CN101072586A - 多价脑膜炎球菌源性多糖－蛋白质缀合物及疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明描述了衍生的多糖－蛋白质缀合物、含一种或多种此类衍生的多糖－蛋白质缀合物的组合物以及用其免疫人类患者的方法。衍生的多糖－蛋白质缀合物是得自脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)血清群A、C、W－135和Y的纯化的荚膜多糖，其是化学衍生活化的，并利用共价化学键选择性连接至载体蛋白，形成能够激发针对各种脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的长期持续的免疫性的多糖－蛋白质缀合物。

Description

多价脑膜炎球菌源性多糖-蛋白质缀合物及疫苗

发明背景

1.发明领域

本发明总的来说涉及医学领域，更具体地说涉及微生物学、免疫学、疫苗以及通过免疫预防细菌病原体感染。

2.相关领域概述

脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)是全球细菌性脑膜炎和脓毒症的主要病因。在最近的30年中，地方性脑膜炎球菌性疾病的发病率在发达国家为每100,000人中有1到5人，而在发展中国家为每100,000人中有10到25人(Reido，F.X.等，(1995) Ped.Infect.Dis.J.14，643-657页)。流行期间脑膜炎球菌性疾病的发病率接近每1000,000人中有1,000人。在美国，每年大约有2,600例细菌性脑膜炎病例，而在发展中国家平均有330,000例。病死率在10到20％之间。

病原性脑膜炎球菌被附着在其生物体外膜表面的多糖荚膜所包被。基于荚膜多糖的免疫学特异性，已鉴别出13个不同的脑膜炎球菌血清群(Frasch，C.E.等，(1985) Rev.Infect.Dis.7，504-510页)。在这13个血清群中，有5个引起了大多数的脑膜炎球菌性疾病；它们包括血清群A、B、C、W-135和Y。血清群A引起大部分流行性疾病。血清群B、C和Y引起大多数的地方病和局部爆发。

人类鼻-口咽粘膜是唯一已知的脑膜炎奈瑟氏球菌的天然贮库。定居在粘膜细胞的外表面以及鼻咽的上皮下组织均有发生。脑膜炎球菌的携带可持续数月。脑膜炎球菌通过直接接触或通过空气飞沫传播。脑膜炎球菌借助于由胞吞作用产生的吞噬泡穿过粘膜上皮而变成侵入性的。宿主对入侵的脑膜炎球菌的防御依赖于补体介导的溶菌作用。负责补体介导溶菌作用的血清抗体大部分针对外部荚膜多糖。

已经描述了基于脑膜炎球菌多糖的疫苗，其激发针对荚膜多糖的免疫应答。这些抗体能引起对血清群特异性脑膜炎球菌的补体介导溶菌作用。业已表明脑膜炎球菌多糖疫苗对儿童和成人有效(Peltola，H.等，(1997) New Engl.J.Med 297，686-691页和Artenstein，M.S.等，(1970) New Engl.J.Med.282，417-420页)，但在婴儿和幼儿中的效力有限(Reingold，A.L.等，(1985) Lancet 2，114-118页)。对年幼群体，此多糖的后继给药激发弱加强应答或无加强应答(Goldschneider，I.等，(1973) J.Infect.Diseases 128，769-776页和Go1d，R.等，(1977) J. Infect.Diseases.136，S31-S35)。脑膜炎球菌多糖疫苗激发的保护期不能持续很久，并且已推测出在成人和4岁以上儿童中为3-5年(Brandt，B.L.和Artenstein，M.S.(1975) J.Infect.Diseases.131，S69-S72页；Kyhty，H.等，(1980) J.Infect.Diseases.142，861-868页，和Cessey，S.J.等，(1993) J.Infect.Diseases.167，1212-1216页)。对1-4岁的儿童而言保护期少于3年(Reingold，A.L.等，(1985) Lancet 2，114-118页)。

多糖不能与主要组织相容性复合物分子结合，而这是抗原呈递至T辅助淋巴细胞并刺激T辅助淋巴细胞的前提条件，即它们是非T细胞依赖性抗原。多糖能够在不借助于T辅助淋巴细胞的情况下刺激B淋巴细胞产生抗体。由于对B淋巴细胞的非T细胞依赖性刺激，在这些抗原免疫后缺乏记忆诱导。多糖抗原能够在成人中激发非常有效的非T细胞依赖性应答，但这些非T细胞依赖性应答在婴儿和幼儿的不成熟免疫系统中却很弱。

非T细胞依赖性多糖抗原可通过将多糖共价连接至蛋白质分子(“载体”或“载体蛋白质”)而转变为T细胞依赖性抗原。与缀合疫苗的多糖组分结合的B细胞可被对作为缀合载体蛋白质一部分的肽特异性的T辅助细胞所活化。对载体蛋白质的T辅助细胞应答用来增加针对多糖的抗体产生。

业已表明，血清群B多糖在人群中具有弱免疫原性至无免疫原性(Wyle，F.A.等，(1972) J.Infect.Diseases.126，514-522页)。此血清群多糖与蛋白质的化学连接未显著改变实验动物中的免疫应答(Jennings，H.J.和Lugowski，C.(1981) J.Immunol.127，1011-1018页)。据认为对此血清群多糖缺乏免疫应答的原因产生于：血清群B多糖与多唾液酸化的宿主糖蛋白如神经细胞粘附分子之间的结构相似性。

一种基于血清群C多糖的脑膜炎球菌缀合疫苗已有叙述。这种单价疫苗激发针对相应于血清群C的脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)菌株上存在的荚膜多糖的强功能性抗体应答。这种疫苗仅仅能够预防由血清群C细菌引起的疾病。

现有的基于脑膜炎球菌多糖的疫苗对幼儿的用途有限，而且不能为成人提供持久保护。已被证实能够在所有有脑膜炎球菌感染风险的群体(包括儿童)中产生持久保护的唯一的脑膜炎球菌疫苗以脑膜炎奈瑟氏球菌单一血清群的多糖为基础，不能提供抗其它血清群感染的保护作用。因此，就需要一种能够在有脑膜炎球菌感染风险的儿童和成人中提供抗脑膜炎球菌性疾病的广谱、长效保护作用的脑膜炎球菌缀合疫苗。本发明的多价脑膜炎球菌多糖通过提供疫苗制剂解决了这一需要，在所述制剂中来源于脑膜炎奈瑟氏球菌主要致病血清群的免疫原性多糖已通过与载体蛋白质缀合而转变成T细胞依赖性抗原。

FDA颁发许可证的脑膜炎球菌多糖疫苗一直基于采用幼兔补体的杀菌活性试验(SBA-BR)，该试验使用用所许可疫苗免疫的人员的血样实施。许多政府和专家小组公布了以此类试验评价脑膜炎球菌多糖疫苗的现行要求和建议，例如：

世界卫生组织生物制品标准化专家委员会(WHO ExpertCommittee on Biological Standardization)，其证实在用抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A和C的脑膜炎球菌疫苗免疫的健康成年受试者中诱导杀菌抗体的产生(WHO 1976)；

国际比较研究中用于确立所述试验标准化用参数的CDCSB-BR，使用相同标准参比血清-CDC供体R21654-3430107，该血清是比较研究中质量控制血清样品之一(Maslanka SE等，1997. Clin. Diagn.Lab.Immunol.4：156-167)；以及

世界卫生组织疫苗和生物制品部专家委员会(WHO ExpertCommittee of the Department of Vaccines and Biologicals)推荐的作为最佳方法的标准化CDC方法(WHO 1999)。

由于已经证明人类对脑膜炎球菌性疾病的免疫性与利用血清杀菌活性试验(SBA)检测的补体介导的杀菌抗体水平密切相关，所以同意颁发许可证(Goldschneider，I等，1969， J.Eep.Med.129：1307-1326和Goldschneider，I等，1969， J.Exp.Med.129：1327-1348)。已使用人补体在试验(SBA-H)中确定了抗血清群C的1∶4 SBA效价的替代水平。但是，脑膜炎球菌多糖疫苗的许可要求是基于使用幼兔补体作为该试验的补体来源(SBA-BR)诱导血清杀菌反应(World HealthOrganization，1976，Requirements for meningococcal polysaccharidevaccine.World Health Organization technical report series，no.594.World Health Organization，Geneva，Switzerland(WHO，1976))。根据此推荐标准，当针对下列靶菌株或等同菌株：对应血清群A的A1、对应血清群C的C11、对应血清群Y的S-1975、对应血清群W-135的S-4383进行测试时，至少90％接种脑膜炎球菌多糖疫苗的受试者的血清抗体效价应在免疫后2-4周表现出4倍以上的升高(WHO 1976，WHO 1981，Bureau of Biologics(生物制品管理署)，Food and DrugAdministration July 17，1985)。生物制品管理署采纳了WHO的推荐标准，并且基于此要求在美国颁发了血清群A和C组合以及血清群A、C、Y和W-135组合的脑膜炎球菌多糖疫苗的许可证。为有利于各实验室之间对脑膜炎球菌疫苗诱导的杀菌活性的比较，经过多实验室研究建立了一种利用幼兔补体的标准化SBA(SBA-BR)(Maslanka SE等，1997. Clin.Diagn.Lab.Immunol.4：156-167)。

