JP2023546740A - プロテオグリカン複合体及びその用途 - Google Patents
プロテオグリカン複合体及びその用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023546740A JP2023546740A JP2023548992A JP2023548992A JP2023546740A JP 2023546740 A JP2023546740 A JP 2023546740A JP 2023548992 A JP2023548992 A JP 2023548992A JP 2023548992 A JP2023548992 A JP 2023548992A JP 2023546740 A JP2023546740 A JP 2023546740A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- polysaccharide
- tetanospasmin
- streptococcus pneumoniae
- truncated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 324
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 323
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 226
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 claims abstract description 179
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 claims abstract description 178
- 108030001722 Tentoxilysin Proteins 0.000 claims abstract description 159
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 97
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 89
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims abstract description 37
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims abstract description 36
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 143
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 139
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 80
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 66
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 66
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 56
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 42
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 35
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 31
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 30
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 30
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 28
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 26
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 25
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 25
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 24
- -1 10A polysaccharide Chemical class 0.000 claims description 22
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 22
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 claims description 21
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 claims description 20
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 20
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 19
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 17
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 16
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 claims description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 13
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 claims description 9
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 claims description 8
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 6
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 5
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 229910000042 hydrogen bromide Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 claims description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 claims description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 claims description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 claims description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 claims description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 103
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 88
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 85
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 27
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Chemical class 0.000 description 11
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 11
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 11
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 11
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 9
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 8
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 7
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 7
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000007398 protein translocation Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 6
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 5
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 5
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 5
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000002766 immunoenhancing effect Effects 0.000 description 4
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 4
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 208000035109 Pneumococcal Infections Diseases 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N adipic acid dihydrazide Chemical group NNC(=O)CCCCC(=O)NN IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940024545 aluminum hydroxide Drugs 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 2
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 2
- 102100037840 Dehydrogenase/reductase SDR family member 2, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 101710188053 Protein D Proteins 0.000 description 2
- 101710132893 Resolvase Proteins 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 2
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 235000021310 complex sugar Nutrition 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 2
- PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCN1C(=O)C=CC1=O PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[(2-iodoacetyl)amino]benzoate Chemical compound C1=CC(NC(=O)CI)=CC=C1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBGSRZSKGVSXRK-UHFFFAOYSA-N 1-[2-[5-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]acetyl]-3,6-dihydro-2H-pyridine-4-carboxylic acid Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1=NN=C(O1)CC(=O)N1CCC(=CC1)C(=O)O DBGSRZSKGVSXRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AWAFMFHOLVZLFG-UHFFFAOYSA-N 1-iodoaziridine-2,3-dione Chemical compound IN1C(=O)C1=O AWAFMFHOLVZLFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940031767 13-valent pneumococcal conjugate vaccine Drugs 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(N)=NN=O WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 206010001076 Acute sinusitis Diseases 0.000 description 1
- 102000019260 B-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010012919 B-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 1
- MTNGROIEEUCDSK-UHFFFAOYSA-N CC[IH]N1C(=O)C1=O Chemical compound CC[IH]N1C(=O)C1=O MTNGROIEEUCDSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101710082714 Exotoxin A Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 1
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 1
- 208000003217 Tetany Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000000184 acid digestion Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000004643 cyanate ester Substances 0.000 description 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- WBJINCZRORDGAQ-UHFFFAOYSA-N ethyl formate Chemical compound CCOC=O WBJINCZRORDGAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000556 factor analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000022760 infectious otitis media Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 108010033194 spasmin Proteins 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- ONSIBMFFLJKTPT-UHFFFAOYSA-L zinc;2,3,4,5,6-pentachlorobenzenethiolate Chemical compound [Zn+2].[S-]C1=C(Cl)C(Cl)=C(Cl)C(Cl)=C1Cl.[S-]C1=C(Cl)C(Cl)=C(Cl)C(Cl)=C1Cl ONSIBMFFLJKTPT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/145—Clostridium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus
Abstract
本出願は、テタノスパスミンタンパク質バリアントを提供し、前記テタノスパスミンタンパク質バリアントは、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントと、前記テタノスパスミンタンパク質の転座領域部分フラグメントを含む。本出願は、さらに、タンパク質－多糖複合体を提供し、前記タンパク質－多糖複合体は、肺炎連鎖球菌から由来する多糖と短縮されたテタノスパスミンタンパク質を含む。本出願は、さらに、免疫原性を向上する方法を提供し、当該方法が、肺炎連鎖球菌から由来する多糖と短縮されたテタノスパスミンタンパク質を含むタンパク質－多糖複合体を提供するステップを含む。
Description
本出願は、生物医薬品分野に関し、具体的に、プロテオグリカン複合体及びその用途に関する。前記プロテオグリカン複合体は、肺炎連鎖球菌から由来する多糖と短縮されたテタノスパスミンタンパク質を含む。前記プロテオグリカン複合体は、肺炎連鎖球菌莢膜多糖の免疫原性を向上することができる。
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、肺炎球菌）、以前は「Ｄｅｐｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ」として知られ、莢膜を持つグラム陽性双球菌であり、莢膜多糖の組成の差に応じて、それは９１以上の血清型に分けられ、その中でも、莢膜多糖は重要な病原因子である。肺炎球菌疾患は、世界中で深刻な公衆衛生問題の１つである。世界保健機関によると、２００５年には、世界で毎年１６０万人が肺炎球菌疾患で死亡し、その中には、７０万人～１００万の５歳未満の子供が含まれ、ほとんどは開発途上国に住んでいた。肺炎球菌が、子供たちの健康を深刻に危険にさらしていることがわかる。先進国では、肺炎球菌の疾患は、主に２歳未満の子供と高齢者、およびすべての年齢層の免疫不全者に発生する。
