖池铺设国产高密度聚乙烯(HDPE)膜，其余步骤及参数与对比例5完全相同。
对比例10：盐生杜氏藻养殖方法，其包括如下步骤：与对比例5的区别在于，养殖池铺设国产高密度聚乙烯(HDPE)膜，且将采收的盐藻加纯净水搅拌进行洗盐操作，添加纯净水的质量为盐藻质量的10倍，然后进行离心分离，其余步骤及参数与对比例5完全相同。
实施例1-3，及对比例1-10盐藻粉铅含量检测数据如表1所示：表1：实施例1-3，及对比例1-10盐藻粉铅含量检测数据(单位/mg/kg)
Figure BDA0002272213220000101
试样中铅含量(mg/kg)＝(试样中铅质量浓度—空白溶液铅质量浓度)×定容体积÷试样称重量÷1000。
实施例1-3，及对比例1-10不同材质膜铅检测数据如表2所示：表2：实施例1-3，及对比例1-10不同材质膜铅检测数据
Figure BDA0002272213220000102
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种降低养殖过程中铅污染的盐生杜氏藻养殖方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)温棚养殖阶段；(2)室外养殖阶段；(3)盐藻洗盐；(4)喷雾干燥制得成品盐藻粉；
(1)温棚养殖阶段：取对数生长期藻种接种于室内养殖池的藻液中，室内盐藻藻液养殖盐度为12-14°Bé，在温棚内培养至藻液密度达到30-50万/ml时，转至室外养殖池培养，室内养殖池与室外养殖池内均铺设池膜；所述池膜为高密度聚乙烯膜；
(2)室外养殖阶段：将从温棚内转移出的藻液在室外培养至胡萝卜素的含量不小于6g/m3，进行盐藻采收，其中，室外盐藻藻液养殖盐度为16-18°Bé；
(3)盐藻洗盐：将采收的盐藻加纯净水搅拌进行洗盐操作，添加纯净水的质量为盐藻质量的6-10倍，然后进行离心分离；
(4)喷雾干燥制得成品盐藻粉：将离心分离后得到的盐藻进行喷雾干燥，制得成品盐藻粉。
2.根据权利要求1所述的一种降低养殖过程中铅污染的盐生杜氏藻养殖方法，其特征在于，所述步骤(1)中，接种密度为1.0×104cell/mL。
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