由于C型脑膜炎球菌缀合疫苗的资料开始变得可以得到，所以有关在测定中使用兔补体可能导致假的高SBA效价的担心开始出现。在1999年3月澄清和解决关于用于分析人血清中脑膜炎球菌血清群A和C特异性抗体之实验室测定法的问题的会议之后，世界卫生组织生物制品标准化专家委员会推荐使用采用幼兔补体的SBA来测量针对血清群C的抗体反应(World Health Organization，1999.Standardization and validation of serological assays for the evaluation ofimmune responses to Neisseria meningitides serogroup A/C vaccines.Geneva，WHO/V&B/99.19(WHO 1999))。为努力避免使用幼兔补体高估保护作用，WHO建议开展研究，以便将通过使用幼兔补体的SBA试验所测定的阈值效价与使用人补体所测定的SBA效价关联起来。召开后续会议，得出的结果支持这样一个总的结论：使用幼兔补体时＜1∶8的SBA效价与缺乏抗血清群C的保护作用相关联，而使用幼兔补体时≥1∶128的SBA效价与使用人补体时的1∶4保护性SBA效价良好关联。未提供有关其它脑膜炎球菌血清群(如A、Y或W-135)或多糖缀合物的相应关联SBA-BR效价的信息。

使用幼兔补体时1∶8至1∶64之间的SBA效价不一定与使用人补体时1∶4的保护性SBA效价良好关联(Jodar L等， Biologicals2002；30：323-329)。WHO专家委员会推荐，1∶8、1∶16、1∶32和1∶64的接种后SBA-BR效价要使用人补体再评价。解决1∶8、1∶16、1∶32和1∶64的SBA-BR效价不确定性的其它措施包括接种前和接种后之间抗体SBA效价升高至4倍的评价。还证明有与保护相关的记忆，但专家委员会公认可得到的有关这些替代方法的资料不不充分或者有限。

高于1∶8的SBA-BR效价是人对脑膜炎球菌性疾病免疫性的较好指标，该效价是从免疫前至免疫后约15至约45天的免疫后阶段内SBA-BR效价的4倍以上升高。

在一个实施方案中，本发明提供用多价脑膜炎球菌多糖缀合组合物免疫人类患者的方法，其中人类患者血清SBA-BR效价为1∶16或更高，优选为1∶32或更高，更优选为1∶64或更高，再更加优选为1∶128或更高。在再进一步的实施方案中，本发明提供用脑膜炎球菌多糖缀合组合物免疫人类患者的方法，其中接种前后人类患者抗体SBA效价有4倍以上的升高。

在再一个实施方案中，本发明提供通过用多价脑膜炎球菌多糖缀合组合物免疫人类患者来为人类患者提供抗多种血清群脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫性的方法，其中所述组合物包含两种以上多糖，这些多糖选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A和W-135；Y和W-135；C和Y；C和W-135；A、C和Y；A、C和W-135；C、Y和W-135；A、Y和W-135以及A、C、Y和W-135。

在再进一步的实施方案中，本发明提供通过用多价脑膜炎球菌(纯化的)多糖缀合组合物免疫人类患者来为人类患者提供抗多种血清群脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫性的方法，其中所述多糖经衍化小于100,000道尔顿。在本发明的一个实施方案中，纯化的多糖被解聚成约5,000至约75,000道尔顿的多糖平均分子量；优选为约7,000至约50,000道尔顿的多糖平均分子量；更加优选为约8,000至约35,000道尔顿的多糖平均分子量；甚至更加优选为约12,000至约25,000道尔顿的多糖平均分子量。在本发明的一个实施方案中，组合物中的多糖平均分子量在约15,000至约22,000道尔顿之间。

发明概述

本发明提供一种方法，所述方法通过给予脑膜炎球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫组合物提供针对致病性脑膜炎奈瑟氏球菌所致脑膜炎球菌性疾病的人类免疫性。

在本发明的一个实施方案中，所述免疫组合物包含两种以上的蛋白质-多糖缀合物，其中每种缀合物均包含缀合至载体蛋白质的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖。在一个优选实施方案中，所述免疫组合物包含两种以上不同的蛋白质-多糖缀合物，其中每种缀合物均包含缀合至载体蛋白质的不同血清群脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖。

本发明提供一种方法，所述方法提供针对致病性脑膜炎奈瑟氏球菌所致脑膜炎球菌性疾病的人类免疫性，所述方法包括给予含两种以上不同蛋白质-多糖缀合物的免疫组合物，其中每种缀合物均包含缀合至载体蛋白质的不同血清群脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖。

本发明提供一种方法，所述方法提供针对致病性脑膜炎奈瑟氏球菌所致脑膜炎球菌性疾病的人类免疫性，所述方法包括给予脑膜炎球菌多糖-蛋白质缀合物。本发明提供多价脑膜炎球菌疫苗，其包含免疫有效量的2-4种不同蛋白质-多糖缀合物，其中每一种缀合物均包含与载体蛋白质缀合的不同荚膜多糖，并且其中每一种荚膜多糖均选自血清群A、C、W-135和Y的荚膜多糖。本发明还提供诱导抗脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖的免疫应答的方法，其包括给予人免疫有效量的本发明免疫组合物。在一个实施方案中，多价脑膜炎球菌疫苗包含免疫有效量的两种不同蛋白质-多糖缀合物，其中每一种缀合物均包含与载体蛋白质缀合的不同荚膜多糖，并且其中每一种荚膜多糖均选自血清群A、C、W-135和Y的荚膜多糖，更优选包含荚膜多糖A和W-135、A和Y、C和W-135、C和Y以及W-135和Y。在一个实施方案中，多价脑膜炎球菌疫苗包含免疫有效量的三种不同蛋白质-多糖缀合物，其中每一种缀合物均包含与载体蛋白质缀合的不同荚膜多糖，并且其中每一种荚膜多糖均选自血清群A、C、W-135和Y的荚膜多糖，更优选包含荚膜多糖A、C和W-135；A、C和Y；C、Y和W-135；C、W-135和Y；以及A、W-135和Y。在另一个实施方案中，多价脑膜炎球菌疫苗包含免疫有效量的四种不同蛋白质-多糖缀合物，其中每一种缀合物均包含与载体蛋白质缀合的不同荚膜多糖，并且其中每一种荚膜多糖均选自血清群A、C、W-135和Y的荚膜多糖。

本发明还提供诱导抗脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖的免疫应答的方法，其包括给予人或动物免疫有效量的本发明免疫组合物。

本发明提供一种多价脑膜炎球菌疫苗，其包含免疫有效量的2-4种不同蛋白质-多糖缀合物，其中每一种缀合物均包含与载体蛋白质缀合的不同荚膜多糖，并且其中每一种荚膜多糖均选自血清群A、C、W-135和Y的荚膜多糖。

本发明提供了保护易感染脑膜炎奈瑟氏球菌的人或动物的方法，其包括给予人或动物免疫有效量的本发明疫苗。

在再一个实施方案中，本发明提供对第一剂、第二剂、第三剂等脑膜炎球菌疫苗或免疫原性组合物后激发的应答进行加强的方法。在这些实施方案的某一些实施方案中，第一剂(或更多剂)脑膜炎球菌疫苗或免疫原性组合物包含一个或多个血清群脑膜炎奈瑟氏球菌(血清群A、B、C、Y、W-135等)的荚膜多糖。在某些其它实施方案中，第一剂(或更多剂)脑膜炎球菌疫苗或免疫原性组合物包含一个或多个血清群的脑膜炎奈瑟氏球菌(血清群A、B、C、Y、W-135等)的荚膜多糖，其中荚膜多糖缀合至一种或多种载体(例如载体蛋白质)。在优选实施方案中，所述载体蛋白质为免疫原性的，和/或提供额外的治疗利益或其它利益。在某些优选实施方案中，在一剂或多剂脑膜炎球菌疫苗或免疫原性组合物之后在受试者(例如人)中激发的初次应答通过随后的一剂或多剂含1、2、3、4或更多个不同血清群的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖的疫苗或免疫原性组合物来加强。但是，本发明不限于给予一次或多次初免剂量的、含非缀合荚膜多糖的疫苗或免疫原性组合物，本发明也无意限于给予一次或多次含缀合的荚膜多糖-载体蛋白质免疫原性组合物或疫苗的加强剂量。同样，本发明无意受限于初免或加强免疫给药的时间间隔。