肺炎球菌多糖複合体ワクチンは、肺炎球菌多糖とキャリアタンパク質を結合させたもので、キャリアタンパク質は、肺炎球菌多糖の免疫原性を向上させる上で非常に重要な役割を果たしている。肺炎連鎖球菌ワクチンの国内外での数々の臨床研究では、予防効果が得られない場合に打ち切られることも珍しくない（Ｍａｒｉｌｌａ Ｇ Ｌｕｃｅｒｏら， Ｔｈｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ． ２８ （６）：４５５ ４６２， ＪＵＮ ２００９） （Ｊａｎ Ｐｏｏｌｍａｎら， Ｖａｃｃｉｎｅ． ２００９ Ｍａｙ ２１；２７（２４）：３２１３－２２）。したがって、より高い免疫原性を誘導できる肺炎連鎖球菌ワクチンを開発する緊急の必要性がある。
本出願は、破傷風菌タンパク質バリアントを提供し、前記破傷風菌タンパク質バリアントは、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントと、前記テタノスパスミンタンパク質の転座領域部分フラグメントを含み、前記タンパク質バリアントは、キャリアタンパク質として肺炎連鎖球菌多糖と結合し、かつ肺炎連鎖球菌多糖の免疫原性を向上する効果を持つ。本出願は、さらに、タンパク質－多糖複合体を提供し、前記タンパク質－多糖複合体は、肺炎連鎖球菌から由来する多糖と短縮されたテタノスパスミンタンパク質を含み、前記多糖は、著しくより良い免疫原性を持つ。本出願は、さらに、免疫原性を向上することができる方法を提供し、前記方法は、肺炎連鎖球菌から由来する多糖と短縮されたテタノスパスミンタンパク質を含むタンパク質－多糖複合体を提供するステップを含み、前記方法は、肺炎連鎖球菌の免疫原性を向上することができる。
一方、本出願は、テタノスパスミンタンパク質バリアントを提供し、それが、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントと、前記テタノスパスミンタンパク質の転座領域部分フラグメントを含む。
ある実施形態において、前記転座領域部分フラグメントは、前記テタノスパスミンタンパク質の転座領域のＴ細胞エピトープＰ２を含む。
ある実施形態において、前記転座領域部分フラグメントは、前記テタノスパスミンタンパク質の８２９－８６４位のアミノ酸を含む。
ある実施形態において、前記転座領域部分フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７－８のいずれか一つに示されたアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されたアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記のテタノスパスミンタンパク質バリアントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－２のいずれか一つに示されたアミノ酸配列を含む。
他方、本出願は、タンパク質－多糖複合体を提供し、それが、肺炎連鎖球菌から由来する多糖と短縮されたテタノスパスミンタンパク質（ＴＴＤ）を含む。
ある実施形態において、前記多糖は、肺炎連鎖球菌莢膜多糖に由来する。
ある実施形態において、前記多糖は、一種以上の肺炎連鎖球菌血清型を有する。
ある実施形態において、前記多糖は、以下の組から選べられるいずれか一つの肺炎連鎖球菌血清型である：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆと３３Ｆ。
ある実施形態において、前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントを含む。
ある実施形態において、前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントを含み、ただし、前記多糖は、以下の組から選べられるいずれか一つの肺炎連鎖球菌血清型である：１、３、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１０Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１９Ａ、１９Ｆと３３Ｆ。
ある実施形態において、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されたアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントと前記テタノスパスミンタンパク質の転座領域部分フラグメントを含む。
ある実施形態において、前記転座領域部分フラグメントは、前記テタノスパスミンタンパク質の転座領域の広域スペクトラムＴ細胞エピトープＰ２を含む。
ある実施形態において、前記転座領域部分フラグメントは、前記テタノスパスミンタンパク質の８２９－８６４位のアミノ酸を含む。
ある実施形態において、前記転座領域部分フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７－８のいずれか一つに示されたアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－３のいずれか一つに示されたアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記多糖と前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、１型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、３型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、５型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、６Ａ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、６Ｂ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、７Ｆ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、１０Ａ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、１２Ｆ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、１５Ｂ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、１９Ａ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、１９Ｆ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、３３Ｆ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、前記のタンパク質－多糖複合体には、カップリングの方法で、前記多糖と前記タンパク質バリアントとを結合しても良い。
ある実施形態において、前記カップリングの方法は、以下のいずれか一つ方法を含む：臭化水素法、ＣＤＡＰ法、還元アミン法。
他方、本出願は、免疫原性を向上する方法を提供し、それが、肺炎連鎖球菌から由来する多糖と短縮されたテタノスパスミンタンパク質を含むタンパク質－多糖複合体を提供するステップを含む。
ある実施形態において、前記多糖は、肺炎連鎖球菌莢膜多糖に由来する。
ある実施形態において、前記多糖は、一種以上の肺炎連鎖球菌血清型を有する。
ある実施形態において、前記多糖は、以下の組から選べられるいずれか一つの肺炎連鎖球菌血清型である：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆと３３Ｆ。
ある実施形態において、前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントを含む。
ある実施形態において、前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントを含み、ただし、前記多糖は、以下の組から選べられるいずれか一つの肺炎連鎖球菌血清型である：１、３、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１０Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１９Ａ、１９Ｆと３３Ｆ。
ある実施形態において、前記破傷風菌タンパク質のＣフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されたアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントとテタノスパスミンタンパク質の転座領域部分フラグメントを含む。
ある実施形態において、前記転座領域部分フラグメントは、前記テタノスパスミンタンパク質の転座領域の広域スペクトラムＴ細胞エピトープＰ２を含む。
ある実施形態において、前記のテタノスパスミンタンパク質の転座領域部分フラグメントは、前記テタノスパスミンタンパク質の８２９－８６４位のアミノ酸を含む。
ある実施形態において、前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－３のいずれか一つに示されたアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、前記肺炎連鎖球菌多糖と前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、１型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、３型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、５型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、６Ａ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、６Ｂ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、７Ｆ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、１０Ａ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、１２Ｆ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、１５Ｂ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、１９Ａ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、１９Ｆ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、３３Ｆ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である。
ある実施形態において、前記方法は、カップリングの方法で、前記多糖と前記タンパク質バリアントとを結合することを含む。
ある実施形態において、前記カップリングの方法は、以下のいずれか一つ方法を含む：臭化水素法、ＣＤＡＰ法、還元アミン法。
ある実施形態において、前記細菌多糖の免疫原性の向上は、多糖ＣＲＭ１９７複合体と比較し、前記タンパク質－多糖複合体は、より高い免疫原性を有することを含む。
ある実施形態において、前記より高い免疫原性は、動物の免疫実験に検出された。
ある実施形態において、前記動物免疫試験は、以下ステップを含む：前記のタンパク質－多糖複合体とアジュバントとを配合し、免疫抗原を調製する。
ある実施形態において、前記の免疫抗原の注射方法は、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内注射、および／または静脈内注射を含む。
ある実施形態において、前記動物免疫試験は、以下ステップを含む：得られる免疫動物の血清中の抗体を、ＥＬＩＳＡで検出する。
ある実施形態において、前記動物免疫試験は、以下ステップを含む：得られる免疫動物の血清に対して、オプソニン食作用試験を行う。
ある実施形態において、前記動物は、マウス、ラット及び／又はウサギを含む。
ある実施形態において、前記アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、および／またはフロイントアジュバントなどを含む。
他方、本出願は、核酸分子を提供し、それが、前記のテタノスパスミンタンパク質バリアントをコードする配列を含む。
ある実施形態において、前記の核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４－６に示されたヌクレオチド配列を含む。
他方、本出願は、ベクターを提供し、それが、前記の核酸分子を含む。
他方、本出願は、さらに、細胞を提供し、それが、前記の核酸分子または前記のベクターを含む。
他方、本出願は、さらに、キャリアタンパク質を提供し、それが、前記のテタノスパスミンタンパク質バリアントを含む。
他方、本出願は、薬物組成物を提供し、それが、前記のタンパク質－多糖複合体と、任意的な薬学に許容されるアジュバントを含む。
他方、本出願は、さらに、薬物の調製における前記テタノスパスミンタンパク質バリアントの用途を提供する。
他方、本出願は、さらに、薬物の調製における前記多糖複合体の用途を提供する。
ある実施形態において、前記薬物は、肺炎連鎖球菌性疾患を予防及び／又は治療することに用いられる。
ある実施形態において、前記肺炎連鎖球菌性疾患は、肺炎、敗血症、髄膜炎及び／又は中耳炎を含む。
他方、本出願は、ワクチンを提供し、それが、前記のタンパク質－多糖複合体、前記の薬物組成物及び／又は任意的な薬学に許容されるアジュバントを含む。
他方、本出願は、さらに、肺炎連鎖球菌性疾患を予防する方法を提供し、それが、必要が有る被験者に、前記タンパク質－多糖複合体、前記核酸分子、前記ベクター、前記細胞、前記キャリアタンパク質、
前記薬物組成物及び／又は前記ワクチンを投与することを含む。
ある実施形態において、前記肺炎連鎖球菌性疾患は、肺炎、敗血症、髄膜炎及び／又は中耳炎を含む。
他方、本出願は、さらに、抗体の調製における前記多糖複合体の抗原としての用途を提供する。
ある実施形態において、前記抗体は、分離された菌株の診断的タイピングに用いられる。
他方、本出願は、さらに、キットを提供し、それが、前記多糖複合体を含む。
ある実施形態において、前記キットは、分離された菌株の診断的タイピングに用いられる。
本出願が関する本発明の特定の特徴は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本出願が関する本発明の特徴および利点は、以下に詳細に説明する例示的な実施形態および添付の図面を参照して、よりよく理解することができる。図面を、以下の通り簡単に説明する：
本願発明の実施形態は、以下の特定の具体的な実施例で説明されるが、当業者は、本明細書に開示された内容から、本願発明の他の利点および効果を容易に理解することができる。
［用語の定義］
本出願において、「破傷風菌」という用語は、「ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ」としても知られ、一般に、感染症および中毒性疾患を引き起こすことができる細菌を指す。それが、毒素タンパク質を合成することにより、感染者の神経系に影響を与える。破傷風菌が産生する毒素タンパク質は、「テタノスパスミンタンパク質」、「破傷風菌トキソイド」または「破傷風痙攣毒素」と呼ぶことができる。前記テタノスパスミンタンパク質は、Ａ、ＢとＣの三つのフラグメントを含んてもよく、各フラグメントの分子量は、約５０ ｋＤａである。例えば、Ａフラグメントは、エンドペプチダーゼ活性をもつ触媒領域であっても良い。例えば、Ｂフラグメントは、転座ドメインであっても良い。例えば、Ｃフラグメントは、受体結合能をもつドメインであっても良い（Ａｎａ Ｃ． Ｃａｌｖｏ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｓｃｉ． ２０１２， １３， ６８８３－６９０１； ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ１３０６６８８３）。例えば、Ｂフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７中に示されたアミノ酸配列を含んでも良い。例えば、Ｂフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８中に示されたアミノ酸配列を含んでも良い。例えば、Ｃフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３中に示されたアミノ酸配列を含んでも良い。本出願において、用語「テタノスパスミンタンパク質転座領域」は、前記テタノスパスミンタンパク質のＢフラグメントを指しても良い。本出願において、用語「テタノスパスミンタンパク質Ｃフラグメント」は、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントを指しても良い。
本出願において、「破傷風菌」という用語は、「ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ」としても知られ、一般に、感染症および中毒性疾患を引き起こすことができる細菌を指す。それが、毒素タンパク質を合成することにより、感染者の神経系に影響を与える。破傷風菌が産生する毒素タンパク質は、「テタノスパスミンタンパク質」、「破傷風菌トキソイド」または「破傷風痙攣毒素」と呼ぶことができる。前記テタノスパスミンタンパク質は、Ａ、ＢとＣの三つのフラグメントを含んてもよく、各フラグメントの分子量は、約５０ ｋＤａである。例えば、Ａフラグメントは、エンドペプチダーゼ活性をもつ触媒領域であっても良い。例えば、Ｂフラグメントは、転座ドメインであっても良い。例えば、Ｃフラグメントは、受体結合能をもつドメインであっても良い（Ａｎａ Ｃ． Ｃａｌｖｏ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｓｃｉ． ２０１２， １３， ６８８３－６９０１； ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ１３０６６８８３）。例えば、Ｂフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７中に示されたアミノ酸配列を含んでも良い。例えば、Ｂフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８中に示されたアミノ酸配列を含んでも良い。例えば、Ｃフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３中に示されたアミノ酸配列を含んでも良い。本出願において、用語「テタノスパスミンタンパク質転座領域」は、前記テタノスパスミンタンパク質のＢフラグメントを指しても良い。本出願において、用語「テタノスパスミンタンパク質Ｃフラグメント」は、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントを指しても良い。