本发明另外的实施方案提供联合疫苗组合物，其包含1、2、3或4种不同蛋白-多糖缀合物和一种或多种得自疫苗组合物(例如已获颁许可证的疫苗)的抗原或免疫原性组分。在其它实施方案中，本发明提供含1、2、3或4种不同蛋白-多糖缀合物和得自疫苗(例如已获颁许可证的疫苗)组合物的一种或多种抗原或抗原性组分的免疫原性组合物。本发明设想(但不限于)组合1-4种不同的脑膜炎奈瑟氏球菌蛋白质-多糖缀合物和用于预防或改善非脑膜炎奈瑟氏球菌所致疾病作用的疫苗的免疫原性组分(例如抗原)。例如，在某些实施方案中，本发明提供含1、2、3或4种不同蛋白-多糖缀合物和一种或多种得自已获颁许可证的疫苗之组分的免疫原性组合物，所述已获颁许可证的疫苗通常给予旅行者，包括但不限于抗伤寒的疫苗(例如TyphimVi_)、抗黄热病的疫苗(例如YF-VAX_)、抗脊髓灰质炎的疫苗等。在其它实施方案中，本发明提供1-4种不同脑膜炎奈瑟氏球菌蛋白-多糖缀合物和疫苗的免疫原性组合物的组合，所述疫苗用于预防或改善肝炎(例如甲、乙、丙、丁或戊型肝炎)、天花和牛痘、AIDS、结核、白喉、流感嗜血杆菌、麻疹、流行性腮腺炎、百日咳、肺炎球菌疾病、脊髓灰质炎、风疹、破伤风、水痘、腺病毒疾病、炭疽、霍乱、脑炎(例如日本脑炎、蜱传脑炎等)、鼠疫、狂犬病、伤寒、疱疹、疟疾、寄生虫病、痘病毒疾病、呼吸道合胞体病毒疾病、轮状病毒、甲病毒感染(例如委内瑞拉、西方或东方马脑炎、屈曲病毒(Chikungunyavirus)疾病、罗斯河病毒(Ross River virus)疾病等)、布尼亚病毒疾病(例如裂谷热、汉坦病毒)、沙粒病毒(例如胡宁病毒(Junin virus)病)、立克次氏体病(例如Q热)、兔热病、布鲁氏菌病、假单胞菌病、肉毒中毒、西尼罗河病和葡萄球菌感染连同基于其它病毒、细菌和寄生虫的疾病的作用。在优选实施方案中，与本发明的不同脑膜炎奈瑟氏球菌蛋白质-多糖缀合物联合(例如共同给予)给予的非脑膜炎奈瑟氏球菌免疫原性组合物来自已获颁许可证的疫苗。但是，本发明并不限于这些组合和使用这些组合的方法。实际上，本发明还提供1-4种不同脑膜炎奈瑟氏球菌蛋白质-多糖缀合物和未获许可(例如实验性)的非脑膜炎奈瑟氏球菌疫苗或免疫原性组合物之免疫原性组分的组合。

可共同给予1-4种不同脑膜炎奈瑟氏球菌蛋白-多糖缀合物和非脑膜炎奈瑟氏球菌疫苗或免疫原性组合物之免疫原性组分的组合。在某些实施方案中，在两个或多个部位使用相似或不相似的给予方法完成1-4种不同脑膜炎奈瑟氏球菌蛋白-多糖缀合物和非脑膜炎奈瑟氏球菌疫苗或免疫原性组合物之免疫原性组分的共同给予。在这些实施方案的另外一些实施方案中，通过将两种或多种组合物物理组合成单一聚集组合物，然后使用一种或多种给药途径在一个或多个部位给予，完成1-4种不同脑膜炎奈瑟氏球菌蛋白-多糖缀合物和非脑膜炎奈瑟氏球菌疫苗或免疫原性组合物之免疫原性组分的共同给予。

可以在时间上以秒、分、小时、天等分隔的两个不同时间实施1-4种不同脑膜炎奈瑟氏球菌蛋白-多糖缀合物和非脑膜炎奈瑟氏球菌疫苗或免疫原性组合物之免疫原性组分的组合的给予。本发明无意受限于给予事件的途径和/或时间。

本文引用的所有专利、专利申请以及其它出版物都全文在此引入作为参考。

附图描述

图1-4显示了本发明的某些优选实施方案。

发明详述

本发明包括具有两种以上不同蛋白质-多糖缀合物的免疫组合物，其中每一种缀合物均包含与载体蛋白质缀合的荚膜多糖。因此，本发明包括含有两种以上不同的衍化荚膜多糖的组合物，其中所述荚膜多糖与一种或多种载体蛋白质缀合。

可通过本领域技术人员已知的标准技术制备荚膜多糖。在本发明中，优选从脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y制备荚膜多糖。

在优选实施方案中，这些脑膜炎球菌血清群缀合物通过单独的方法制备，并配制成单剂量制剂。例如，从脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y中分别纯化荚膜多糖。

在本发明的优选实施方案中，纯化的多糖在缀合至载体蛋白质前被解聚并活化。在本发明的优选实施方案中，利用温和氧化条件将脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的荚膜多糖部分解聚。

天然的脑膜炎球菌多糖约为500,000-1,500,000道尔顿。本发明涉及较小分子量的脑膜炎球菌多糖。在纯化天然多糖时，将有一定比例的多糖是较小分子量的。然而，为了获得更好的收率，通常优选将天然脑膜炎球菌多糖解聚或衍生至优选的分子量范围，优选小于100,000道尔顿。在本发明的一个实施方案中，纯化的多糖被解聚成约5,000至约75,000道尔顿的多糖平均分子量；优选为大约7,000至大约50,000道尔顿的多糖平均分子量；更优选为约8,000至约35,000道尔顿的多糖平均分子量；再更优选为约12,000至约25,000道尔顿的多糖平均分子量。在本发明的一个实施方案中，组合物中的多糖平均分子量在约15,000至约22,000道尔顿之间。

多糖解聚或部分解聚之后可接着进行活化步骤。所谓“活化”是指对多糖进行化学处理以提供能够与载体蛋白质反应的化学基团。优选的活化方法包括在15-30℃下于pH 5.0±0.1的生理盐水中使用己二酸二酰肼处理约2小时。美国专利号5,965,714描述了一种用于活化的方法。

荚膜多糖一旦被活化，就可以将其缀合至一种或多种载体蛋白质。在本发明的优选实施方案中，每一种荚膜多糖均独立地与一种载体蛋白物质缀合。在优选实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的荚膜多糖各自独立地缀合至相同载体蛋白质物质。

载体蛋白质可以包括细菌毒素如白喉毒素、失活的细菌毒素如白喉类毒素、CRM₁₉₇、破伤风类毒素、百日咳类毒素、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST以及来自铜绿假单胞菌(Pseudornonas aeruginosa)的外毒素A。还可以使用细菌外膜蛋白，例如外膜复合体c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)或肺炎球菌粘附素蛋白质(PsaA)。其它蛋白质如卵清蛋白、匙孔_血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)也可以用作载体蛋白质。载体蛋白质优选无毒和无反应原性并且可以足够量和足够纯度获得的蛋白质。载体蛋白质应经得住标准缀合过程。在本发明的优选实施方案中，从白喉棒杆菌(Corynebacteriadiphtheriae)培养物纯化并利用甲醛化学脱毒的白喉毒素被用作载体蛋白质。一种备选的载体蛋白质是D蛋白，它是流感嗜血杆菌(H.influenza)的外膜表面暴露蛋白。

在本发明的一个实施方案中，每一种衍生多糖与载体蛋白质的平均比率为约1∶1至约1∶20(重量/重量)。在本发明的优选实施方案中，总衍生多糖与载体蛋白质的平均比率为约1∶2至约1∶10(重量/重量)，每一种衍生多糖对载体蛋白质的再更优选的平均比率为约1∶2至约1∶6(重量/重量)。在本发明的更优选的实施方案中，总衍生多糖与载体蛋白质的平均比率为约1∶(4±1)，更优选为1∶(4±0.5)，再更优选为1∶(4±0.25)(重量/重量)。

在荚膜多糖与载体蛋白质缀合后，多糖-蛋白质缀合物可通过多种技术纯化(就多糖-蛋白质缀合物的量而言为富集)。纯化步骤的一个目的是从多糖-蛋白质缀合物中去除未结合的多糖。美国专利号6,146,902中描述了一种包括在硫酸铵存在下超滤的纯化方法。或者，可以通过任何数量的标准技术从未反应的蛋白质和多糖中纯化出缀合物，所述标准技术尤其包括大小排阻层析、密度梯度离心、疏水作用层析或硫酸铵分级分离等。参见例如P.W.Anderson等，(1986).J.Immunol.137：1181-1186。还可见H.J.Jennings和C.Lugowski(1981)J.Immunol.127：1011-1018。

在将多糖和载体蛋白质缀合后，可通过组合多种衍化多糖-蛋白质缀合物来制备本发明的免疫组合物。本发明的免疫组合物包含与一种或多种载体蛋白质缀合的两种以上不同的荚膜多糖。本发明的优选实施方案是二价免疫组合物，其包含分别缀合至白喉毒素或类毒素的脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A和C的衍化荚膜多糖。更优选本发明为四价免疫组合物，其包含分别缀合至白喉毒素或类毒素的脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的荚膜多糖。

本发明部分地涉及多组分、衍化的多糖缀合物的组合物，在所述组合物中，每一种衍化多糖都以每剂约0.5至约15μg存在。因此，所述组合物可包含1-60μg的总衍化多糖。在优选实施方案中，组合物中每一种衍化多糖的相对量大约相等，差值范围在±50％内，更优选地在±30％内；再更优选地在±20％内。

载体蛋白质的制备和使用以及多种可能的缀合方法是本领域技术人员周知的。本发明缀合物可由这些技术人员使用本发明所包含的教导以及在普通文献上可轻易得到的信息来制备。也可以从以下美国专利的任一个或全部中得到指导：美国专利号4,356,170、4,619,828、5,153,312、5,422,427和5,445,817，这些专利的教导全文在此引用作为参考。

或者，可通过共同培养两种以上脑膜炎奈瑟氏球菌血清群并共纯化、解聚、活化和缀合多糖，或通过分别培养纯化脑膜炎奈瑟氏球菌血清群并在解聚、活化和缀合多糖的任何步骤之前或之后将两种以上纯化多糖混合，制备免疫组合物。

可通过从不同的脑膜炎球菌血清群分别制备多糖-蛋白质缀合物然后将缀合物混合而制备本发明免疫组合物。本发明的免疫组合物可用作疫苗。本发明疫苗的配制可利用本领域公知的方法完成。本发明的疫苗组合物还可包含一种或多种佐剂。作为实例但非限制性地，佐剂包括：铝佐剂(例如铝盐，诸如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝或其组合)、弗氏佐剂(完全佐剂或不完全佐剂)、BAY、DC-chol、pcpp、单磷酰脂质A、CpG、QS-21、霍乱毒素和甲酰甲硫氨酰肽。参见例如：Vaccine Design，the Subunit and Adjuvant Approach，1995(M.F.Powell和M.J.Newman编，Plenum Press，N.Y.)。佐剂优选为铝佐剂，如氢氧化铝或磷酸铝。

备选佐剂包括水包油乳剂制剂，例如PCT公开号WO 90/14837中所描述的MF59、SAF(含10％角鲨烷、0.4％Tween 80、5％pluronic嵌段共聚物L121和thr-MDP)、RibiTM佐剂系统(RAS)(RibiImmunochem，Hamilton，MT，含2％角鲨烯、0.2％Tween 80以及选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉酚酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)的一种或多种细菌细胞壁成分，优选MPL+CWS(DetoxTM))；皂苷佐剂，例如可以使用StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，Mass.)或者由其产生的颗粒如ISCOM(免疫刺激复合物)；细胞因子，例如白细胞介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(例如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)。

在本发明的一个实施方案中，蛋白质-多糖缀合物的平均糖基化比率(多糖与蛋白质的比率)为约0.05至约2；更优选平均比率为约0.08至约1.25；再更优选平均比率为约0.1至约0.9。在一个优选实施方案中，蛋白质-多糖缀合物的平均糖基化比率(多糖与蛋白质的比率)为约0.2至约0.8；更优选平均比率为约0.2至约0.6；再更优选平均比率为约0.3至约0.5。

如下所示，本发明的疫苗和免疫组合物在各种动物模型中激发T细胞依赖性样免疫应答，而多糖疫苗激发非T细胞依赖性样免疫应答。因此，本发明组合物也是研究针对脑膜炎奈瑟氏球菌抗原的T细胞依赖性样免疫应答中所涉及的生物学途径和过程的有用研究工具。

可以按照药学和兽医学领域一般技术人员众所周知的标准技术，考虑诸如所用具体抗原、佐剂(如果有的话)、特定动物或患者的年龄、性别、体重、物种和状况以及给药途径之类的因素，确定待给予人或动物的本发明疫苗的量以及给药方案。在本发明中，为提供有效接种剂量对抗脑膜炎奈瑟氏球菌，多糖-蛋白质载体的量可为每公斤体重约0.02μg至约5μg。在本发明的优选组合物和方法中，所述剂量为每公斤体重约0.1μg至3μg。例如，如果感染后时间过去的不长，由于细菌增殖的时间较短，则有效剂量就需要较少的抗体。同样，有效剂量取决于诊断时的细菌载量。对于治疗用途，可考虑在几天的时间段内给予多次注射。

本发明的多价缀合物可以单次剂量或以系列剂量(即有“一次加强”或“数次加强”)给予。例如，就像目前对预防儿童疾病的其它疫苗所推荐的那样，儿童可以在生命早期接受单次剂量，接着接受加强剂量一直到10年后。

加强剂量可使敏化B细胞产生抗体，即回忆应答。也就是说，多价缀合物疫苗与获颁许可证的多糖疫苗相比，在年幼群体中激发高初次(即在单次疫苗给予后)功能性抗体应答，并能够激发回忆应答(即在加强给予后)，这表明由本发明的多价缀合疫苗所激发的保护性免疫应答是长效的。

本发明组合物可包括经管口例如口、鼻、肛、阴道、经口、胃内、粘膜(例如经舌、肺泡、齿龈、嗅觉或呼吸道粘膜)等给予用的液体制剂，诸如混悬剂、糖浆剂或酏剂；以及经肠胃外、皮下、皮内、肌内、腹膜内或静脉给予(例如注射给予)用的制剂，诸如无菌混悬剂或乳剂。优选静脉内和肠胃外给予。此类组合物可以与适当载体、稀释剂或赋形剂诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖等混合。组合物也可以被冻干。组合物可含诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、胶凝剂或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等辅料，这取决于所需的给药途径和剂型。可参考标准教科书如“REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCE”，第17版，1985(在此并入作为参考)来制备适宜的制剂，而无需过度不当实验。

在本发明的一个实施方案中，优选的给药途径是肌内或皮下，优选肌内途径。可通过注射或备选的递送装置给予。本发明组合物可作为液体制剂方便地提供，所述液体制剂例如为可被缓冲至选定pH的等渗水溶液、混悬液、乳液或粘性组合物。如果优选消化道吸收，则本发明组合物可以为药丸、片剂、胶囊、膜片(caplet)等“固体”形式，包括缓释或具有液体填充物(例如以明胶包裹的液体，由此明胶在胃中溶解，用于递送至消化道)的“固体”制剂。如果期望鼻腔或呼吸道(粘膜)给予，则组合物可采用某种形式并通过压力喷雾分配器、泵分配器或气溶胶分配器分配。气溶胶通常处于依靠碳氢化合物产生的压力下。泵分配器优选可分配定量剂量或具有特定粒径的剂量。

液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更易制备。另外，液体组合物对给予(尤其是通过注射或口服方式)动物、儿童(尤其是幼儿)和其它可能难以吞咽药丸、片剂、胶囊等的个体或在多剂量给药情况下稍微更便利。另一方面，可将粘性组合物配制在适当的粘度范围内，以提供更长的粘膜(诸如胃内衬或鼻粘膜)接触期。

在本发明的优选实施方案中，疫苗组合物配制成无菌液态、无热原磷酸盐缓冲的生理盐水，有或没有防腐剂。在一个优选实施方案中，每剂配方含约0.3至约1.0mg磷酸钠、约3.5至约6.0mg氯化钠以及加至1.5mL的水。在一个优选实施方案中，每剂配方含约0.6±0.2mg磷酸钠、4.4±0.2mg氯化钠以及加至约0.5±0.2mL的水。

显然，对适当载体和其它添加剂的选择将取决于确切给药途径和特定剂型的性质，例如液体剂型(例如组合物配制成溶液、混悬液、凝胶还是另一种液体形式)或固体剂型(例如组合物配制成药丸、片剂、胶囊、膜片、缓释型还是液体填充型)。

溶液、混悬液和凝胶除含有活性成分之外通常还含有大量水(优选纯化水)。还可存在少量的其它成分，例如pH调节剂(例如碱，如氢氧化钠)、乳化剂或分散剂、缓冲剂、防腐剂、湿润剂、胶凝剂(例如甲基纤维素)、着色剂和/或调味剂。组合物可为等渗的，即它可以具有与血液和泪液相同的渗透压。

本发明组合物的所需等渗性可以利用酒石酸钠、丙二醇或其它无机或有机溶质实现。在一个实施方案中，由磷酸钠或氯化钠或其混合物获得组合物的优选等渗性。对于含钠离子的缓冲液而言，特别优选氯化钠。

组合物的粘度可使用药学可接受的增稠剂维持在选定水平。由于甲基纤维素可容易且经济地获得，而且易于配伍，所以优选甲基纤维素。其它适宜的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的优选浓度取决于选定试剂。要点是使用可达到所选粘度的量。粘性组合物通常通过添加此类增稠剂而由溶液制备。

可使用药学可接受的防腐剂来增加组合物的保存期。苯甲醇可能是适宜的，尽管还可使用各种防腐剂，包括例如对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、三氯叔丁醇或苯扎氯铵。防腐剂的适宜浓度为总重的0.02％-2％，但根据所选试剂可显著变化。

本领域技术人员将认识到：必须选择对脑膜炎奈瑟氏球菌多糖-蛋白质载体缀合物为化学惰性的组合物组分。

援引下列示例性、非限制性的实施例进一步阐述本发明，所述实施例详细阐明了本发明构思的几个优选实施方案。在不背离本发明精神的情况下，本发明的其它实施例对本领域技术人员而言是显而易见的。