本出願において、用語「タンパク質バリアント」、「バリアント」は、一般に、天然の生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドに対して、配列相同性を有する化合物を指す。本出願に記載のタンパク質バリアントは、親配列の少なくとも１つの生物学的活性を保持しながら、１つまたは複数のアミノ酸残基の付加（挿入を含む）、欠失、修飾および／または置換によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質を含んでも良い。例えば、バリアントは、親タンパク質に対して、少なくとも約０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する。バリアントは、天然または非天然に存在する可能性がある。非天然に存在する変異体は、当技術分野で既知される技術を使用して生成することができる。タンパク質バリアントは、保存的又は非保存的なアミノ酸の置換、削除又は付加を含んでも良い。本出願において、前記「テタノスパスミンタンパク質バリアント」は、前記テタノスパスミンタンパク質の部分アミノ酸配列欠失のタンパク質を指しても良い。
本出願において、用語「短縮された」ものは、一般的に、全体に満たないあらゆるものを指す。本出願において、前記「短縮されたテタノスパスミンタンパク質（ＴＴＤ）」は、そのアミノ酸配列はが、テタノスパスミンタンパク質の全配列より少ない化合物を指しても良い。例えば、短縮されたものは、親タンパク質より、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％少ないアミノ酸配列を有する。短縮されたものは、天然または非天然に存在する可能性がある。非天然に存在する短縮されたものは、当技術分野で既知される技術を使用して生成することができる。
本出願において、用語「Ｔ細胞エピトープ’は、一般的に、Ｔリンパ球に認識され得るポリペプチド又はタンパク質フラグメントを指す。前記「Ｔ細胞エピトープＰ２」は、一般的に、Ｔ細胞に認識され得るテタノスパスミンタンパク質のポリペプチドを指し、それがｐ２、ｐ４及び／又はｐ３０を含んでも良い。例えば、ｐ２は、全てのＭＨＣ（組織適合複合体分子）を認識できるＤＲ分子を有しても良い。前記Ｔ細胞エピトープｐ２は、テタノスパスミンタンパク質８３０－８４４位のアミノ酸配列を含んでも良い。例えば、ｐ３０は、多数の異なるＭＨＣ ＩＩに結合でき、Ｔ細胞に認識され得、免疫原性を有するという特性を示す。前記Ｔ細胞エピトープｐ３０は、テタノスパスミンタンパク質９４７－９６７位のアミノ酸配列を含んでも良い。前記Ｔ細胞エピトープｐ４は、テタノスパスミンタンパク質１２７３－１２８４位のアミノ酸配列を含んでも良い。本出願において、例えば、タンパク質バリアントは、前記「Ｔ細胞エピトープｐ２」領域を含んでも良い。
本出願において、用語「肺炎連鎖球菌莢膜多糖」、「肺炎連鎖球菌多糖」と「肺炎球菌多糖」は、交換可能に使用され、一般的に肺炎連鎖球菌の表面にあるゆるい粘液物質を指す。肺炎連鎖球菌多糖は、主に、Ｔ細胞とは無関係に体の免疫応答を誘導する。本出願において、前記免疫応答は、体が抗原によって刺激された後、免疫細胞が抗原分子を認識、活性化、増殖および分化し、免疫物質を産生して特定の免疫効果を生じるプロセスを含んでも良い。前記免疫応答は、抗原提示、リンパ球の活性化、免疫分子の形成、および免疫効果の生成などの一連の生理学的反応を含んでも良い。肺炎連鎖球菌は、莢膜多糖の抗原性に応じて、異なる血清型に分けることができる。ある場合には、莢膜多糖抗原に応じて、肺炎連鎖球菌は、９１種類の血清型を含んでも良い。肺炎連鎖球菌の主な病原性血清型には、次の２４種類がある：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆと３３Ｆ。
ある場合には、肺炎連鎖球菌の莢膜多糖は、最大８個の糖残基を含み得る繰り返すオリゴ糖単位を含んでも良い。ある場合には、莢膜多糖は、全長の多糖であっても良い。ある場合には、莢膜多糖は、１つのオリゴ糖単位または天然の長さよりも短い繰り返すオリゴ糖単位の糖鎖であっても良い。
本出願において、用語「肺炎連鎖球菌性疾患」とは、肺炎連鎖球菌による体の感染によって引き起こされる疾患を指し、小児肺炎、髄膜炎、菌血症、急性中耳炎・副鼻腔炎などを含むが、これらに限定されない。
本出願において、用語「キャリアタンパク質」は、一般的に、微生物由来の糖類または多糖と結合して、微生物由来の糖類または多糖を被験者の体内に運び、免疫応答を引き起こすことができるタンパク質、タンパク質相同体またはポリペプチドを指す。キャリアタンパク質への糖の結合は、糖を胸腺非依存性抗原（ｔｈｙｍｕｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ）から胸腺依存性抗原（ｔｈｙｍｕｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ）に変換し、それによって免疫記憶を誘発するため、糖の免疫原性を高める。胸腺依存性抗原は、Ｔ細胞依存性抗原とも言う；胸腺非依存性抗原は、Ｔ細胞非依存性抗原ともいう。子供、高齢者、および免疫不全の人にとって、Ｔ細胞依存性抗原は効果的な免疫応答を生成し、免疫効果をより適切に維持できる抗体を産生することができる。本出願において、用語「タンパク質－多糖複合体」は、前記キャリアタンパク質と細菌由来の糖又は多糖とを結合してなる単一構造の物質である。
本出願において、用語「カップリング」は、単一の構造を形成するために二つの部分の物質を共有結合または非共有結合によって結合させることを指し、ただし、第一の部分は抗原、特に多糖であり、第二の部分は免疫原性キャリア、特にキャリアタンパク質である。前記結合は、分子間の共有化学結合を介して、またはアジピン酸ジヒドラジドのような連結基を使用して達成することができる。
本出願において、用語「免疫原性」は、一般に、免疫応答を誘発することができる特性を指し、細胞の活性化、増殖、分化を刺激し、免疫エフェクター抗体を産生し、リンパ球を感作できるという特性を含むが、これらに限定されない。本出願において、より高い免疫原性は、被験者が免疫化された後の被験者の血清におけるより高い抗体価、より血清型特異的な抗体およびより高い殺菌効率を含むが、これらに限定されない。
本出願において、「多糖とタンパク質との質量比」は、通常に、複合体中のタンパク質のグリコシル化修飾の程度を量るために使用し、異なる質量比が、複合体の免疫原性に影響を与え、遊離多糖と遊離タンパク質の両方が結合反応の基質であり、複合体中の遊離莢膜多糖は、複合体の免疫応答を低下させ、過剰な遊離タンパク質は、免疫反応を抑制する効果もある。ある場合には、複合体の分子サイズの分布は、製品の免疫原性に直接関係し、コンジュゲートのプロセスと複合体の安定性を量る重要な指標でもある。
本出願において、用語「ベクター」は、一般的に、クローニングされた１つまたは複数の核酸分子の転写および翻訳に必要な調節配列を含み、かつ、それによって核酸分子の転写およびクローニングを可能にするベクターを指す。ベクターは、核酸分子に作動可能に連結された１つまたは複数の調節配列を含んでも良く、この調節配列は、使用される宿主細胞のタイプに従って選択されても良い。調節配列は、プロモーター、エンハンサーと他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化（ｐｏｌｙ（Ａ）＋）配列）を含む。他のベクター成分は、信号配列、複製開始点、１つまたは複数の選択遺伝子、および転写終了配列の１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。
本出願において、用語「薬物組成物」は、一般に、必要が有る被験者への投与に適した組成物を指す。例えば、本出願に記載の薬物組成物は、本明細書に記載のタンパク質多糖複合体及び薬学的に許容される担体を含んでも良い。
本出願において、用語「ワクチン」は、被験者の特定の病原体または疾患に対する治療程度の免疫性に効果的に誘導する活性成分を含む試薬または組成物を指す。本出願において、前記ワクチンは、細菌多糖とキャリアタンパク質を含んでも良い。本出願において、前記ワクチンは、さらに、他の免疫原活性成分を含んでも良い。本出願において、前記細菌多糖とタンパク質との複合体は、多成分ワクチン中の活性成分としてもよい。本出願において、前記「ワクチン」は、さらに医薬組成物を含んでも良く、且つそして、通常に、医薬学的に許容される希釈剤、担持剤又は賦形剤を含んでも良い。これは、他の活性成分を含むか、含まないことがある。ある場合には、免疫反応（例えば抗細菌多糖の他のタンパク質及び／又は抗他感染物）を誘導する他の成分をさらに含む組合せワクチンであってもよい。
本出願において、用語「ＥＬＩＳＡ」は、通常に、酵素結合免疫吸着アッセイを指す。これは、免疫検査のための様々なプロトコルを含んでも良い。例えば、ＥＬＩＳＡ方法は、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ブリッジＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＡ直接法、ＥＬＩＳＡ間接法などを含んでも良い。ある場合には、ＥＬＩＳＡ免疫測定は手動測定でもよいし、自動方式で実施してもよい。例えば、本出願において、肺炎連鎖球菌多糖免疫原性をＥＬＩＳＡ法で評価しても良い。
本出願において、用語「オプソニン食作用試験」は、「ＯＰＡ」ともいい、通常に、抗体、補体を介して細菌などの粒子性抗原に対する食細胞の食作用を促進する試験を指す。前記抗体は、抗原免疫を介して被験者から産生された抗体を含む。前記抗体は、血清由来のものを含む。前記食細胞は、食細胞または分化能を有する細胞（例えばＨＬ（Ｈｅｌａ細胞）－６０）から分化された食細胞を含む。前記細菌は、肺炎連鎖球菌を含む。
本出願において、用語「被験者」又は「個体」又は「動物」又は「患者」は、本出願の薬物組成物を投与する必要が有る被験者、例えば哺乳動物被験者を指すことに交換可能に使用される。動物被験者は、ヒト、非ヒト霊長類、犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、黄牛、乳牛など、例えばマウス、例えばラット、例えばウサギを含む。ただし、ウサギは、ラビットであってもよく、例えばニュージーランドホワイトラビットであってもよい。
本出願において、用語「相同性」は、通常に、比較されるアミノ酸配列と比較されるヌクレオチド配列に対して、一定の相同性を有するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を指す。用語「相同性」は、配列の「同一性」と同等であってもよい。相同配列は、主題配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％同一のアミノ酸配列を含んでも良い。一般に、ホモログは、主題アミノ酸配列と同じ活性部位などを含む。相同性は、類似性（すなわち、類似の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）に基づいて考慮することができ、又は、配列同一性の点で相同性を発現することもできる。本出願において、言及されたアミノ酸配列またはヌクレオチド配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯのいずれか１つの同一性パーセントを有する配列は、言及されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯの全長にわたって前記同一性パーセントを有する配列を指す。
配列同一性を決定するために、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＮＥＥＤＬＥ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどを使用するなど、当業者に理解されるさまざまな方法で配列のアラインメントを行うことができる。当業者は、アラインメントされる全長配列において最適なアラインメントを実現するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。
本出願において、用語「および／または」は、オプションのいずれかまたはオプションの２つを意味すると理解されるべきである。
本出願において、用語「含む」または「包含する」は、通常は明示的に指定された特徴を含むことを意味するが、他の要素は除外されない。
本出願において、用語「約」は、通常、指定された値以上または以下の０．５～１０％の範囲内で変動することを意味し、例えば、指定された値以上または以下の０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％または１０％の範囲内で変動する。
［具体的な実施形態］
タンパク質バリアント
一つは、本出願は、テタノスパスミンタンパク質（ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ）バリアント（Ｔｅｔａｎｕｓ Ｔｏｘｉｎ Ｄｏｍａｉｎ、ＴＴＤ）を提供し、野生型テタノスパスミンタンパク質（ＮＢＣＩ登録番号ＷＰ０１１１００８３６）のアミノ酸配列と比較すると、前記テタノスパスミンタンパク質バリアントが、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントと前記テタノスパスミンタンパク質の転座領域部分フラグメントを含む。
タンパク質バリアント
一つは、本出願は、テタノスパスミンタンパク質（ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ）バリアント（Ｔｅｔａｎｕｓ Ｔｏｘｉｎ Ｄｏｍａｉｎ、ＴＴＤ）を提供し、野生型テタノスパスミンタンパク質（ＮＢＣＩ登録番号ＷＰ０１１１００８３６）のアミノ酸配列と比較すると、前記テタノスパスミンタンパク質バリアントが、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントと前記テタノスパスミンタンパク質の転座領域部分フラグメントを含む。
ある場合には、前記破傷風菌タンパク質バリアントは、遺伝子工学組換えタンパク質技術によって、テタノスパスミンタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列を除去し、Ｎ末端部分のアミノ酸配列を含まない新のタンパク質フラグメントを得る。テタノスパスミンタンパク質Ｎ末端のＡフラグメントは、神経伝達物質の放出を抑制することによって毒性作用を発揮することができるので、本出願では、毒性のあるＮフラグメントは当技術分野でよく用いられる技術によって除去された。
ある場合には、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されたアミノ酸配列を含む。ある場合には、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されたアミノ酸配列と少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでも良い。
ある場合には、前記のテタノスパスミンタンパク質転座領域部分フラグメントは、前記テタノスパスミンタンパク質の転座領域のＴ細胞エピトープＰ２を含む。
ある場合には、前記のテタノスパスミンタンパク質の転座領域部分フラグメントは、前記テタノスパスミンタンパク質の８２９－８６４位のアミノ酸を含む。
ある場合には、前記テタノスパスミンタンパク質転座領域部分フラグメントは、前記テタノスパスミンタンパク質転座領域の１－３６個のアミノ酸、例えば：１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、２０個のアミノ酸、２１個のアミノ酸、２２個のアミノ酸、２３個のアミノ酸、２４個のアミノ酸、２５個のアミノ酸、２６個のアミノ酸、２７個のアミノ酸、２８個のアミノ酸、２９個のアミノ酸、３０個のアミノ酸、３１個のアミノ酸、３２個のアミノ酸、３３個のアミノ酸、３４個のアミノ酸、３５個のアミノ酸又は３６個のアミノ酸を含んでも良い。
ある場合には、前記８２９－８６４位のアミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されたアミノ酸配列の１－３６位のアミノ酸残基である。
ある場合には、例えば、前記テタノスパスミンタンパク質転座領域部分フラグメントは、前記テタノスパスミンタンパク質の：８３０－８６４位のアミノ酸、８３１－８６４位のアミノ酸、８３２－８６４位のアミノ酸、８３３－８６４位のアミノ酸、８３４－８６４位のアミノ酸、８３５－８６４位のアミノ酸、８３６－８６４位のアミノ酸、８３７－８６４位のアミノ酸、８３８－８６４位のアミノ酸、８３９－８６４位のアミノ酸、８４０－８６４位のアミノ酸、８４１－８６４位のアミノ酸、８４２－８６４位のアミノ酸、８４３－８６４位のアミノ酸、８４４－８６４位のアミノ酸、８４５－８６４位のアミノ酸、８４６－８６４位のアミノ酸、８４７－８６４位のアミノ酸、８４８－８６４位のアミノ酸、８４９－８６４位のアミノ酸、８５０－８６４位のアミノ酸、８５１－８６４位のアミノ酸、８５２－８６４位のアミノ酸、８５３－８６４位のアミノ酸、８５４－８６４位のアミノ酸、８５５－８６４位のアミノ酸、８５６－８６４位のアミノ酸、８５７－８６４位のアミノ酸、８５８－８６４位のアミノ酸、８５９－８６４位のアミノ酸、８６０－８６４位のアミノ酸、８６２－８６４位のアミノ酸又は８６３－８６４位のアミノ酸を含む。
ある場合には、前記テタノスパスミンタンパク質の転座領域部分フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されたアミノ酸配列を含んでも良い。
ある場合には、前記テタノスパスミンタンパク質の転座領域部分フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されたアミノ酸配列を含んでも良い。
ある場合には、前記のテタノスパスミンタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－３に示されたアミノ酸配列と少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでも良い。
ある場合には、前記タンパク質バリアントは、前記破傷風菌Ｃフラグメントの少なくとも約７０％（例えば約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％）の部分と、前記転座領域フラグメントの少なくとも約７０％（例えば約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％）の部分を含んでも良い。
ある場合には、前記タンパク質バリアントは、前記破傷風菌Ｃフラグメントの少なくとも約７０％（例えば約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％）の部分と、前記転座領域フラグメントの少なくとも約７０％（例えば約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％）の部分を含んでも良い。
ある場合には、前記のタンパク質バリアントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－２のいずれか一つに示されたアミノ酸配列を含む。ある場合には、前記のタンパク質バリアントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－２に示されたアミノ酸配列と少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでも良い。
ある場合には、前記タンパク質バリアントアミノ酸配列は、分子のキャリア能力に悪影響を与えることなくバリアントを生成するために種々の添加、削除、置換を行うことができる。例えば、保存的および半保存的アミノ酸置換を行うことができる。例示的な保存的アミノ酸置換には、以下の変換が含まれるが、これらに限定されない：アラニンからセリンに変換する；アルギニンからリジンに変換する；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンに変換する；システインからセリンに変換する、グルタミンからアスパラギンに変換する、グルタミン酸からアスパラギンに変換する；グリシンからプロリンに変換する；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンに変換する；イソロイシンからロイシン又はバリンに変換する；ロイシンからバリンまたはイソロイシンに変換する；リジンからアルギニン、グルタミンまたはグルタミン酸に変換する；メチオニンからロイシンまたはイソロイシンに変換する；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニンに変換する；セリンからトレオニンに変換する；トレオニンからセリンに変換する；チロシンからチロシンに変換する；チロシンからロイシン又はフェニルアラニンに変換する；バリンからイソロイシンまたはロイシンに変換する。タンパク質工学分野の一般的な当業者が理解するように、本明細書に記載された保存的および半保存的突然変異は、ＴＴＤのキャリア機能に影響を与えない。例えば、様々な目的の突然変異のための適切な領域（例えば、タンパク質の精製を容易にするためにポリペプチド「ラベル」を添加する）は、Ｃ末端領域とＮ末端領域を含む。
他方、本出願は、核酸分子を提供し、それが、前記のテタノスパスミンタンパク質バリアントをコードする配列を含む。ある場合には、前記のＴＴＤをコードする核酸配列は、野生型のＴＴＤの核酸配列、配列フラグメント、相補配列及び／又はそのホモログを含む。ある場合には、前記のＴＴＤをコードする核酸配列は、野生型ＴＴＤ核酸配列の突然変異、切断、置換突然変異または転位を含む。
ある場合には、前記ＴＴＤタンパク質発現の核酸コード配列は、コドン最適化によって得られる。例えば、前記ＴＴＤタンパク質の核酸コード配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４－６のいずれか一つに示された。例えば、前記のコドン最適化されたＴＴＤヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４－６のいずれか一つに示されたヌクレオチド配列と少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでも良い。ある場合には、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントの核酸コード配列は、コドン最適化によって得られる。例えば、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントの核酸コード配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示された。例えば、前記のコドン最適化されたテタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示されたヌクレオチド配列と少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでも良い。前記のコドン最適化は、前記ＴＴＤのタンパク質の発現量を向上することができる。例えば、前記コドン最適化後、前記ＴＴＤタンパク質発現の核酸配列を細胞に導入した後に、タンパク質の発現量、配列の完全性、配列の正確性及び／又は増幅が、少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は以上）向上する。
ある場合には、前記ＴＴＤタンパク質は、前記Ｔ細胞エピトープｐ２を含んでも良い。ある場合には、前記Ｔ細胞エピトープｐ２は、テタノスパスミンタンパク質の８３０位～８４４位のアミノ酸を含んでも良い。ある場合には、前記ＴＴＤタンパク質は、前記Ｔ細胞エピトープｐ２のアミノ酸配列と少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでも良い。
ある場合には、前記ＴＴＤタンパク質を、その発現配列をタンパク質発現ベクターにクローニングすること、高い産量でタンパク質発現を達成する。ある場合には、前記タンパク質発現ベクターの宿主は、当分野に良く用いられる発現システム、例えば、大腸菌発現システム、ピキア酵母発現システム、または枯草バチルス発現システム、昆虫細胞発現システム、植物細胞発現システム、および／または哺乳動物発現システムであっても良い。例えば、前記タンパク質発現システムは、大腸菌発現システムを含んでも良い。
他方、本出願は、ベクターを提供し、それが、前記の核酸分子を含む。ある場合には、前記ベクターは、前記核酸分子、複製開始部位、選択マーカー遺伝子、マルチクローニングサイト、エンハンサー、プロモーター及びエンドターを含んでも良い。発現ベクターには、色々なタイプがあり、いずれか好適な発現ベクターを使用しても良い。通常に、プラスミド発現ベクターや、ｃｏｓｍｉｄベクターや、ウイルスベクターを使用する。ある場合には、前記ベクターは、原核発現ベクターと真核発現ベクターを含んでも良く、例えば大腸菌発現システムのｐＥＴ３００、ｐＥＴ３０２、ｐＢＡＤベクター；ファージＤＮＡの誘導体、例えばＭ １３や他の糸状単鎖ＤＮＡファージ；ピロリ酵母発現システムのｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３Ｋ、ｐＰＩＣＺ；枯草バチルス発現システムのｐＧＰＳＴ、ｐＥＢ１０、ｐＥＢ２０、ｐＵＢ１８；哺乳動物発現システムのＳＶ４０、アデノウイルス、レトロウイルスから誘導するＤＮＡ配列の公知される誘導体と、機能性哺乳類ベクター（例えば上述のもの）の組み合わせから誘導されるシャトルベクター、及び機能性プラスミドとファージＤＮＡである。ある場合には、前記ベクターは、ｐＧＥＸ－４Ｔ、ｐＥＴ２１を含んでも良い。
他方、本出願は、前記核酸分子及び／又は前記ベクターを含む細胞を提供する。ある場合には、前記核酸分子は、コドン最適化されたＴＴＤのヌクレオチド配列を含んでも良い。本出願に記載の細胞は、正確な前記ＴＴＤタンパク質を発現することができる。前記細胞は、真核生物と原核生物から由来しても良く、例えば、醸造酵母、ビヒクル酵母、大腸菌、枯草バチルス、ｓｆ９、植物細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などである。本出願において、前記細胞は、大腸菌細胞を含んでも良い。
他方、本出願は、キャリアタンパク質を提供し、それが、前記破傷風菌タンパク質バリアント及び前記タンパク質バリアントの誘導体、ホモログ、類似物を含む。ある場合には、前記破傷風菌タンパク質バリアントは、細菌から由来する多糖又はそれに誘導されるオリゴ糖と結合しても良い。ある場合には、前記細菌多糖は、肺炎連鎖球菌多糖、トラバクテリウム内多糖、炭疽菌多糖、インフルエンザ好血桿菌多糖、チフスサルモネラ菌多糖、サルモネラ菌種多糖、志賀菌多糖を含むが、これらに限定されない。
タンパク質多糖複合物及び調製方法
他方、本出願は、タンパク質－多糖複合体を提供し、前記タンパク質－多糖複合体は、前記肺炎連鎖球菌から由来する多糖と前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質とを含んでも良い。多くの多糖は、胸腺依存の免疫応答反応を誘導できず、２歳未満の子供や高齢者は免疫能力を得ることができないため、タンパク質キャリアと化学結合することで多糖に胸腺依存性特性を持たせる必要があり、これにより、比較的強い免疫原性を誘導でき、抗多糖と抗タンパク質の抗体を同時に誘導することができる。
他方、本出願は、タンパク質－多糖複合体を提供し、前記タンパク質－多糖複合体は、前記肺炎連鎖球菌から由来する多糖と前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質とを含んでも良い。多くの多糖は、胸腺依存の免疫応答反応を誘導できず、２歳未満の子供や高齢者は免疫能力を得ることができないため、タンパク質キャリアと化学結合することで多糖に胸腺依存性特性を持たせる必要があり、これにより、比較的強い免疫原性を誘導でき、抗多糖と抗タンパク質の抗体を同時に誘導することができる。
ある場合には、前記「肺炎連鎖球菌から由来する多糖」は、肺炎連鎖球菌莢膜から由来する多糖と、多糖に誘導されるオリゴ糖を含んでも良い。前記肺炎連鎖球菌は、天然から由来する肺炎連鎖球菌であっても良く、人為的に改造された肺炎連鎖球菌であっても良い。莢膜多糖の抗原性によって、肺炎連鎖球菌は、９１種類の血清型を含んでも良いが、肺炎球菌の主な病原性の血清型は、以下の２４種類を含むことができ、それぞれは、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆと３３Ｆである。ある場合には、前記のタンパク質－多糖複合体の多糖は、一種類以上、例えば、少なくとも１種類、少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも９種類、少なくとも１２種類、少なくとも１５種類又は少なくとも２４種類の肺炎連鎖球菌血清型を有する。
ある場合には、前記のタンパク質－多糖複合体の多糖は、以下のいずれか一つの肺炎連鎖球菌の血清型から選べられても良い：１、３、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１０Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１９Ａ、１９Ｆと３３Ｆ。
本出願において、前記の肺炎連鎖球菌莢膜から由来する糖は、莢膜多糖から誘導されるオリゴ糖を含んでも良い。前記「多糖」は、通常に、少なくとも１０個の単糖からなる重合糖高分子炭水化物を指す。前記「オリゴ糖」は、少なくとも２個の糖残基を含有する。肺炎連鎖球菌の莢膜多糖は、８個までの糖残基の繰り返すオリゴ糖単位を含んでも良い。ある場合には、抗原とする莢膜糖は、全長の多糖であっても良く、一つのオリゴ糖単位や、繰り返すオリゴ糖単位の天然長さの糖鎖より短い単位であっても良い。ある場合には、前記タンパク質－多糖複合体に存在する全ての糖は、多糖である。
ある場合には、前記多糖及び／又はオリゴ糖は、天然に存在する多糖及び／又はオリゴ糖ではなくても良く、これは、当技術分野で知られている任意の技術によって合成されてもよく、天然に存在する化合物から誘導されてもよく、またはそれを修飾して得られてもよい。例えば、全長多糖は、「サイズ調整」されてもよく、例えば、酸分解処理、過酸化物処理、その後過酸化物処理によりオリゴ糖断片を生成することにより、そのサイズを調整するなど、様々な方法によりサイズを縮小することができる。例えば、多糖及び／又はオリゴ糖に対する修飾は、精製、カルボキシル化、スルホン化、硫酸化、解重合及び／又は脱アセチル基を含んでも良い。
ある場合には、多糖及び／又はオリゴ糖に対する修飾は、それらが活性化される前に行われても良いが、後処理のステップを採用しても良い。
ある場合には、修飾された多糖又はオリゴ糖は、野生型に比べて、抗原性を高めることができる。
ある場合には、本出願に記載の多糖及び／又はオリゴ糖は、前記肺炎連鎖球菌の抗原結合フラグメントから由来しても良い。
ある場合には、本出願に記載の多糖及び／又はオリゴ糖は、異なるタイプ及び／又は菌株から由来する多糖及び／又はオリゴ糖のフラグメントによって、合成の手法で連結し、複数のエピトープを含む多糖及び／又はオリゴ糖を形成する。
ある場合には、肺炎連鎖球菌多糖は、当分野に既知の技術で調製されても良い。例えば、調製された肺炎連鎖球菌の菌種を増幅培養した後に、殺菌・不活性化し、清澄培養液を収集し、多糖沈殿剤を加え、さらに精製工程により精製された多糖を得た。精製のステップは、ＮａＣｌ溶液を加え、複合糖を溶解し、溶解後に遠心分離し、上澄みを取り、アルコールの添加で不純物と沈殿糖を除去することを含むことができる。精製された多糖は、複数回の洗浄沈殿により、不純物を除去し、イオン交換カラム、複合充填剤などのクロマトグラフィー法を用いて得ることができる。
ある場合には、前記の短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントと前記テタノスパスミンタンパク質バリアントを含んでも良い。
ある場合には、前記の短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントを含んでも良い。
ある場合には、前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－３のいずれか一つに示されたアミノ酸配列を含んでも良い。前記の短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－３に示されたアミノ酸配列と少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでも良い。ある場合には、前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質を発現する核酸コード配列は、コドン最適化によって得られる。例えば、短縮されたテタノスパスミンタンパク質の核酸コード配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４－６のいずれか一つに示された。例えば、前記のコドン最適化された短縮されたテタノスパスミンタンパク質のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４－６のいずれか一つに示されたヌクレオチド配列と少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでも良い。
ある場合には、前記タンパク質－多糖複合体は、前記の短縮されたテタノスパスミンタンパク質と、前記いずれか一つの血清型肺炎連鎖球菌から由来する莢膜多糖又はそれに誘導されるオリゴ糖を含む。ある場合には、前記タンパク質－多糖複合体は、前記の短縮されたテタノスパスミンタンパク質と、前記肺炎連鎖球菌から由来する莢膜多糖又はそれに誘導されるオリゴ糖を含み、以下のいずれか一つの肺炎連鎖球菌血清型から選べられる：１、３、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１０Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１９Ａ、１９Ｆと３３Ｆ。ある場合には、前記タンパク質－多糖複合体は、前記の短縮されたテタノスパスミンタンパク質と、前記肺炎連鎖球菌から由来する莢膜多糖又はそれに誘導されるオリゴ糖を含み、以下のいずれか一つの肺炎連鎖球菌血清型から選べられる：１、３、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１０Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１９Ａ、１９Ｆと３３Ｆ。ある場合には、前記タンパク質－多糖複合体は、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントと、前記肺炎連鎖球菌から由来する莢膜多糖又はそれに誘導されるオリゴ糖を含み、以下のいずれか一つの肺炎連鎖球菌血清型から選べられる：１、３、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１０Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１９Ａ、１９Ｆと３３Ｆ。ある場合には、前記タンパク質－多糖複合体は、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントと、前記肺炎連鎖球菌から由来する莢膜多糖又はそれに誘導されるオリゴ糖を含み、以下のいずれか一つの肺炎連鎖球菌血清型から選べられる：１、３、６Ａと１５Ｂ。ある場合には、前記タンパク質－多糖複合体は、前記テタノスパスミンタンパク質のバリアントＴＴＤ－１と、前記肺炎連鎖球菌から由来する莢膜多糖又はそれに誘導されるオリゴ糖を含み、以下のいずれか一つの肺炎連鎖球菌血清型から選べられる：３、６Ｂ、７Ｆと１９Ａ。ある場合には、前記タンパク質－多糖複合体は、前記テタノスパスミンタンパク質バリアントＴＴＤ－２と、１０Ａ型肺炎連鎖球菌の莢膜多糖又はそれに誘導されるオリゴ糖を含む。
本出願において、前記タンパク質は、少なくとも１個（例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個又は少なくとも５個）の前記多糖と結合してもよく、前記多糖は、１種類又は１種類以上（例えば少なくとも２種類、少なくとも３種類又は少なくとも４種類）の肺炎連鎖球菌血清型の多糖を含んでも良い。本出願において、前記多糖は、１個以上の前記タンパク質分子と結合しても良い（例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個又は少なくとも５個）。
本出願において、前記タンパク質は、少なくとも１個（例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個又は少なくとも５個）の前記多糖と結合してもよく、前記多糖は、１種類又は１種類以上（例えば少なくとも２種類、少なくとも３種類又は少なくとも４種類）の肺炎連鎖球菌血清型の多糖を含んでも良い。本出願において、前記多糖は、１個以上の前記タンパク質分子と結合しても良い（例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個又は少なくとも５個）。
本出願において、前記「質量比」は、前記多糖の分子質量と前記タンパク質の分子質量との比の値を含んでも良い。ある場合には、前記多糖と前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質の質量比は、０．４－２．５であっても良い。
ある場合には、３型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質との質量比は、０．４－２．５であっても良い。
ある場合には、５型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質との質量比は、０．４－２．５であっても良い。
ある場合には、６Ａ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質との質量比は、０．４－２．５であっても良い。
ある場合には、６Ｂ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質との質量比は、０．４－２．５であっても良い。
ある場合には、１２Ｆ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質との質量比は、０．４－２．５であっても良い。
ある場合には、１５Ｂ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質との質量比は、０．４－２．５であっても良い。
ある場合には、１９Ａ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質との質量比は、０．４－２．５であっても良い。
ある場合には、１９Ｆ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質との質量比は、０．４－２．５であっても良い。