以下缩写和商标为：ACIP，免疫实施咨询委员会(AdvisoryCommittee on Immunization Practices)；AE，不良事件：Cetavalon^TM，溴化十六烷基三甲基铵，CTAB；CFR，联邦法规(Code of FederalRegulation)；CRF，病例报告表；DTP，白喉-破伤风-百日咳；ELISA，酶联免疫吸附测定；FDA，美国食品药品管理局；GCP，药品临床试验管理规范；GMC，几何平均浓度；GMT，几何平均效价；IgG，免疫球蛋白G；IgG1，免疫球蛋白G亚类1；IgG2，免疫球蛋白G亚类2；IgM，免疫球蛋白M；ICH，国际协调会议；IND，研究用新药；IRB，机构审查委员会；MenA/C-Dt，二价(A和C)脑膜炎球菌多糖-白喉缀合疫苗；MenPS，脑膜炎球菌群特异性多糖；mL，毫升；Menomune^TM，获颁许可证的脑膜炎球菌A、C、Y和W-135多糖疫苗；OD，光密度；PBS，磷酸缓冲盐溶液；SAE，严重不良事件；SBA，血清杀菌活性；SBA-BR，使用幼兔补体进行的血清杀菌活性试验；SBA-HC，使用人补体进行的血清杀菌活性试验；SIDS，婴儿猝死综合症；TetraMenD，四价(A、C、Y和W-135)脑膜炎球菌多糖-白喉缀合疫苗；Td，破伤风和白喉疫苗；UAE，预料外不良事件；URI，上呼吸道感染；μg，微克。

实施例

实施例1    脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的纯化荚膜多糖粉末的制备

粗制膏浆的制备

分别将脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y湿冻种子培养物融化，并在液体Watson Scherp培养基中复苏，而后接种至含有Mueller Hinton琼脂培养基的Blake培养瓶中。将Blake培养瓶在CO₂气氛中于35-37℃培养15-19小时。培养期后，将生长物从Blake培养瓶中移出并加至含有Watson Scherp培养基的4 L摇瓶中。摇瓶在水平摇床上于35-37℃培养3-7小时。将4 L摇瓶中的内容物转移至含有Watson Scherp培养基的发酵罐中。发酵罐在35-37℃培养7-12小时，同时控制溶解氧含量和pH，进行补料和消泡剂添加。培养期后，将发酵罐内容物转移至500 L大罐中，加入Cetavlon^TM，将材料混合1小时。将Cetavlon^TM处理的生长物以每小时约30-70升的流速以约15,000-17,000×g离心。利用第二次Cetavlon^TM沉淀将粗制多糖从上清液中沉淀出来。向上清液中加入Cetavlon^TM并将材料在室温下混合至少1小时。将材料于1-5℃贮藏8-12小时。以每分钟300-400ml的流速以约45,000-50,000×g离心收集沉淀的多糖。将收集的膏浆贮藏于-60℃或更低温度，直至进一步处理。

纯化多糖粉末的制备

将未活化的膏浆融化并转移至搅拌器中。将膏浆于0.9M氯化钙中搅拌以得到均一悬浮液。悬浮液以约10,000×g离心15分钟。通过不脱毛垫将上清液倾析入容器中，作为第一次提取物。向膏浆中加入第二份体积的0.9M氯化钙，搅拌得到均一悬浮液。悬浮液如上所述离心，将上清液与来自第一次提取的上清液混合。总共进行4次提取，并将上清液混合。合并的提取物通过使用10-30 kDa MWCO螺旋卷式超滤单元超滤来浓缩。

向浓缩物中加入氯化镁，并用氢氧化钠调节pH值为7.2-7.5。向浓缩物中加入DNA酶和RNA酶，并在混合下于25-28℃温育4小时。加乙醇至浓度为30-50％。通过以10,000×g离心2小时除去沉淀的核酸和蛋白质。回收上清液，通过加入乙醇至80％并使其于1-5℃静置过夜使多糖沉淀。虹吸除去乙醇，并将沉淀的多糖以10,000×g离心5分钟。用乙醇洗涤沉淀的多糖。用丙酮洗涤多糖，以10,000×g离心15-20分钟。将多糖真空干燥。将初始多糖粉末溶于乙酸钠溶液中。加入氯化镁，并用氢氧化钠溶液调节pH至7.2-7.5。向溶液中加入DNA酶和RNA酶，并在混合下于25-28℃温育4小时，以去除残余核酸。在与这些酶温育后，向多糖-酶混合物中加入等体积的乙酸钠-苯酚溶液，并置于1-5℃水平摇床中约30分钟。将混合物以10,000×g离心15-20分钟。将上部水层回收并保存。向水层中加入等体积乙酸钠-苯酚溶液，并如上提取。总共进行4次提取，以便从多糖溶液中去除蛋白质和内毒素。合并的水相提取物用注射用水稀释达10倍，并对10倍体积注射用水透析。向透析后的多糖中加入氯化钙。通过加入乙醇至80％于1-5℃过夜沉淀多糖。移去乙醇上清液，并通过以10,000×g离心15分钟收集多糖。纯化的多糖用乙醇洗涤两次，并用丙酮洗涤一次。将洗涤后的粉末在干燥器中进行真空干燥。干粉贮藏于-30℃或更低温度，直至被加工到缀合物上。

实施例2    脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的纯化

荚膜多糖粉末的解聚

本制备所用材料包括来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的纯化荚膜多糖粉末(按照实施例1制备)、无菌的50mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0)、无菌的1N盐酸、无菌的1N氢氧化钠、30％过氧化氢以及无菌生理盐水(0.85％氯化钠)。

以单独的反应解聚每种血清群多糖。向一不锈钢罐中装入达60克的纯化荚膜多糖粉末。向多糖中加入无菌的50mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0)，得到每升2.5g多糖的浓度。在1-5℃下使多糖溶液混合12-24小时，以实现溶解。将反应罐与热交换器单元相连。加入另外的50mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0)，以稀释多糖至每升1.25g的反应浓度。将多糖溶液加热至55℃±0.1℃。向反应混合物中加入等份的30％过氧化氢，获得1％过氧化氢的反应浓度。

通过随时间跟踪多糖分子量的变化来监控反应进程。每隔15-20分钟，从反应混合物中取出等份部分并注射至HPSEC柱，以测量多糖的分子量。当多糖的分子量达到目标分子量时，关闭加热器并通过冰水浴循环将多糖溶液迅速冷却至5℃。通过将反应罐与配有3000MWCO再生纤维素柱的超滤器连接，将解聚多糖溶液浓缩至每升15g。使浓缩后的解聚多糖溶液对10倍体积无菌生理盐水(0.85％氯化钠)透析。将解聚多糖贮存于1-5℃，直至下一处理步骤。

通过流经凝胶过滤层析柱以及通过多角度激光光散射确定解聚多糖的分子量，所述凝胶过滤层析柱以商品名“Ultahydrogel.TM.250”售卖，用葡聚糖分子量标准品来校准。使用Bartlet G.R.J(1959)Journalof Biophygical Chemistry，234，466-468页所述的方法根据血清群A的磷含量，并使用Svennerholm L.((1955)，Biochimica Biophysica Acta，24，604-611页所述的方法根据血清群C、W-135和Y的唾液酸含量，来测定多糖量。通过Hesterin S.(1949)Journalof Biological Chemistry，180，249页所述的方法测定O-乙酰基含量。通过Park J.T.和JohnsonM.J.(1949)Journal of Biological Chemistry，181，149-151页所述的方法测定还原活性。解聚多糖的结构完整性通过蛋白1H和13C NMR确定。解聚多糖的纯度通过测量LAL(内毒素)含量和残余过氧化氢含量来确定。

实施例3    脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y解聚多糖的衍生化

本制备所用材料包括过氧化氢解聚的脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y荚膜多糖(按照实施例2制备)、己二酸二酰肼、仅用于血清群A的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)、氰基硼氢化钠、无菌的1N盐酸、无菌的1N氢氧化钠、无菌的1M氯化钠以及无菌生理盐水(0.85％氯化钠)。

以单独的反应衍化每一种血清群多糖。向一不锈钢罐中装入纯化的解聚多糖，并用无菌0.85％生理盐水稀释，以达到每升6g多糖的终反应浓度。向该溶液中加入溶于无菌0.85％生理盐水的己二酸二酰肼的浓等分试样，以达到每升1g的反应浓度。仅对于血清群A，将EDAC作为溶于无菌0.85％生理盐水的浓等分试样加入，以达到每升1g的反应浓度。调节pH值至5.0±0.1，并利用无菌的1 N盐酸和无菌的1 N氢氧化钠在室温下(15-30℃)维持此pH值达2小时。2小时后，向此反应混合物中加入溶于0.85％生理盐水的氰基硼氢化钠浓等分试样，以达到每升2g的反应浓度。在室温下(15-30℃)搅动反应物44±4小时，同时维持pH值于5.5±0.5。此反应期后，将pH值调至6.0±0.1，并通过将反应罐连接至配有3000 MWCO再生纤维素柱的超滤器将衍化的多糖浓缩至每升12g多糖。使浓缩后的衍化多糖对30倍体积的1M氯化钠透析，接着对10倍体积的0.15M氯化钠透析。将反应罐与超滤器拆开，并在1-5℃贮藏7天。将反应罐与配有3000 MWCO再生纤维素柱的超滤器重新连接，并对30倍体积的1M氯化钠透析，接着对10倍体积的0.15M氯化钠透析。