ある場合には、３３Ｆ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質との質量比は、０．４－２．５であっても良い。
本出願において、前記タンパク質多糖結合体は、任意の公知のカップリング技術によって製造することができる。結合方法は、１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）を用いて糖を活性化することによりシアン酸エステルを形成することができる。したがって、活性化された糖は、キャリアタンパク質上のアミノ基に直接又はスペーサー（リンカー）基を介して結合することができる。例えば、スペーサーは、チオール化（ｔｈｉｏｌａｔｅｄ）多糖を生成するために、シスチアミンまたはシステアミンであってもよく、後者は、マレイミドで活性化されたキャリアタンパク質（例えばＧＭＢＳを使用）、またはハロアセチル化キャリアタンパク質（例えば、ヨードアセトイミド（例えば、エチルヨードアセトイミド）または臭素酢酸Ｎ－スクシンイミドまたはＳＩＡＢ、またはＳＩＡ、またはＳＢＡＰを使用）と反応させた後に得られるチオエーテル結合によって、キャリアにカップリングすることができる。ある場合には、多糖の特徴に応じて、臭化シアン法（ＵＳ５９５２４５４）、１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）（ＥＰ０７２０４８５）、過ヨウ素酸酸化法（ＵＳ４７１１７７９）を選択することができる。
免疫原性を向上する方法
他方、本出願は、免疫原性を向上する方法を提供し、それが、肺炎連鎖球菌から由来する多糖と短縮されたテタノスパスミンタンパク質を含むタンパク質－多糖複合体を提供するステップを含んでも良い。多糖の大部分は、２型Ｔ細胞非依存抗原（Ｔ ｃｅｌｌ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｙｐｅ ２、ＴＩ－２）に属し、生体に入ると、Ｂ細胞表面の抗原識別受容体（即ち、表面免疫グロブリン分子（ｓｕｒｆａｃｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ｓＩｇ））と架橋することでＢ細胞を活性化させ、一連の下流変化を引き起こすことができ、Ｂ細胞を抗体分泌が可能な形質細胞に分化させ、免疫過程全体でＴ細胞の関与がないため、免疫記憶は形成されず、生成される抗体は、主に親和性の低いＩｇＭとＩｇＧ ２である。糖タンパク質と結合した後、タンパク質－多糖複合体は、抗体提示細胞によって提示することができ、Ｔ補助細胞によって成熟したＢ細胞を活性化させ、ｌｇＧ類抗体の産生を誘導し、免疫記憶性応答を引き起こすことができる。したがって、キャリアタンパク質のタイプは、多糖複合体の免疫原性に影響を与える。最も典型的な例は、ＤＴをタンパク質キャリアとするＨｉｂ結合ワクチンの市場からの淘汰である：破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＣＲＭ １９７などのタンパク質をキャリアとする結合ワクチンと比較すると、ＤＴをキャリアとするＨｉｂ結合ワクチンは、１８カ月以下の乳幼児に免疫原性が劣るため、発売後に淘汰された；また、海外の１１価肺炎結合ワクチンの臨床研究によると、百白破結合ワクチンと共同免疫する際に、ＴＴをキャリアとする多糖血清抗体は、明らかに抑制され、この研究は、この結果により開発を中止したが、この抑制効果はＤＴをキャリアとする結合物には現れなかった。
他方、本出願は、免疫原性を向上する方法を提供し、それが、肺炎連鎖球菌から由来する多糖と短縮されたテタノスパスミンタンパク質を含むタンパク質－多糖複合体を提供するステップを含んでも良い。多糖の大部分は、２型Ｔ細胞非依存抗原（Ｔ ｃｅｌｌ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｙｐｅ ２、ＴＩ－２）に属し、生体に入ると、Ｂ細胞表面の抗原識別受容体（即ち、表面免疫グロブリン分子（ｓｕｒｆａｃｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ｓＩｇ））と架橋することでＢ細胞を活性化させ、一連の下流変化を引き起こすことができ、Ｂ細胞を抗体分泌が可能な形質細胞に分化させ、免疫過程全体でＴ細胞の関与がないため、免疫記憶は形成されず、生成される抗体は、主に親和性の低いＩｇＭとＩｇＧ ２である。糖タンパク質と結合した後、タンパク質－多糖複合体は、抗体提示細胞によって提示することができ、Ｔ補助細胞によって成熟したＢ細胞を活性化させ、ｌｇＧ類抗体の産生を誘導し、免疫記憶性応答を引き起こすことができる。したがって、キャリアタンパク質のタイプは、多糖複合体の免疫原性に影響を与える。最も典型的な例は、ＤＴをタンパク質キャリアとするＨｉｂ結合ワクチンの市場からの淘汰である：破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＣＲＭ １９７などのタンパク質をキャリアとする結合ワクチンと比較すると、ＤＴをキャリアとするＨｉｂ結合ワクチンは、１８カ月以下の乳幼児に免疫原性が劣るため、発売後に淘汰された；また、海外の１１価肺炎結合ワクチンの臨床研究によると、百白破結合ワクチンと共同免疫する際に、ＴＴをキャリアとする多糖血清抗体は、明らかに抑制され、この研究は、この結果により開発を中止したが、この抑制効果はＤＴをキャリアとする結合物には現れなかった。
現在、市販されている結合ワクチンに使用されるキャリアタンパク質は、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、ジフテリアトキソイド突然変異体（ＣＲＭ １９７）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、Ｂ群流脳外膜タンパク質複合体（ＯＭＰ）、不可分型インフルエンザ好血桿菌タンパク質Ｄ（ＰＤ）を含む。現在研究開発されているキャリアタンパク質は、さらに、組換え銅緑仮細胞菌外毒素Ａ（ｒＥＰＡ）、組換え黄色ブドウ球菌腸毒素Ｃ １（ｒＳＥＣ）、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）などがある。ジフテリアトキソイド無毒変異体（ＣＲＭ １９７）は、常用され、臨床で安全、有効なキャリアタンパク質であり、市販されている肺炎球菌多糖結合ワクチンで広く使用されている。ＣＲＭ １９７は、非毒性ファージβ１９７ ｔｏｘに感染したジフテリア菌（Ｃ ｄｉｐｈｔｈｈｅｒｉａｅ）から産生し、ファージβ１９７ ｔｏｘは、ニトロソグアニジン変異誘発毒素ｃａｒｙｎｅｐｈａｇｅ ｂにより産生する（Ｕｃｈｉｄａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９７１）２３３；８－１１）。ＣＲＭ １９７タンパク質は、ジフテリア毒素と類似する配列と分子量を有するが、ジフテリア毒素との相違点は、構造遺伝子における単一塩基変化である。これにより、５２位のアミノ酸が、グリシンからグルタミンに変化し、当該変化により、フラグメントが、ＮＡＤと結合できず、毒性を持たない（Ｐａｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ １９７７，Ａｎｎ Ｒｅｖ，Ｂｉｏｃｈｅｍ ．４６；６９－９４，Ｒａｐｐｕｏｌｉ Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｐｔ １９８３ｐ５６０－５６４）。
ファイザー社が開発した１３価肺炎球菌結合ワクチンＰｒｅｖｅｎａｒ－１３は、ＣＲＭ １９７（ジフテリアトキソイド無毒変異体）をキャリアタンパク質として２０１０年に米国で初めて発売されたが、臨床応用において、異なる血清型多糖の免疫原性に比較的大きな差が見られた。ＣＲＭ １９７の比較として、ＴＴＤは、新しいキャリアタンパク質と重要な臨床的意義と価値を有する。本出願において、前記免疫原性を向上することとは、前記多糖が、短縮された破傷風菌と結合した後、多糖の免疫原性を高めることができる作用を有することを意味する。ある場合には、免疫原性のアップレギュレーションは、多糖ＣＲＭ １９７結合体と比較して、多糖と短縮された破傷風菌との複合体が免疫原性に劣らない、またはそれ以上の免疫原性を有することを含む。
本出願において、前記免疫原性は、当業者に周知のいずれかの方法で検出することができる。ある場合には、前記検出方法は、以下のステップを含んでも良い：多糖－短縮されたタンパク質複合体と多糖－ＣＲＭ１９７複合体とを、それぞれに任意のアジュバントに添加し、免疫抗原に調製する；前記免疫抗原は、被験者に導入され、一定期間に被験者の血液サンプルを抽出して検出することができる。本出願において、アジュバントは、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウムまたはミョウバンのアルミニウム塩を含んでも良いが、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩または亜鉛塩などの他の金属塩であってもよい；あるいは、アシル化チロシン、またはアシル化糖、カチオン誘導体化またはアニオン誘導体化糖またはポリホスファゼン含有不溶性混合液であってもよい。ある場合には、前記アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、および／またはフロイントアジュバントを含んでも良い。ある場合には、前記導入は、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射などの注射方法を含んでも良い。
本出願において、前記免疫原性は、当業者に周知のいずれかの方法で検出することができる。ある場合には、前記検出方法は、以下のステップを含んでも良い：多糖－短縮されたタンパク質複合体と多糖－ＣＲＭ１９７複合体とを、それぞれに任意のアジュバントに添加し、免疫抗原に調製する；前記免疫抗原は、被験者に導入され、一定期間に被験者の血液サンプルを抽出して検出することができる。本出願において、アジュバントは、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウムまたはミョウバンのアルミニウム塩を含んでも良いが、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩または亜鉛塩などの他の金属塩であってもよい；あるいは、アシル化チロシン、またはアシル化糖、カチオン誘導体化またはアニオン誘導体化糖またはポリホスファゼン含有不溶性混合液であってもよい。ある場合には、前記アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、および／またはフロイントアジュバントを含んでも良い。ある場合には、前記導入は、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射などの注射方法を含んでも良い。
ある場合には、前記検出方法は、ＥＬＩＳＡ－ブリッジ法、ＥＬＩＳＡ直接法、ＥＬＩＳＡ間接法、放射免疫分析法、電気化学発光法、表面プラズモン共鳴、酵素結合免疫斑点法、免疫ＰＣＲ法によって、免疫血清中の抗体価を検出することを含んでも良い。ある場合には、前記検出方法は、オプソニン食作用試験によって、特異的抗体の産生を検出することを含んでも良い。
薬物組成物、ワクチン、用途と予防方法
他方、本出願は、薬物組成物を提供し、それが、前記のタンパク質－多糖複合体と、任意的な薬学に許容されるアジュバントを含む。好適なアジュバントは、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウムまたはミョウバンのアルミニウム塩を含んでも良いが、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩または亜鉛塩などの他の金属塩であってもよい；あるいは、アシル化チロシン、またはアシル化糖、カチオン誘導体化またはアニオン誘導体化糖またはポリホスファゼン含有不溶性混合液であってもよい。
他方、本出願は、薬物組成物を提供し、それが、前記のタンパク質－多糖複合体と、任意的な薬学に許容されるアジュバントを含む。好適なアジュバントは、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウムまたはミョウバンのアルミニウム塩を含んでも良いが、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩または亜鉛塩などの他の金属塩であってもよい；あるいは、アシル化チロシン、またはアシル化糖、カチオン誘導体化またはアニオン誘導体化糖またはポリホスファゼン含有不溶性混合液であってもよい。
他方、本出願は、薬物の調製における前記テタノスパスミンタンパク質バリアントの用途を提供する。ある場合には、前記用途は、グラム陽性菌に引かられる細菌性疾患、例えば黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、α型溶血連鎖球菌、β型溶血連鎖球菌、非溶血連鎖球菌、肺炎球菌、腸球菌などに引かれる疾患を治療することを含んでも良い。ある場合には、前記用途は、グラム陰性菌、例えば髄膜炎球菌、淋菌、モラカタ菌、不動桿菌属、偽単胞菌属、糞産アルカリ桿菌、ブルセラ菌属、百日ぜき桿菌、軍団菌、サルモネラ属、志賀菌属、クレバー菌属に引かれる疾患を治療することを含んでも良い。ある場合には、前記細菌性疾患は、肺炎連鎖球菌性疾患を含んでも良い。ある場合には、前記肺炎連鎖球菌性疾患は、肺炎、敗血症、髄膜炎及び／又は中耳炎を含んでも良い。
他方、本出願は、薬物の調製における前記多糖複合体の用途を提供する。ある場合には、前記用途は、細菌性疾患を予防及び／又は治療することを含んでも良い。ある場合には、前記細菌性疾患は、肺炎連鎖球菌性疾患を含んでも良い。ある場合には、前記肺炎連鎖球菌性疾患は、肺炎、敗血症、髄膜炎及び／又は中耳炎を含んでも良い。
本出願において、「予防」とは、一般に、疾患またはその１つまたは複数の症状の発生および発作、再発、および／または拡散を防止するための事前措置を講じることを意味する。「治療」とは、一般に、疾患の除去または改善、または疾患に関連する１つまたは複数の症状の緩和を意味する。例えば、本出願に記載のテタノスパスミンタンパク質バリアント及び／又はそれに調製された薬物を用い、細菌性疾患の発生、発作、再発及び／又は拡散を防止する。例えば、本出願に記載の多糖複合体及び／又はそれに調製された薬物を用い、細菌性疾患の発生、発作、再発及び／又は拡散を防止する。例えば、前記細菌性疾患は、肺炎連鎖球菌性疾患であっても良い。例えば、前記肺炎連鎖球菌性疾患は、肺炎、敗血症、髄膜炎及び／又は中耳炎を含んでも良い。
本出願において、「予防」とは、一般に、疾患またはその１つまたは複数の症状の発生および発作、再発、および／または拡散を防止するための事前措置を講じることを意味する。「治療」とは、一般に、疾患の除去または改善、または疾患に関連する１つまたは複数の症状の緩和を意味する。例えば、本出願に記載のテタノスパスミンタンパク質バリアント及び／又はそれに調製された薬物を用い、細菌性疾患の発生、発作、再発及び／又は拡散を防止する。例えば、本出願に記載の多糖複合体及び／又はそれに調製された薬物を用い、細菌性疾患の発生、発作、再発及び／又は拡散を防止する。例えば、前記細菌性疾患は、肺炎連鎖球菌性疾患であっても良い。例えば、前記肺炎連鎖球菌性疾患は、肺炎、敗血症、髄膜炎及び／又は中耳炎を含んでも良い。
他方、本出願は、ワクチンを提供し、それが、前記のタンパク質－多糖複合体、前記の薬物組成物及び／又は任意的な薬学に許容されるアジュバントを含む。前記タンパク質－多糖複合体は、前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質、前記テタノスパスミンタンパク質バリアント及び／又は前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントを含んでも良い。各タイプのキャリアタンパク質は、複数の糖のキャリアとして使用することができ、ただし、前記の糖は同じであっても異なっていてもよい。例えば、肺炎連鎖球菌血清型３及び５は、同じキャリアタンパク質と結合してもよく、或いはキャリアタンパク質の同じ分子と結合してもよく、又は同じキャリアタンパク質の異なる分子と結合してもよい。ある場合には、三種類又はこれ以上の異なる糖は、同じキャリアタンパク質と結合しても良く、あるいはキャリアタンパク質の同じ分子と結合しても良く、あるいは同じキャリアタンパク質の異なる分子と結合しても良い。
本出願の薬物組成物を含むワクチン製剤は、感染しやすい哺乳類を保護または治療するために、系統的経路または粘膜経路を介してワクチンを投与しても良い。これらの投与は、筋肉内、腹膜内、皮内または皮下経路による注射を含んでも良く、または粘膜を介して口腔／消化管、呼吸道、泌尿器生殖道に投与しても良い。ある場合には、前記薬物組成物の成分は、同じ時間または異なる時間に共同で投与しても良い（例えば、ワクチンの任意のバクテリアタンパク質成分を同時に、または投与した１～２週間後に、肺炎連鎖球菌糖複合体を単独で投与し、両者の間の免疫応答を最適な配合にすることができる）。共同で投与は、任意のまたはすべての異なる投与には、任意のアジュバントが存在しても良い。単一の投与経路に加えて、２つの異なる投与経路を使用しても良い。例えば、糖または糖複合体は、筋肉内（または皮内）で投与しても良いが、細菌タンパク質は、粘膜（または皮内）で投与しても良い。
他方、本出願は、肺炎連鎖球菌性疾患を予防する方法を提供し、それが、必要が有る被験者に、前記タンパク質－多糖複合体、前記核酸分子、前記ベクター、前記細胞、前記キャリアタンパク質、前記薬物組成物及び／又は前記ワクチンを投与することを含む。ある場合には、前記肺炎連鎖球菌性疾患は、肺炎、敗血症、髄膜炎及び／又は中耳炎を含んでも良い。
ある場合には、本出願に提供される前記タンパク質－多糖複合体、前記薬物組成物及び／又は薬学に許容されるアジュバントは、抗血清の調製に使用しても良い。ある場合には、本出願に提供される前記タンパク質－多糖複合体、前記薬物組成物及び／又は薬学に許容されるアジュバントは、抗体の調製に使用しても良い。前記タンパク質－多糖複合体は、前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質、前記テタノスパスミンタンパク質バリアント及び／又は前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントを含んでも良い。各タイプのキャリアタンパク質は、複数の糖のキャリアとして使用することができ、ただし、前記の糖は同じであっても異なっていてもよい。前記糖は、肺炎連鎖球菌の莢膜多糖であっても良い。
ある場合には、本出願に提供される前記タンパク質－多糖複合体、前記薬物組成物及び／又は薬学に許容されるアジュバントは、サンプルにおける抗体の検出に使用しても良い。ある場合には、本出願に提供される前記タンパク質－多糖複合体、前記薬物組成物及び／又は薬学に許容されるアジュバントは、サンプルにおける抗体を検出するキットの製造に使用しても良い。
例えば、前記抗体は、細菌の抗体であっても良い。例えば、前記細菌の抗体は、肺炎連鎖球菌の抗体であっても良い。例えば、肺炎連鎖球菌血清型３の抗体、肺炎連鎖球菌血清型５の抗体、肺炎連鎖球菌血清型６Ａの抗体、肺炎連鎖球菌血清型６Ｂの抗体、肺炎連鎖球菌血清型１０Ａの抗体、肺炎連鎖球菌血清型１２Ｆの抗体、肺炎連鎖球菌血清型１５Ｂの抗体、肺炎連鎖球菌血清型１９Ａの抗体及び／又は肺炎連鎖球菌血清型３３Ｆの抗体である。
ある場合には、本出願に提供される前記テタノスパスミンタンパク質バリアント、短縮されたテタノスパスミンタンパク質及び／又は前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントは、抗テタノスパスミンの抗体の調製、抗テタノスパスミンの抗原及び／又はワクチンの調製、及び／又はテタノスパスミン抗体を診断するキットの製造に使用しても良い。
他方、本出願は、さらに、抗体の調製における前記多糖複合体の抗原としての用途を提供する。
ある実施形態において、前記抗体は、分離された菌株の診断的タイピングに用いられる。
他方、本出願は、さらに、キットを提供し、それが、前記多糖複合体を含む。
ある実施形態において、前記キットは、分離された菌株の診断的タイピングに用いられる。
いかなる理論によっても制限されることは意図されておらず、以下の実施例は、本願のタンパク質バリアント、製造方法、および用途などを説明するためのものであり、本願発明の範囲を制限するためのものではない。
実施例１：ＴＴＤ組換えタンパク質の配列設計
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ のｔｅｔａｎｕｓ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ 配列（ＮＢＣＩ ＷＰ０１１１００８３６）及びその結晶構造（ＰＤＢ： ５Ｎ０Ｂ）に基づき、本出願が、短縮されたテタノスパスミンタンパク質（Ｔｅｔａｎｕｓ Ｔｏｘｉｎ Ｄｏｍａｉｎ、ＴＴＤ）を設計し、テタノスパスミンタンパク質（Ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ、ＴＴ）のＮ末端の配列を排除したが、そのＣ末端の配列を含む。したがって、ＴＴＤタンパク質が、テタノスパスミンタンパク質の毒性を有しないが、そのＣ末端のドメイン及び機能性フラグメントを保持し、タンパク質の正確な折り畳み、安定性を維持する上で、Ｔ細胞エピトープと構造の柔軟性を提供し、化学結合に有利である。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ のｔｅｔａｎｕｓ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ 配列（ＮＢＣＩ ＷＰ０１１１００８３６）及びその結晶構造（ＰＤＢ： ５Ｎ０Ｂ）に基づき、本出願が、短縮されたテタノスパスミンタンパク質（Ｔｅｔａｎｕｓ Ｔｏｘｉｎ Ｄｏｍａｉｎ、ＴＴＤ）を設計し、テタノスパスミンタンパク質（Ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ、ＴＴ）のＮ末端の配列を排除したが、そのＣ末端の配列を含む。したがって、ＴＴＤタンパク質が、テタノスパスミンタンパク質の毒性を有しないが、そのＣ末端のドメイン及び機能性フラグメントを保持し、タンパク質の正確な折り畳み、安定性を維持する上で、Ｔ細胞エピトープと構造の柔軟性を提供し、化学結合に有利である。
設計されたタンパク質配列０１（ＴＴＤ－１）は、ＴＴ配列からＮ末端の８２８個アミノ酸を除去して得た、４８７個アミノ酸を含有するＴＴＤタンパク質配列であり、即ち、Ｎ末端のポリペプチド酵素Ｍ ２７及び部分転位領域を除去し、Ｃ末端の機能ドメイン（受容体結合ドメイン）を保持した：そのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示された。コドン最適化された相応する核酸配列（ＴＴＤ－４）は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示された。
設計されたタンパク質配列０２（ＴＴＤ－２）は、ＴＴ配列からＮ末端の８３９個アミノ酸を除去して得た、４７６個アミノ酸を含有するＴＴＤタンパク質配列であり、即ち、Ｎ末端のポリペプチド酵素Ｍ ２７及び部分転位領域を除去し、Ｃ末端の機能ドメイン（受容体結合ドメイン）を保持した：そのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示された。コドン最適化された相応する核酸配列（ＴＴＤ－５）は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示された。
設計されたタンパク質配列０３（ＴＴＤ－３）は、ＴＴ配列からＮ末端の８６４個アミノ酸を除去して得た、４５１個アミノ酸を含有するＴＴＤタンパク質配列であり、即ち、Ｎ末端のポリペプチド酵素Ｍ ２７及び部分転座領域を除去し、Ｃ末端の機能ドメイン（受容体結合ドメイン）を保持した：そのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示された。コドン最適化された相応する核酸配列（ＴＴＤ－６）は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示された。
実施例２：発現ベクターの構築及びタンパク質の発現
大腸菌タンパク質発現システムを利用するために、設計されたタンパク質ＴＴＤとその対応する遺伝子配列を、遺伝子配列合成、プライマー設計、ＰＣＲ増幅、分子クローニングなどの一般的な技術によって、タンパク質発現ベクター（例えばｐＧＥＸ－４ Ｔ、ｐＥＴ ２１）に構築し、組換え発現プラスミドを得た。組換えタンパク質発現プラスミドを、ＢＬ２１（ＤＥ ３）コンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）により形質転換した後、組換え発現プラスミドを得た。ＴＴＤ－４、ＴＴＤ－５及びＴＴＤ－６のＰＣＲ電気泳動の結果を図１に示す。保存した菌種を、Ａｍｐ＋を含むプレートにストリークして活性化し、シングルコロニーを採取し、Ａｍｐ＋を含むＬＢ液体培地に播種し、３７℃、２５０ ｒｐｍで一晩培養した。培養した菌種を、Ａｍｐ＋を含むＬＢ液体培地に比例希釈し、播種し、３７℃でＯＤ ６００が０．５～１．５に達するまで揺動培養した後、１ ｍＭのＩＰＴＧを加えて誘導した。培養を終了した後、１ｍＬのサンプルを採取して遠心分離し、上澄みを除去した後、溶解液を加え、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動分析を行い、組換えタンパク質発現を確定した。電気泳動の結果を、図２に示すように、いずれも目標ＴＴＤタンパク質が得られた。
大腸菌タンパク質発現システムを利用するために、設計されたタンパク質ＴＴＤとその対応する遺伝子配列を、遺伝子配列合成、プライマー設計、ＰＣＲ増幅、分子クローニングなどの一般的な技術によって、タンパク質発現ベクター（例えばｐＧＥＸ－４ Ｔ、ｐＥＴ ２１）に構築し、組換え発現プラスミドを得た。組換えタンパク質発現プラスミドを、ＢＬ２１（ＤＥ ３）コンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）により形質転換した後、組換え発現プラスミドを得た。ＴＴＤ－４、ＴＴＤ－５及びＴＴＤ－６のＰＣＲ電気泳動の結果を図１に示す。保存した菌種を、Ａｍｐ＋を含むプレートにストリークして活性化し、シングルコロニーを採取し、Ａｍｐ＋を含むＬＢ液体培地に播種し、３７℃、２５０ ｒｐｍで一晩培養した。培養した菌種を、Ａｍｐ＋を含むＬＢ液体培地に比例希釈し、播種し、３７℃でＯＤ ６００が０．５～１．５に達するまで揺動培養した後、１ ｍＭのＩＰＴＧを加えて誘導した。培養を終了した後、１ｍＬのサンプルを採取して遠心分離し、上澄みを除去した後、溶解液を加え、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動分析を行い、組換えタンパク質発現を確定した。電気泳動の結果を、図２に示すように、いずれも目標ＴＴＤタンパク質が得られた。
実施例３：ＴＴＤタンパク質の精製
組換えＴＴＤ菌種を発酵により得た菌体２５ｇを、１０倍５０ ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で溶解し、２５０ ｍＬの系になり、高圧ホモジナイザで２回破砕し、高速遠心分離により沈殿を除去し、上澄みを保持した。上澄みに硫酸アンモニウムを加えて沈殿させ、低温で２時間攪拌し、さらに１時間の高速遠心により沈殿を収集し、収集した沈殿を緩衝液で溶解した後、限外濾過により液を交換し、その後、それぞれ複合型クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーを行い、そして異なるＮａＣｌ濃度勾配を用いて溶出し、不純物を除去し、最後に精製度が９５％を超えるＴＴＤタンパク質を得た。精製結果は、図３に示された。精製されたＴＴＤタンパク質はＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析により、タンパク質に良好な均一性があることが明らかになった。ＴＴＤ－１のＳＥＣ－ＨＰＬＣの結果を図４に示す。
組換えＴＴＤ菌種を発酵により得た菌体２５ｇを、１０倍５０ ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で溶解し、２５０ ｍＬの系になり、高圧ホモジナイザで２回破砕し、高速遠心分離により沈殿を除去し、上澄みを保持した。上澄みに硫酸アンモニウムを加えて沈殿させ、低温で２時間攪拌し、さらに１時間の高速遠心により沈殿を収集し、収集した沈殿を緩衝液で溶解した後、限外濾過により液を交換し、その後、それぞれ複合型クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーを行い、そして異なるＮａＣｌ濃度勾配を用いて溶出し、不純物を除去し、最後に精製度が９５％を超えるＴＴＤタンパク質を得た。精製結果は、図３に示された。精製されたＴＴＤタンパク質はＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析により、タンパク質に良好な均一性があることが明らかになった。ＴＴＤ－１のＳＥＣ－ＨＰＬＣの結果を図４に示す。
実施例４：肺炎連鎖球菌多糖の調製
管で調製した肺炎連鎖球菌菌種（ＡＴＣＣ）をシェイクボトルに接種し、３７℃ ＣＯ２培養箱で一晩培養し、鏡検査の結果が正常になった後、培養液を１０Ｌの発酵タンクに接種し、６～１０時間発酵培養した。培養終了後、不活化剤を添加して殺菌・不活化し、次いで遠心分離により清澄培養液を収集し、清澄培養液に多糖沈殿剤を添加し、粗沈殿複合糖を得た。その後、一連の精製後に精製多糖を得た。通常の精製多糖精製プロセスは、ＮａＣｌ溶液を加え、複合糖を溶解し、溶解後に遠心分離し、上澄みを取り、アルコールの添加で不純物と沈殿糖を除去することを含むが、これらに限定されない。精製された多糖は、複数回の洗浄沈殿により、不純物を除去し、イオン交換カラム、複合充填剤などのクロマトグラフィー法を用いて得ることができる。調製した異なるタイプの多糖には、品質分析の結果としては、各指標は欧州薬局方基準に符合し、例えばタンパク質及び核酸などの不純物含有量はいずれも１％未満であった。
管で調製した肺炎連鎖球菌菌種（ＡＴＣＣ）をシェイクボトルに接種し、３７℃ ＣＯ２培養箱で一晩培養し、鏡検査の結果が正常になった後、培養液を１０Ｌの発酵タンクに接種し、６～１０時間発酵培養した。培養終了後、不活化剤を添加して殺菌・不活化し、次いで遠心分離により清澄培養液を収集し、清澄培養液に多糖沈殿剤を添加し、粗沈殿複合糖を得た。その後、一連の精製後に精製多糖を得た。通常の精製多糖精製プロセスは、ＮａＣｌ溶液を加え、複合糖を溶解し、溶解後に遠心分離し、上澄みを取り、アルコールの添加で不純物と沈殿糖を除去することを含むが、これらに限定されない。精製された多糖は、複数回の洗浄沈殿により、不純物を除去し、イオン交換カラム、複合充填剤などのクロマトグラフィー法を用いて得ることができる。調製した異なるタイプの多糖には、品質分析の結果としては、各指標は欧州薬局方基準に符合し、例えばタンパク質及び核酸などの不純物含有量はいずれも１％未満であった。
実施例５：肺炎連鎖球菌多糖－タンパク質複合体の調製
活性化された肺炎連鎖球菌多糖は、キャリアタンパク質との化学反応活性を有する。多糖－タンパク質の化学カップリングは、直接カップリングしてもよく、またはリンカーを介して実施してもよく、例えば、リンカーであるアジピン酸ジヒドラジドを用いてカップリングする。化学カップリングの通常の方法は、臭化シアン法、ＣＤＡＰ法または還元アミン化法（ＵＳ ５９５２４５４、ＥＰ ０７２０４８５、ＵＳ ４７１１７７９）によるものである。カップリングにより得られた多糖－タンパク質複合体は、比較的強い免疫原性を誘導することができ、抗多糖と抗タンパク質の特異的抗体を同時に誘導することができる。
活性化された肺炎連鎖球菌多糖は、キャリアタンパク質との化学反応活性を有する。多糖－タンパク質の化学カップリングは、直接カップリングしてもよく、またはリンカーを介して実施してもよく、例えば、リンカーであるアジピン酸ジヒドラジドを用いてカップリングする。化学カップリングの通常の方法は、臭化シアン法、ＣＤＡＰ法または還元アミン化法（ＵＳ ５９５２４５４、ＥＰ ０７２０４８５、ＵＳ ４７１１７７９）によるものである。カップリングにより得られた多糖－タンパク質複合体は、比較的強い免疫原性を誘導することができ、抗多糖と抗タンパク質の特異的抗体を同時に誘導することができる。
臭化シアン法を用いた細菌多糖－タンパク質複合体の製造方法は以下の通りである：精製された多糖２００ ｍｇを、２０ ｍｌの０．９％ＮａＣｌ溶液に溶解し、臭化シアンを加え、０．５ ＮのＮａＯＨ溶液を加え、溶液ｐＨを１０．５に調整し、１０－１５分間反応した後、０．５ ＮのＨＣｌを加えてｐＨ ７．８に調整した。次いで、アジピン酸ジヒドラジド溶液（ＡＤＨ）を加えて、多糖－ＡＤＨ誘導体を調製した。同時に、キャリアタンパク質（ＴＴＤまたはＣＲＭ ９７）を、ＥＤＣ（１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）－ｃａｒｂｏｄｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）と反応させ、キャリアタンパク質誘導体を調製した。最後に、多糖－ＡＤＨ誘導体と活性化されたキャリアタンパク質を、比例的に混合した後、反応により、多糖－タンパク質複合体を生成し、さらに限外濾過による濃縮またはクロマトグラフィーにより、不純物と未反応物質を除去し、精製して、多糖－タンパク質複合体を得た。
ＣＤＡＰ法を用いた細菌多糖－タンパク質複合体の製造方法は以下の通りである：典型的な反応では、肺炎多糖（５０ ｍｇ）を、ホウ酸ナトリウム緩衝液１０ ｍｌ（１００ ｍＭ、ｐＨ ９．０）に溶解した後、順に、ＣＤＡＰ溶液、０．２ ＮのＮａＯＨ溶液を加えて、反応液のｐＨを９．０に調整した。室温で５～１０分間攪拌反応した後、０．１ ＮのＨＣｌ溶液を加えてｐＨを７．５に調整した。次いで、反応液をＧ２５カラムにより脱塩し、活性化多糖を収集した。同時に、キャリアタンパク質を、０．１ ＭのＮａＨＣＯ３ ｐＨ ８．０緩衝液に溶解し、その後、活性化された多糖と混合し、室温条件下で６～１０時間攪拌した。反応終了後、液を限外濾過による濃縮より交換し、不純物を除去し、最終的に多糖－タンパク質複合体を得た。
還元アミン法を用いた細菌多糖－タンパク質複合体の製造方法は以下の通りである：典型的な反応では、凍結乾燥された多糖を、リン酸緩衝液（４ ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、１００ ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム溶液を加え、一晩攪拌した後、Ｇ ２５カラムにより脱塩し、活性化された多糖を得た。同時に、キャリアタンパク質を、リン酸緩衝液に溶解し、その後、活性化された多糖溶液と、比例的に混合し、一定当量のシアノホウ素水素化ナトリウムを加え、室温または３７℃度で一晩攪拌した。反応終了後、反応液をクロマトグラフィーに通じ、不純物を除去し、精製された多糖－タンパク質複合体を得た。
実施例６－１５：タンパク質－多糖複合体の免疫原性評価
マウス免疫試験プロトコル：肺炎連鎖球菌多糖－タンパク質複合体を、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムアジュバントに添加し、免疫抗原を調製し、６－８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを選択し、腹腔免疫を行い、ただし、各群５－８マウスであり、毎回の免疫用量は２マイクログラムで、それぞれ０日目、１４日目、２１日目に免疫を行い、２１日目と３５日目に採血して多糖の免疫原性を評価した。
マウス免疫試験プロトコル：肺炎連鎖球菌多糖－タンパク質複合体を、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムアジュバントに添加し、免疫抗原を調製し、６－８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを選択し、腹腔免疫を行い、ただし、各群５－８マウスであり、毎回の免疫用量は２マイクログラムで、それぞれ０日目、１４日目、２１日目に免疫を行い、２１日目と３５日目に採血して多糖の免疫原性を評価した。
ウサギ免疫試験プロトコル：多糖－タンパク質複合体をフロイントアジュバントに加え、免疫抗原として調製し、２～２．５ ｋｇのニュージーランドホワイトラビットを選択し、免疫し、１群２匹のウサギを免疫した。初めに、完全フロイントアジュバントと抗原を乳化して混合し、皮下免疫を行い、用量は２００マイクログラムであった；１４日目に、不完全フロイントアジュバントと抗原を乳化そて混合し、２回目の皮下免疫を行い、用量は２００マイクログラムであった；２８日目に、１００マイクログラムの抗原で静脈免疫した。２１日目と４２日目に採血し、多糖の免疫原性を評価した。
ＥＬＩＳＡ法で肺炎連鎖球菌多糖免疫原性を評価する：肺炎連鎖球菌多糖をコーティング緩衝液で希釈し、９６ウェルマイクロプレートを１００μｌ／ウェルでコーティングし、３７℃で５時間インキュベート後にプレートを洗浄した。マウス、ウサギの抗血清を、吸着剤で処理した後、マウスの血清をまず１：２００で希釈し（ウサギの血清をまず１：１００００で希釈し）、それから２．５倍の勾配で希釈し、８つの勾配を希釈し、それからマイクロプレートに加え、１ウェル当たり５０μｌ、一晩インキュベートした。プレートを洗浄した後、二次抗体を１：２００００で希釈した後、マイクロプレートに添加し、１ウェル当たり１００μｌ、２時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、その後、１ ｍｇ／ｍｌのＰＮＰＰ－Ｎａ発色基質を添加し、１ウェル当たり１００μｌ、２時間インキュベートした後、５０ μｌ／ウェルで３ ＭのＮａＯＨを添加して反応を中止し、マシンで波長４０５ ｎｍの吸収値を読み取った。測定されたウェルのＯＤ値と陰性ウェルのＯＤ値の比が２．１以上である場合、陽性として判定し、希釈の最大倍数が陽性である希釈度を血清ごとの抗体価とし、群ごとの免疫動物の抗体価の幾何平均値を計算し、Ｔ－ｔｅｓｔを用いて、異なる群の間の統計学的意義を分析した。
肺炎連鎖球菌莢膜多糖特異的抗体オプソニン食作用試験： 肺炎連鎖球菌を１０５ＣＦＵ／ｍｌ希釈し、１０ μｌ／ウェルで９６ウェル細胞プレートに添加した。不活性化された血清サンプルを、勾配希釈した後、２０μｌ／ウェルで上記の細胞プレートに添加し、菌体と抗血清を、７００ ｒｐｍ／ｍｉｎで３０ ｍｉｎインキュベートし、ＤＭＦより分化されたＨＬ－６０細胞を、ＨＢＳＳ緩衝液で洗浄した後、濃度１×１０７個／ｍｌに調整した後に、１×１０７個／ｍｌの細胞液と、希釈された補体を１：４体積比で混合し、混合液を５０ μｌ／ウェルで９６ウェル細胞プレートに添加した。９６ウェル細胞プレートをホモジナイザ上に置き、５％ＣＯ２、温度３７℃のＣＯ２培養箱に入れ、４５分間振動培養した。オプソニン食を中止した後に、血液プレートに点滴し、ＣＯ２培養箱で一晩培養した。各希釈された血清下の殺菌率を算出した。