通过与对解聚多糖所用方法相同的方法测量衍化多糖的分子量、多糖量以及O-乙酰基含量。通过Snyder，S.L.和Sobocinski，P.Z.(1975)Analytical Biochemistry，64，282-288页的2，4，6-三硝基苯磺酸法测定酰肼含量。衍化多糖的结构完整性通过质子¹H和¹³C NMR确定。衍化多糖的纯度通过测量未结合的酰肼水平、LAL(内毒素)含量和残余氰基硼氢化物含量来确定。

实施例4    载体蛋白质的制备

粗制白喉类毒素蛋白的制备

将冻干的种子培养物复水并培养16-18小时。取一等份培养物转移至含有生长培养基的0.5升摇瓶中，并将培养瓶在旋转摇床上于34.5-36.5℃培养7-9小时。从培养瓶取一等份转移至含有生长培养基的4升摇瓶中，并将培养瓶在旋转摇床上于34.5-36.5℃培养14-22小时。使用来自4升摇瓶中的培养物接种含生长培养基的发酵罐。将发酵罐在34.5-36.5℃培养70-144小时。发酵罐内容物通过深层滤器过滤至收集器中。向收获物中加入等份的37％甲醛溶液，以达到0.2％的浓度。将pH调节至7.4-7.6。将收获物通过0.2微米过滤柱过滤至无菌的20升瓶中。将瓶子于34.5-36.5℃温育7天。向每一20升瓶中加入等份的37％甲醛溶液，以达到0.4％的浓度。调节混合物pH值至7.4-7.6。将瓶子在摇床上于34.5-36.5℃温育7天。向每一20升瓶中加入等份的37％甲醛溶液，以达到0.5％的浓度。调节混合物pH值至7.4-7.6。将瓶子于34.5-36.5℃温育8周。对粗制类毒素进行脱毒测试。在测试期间将瓶子贮藏于1-5℃。

粗制白喉类毒素蛋白的纯化

将粗制类毒素升温至室温，并将20升瓶中的内容物合并入纯化罐中。调节类毒素pH值至7.2-7.4，向粗制类毒素中加入活性炭并混合2分钟。使活性炭类毒素混合物静置1小时，然后通过深层过滤柱过滤至第二个纯化罐中。向滤液中加入固体硫酸铵，以达到70％饱和度。调节pH值至6.8-7.2，并使溶液静置16小时。经过滤收集沉淀的蛋白质，并用70％饱和度的硫酸铵溶液(pH 7.0)洗涤。将沉淀溶于无菌蒸馏水中，并将蛋白质溶液过滤至不锈钢收集器中。调节pH值至6.8-7.2，并加入硫酸铵至40％饱和度。调节溶液pH值至7.0-7.2，并使溶液静置16小时。沉淀通过过滤去除并丢弃。向滤液中加入硫酸铵至60％饱和度，并调节pH值至7.0-7.2。使混合物静置16小时，并通过过滤收集沉淀的蛋白质。将沉淀溶于无菌蒸馏水中，过滤去除不溶的蛋白质，并对0.85％生理盐水透析。

纯化白喉类毒素蛋白的浓缩和除菌过滤

使用10,000 MWCO再生纤维素滤柱，将蛋白质溶液浓缩至每升15g，并对10倍体积的0.85％生理盐水透析。浓缩的蛋白质溶液通过0.2微米滤膜过滤除菌。将蛋白质溶液贮藏于1-5℃，直至加工到缀合物上。

蛋白质浓度通过Lowry，O.H.等(1951)，Journal of BiologicalChemistry，193，265-275页所述的方法测定。蛋白质纯度通过无菌性、LAL(内毒素)含量和残余甲醛含量确定。

实施例5    脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y多糖与白喉类毒素蛋白的单价缀合物的制备

本制备所用材料包括脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的己二酸衍化多糖(按照实施例3制备)、无菌白喉类毒素蛋白(按照实施例4制备)、EDAC、硫酸铵、无菌的1N盐酸、无菌的1N氢氧化钠以及无菌生理盐水(0.85％)。

以单独的反应制备每一种血清群多糖缀合物。全部四种缀合物均通过以下方法制备。向一不锈钢罐中装入纯化的己二酸衍化多糖(反应浓度为700-1000μmole活性酰肼/升)以及纯化的白喉类毒素蛋白(反应浓度为3.8-4.0g蛋白质/升)。使用0.85％生理盐水稀释这些原料至目标反应浓度，并调节pH值至5.0±0.1。将等份EDAC加入到多糖蛋白质混合物中，以达到2.28-2.4g/L的反应浓度。在15-30℃下将反应pH维持在5.0±0.1达2小时。2小时后，用无菌的1 N氢氧化钠调节pH至7.0±0.1，并将反应物在1-5℃储存16-20小时。

使反应混合物升温至15-30℃，并将反应罐连接至配有30,000MWCO再生纤维素柱的超滤器。加入固体硫酸铵至60％饱和度(对于血清群A、W-135和Y)和50％饱和度(对于血清群C)。使缀合反应混合物对20倍体积的60％饱和硫酸铵溶液(对于血清群A、W-135和Y)和50％饱和硫酸铵溶液(对于血清群C)透析，接着对20倍体积的0.85％生理盐水透析。透析后的缀合物先通过含1.2微米和0.45微米滤膜的囊式滤器(filter capsule)过滤，然后通过含0.22微米滤膜的第二个囊式滤器过滤。

通过与对经解聚并衍化的多糖所用方法相同的方法测定多糖量和O-乙酰基含量。蛋白质的量通过Lowry法测定。缀合物的分子量通过流经凝胶过滤层析柱确定，所述凝胶过滤层析柱以商品名“TSK6000PW”售卖，使用DNA作为外水体积标记物，使用ATP作为总体积标记物，并使用牛甲状腺球蛋白作为参比标记物。此外，通过多角度激光光散射测量从TSK6000PW柱上洗脱的缀合物的分子量。使用双夹心ELISA法，通过与抗多糖血清群特异性抗体结合检测缀合物的抗原特征。缀合物纯度通过测定未结合(未缀合)多糖的量(通过经疏水作用层析柱洗脱)、未缀合蛋白质的量(通过毛细管电泳)、无菌性、LAL(内毒素)含量、残余EDAC含量以及残余铵离子含量来确定。

实施例6    多价脑膜炎球菌A、C、W-135和Y多糖白喉类毒素

缀合疫苗的配制

本制备所用材料包括按照实施例5制备的血清群A、C、W-135和Y多糖-白喉类毒素缀合物、无菌的100mM磷酸钠缓冲的生理盐水(0.85％氯化钠)。

向不锈钢配制罐内的生理盐水(0.85％)中加入等份无菌的100-500mM磷酸钠缓冲生理盐水，以得到10mM磷酸钠的最终疫苗浓度。向含有10mM无菌磷酸钠生理盐水的配制罐中加入等份的2-4种无菌单价脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素缀合物中的每一种，获得每毫升缓冲液中每一种血清群多糖各8μg的终浓度。将配制的四价缀合物混合并通过0.2μm滤器过滤至第二个配制罐中。

使用高pH阴离子交换层析和脉冲安培检测法，通过糖成分分析测定多价制剂中存在的每种血清群多糖的量。蛋白质的量通过Lowry法测定。使用与pH计连接的复合电极测定疫苗的pH值。使用双夹心ELISA方法通过与抗多糖血清群特异性抗体结合测定多价缀合物的抗原特征。通过疫苗中存在的每种缀合物在动物模型中激发初次和加强抗多糖IgG免疫应答的能力来确定多价缀合疫苗的免疫原性。多价缀合疫苗的纯度通过测定未结合(未缀合)多糖的量(使用高pH阴离子交换层析和脉冲安培检测法)、无菌性、LAL(内毒素)含量、热原含量和一般安全性来测定。

实施例7    以氢氧化铝为佐剂的多价脑膜炎球菌多糖白喉类毒素

蛋白缀合物的制备

缀合物制品吸附至氢氧化铝。本制备所用材料包括按照实施例5制备的血清群A、C、W-135和Y多糖-白喉类毒素缀合物、无菌生理盐水(0.85％氯化钠)以及无菌氢氧化铝的生理盐水溶液(0.85％氯化钠)。

向含有生理盐水的配制罐中加入等份的每种无菌单价脑膜炎球菌多糖白喉类毒素缀合物，以获得每毫升缓冲液中每种血清群多糖各为8μg的终浓度。向多价缀合疫苗中加入等份的无菌氢氧化铝的生理盐水溶液(0.85％氯化钠)，以达到0.44mg铝离子/毫升疫苗的终浓度。