実施例６：３型多糖に対するキャリアタンパク質ＴＴＤの免疫増強効果
３型（Ｔ３）肺炎連鎖球菌多糖－ＴＴＤ複合体と３型肺炎連鎖球菌多糖－ＣＲＭ１９７との免疫効果を比較することで、当該型の肺炎連鎖球菌多糖－ＴＴＤが、マウスにおける免疫増強効果を分析した。
３型（Ｔ３）肺炎連鎖球菌多糖－ＴＴＤ複合体と３型肺炎連鎖球菌多糖－ＣＲＭ１９７との免疫効果を比較することで、当該型の肺炎連鎖球菌多糖－ＴＴＤが、マウスにおける免疫増強効果を分析した。
それぞれに、３型多糖－ＣＲＭ１９７複合体と３型多糖－ＴＴＤ－１、２、３複合体でマウスを免疫し、それぞれに２１日目と３５日目の抗体価を評価した。結果は、図５に示すように、３５日目に、Ｔ ３－ＴＴＤ－１、Ｔ ３－ＴＴＤ－２、Ｔ ３－ＴＴＤ－３の群は、いずれもより高い抗体価を誘導することができた。
３５日目の免疫血清の抗体価を群間分析し、ＡＮＯＶＡ単因子分散分析を経て、Ｔ ３－ＴＴＤ群はＴ ３－ＣＲＭ １９７群と比較し、Ｐ＝０．００１＜０．０１、統計差異は、統計学的に高度に有意であり、ＴＴＤ－１、ＴＴＤ－２、ＴＴＤ－３キャリアタンパクは、いずれもＣＲＭ １９７より明らかな免疫強化効果を持つことを説明した。
Ｔ ３－ＣＲＭ １９７とＴ ３－ＴＴＤ－１の２群を、３５日目の免疫血清をＯＰＡ試験に供した。結果は、図６に示すように、Ｔ ３－ＣＲＭ １９７とＴ ３－ＴＴＤ－１、Ｔ ３－ＴＴＤ－２とＴ ３－ＴＴＤ－３のＩＣ ５０（５０％殺菌率における抗血清の希釈倍数）はそれぞれ１５９９と９９２６、７１４２と５７２８であった。結果は、ＴＴＤ－１、ＴＴＤ－２及びＴＴＤ－３キャリアタンパク質結合物に誘導されてなる３型多糖特異性抗体は、いずれもＣＲＭ １９７キャリアタンパク質結合物より明らかに多かったことを示した。
実施例７：肺炎６Ｂ型多糖に対するキャリアタンパク質ＴＴＤの免疫増強効果
６Ｂ型（Ｔ６Ｂ）肺炎連鎖球菌多糖－ＴＴＤ－１複合体と６Ｂ型肺炎連鎖球菌多糖－ＣＲＭ１９７との免疫効果を比較することで、当該型の肺炎連鎖球菌多糖－ＴＴＤ－１が、マウスにおける免疫増強効果を分析した。
６Ｂ型（Ｔ６Ｂ）肺炎連鎖球菌多糖－ＴＴＤ－１複合体と６Ｂ型肺炎連鎖球菌多糖－ＣＲＭ１９７との免疫効果を比較することで、当該型の肺炎連鎖球菌多糖－ＴＴＤ－１が、マウスにおける免疫増強効果を分析した。
それぞれに、６Ｂ型多糖－ＣＲＭ１９７複合体と６Ｂ型多糖－ＴＴＤ－１複合体でマウスを免疫し、それぞれに２１日目と３５日目の抗体価を評価した。結果は、図７に示すように、３５日目に、６Ｂ多糖－ＴＤＤ－１複合体はより高い抗体価を誘導することができた。
６Ｂ－ＴＴＤ－１と６Ｂ－ＣＲＭ－１の２群を、２１日目と３５日目の免疫血清をＯＰＡ試験に供した。結果は、図８に示すように、６ Ｂ－ＴＴＤ－１と６ Ｂ－ＣＲＭ １９７による免疫２１日目の血清のＩＣ ５０（５０％殺菌率における抗血清の希釈倍数）はそれぞれ２８５１と７４６．３であり、６ Ｂ－ＴＴＤ－１と６ Ｂ－ＣＲＭ １９７による免疫３５日目の血清のＩＣ ５０（５０％殺菌率における抗血清の希釈倍数）は、それぞれ７６７７と１８０２であり、ＴＴＤ－１キャリアタンパク質複合体が、ＣＲＭ １９７キャリアタンパク質複合体よりも高い６ Ｂ型多糖特異的機能抗体の産生を誘導できることを示した。
実施例８：肺炎１５Ｂ型多糖に対するキャリアタンパク質ＴＴＤの免疫増強効果
１５Ｂ型（Ｔ１５Ｂ）肺炎連鎖球菌多糖－ＴＴＤ－３複合体と１５Ｂ型肺炎連鎖球菌多糖－ＣＲＭ１９７との免疫効果を比較することで、当該型の肺炎連鎖球菌多糖－ＴＴＤが、マウスにおける免疫増強効果を分析した。
１５Ｂ型（Ｔ１５Ｂ）肺炎連鎖球菌多糖－ＴＴＤ－３複合体と１５Ｂ型肺炎連鎖球菌多糖－ＣＲＭ１９７との免疫効果を比較することで、当該型の肺炎連鎖球菌多糖－ＴＴＤが、マウスにおける免疫増強効果を分析した。
それぞれに、１５Ｂ型多糖－ＣＲＭ１９７複合体と１５Ｂ型多糖－ＴＴＤ－１複合体でマウスを免疫し、それぞれに２１日目と３５日目の抗体価を評価し、結果は、図９に示すように、３５日目に、多糖－ＴＤＤ－３複合体は、より高い抗体価を誘導することができた。
１５Ｂ－ＣＲＭ１９７と１５Ｂ－ＴＴＤ－３の２群を、２１日目と３５日目の免疫血清をＯＰＡ試験に供した。結果は、図１０に示すように、１５Ｂ－ＣＲＭ１９７と１５Ｂ－ＴＴＤ－３との２１日目の免疫血清のＩＣ５０は、それぞれに、１３９２と２６３３であった。１５Ｂ－ＣＲＭ１９７と１５Ｂ－ＴＴＤ－３との３５日目の免疫血清のＩＣ５０は、それぞれに、９００５と１４９９７であった。ＴＴＤ－３キャリアタンパク質結合物に誘導されてなる１５Ｂ型多糖特異性抗体は、ＣＲＭ １９７キャリアタンパク質結合物より明らかに多かったことを示した。
実施例９：肺炎６Ａ型多糖に対するキャリアタンパク質ＴＴＤの免疫増強効果
それぞれに、６Ａ型（Ｔ６Ａ）肺炎連鎖球菌多糖－ＣＲＭ１９７複合体と６Ａ型多糖－ＴＴＤ－３複合体でマウスを免疫し、それぞれに２１日目と３５日目の抗体価を評価した（図１１に示された）。３５日目に、多糖－ＴＤＤ複合体は、多糖－ＣＲＭ １９７以上の抗体価を誘導することができた。
それぞれに、６Ａ型（Ｔ６Ａ）肺炎連鎖球菌多糖－ＣＲＭ１９７複合体と６Ａ型多糖－ＴＴＤ－３複合体でマウスを免疫し、それぞれに２１日目と３５日目の抗体価を評価した（図１１に示された）。３５日目に、多糖－ＴＤＤ複合体は、多糖－ＣＲＭ １９７以上の抗体価を誘導することができた。
Ｔ６Ａ－ＣＲＭ１９７とＴ６Ａ－ＴＴＤ－３の２群を、２１日目と３５日目の免疫血清をＯＰＡ試験に供した。結果は、図１２に示すように、Ｔ６Ａ－ＣＲＭ１９７とＴ６Ａ－ＴＴＤ－３との２１日目の免疫血清のＩＣ５０は、それぞれに、４５８と１６０６であった。Ｔ６Ａ－ＣＲＭ１９７とＴ６Ａ－ＴＴＤ－３との３５日目の免疫血清のＩＣ５０は、それぞれに、９１０３と２０８５０であり、ＴＴＤ－３キャリアタンパク質結合物に誘導されてなる６型多糖特異性抗体は、ＣＲＭ １９７キャリアタンパク質結合物より明らかに多かったことを示した。
実施例１０：肺炎７Ｆ糖に対するキャリアタンパク質ＴＴＤの免疫増強効果
７Ｆ型（Ｔ７Ｆ）肺炎連鎖球菌多糖－ＴＤＤ－１複合体と多糖－ＣＲＭ １９７複合体とを比較した。それぞれに、多糖－ＣＲＭ１９７複合体と多糖－ＴＴＤ－１複合体でマウスを免疫し、それぞれに２１日目と３５日目の抗体価を評価した。結果は、図１３に示すように、３５日目に、７Ｆ多糖－ＴＤＤ－１複合体は、多糖－ＣＲＭ １９７に相当する抗体価を誘導することができた。
７Ｆ型（Ｔ７Ｆ）肺炎連鎖球菌多糖－ＴＤＤ－１複合体と多糖－ＣＲＭ １９７複合体とを比較した。それぞれに、多糖－ＣＲＭ１９７複合体と多糖－ＴＴＤ－１複合体でマウスを免疫し、それぞれに２１日目と３５日目の抗体価を評価した。結果は、図１３に示すように、３５日目に、７Ｆ多糖－ＴＤＤ－１複合体は、多糖－ＣＲＭ １９７に相当する抗体価を誘導することができた。
Ｔ７Ｆ－ＣＲＭ１９７とＴ７Ｆ－ＴＴＤ－１の２群を、２１日目と３５日目の免疫血清をＯＰＡ試験に供した。結果は、図１４に示すように、Ｔ７Ｆ－ＣＲＭ１９７とＴ７Ｆ－ＴＴＤ－１との２１日目の免疫血清のＩＣ５０は、それぞれに、１２１３と１９２５であった；Ｔ７Ｆ－ＣＲＭ１９７とＴ７Ｆ－ＴＴＤ－１との３５日目の免疫血清のＩＣ５０は、それぞれに、５３６２と７９７５であった。結果は、ＴＴＤ－１キャリアタンパク質結合物に誘導されてなる７Ｆ型多糖特異性抗体は、ＣＲＭ １９７キャリアタンパク質結合物より低くなかったことを示した。
実施例１１：肺炎１０Ａ型多糖に対するキャリアタンパク質ＴＴＤの免疫増強効果
１０Ａ型（Ｔ１０Ａ）肺炎連鎖球菌多糖－ＴＤＤ－２複合体と多糖－ＣＲＭ １９７複合体とを比較した。それぞれに、多糖－ＣＲＭ１９７複合体と多糖－ＴＴＤ－２複合体でマウスを免疫し、それぞれに２１日目と３５日目の抗体価を評価し、結果は、図１５に示すように、３５日目に、１０Ａ多糖－ＴＤＤ－２複合体は、多糖－ＣＲＭ１９７複合体より高い抗体価を誘導することができた。
１０Ａ型（Ｔ１０Ａ）肺炎連鎖球菌多糖－ＴＤＤ－２複合体と多糖－ＣＲＭ １９７複合体とを比較した。それぞれに、多糖－ＣＲＭ１９７複合体と多糖－ＴＴＤ－２複合体でマウスを免疫し、それぞれに２１日目と３５日目の抗体価を評価し、結果は、図１５に示すように、３５日目に、１０Ａ多糖－ＴＤＤ－２複合体は、多糖－ＣＲＭ１９７複合体より高い抗体価を誘導することができた。
Ｔ１０Ａ－ＣＲＭ １９７とＴ１０Ａ－ＴＴＤ－２の２群を、３５日目の免疫血清をＯＰＡ試験に供した。結果は、図１６に示すように、Ｔ１０Ａ－ＣＲＭ１９７とＴ１０Ａ－ＴＴＤ－２との３５日目の免疫血清のＩＣ５０は、それぞれに、２３２６４と３０７０９であった。結果は、ＴＴＤ－２キャリアタンパク質結合物に誘導されてなる１０Ａ型多糖特異性抗体は、ＣＲＭ １９７キャリアタンパク質結合物と相当することを示した。
実施例１２：肺炎１９Ａ型多糖に対するキャリアタンパク質ＴＴＤの免疫増強効果
１９Ａ型（Ｔ１９Ａ）肺炎連鎖球菌多糖－ＴＴＤ複合体と１９Ａ型肺炎連鎖球菌多糖－ＣＲＭ１９７との免疫効果を比較することで、当該型の肺炎連鎖球菌多糖－ＴＴＤが、ニュージーランドホワイトラビットにおける免疫増強効果を分析した。
１９Ａ型（Ｔ１９Ａ）肺炎連鎖球菌多糖－ＴＴＤ複合体と１９Ａ型肺炎連鎖球菌多糖－ＣＲＭ１９７との免疫効果を比較することで、当該型の肺炎連鎖球菌多糖－ＴＴＤが、ニュージーランドホワイトラビットにおける免疫増強効果を分析した。
それぞれに、１９Ａ型多糖－ＣＲＭ１９７複合体と１９Ａ型多糖－ＴＴＤ－１複合体でニュージーランドホワイトラビットを免疫し、それぞれに２１日目と４２日目の抗体価を評価した。結果は、図１７に示すように、４２日目に、多糖－ＴＤＤ複合体はより高い抗体価を誘導することができた。
Ｔ１９Ａ－ＣＲＭ １９７とＴ１９Ａ－ＴＴＤ－１の２群を、４２日目の免疫血清をＯＰＡ試験に供した。結果は、図１８に示すように、１９Ａ－ＣＲＭ１９７と１９Ａ－ＴＴＤ－１との４２日目免疫血清のＩＣ５０は、それぞれに、８６１７と３５７８０であった。結果は、ＴＴＤ－１キャリアタンパク質結合物に誘導されてなる１９Ａ型多糖特異性抗体は、ＣＲＭ １９７キャリアタンパク質結合物より明らかに多かったことを示した。
実施例１３：肺炎１型多糖に対するキャリアタンパク質ＴＴＤの免疫増強効果
１型（Ｔ１）肺炎連鎖球菌多糖－ＴＤＤ－３複合体と多糖－ＣＲＭ １９７複合体とを比較した。それぞれに、多糖－ＣＲＭ１９７複合体と多糖－ＴＴＤ－３複合体でウサギを免疫し、それぞれに２１日目と４２日目の抗体価を評価した。結果は、図１９に示すように、４２日目に、多糖－ＴＤＤ複合体はより高い抗体価を誘導することができた。
１型（Ｔ１）肺炎連鎖球菌多糖－ＴＤＤ－３複合体と多糖－ＣＲＭ １９７複合体とを比較した。それぞれに、多糖－ＣＲＭ１９７複合体と多糖－ＴＴＤ－３複合体でウサギを免疫し、それぞれに２１日目と４２日目の抗体価を評価した。結果は、図１９に示すように、４２日目に、多糖－ＴＤＤ複合体はより高い抗体価を誘導することができた。
Ｔ１－ＣＲＭ１９７とＴ１－ＴＴＤ－３の２群を、２１日目と４２日目の免疫血清をＯＰＡ試験に供した。結果は、図２０に示すように、Ｔ１－ＣＲＭ１９７とＴ１－ＴＴＤ－３との２１日目免疫血清のＩＣ５０は、それぞれに、６５２３と３５５７１であった；Ｔ１－ＣＲＭ１９７とＴ１－ＴＴＤ－３との４２日目免疫血清のＩＣ５０は、それぞれに、１９３７３２と４９３１１４であった。結果は、ＴＴＤ－３キャリアタンパク質結合物に誘導されてなる１型多糖特異性抗体は、ＣＲＭ １９７キャリアタンパク質結合物より明らかに多かったことを示した。
実施例１４：他のタイプの肺炎連鎖球菌多糖に対するキャリアタンパク質ＴＴＤの免疫増強効果
他の血清型の肺炎連鎖球菌多糖複合体は、例えば血清型５、１２Ｆ、３３Ｆ、１９Ｆである。それぞれに、多糖－ＣＲＭ１９７複合体と多糖－ＴＴＤ複合体でマウスを免疫し、それぞれに２１日目と３５日目の抗体価を評価した（図２１に示された）。３５日目に、多糖－ＴＤＤ複合体は、より高い抗体価を誘導することができた。
他の血清型の肺炎連鎖球菌多糖複合体は、例えば血清型５、１２Ｆ、３３Ｆ、１９Ｆである。それぞれに、多糖－ＣＲＭ１９７複合体と多糖－ＴＴＤ複合体でマウスを免疫し、それぞれに２１日目と３５日目の抗体価を評価した（図２１に示された）。３５日目に、多糖－ＴＤＤ複合体は、より高い抗体価を誘導することができた。
本発明は、同時にＴＴＤタンパク質の他の血清型の肺炎多糖に対する免疫増強効果を比較し、ＴＴＤタンパク質がＣＲＭ １９７より高い免疫原性を誘導できることを発見した。例えば、それぞれに、多糖－ＣＲＭ１９７複合体と多糖－ＴＴＤ複合体でマウスを免疫し、それぞれに２１日目と３５日目の抗体価を評価し、３５日目に、多糖－ＴＤＤ複合体に誘導された抗体価と多糖－ＣＲＭ １９７複合体の抗体価との比は、２～２０倍に至り、さらにＴＴＤがキャリアタンパク質としての優位性を説明することができた。
実施例１５：多糖－ＴＴＤ変異体複合体の免疫原性
ＴＴＤ変異体の設計：タンパク質配列０１、０２、０３を基礎として、Ｎ末端の異なる長さのアミノ酸を切断し、そのＣ末端配列を含む。
ＴＴＤ変異体の設計：タンパク質配列０１、０２、０３を基礎として、Ｎ末端の異なる長さのアミノ酸を切断し、そのＣ末端配列を含む。
多糖－ＴＴＤ変異体複合体の免疫原性：Ｘ型多糖－ＣＲＭ １９７複合体（ＴＸ－ＣＲＭ １９７群）とＸ型多糖－ＴＤＤ複合体（ＴＸ－ＴＴＤ）で、それぞれにマウスを免疫し、２１日目と３５日目の抗体価をそれぞれ評価した。３５日目に、多糖－ＴＤＤ複合体は、より高い抗体価を誘導することができた。Ｘは、いずれかの肺炎連鎖球菌多糖型である。
ＴＸ－ＣＲＭ １９７とＴＸ－ＴＴＤの２群を、３５日目の免疫血清をＯＰＡ試験に供した。結果は、ＴＴＤ－１キャリアタンパク質結合物に誘導されてなるＸ型多糖特異性抗体は、ＣＲＭ １９７キャリアタンパク質結合物より明らかに多かったことを示した。
前述の詳細な説明は、説明および例として提供され、添付の請求項の範囲を限定するものではない。現在、本願に列挙されている実施形態の様々な変化は、当業者にとって自明なものであり、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内にある。
Claims (84)
- テタノスパスミンタンパク質バリアントであって、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントと、前記テタノスパスミンタンパク質の転座領域部分フラグメントを含むテタノスパスミンタンパク質バリアント。
- 前記転座領域部分フラグメントは、前記テタノスパスミンタンパク質の転座領域のＴ細胞エピトープＰ２を含む請求項１に記載のテタノスパスミンタンパク質バリアント。
- 前記転座領域部分フラグメントは、前記テタノスパスミンタンパク質の８２９－８６４位のアミノ酸を含む請求項１又は２に記載のテタノスパスミンタンパク質バリアント。
- 前記転座領域部分フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７－８のいずれか一つに示されたアミノ酸配列を含む請求項１－３のいずれか一つに記載のテタノスパスミンタンパク質バリアント。
- 前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されたアミノ酸配列を含む請求項１－４のいずれか一つに記載のテタノスパスミンタンパク質バリアント。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－２のいずれか一つに示されたアミノ酸配列を含む請求項１－５のいずれか一つに記載のテタノスパスミンタンパク質バリアント。
- 肺炎連鎖球菌から由来する多糖と短縮されたテタノスパスミンタンパク質（ＴＴＤ）を含むタンパク質－多糖複合体。
- 前記多糖は、肺炎連鎖球菌莢膜多糖に由来する請求項７に記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記多糖は、一種以上の肺炎連鎖球菌血清型を持つ請求項７－８のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記多糖は、以下の組から選べられるいずれか一つの肺炎連鎖球菌血清型である請求項７－９のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆと３３Ｆ。
- 前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントを含む請求項７－１０のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントを含み、前記多糖は、以下の組から選べられるいずれか一つの肺炎連鎖球菌血清型である請求項７－１１のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体：１、３、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１０Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１９Ａ、１９Ｆと３３Ｆ。
- 前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されたアミノ酸配列を含む請求項７－１２のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントと前記テタノスパスミンタンパク質の転座領域部分フラグメントを含む請求項７－１３のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記転座領域部分フラグメントは、前記テタノスパスミンタンパク質の転座領域の広域スペクトラムのＴ細胞エピトープＰ２を含む請求項１４に記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記転座領域部分フラグメントは、前記テタノスパスミンタンパク質の８２９－８６４位のアミノ酸を含む請求項１４－１５のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記転座領域部分フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７－８のいずれか一つに示されたアミノ酸配列を含む請求項１４－１６のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－３のいずれか一つに示されたアミノ酸配列を含む請求項７－１７のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記多糖と前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項７－１８のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記１型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項１０－１９のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記３型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項１０－２０のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記５型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項１０－２１のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記６Ａ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項１０－２２のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記６Ｂ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項１０－２３のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記７Ｆ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項１０－２４のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記１０Ａ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項１０－２５のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記１２Ｆ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項１０－２６のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記１５Ｂ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項１０－２７のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記１９Ａ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項１０－２８のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記１９Ｆ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項１０－２９のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記３３Ｆ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項１０－３０のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記のタンパク質－多糖複合体には、カップリングの方法で、前記多糖と前記タンパク質バリアントとを結合する請求項７－３１のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体。
- 前記カップリングの方法は、以下のいずれか一つ方法を含む請求項３２に記載のタンパク質－多糖複合体：臭化水素法、ＣＤＡＰ法、還元アミン法。
- 肺炎連鎖球菌から由来する多糖と短縮されたテタノスパスミンタンパク質を含むタンパク質－多糖複合体を提供するステップを含む、免疫原性を向上する方法。
- 前記多糖は、肺炎連鎖球菌莢膜多糖に由来する請求項３４に記載の方法。
- 前記多糖は、一種以上の肺炎連鎖球菌血清型を持つ請求項３４－３５のいずれか一つに記載の方法。
- 前記多糖は、以下の組から選べられるいずれか一つの肺炎連鎖球菌血清型である請求項３４－３６のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆと３３Ｆ。
- 前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントを含む請求項３４－３７のいずれか一つに記載の方法。
- 前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、前記テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントを含み、前記多糖は、以下の組から選べられるいずれか一つの肺炎連鎖球菌血清型である請求項３４－３８のいずれか一つに記載の方法：１、３、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１０Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１９Ａ、１９Ｆと３３Ｆ。
- 前記破傷風菌タンパク質のＣフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されたアミノ酸配列を含む請求項３８－３９のいずれか一つに記載の方法。
- 前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、テタノスパスミンタンパク質のＣフラグメントと前記テタノスパスミンタンパク質の転座領域部分フラグメントを含む請求項３４－４０のいずれか一つに記載の方法。
- 前記転座領域部分フラグメントは、前記テタノスパスミンタンパク質の転座領域の広域スペクトラムのＴ細胞エピトープＰ２を含む請求項４１に記載の方法。
- 前記のテタノスパスミンタンパク質の転座領域部分フラグメントは、前記テタノスパスミンタンパク質の８２９－８６４位のアミノ酸を含む請求項４１－４２のいずれか一つに記載の方法。
- 前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－３のいずれか一つに示されたアミノ酸配列を含む請求項３４－４３のいずれか一つに記載の方法。
- 前記肺炎連鎖球菌多糖と前記短縮されたテタノスパスミンタンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項３４－４４のいずれか一つに記載の方法。
- 前記１型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項３７－４５のいずれか一つに記載の方法。
- 前記３型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項３７－４６のいずれか一つに記載の方法。
- 前記５型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項３７－４７のいずれか一つに記載の方法。
- 前記６Ａ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項３７－４８のいずれか一つに記載の方法。
- 前記６Ｂ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項３７－４９のいずれか一つに記載の方法。
- 前記７Ｆ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項３７－５０のいずれか一つに記載の方法。
- 前記１０Ａ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項３７－５１のいずれか一つに記載の方法。
- 前記１２Ｆ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項３７－５２のいずれか一つに記載の方法。
- 前記１５Ｂ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項３７－５３のいずれか一つに記載の方法。
- 前記１９Ａ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項３７－５４のいずれか一つに記載の方法。
- 前記１９Ｆ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項３７－５５のいずれか一つに記載の方法。
- 前記３３Ｆ型肺炎連鎖球菌多糖と短縮された前記タンパク質の質量比は、０．４－２．５である請求項３７－５６のいずれか一つに記載の方法。
- 前記方法は、カップリングの方法で、前記多糖と前記タンパク質バリアントとを結合することを含む請求項３４－５７のいずれか一つに記載の方法。
- 前記カップリングの方法は、以下のいずれか一つ方法を含む請求項５８に記載の方法：臭化水素法、ＣＤＡＰ法、還元アミン法。
- 前記細菌多糖の免疫原性の向上は、多糖ＣＲＭ１９７複合体と比較し、前記タンパク質－多糖複合体は、より高い免疫原性を有することを含む請求項３４－５９のいずれか一つに記載の方法。
- 前記より高い免疫原性は、動物の免疫実験に検出された請求項３４－６０のいずれか一つに記載の方法。
- 前記動物免疫試験は、以下ステップを含む請求項６１に記載の方法：請求項７－３３に記載のタンパク質－多糖複合体とアジュバントとを配合し、免疫抗原を調製する。
- 前記の免疫抗原の注射方法は、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内注射、および／または静脈内注射を含む請求項６２に記載の方法。
- 前記動物免疫試験は、以下ステップを含む請求項６１－６３のいずれか一つに記載の方法：得られる免疫動物の血清中の抗体を、ＥＬＩＳＡで検出する。
- 前記動物免疫試験は、以下ステップを含む請求項６１－６４のいずれか一つに記載の方法：得られる免疫動物の血清に対して、オプソニン食作用試験を行う。
- 前記動物は、マウス、ラット及び／又はウサギを含む請求項６１－６５のいずれか一つに記載の方法。
- 前記アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、および／またはフロイントアジュバントなどを含む請求項６２－６６のいずれか一つに記載の方法。
- 請求項１－６のいずれか一つに記載のテタノスパスミンタンパク質バリアントをコードする核酸分子。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４－６に示されたヌクレオチド配列を含む請求項６８に記載の核酸分子。
- 請求項６８－６９のいずれか一つに記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項６８－６９のいずれか一つに記載の核酸分子又は請求項７０に記載のベクターを含む細胞。
- 請求項１－６のいずれか一つに記載のテタノスパスミンタンパク質バリアントを含むキャリアタンパク質。
- 請求項７－３３のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体と任意のな薬学に許容されるアジュバントを含む薬物組成物。
- 薬物の調製における請求項１－６のいずれか一つに記載のテタノスパスミンタンパク質バリアントの用途。
- 薬物の調製における請求項７－３３のいずれか一つに記載の多糖複合体の用途。
- 前記薬物は、肺炎連鎖球菌性疾患の予防及び／又は治療に用いられる請求項７４－７５のいずれか一つに記載の用途。
- 前記肺炎連鎖球菌性疾患は、肺炎、敗血症、髄膜炎及び／又は中耳炎を含む請求項７６に記載の用途。
- 請求項７－３３のいずれか一つに記載のタンパク質－多糖複合体、請求項７３に記載の薬物組成物及び／又は任意の薬学に許容されるアジュバントを含むワクチン。
- 必要が有る被験者に請求項７－３３のいずれか一つ前記タンパク質－多糖複合体、請求項６８－６９のいずれか一つに記載の核酸分子、請求項７０に記載のベクター、請求項７１に記載の細胞、請求項７２に記載のキャリアタンパク質、請求項７３に記載の薬物組成物及び／又は請求項７８に記載のワクチンを投与することを含む、肺炎連鎖球菌性疾患を予防する方法。
- 前記肺炎連鎖球菌性疾患は、肺炎、敗血症、髄膜炎及び／又は中耳炎を含む請求項７９に記載の方法。
- 抗体の調製における請求項７－３３のいずれか一つに記載の多糖複合体の抗原としての用途。
- 前記抗体は、分離された菌株の診断的タイピングに用いられる請求項８１に記載の用途。
- 請求項７－３３のいずれか一つに記載の多糖複合体を含むキット。
- 前記抗体は、分離された菌株の診断的タイピングに用いられる請求項８３に記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011126136.9 | 2020-10-20 | ||
| CN202011126136 | 2020-10-20 | ||
| PCT/CN2021/124705 WO2022083585A1 (zh) | 2020-10-20 | 2021-10-19 | 一种蛋白多糖结合物及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023546740A true JP2023546740A (ja) | 2023-11-07 |
Family
ID=81289678
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023548992A Pending JP2023546740A (ja) | 2020-10-20 | 2021-10-19 | プロテオグリカン複合体及びその用途 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230405104A1 (ja) |
| EP (1) | EP4234572A1 (ja) |
| JP (1) | JP2023546740A (ja) |
| KR (1) | KR20230123464A (ja) |
| CN (1) | CN116507359A (ja) |
| AU (1) | AU2021367018A1 (ja) |
| CA (1) | CA3196222A1 (ja) |
| WO (1) | WO2022083585A1 (ja) |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1187753B (it) | 1985-07-05 | 1987-12-23 | Sclavo Spa | Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente |
| AU678613B2 (en) | 1993-09-22 | 1997-06-05 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Method of activating soluble carbohydrate using novel cyanylating reagents for the production of immunogenic constructs |
| CA2216425C (en) * | 1996-03-23 | 2003-08-12 | The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University | Tetanus toxin functional fragment antigen and tetanus vaccine |
| US5952454A (en) | 1997-12-12 | 1999-09-14 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Linking compounds useful for coupling carbohydrates to amine-containing carriers |
| ES2317043T3 (es) * | 2003-06-23 | 2009-04-16 | Baxter International Inc. | Proteinas portadoras para vacunas. |
| CN107224577B (zh) * | 2017-05-10 | 2020-08-04 | 山东大学 | 一种基于3型肺炎链球菌荚膜多糖的寡糖缀合物及其制备方法与应用 |
-
2021
- 2021-10-19 CN CN202180071656.0A patent/CN116507359A/zh active Pending
- 2021-10-19 CA CA3196222A patent/CA3196222A1/en active Pending
- 2021-10-19 US US18/032,784 patent/US20230405104A1/en active Pending
- 2021-10-19 EP EP21882001.7A patent/EP4234572A1/en active Pending
- 2021-10-19 AU AU2021367018A patent/AU2021367018A1/en active Pending
- 2021-10-19 WO PCT/CN2021/124705 patent/WO2022083585A1/zh active Application Filing
- 2021-10-19 KR KR1020237017056A patent/KR20230123464A/ko unknown
- 2021-10-19 JP JP2023548992A patent/JP2023546740A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA3196222A1 (en) | 2022-04-28 |
| AU2021367018A1 (en) | 2023-06-22 |
| WO2022083585A1 (zh) | 2022-04-28 |
| EP4234572A1 (en) | 2023-08-30 |
| US20230405104A1 (en) | 2023-12-21 |
| CN116507359A (zh) | 2023-07-28 |
| KR20230123464A (ko) | 2023-08-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7403576B2 (ja) | 多糖類－タンパク質コンジュゲートを含む多価肺炎球菌ワクチン組成物 | |
| RU2608905C2 (ru) | Иммуногенные композиции | |
| ES2642076T3 (es) | Composiciones inmunogénicas de antígenos de Staphylococcus aureus | |
| CN110859957A (zh) | 包含缀合荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其用途 | |
| JP5744842B2 (ja) | 髄膜炎菌と肺炎球菌との結合型ワクチン及びそれを使用する方法 | |
| JP2022513562A (ja) | 肺炎連鎖球菌の精製された莢膜多糖 | |
| BE1024282B1 (fr) | Compositions immunogènes | |
| JP2023546740A (ja) | プロテオグリカン複合体及びその用途 | |
| US20230101892A1 (en) | Multivalent pneumococcal vaccine compositions comprising polysaccharide-protein conjugates | |
| WO2023202607A1 (zh) | 多价肺炎球菌多糖结合疫苗的成分及其应用 | |
| CN110652585B (zh) | 多糖-蛋白缀合物免疫制剂及其制备与应用 | |
| JP2016029103A (ja) | 免疫原性組成物 | |
| CN116688109A (zh) | 多糖蛋白缀合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230620 |