实施例8    以磷酸铝为佐剂的缀合物的制备

本制备所用材料包括按照实施例5制备的血清群A、C、W-135和Y多糖-白喉类毒素缀合物、无菌生理盐水(0.85％氯化钠)以及无菌磷酸铝的生理盐水溶液(0.85％氯化钠)。

向含有生理盐水的配制罐中加入等份的每种无菌单价脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素缀合物，以获得每毫升缓冲液中每种血清群多糖各为8μg的终浓度。向多价缀合疫苗中加入等份的无菌磷酸铝的生理盐水溶液(0.85％氯化钠)，以达到0.44mg铝离子/毫升疫苗的终浓度。

实施例9    在人类临床研究中使用的材料和方法的一般性描述四价衍生缀合疫苗的免疫原性

在多种不同的临床方案下研究了缀合疫苗激发人类免疫应答的能力。以下研究总结了结果。除非另有说明，否则以下每项研究中所使用的材料和方法都为：

TetraMenD

TetraMenD疫苗包含四种脑膜炎球菌荚膜多糖：血清群A、C、Y和W-135，每种多糖4μg，共价连接至总共48μg的白喉类毒素蛋白。疫苗用无菌的、无热原的磷酸盐缓冲生理盐水配制，不含防腐剂。配方包含0.6mg磷酸钠、4.4mg氯化钠以及加至0.5mL的水。

Menomune_

Menomune_在美国和其它国家被许可用于2岁以上的人群。Menomune为冻干制剂，每剂疫苗含各50μg的A、C、Y和W-135多糖作为抗原，用采用硫柳汞防腐的等渗氯化钠溶液的稀释液重建，以0.5mL剂量皮下给药。每0.5mL剂量的疫苗包含2.5-5mg乳糖作为稳定剂。对于皮下施用，组合血清群A、C、Y和W-135的脑膜炎球菌多糖疫苗Menomune_-A/C/Y/W-135是一种脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、Y和W-135的血清群特异性多糖抗原的冻干制剂。稀释剂是无菌、无热原的蒸馏水。按照标签指示用稀释剂将冻干制品重建后，每0.5mL剂量配制成包含各50μg的血清群A、C、Y和W-135的“分离产品”的等渗氯化钠溶液。

成人用破伤风和白喉类毒素吸附疫苗(Tetanus and DiphtheriaToxoids Adsorbed for Adult Use_)(以下称作Td)是一种明矾沉淀类毒素在等渗氯化钠溶液中的无菌混悬剂，所述等渗氯化钠溶液含有磷酸钠缓冲液，以控制pH值。此疫苗用于肌内注射。通过检测，每0.5mL剂量配制成包含5 Lf破伤风类毒素、2 Lf白喉类毒素和不超过0.28mg的铝。在豚鼠效力测试中，破伤风和白喉类毒素分别诱导出至少2单位/毫升和0.5单位/毫升的抗毒素。在第一次随访时，用一枚1英寸的25号针通过肌内注射入左臂三角肌给予所有参与者0.5mL单剂的Td。每0.5mL剂量包含5 Lf破伤风类毒素和2Lf白喉类毒素。

血清样品

于基线期之后指定的天数抽取血液样品。例如，如果方案指定3个时间点：0天、28天和6个月，则在接种前0天(基线)、接种后28天(为了评价初次免疫应答)和接种后6个月(为了评价免疫应答的持久性)抽取血液样品。在每个时间点从每位受试者收集大约5mL全血。全血在采集后4小时之内离心。取出血清并贮存于-20℃。“28天”的血液样品取自0天注射后至少28天但尚未到57天时。“6个月”血液样品取自0天注射后6个月加或减28天时。因此，28天血清代表取自0天后28天-56天的血清；6个月血清代表取自0天后149天-217天的血清。

测定技术

本研究使用了多种标准化免疫学测定法。以下描述总结了文中所用方法。但是，其它相似的测定法(包括本文提到的那些测定法的变更)是本领域技术人员众所周知的，且可以使用。

通过使用幼兔补体的血清杀菌试验(SBA-BR)进行抗脑膜炎球菌抗体测定

使用血清杀菌试验测定针对血清群A、C、Y和W-135的抗脑膜炎球菌抗体的功能性抗体活性。在无菌96孔微量滴定板中制备测试血清的2倍稀释液。将血清群特异性脑膜炎球菌和幼兔补体加入到血清稀释液中并使其温育。在该温育期之后，向血清/补体/细菌混合物中加入琼脂覆层培养基，使之凝固，然后在37℃、5％CO₂下培养过夜。计数孔中存在的细菌菌落。根据和补体对照孔的平均值相比达到＞50％杀死的血清稀释度倒数确定终点效价。对于使用兔补体的该测定，检出限度为效价8。

IgG抗脑膜炎球菌抗体的测定

使用间接ELISA测定针对血清群A、C、Y和W-135的抗脑膜炎球菌抗体的IgG抗体活性。该方法涉及使血清中的抗体与通过甲基化人血清白蛋白吸附至塑料微量滴定孔的过量脑膜炎球菌群特异性多糖(MenPs)抗原反应。通过与过氧化物酶标记的小鼠抗人IgG特异性单克隆抗体的反应测定结合抗体的量。随后使用过氧化物酶底物的反应产生显色产物，用分光光度计法测定该产物。所得到的光密度(OD)与结合到微量滴定板上的脑膜炎球菌多糖的血清中IgG抗体量相关联。然后通过使用4参数逻辑曲线法与具有指定值的参比品(Lot CDC 1992或等效物)相比较来计算IgG抗体量。

IgM抗脑膜炎球菌抗体的测定

使用间接ELISA测定针对血清群A、C、Y和W-135的抗脑膜炎球菌抗体的IgM抗体活性。该方法涉及使血清中的抗体与通过甲基化人血清白蛋白吸附到塑料微量滴定孔中的过量MenPs抗原反应。通过与过氧化物酶标记的小鼠抗人IgM特异性单克隆抗体的反应来测定结合抗体的量。随后使用过氧化物酶底物的反应产生显色产物，用分光光度计法测定该产物。所得到的OD与结合到微量滴定板上的脑膜炎球菌多糖的血清中IgM抗体量相关联。然后通过使用4参数逻辑曲线与具有指定值的参比品(Lot CDC 1992或等效物)相比较来计算IgM抗体量。

高亲和力抗脑膜炎球菌IgG抗体的测定

在Aventis Pasteur Inc.使用改良型ELISA法测定针对血清群A、C、Y和W-135的抗脑膜炎球菌抗体的高亲和力IgG抗体活性。该测定法目前处于Aventis Pasteur Inc.研发中，并且将在临床样品测试之前取得资格。简言之，就是用MenPs抗原包被96孔微量滴定板。吸出并洗涤包被板后，使用包含75 mM硫氰酸铵的磷酸缓冲盐水(PBS)血清稀释缓冲液在板中直接制备临床血清的系列稀释液，并使其过夜温育。通过与过氧化物酶标记的小鼠抗人IgG特异性单克隆抗体的反应测定结合抗体量。随后使用过氧化物酶底物的反应产生显色产物，用分光光度计法测定该产物。所得到的OD与结合到微量滴定板上的脑膜炎球菌多糖的血清中高亲和力IgG抗体量相关联。然后通过使用4参数逻辑曲线与参比品(Lot CDC 1992或等效物)相比较来计算高亲和力IgG抗体的量。

IgG1和IgG2亚类脑膜炎球菌抗体的测定

使用ELISA检测针对血清群A、C、Y和W-135的抗脑膜炎球菌抗体的IgG1和IgG2亚类抗体分布。血清连续稀释液中存在的抗体与吸附至微量滴定板孔的MenPs抗原反应。使用抗人IgG1 Fc或IgG2 Fc特异性试剂，测定结合抗体量。随后与酶底物的反应产生显色产物，用分光光度计法测定该产物。所得到的OD与结合到微量滴定板上的脑膜炎球菌多糖的血清中IgG1或IgG2抗体量相关联。抗体量将以血清样品中的IgG1∶IgG2比率报告，或者，如果可得到适宜的参比品，则将以样品中IgG1或IgG2的浓度报告。

通过VERO细胞的代谢抑制进行抗白喉抗体测定

通过测试血清保护VERO细胞免受白喉毒素攻击的能力检测抗白喉抗体反应。使用无菌的96孔微量滴定板，用白喉毒素攻击测试血清的2倍稀释液(以1∶4稀释度开始)，并使其温育。然后加入VERO细胞，用无菌矿物油密封孔并温育6-8天。然后通过观察由细胞代谢副产物引起的培养基中pH指示剂的颜色变化来确定抗体水平。结果通过与校准过的WHO参考血清对比以国际单位/毫升报告，并以存在攻击剂量的白喉毒素时允许细胞代谢的最高血清稀释度来确定。检测下限可通过参考血清的最小可检测抗毒素水平以及测试血清的起始稀释度来确定，通常为0.005IU/mL。

通过ELISA测定抗破伤风抗体

通过间接酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定抗破伤风抗体水平。该方法涉及使测试血清中的抗体与吸附到塑料微量滴定孔的破伤风类毒素反应。通过与缀合至碱性磷酸酶的山羊抗人IgG特异性抗体的反应测定结合抗体量。随后与碱性磷酸酶底物的反应产生显色产物，用分光光度计法测定该产物。OD(光密度)与血清稀释液中结合到抗原包被的微量滴定板的抗体量相关联。通过使用平行线分析法与具有指定单位量的国际人类参比品(WHO Lot TE-3)相比较，计算出抗体浓度。结果以国际单位/毫升(IU/mL)报告。抗破伤风IgG ELISA的最低定量水平为0.01IU/mL，所获值低于此水平的样品报告为＜0.01IU/mL。

本文使用的“不良事件”、“严重不良事件”和“预料外不良事件”均为疫苗行业内被充分理解的术语。依据标准临床实验规范总结和分析安全性资料，包括评价接种疫苗的所有参与者的临床研究持续时间。一般来说，每个术语均理解为具有以下含义。

不良事件(AE)定义为：“在给予药品的患者或临床研究受试者中出现的任何不幸医疗事件，其不一定与该治疗存在因果关系。因此，不良事件可以是在时间上与医药(研究)产品的使用相关的任何不利的和非故意的病征(包括异常实验室结果)、症状或疾病，而不管其是否与医药(研究)产品相关。”(ICH guidelines，GCP(E6)§1.2)。

严重不良事件(SAE)是：“在任何剂量出现的导致任何下列后果的任何不良药物体验：死亡、威胁生命的不良药物体验、病人住院或现有住院期延长、持久或明显的失能/无能或先天性异常/出生缺陷。根据适当的医疗鉴定，可能不导致死亡、威胁生命或需要住院的重大医疗事件可能危害到病人或受试者并可能需要药物或外科介入避免发生本定义所列后果之一，此时可将这些事件认作严重不良药物体验。此类医疗事件的实例包括需要在急诊室或家中进行精心治疗的过敏性支气管痉挛、未导致病人住院的血恶夜质或惊厥或者出现药物依赖或药物滥用。”(21 CFR Ch.I，§312.32(a))。

预料外不良事件(UAE)是：“任何不良的药物体验，其特异性或严重性与现行研究者手册不一致；或者，经修正的，在不需要或者得不到研究者手册的情况下，其特异性或严重性与当前应用的总体研究计划或其它地方描述的风险信息不一致。”(21 CFR Ch.I，§312.32(a))。

本研究依据标准临床实验规范开展，并且研究中患者入选或排除的标准如下：

患者的入选标准：

1.据医疗史和身体检查确定，参与者是健康的。

2.接种时参与者至少11岁而未到19岁。

3.在需要办理的情况下，父母/监护人或参与者已签署了机构审查委员会(IRB)批准的知情同意书。

4.在需要办理的情况下，参与者已签署了机构审查委员会(TRB)批准的同意书。

患者的排除标准：

1.患有严重慢性病(即心脏病、肾病、神经病、代谢疾病、风湿病等)。

2.已知或怀疑免疫功能损伤。

3.在最近的72小时内有伴随或未伴随发热的急性内科疾病或者在入选时口腔温度≥38℃(100.4_)。

4.具有文件证实的侵入性脑膜炎球菌性疾病史或以前进行过脑膜炎球菌接种。

5.在最近的3个月内给予过免疫球蛋白、其它血液制品，或者在研究疫苗的6周内口服或注射过皮质类固醇或进行过其它免疫调节治疗。处于持续时间＜7天的口服类固醇递减剂量程序中的个体可入选试验，只要他们在入选前2周内没有接受过超过1个疗程的治疗。

6.在接种前的72小时内接受过抗生素治疗。

7.在入选前28天的时间段内接种过任何疫苗，或在入选后28天的时间段内计划接种本研究指明的附加疫苗之外的任何疫苗。

8.怀疑或已知对任何疫苗成分过敏。

9.无法参与整个研究阶段或者不能参加预定随访或不遵守研究规程。

10.入选另一个临床试验。

11.在研究者看来，对参与者应具有健康危险或者干扰疫苗评价的任何情况。

12.在接种时尿妊振试验阳性或可疑阳性的女性。

实施例10  研究A-剂量研究

研究A是向3个年龄组的参与者给予三个剂量水平TetraMenD疫苗的非盲的、开放标记的、剂量递增的试验。90个健康成人(18-55岁)入选I期试验，并接受TetraMenD疫苗单次注射。30个健康儿童(12-22月龄)入选II期试验，并接受单剂水平TetraMenD疫苗的两次注射。90个健康婴儿(6-12周龄)入选III期试验，并接受单剂水平TetraMenD疫苗的三次注射。

在18-55岁成人中的I期剂量研究

此临床试验是给予3个年龄组的参与者三个剂量水平TetraMenD疫苗的非盲的、开放标记的、剂量递增的试验。在I期中，90个健康成人(18-55岁)接受TetraMenD疫苗的单次注射。

对于成人参与者，在TetraMenD给予前的基线期(0天)和TetraMenD给予后28天获取用于血清学分析的血清样品。分析所有可得到样品的抗脑膜炎球菌多糖血清群A、C、Y和W-135的SBA，并通过ELISA分析抗这些相同血清群的IgG抗体。下文总结了所有血清群的SBA和IgG ELISA结果。

一个关键的免疫原性终点是从基线起具有≥4倍升高的参与者比例。为了确定基线SBA效价对SBA有≥4倍升高的比例有何作用，对于其对各个具体抗原的基线效价小于1∶64的成人和其对该具体抗原的基线效价至少为1∶64的成人进行亚组分析。

TetraMenD的安全性与Menomune_的安全性相当。该研究的结果总结于下表。

表A-1：I期(成人)-按照TetraMenD剂量水平的基线期(0天)的SBA效价分布
										血清群和剂量水平	ND0 _	效价结果＜8至512的参与者数量n*(％)§
＜8	8	16	32	64	128	256	512
								SBA(A)
1μg	26	1(3.8)	1(3.8)	-	1(3.8)	-	4(15.4)			-	9(34.6)
								4μg	28			2(7.1)	-	-	1(3.6)	3(10.7)	1(3.6)	2(7.1)	3(10.7)
10μg	27	-	1(3.7)	-	1(3.7)	2(7.4)	2(7.4)			2(7.4)	6(22.2)
								SBA(C)
1μg	26	15(57.7)	-	-	1(3.8)	1(3.8)	6(23.1)			-	1(3.8)
								4μg	28			18(64.3)	1(3.6)	-	1(3.6)	-	3(10.7)	-	2(7.1)
10μg	27	17(63.0)	-	1(3.7)	-	-	2(7.4)			2(7.4)	3(11.1)
								SBA(Y)
1μg	26	15(57.7)	1(3.8)	4(15.4)	2(7.7)	3(11.5)	1(3.8)			-	-
								4μg	28			15(53.6)	-	-	4(14.3)	310.7)	3(10.7)	1(3.6)	1(3.6)
10μg	27	10(37.0)	1(3.7)	2(7.4)	2(7.4)	6(22.2)	2(7.4)			2(7.4)	-
								SBA(W-135)
1μg	26	18(69.2)	1(3.8)	-	1(3.8)	1(3.8)	-			1(3.8)	1(3.8)
								4μg	28			13(46.4)	8(28.6)	2(7.1)	1(3.6)	1(3.6)	1(3.6)	1(3.6)	1(3.6)
10μg	27	19(70.4)	1(3.7)	2(7.4)	-	1(3.7)	1(3.7)			1(3.7)	1(3.7)

表A-1：I期(成人)-按照TetraMenD剂量水平的基线期(0天)的SBA效价分布
									血清群和剂量水平	ND0 _	效价结果从1024至65536的参与者数量n*(％)§
1024	2048	4096	8192	16384	32768	65536
							SBA(A)
1μg	26	2(7.7)	6(23.1)	1(3.8)	1(3.8)	-			-	-
							4μg	28			5(17.9)	1035.7)	-	1(3.6)	-	-	-
10μg	27	5(18.5)	6(22.2)	2(7.4)	-	-			-	-
							SBA(C)
1μg	26	-	2(7.7)	-	-	-			-	-
							4μg	28			3(10.7)	-	-	-	-	-	-
10μg	27	2(7.4)	-	-	-	-			-	-
							SBA(Y)
1μg	26	-	-	-	-	-			-	-
							4μg	28			-	-	-	1(3.6)	-	-	-
10μg	27	-	1(3.7)	1(3.7)	-	-			-	-
							SBA(W-135)
1μg	26	2(7.7)	1(3.8)	-	-	-			-	-
							4μg	28			-	-	-	-	-	-	-
10μg	27	1(3.7)	-	-	-	-			-	-

表A-2：I期(成人)-按照TetraMenD剂量水平的注射后28天的SBA效价分布(符合方案人群)
										血清群和剂量水平	ND28 _	效价结果§从＜8至512的参与者数量n*(％)
＜8	8	16	32	64	128	256	512
								SBA(A)
1μg	26	-	-	-	-	-	13.8)			1(3.8)	2(7.7)
								4μg	28			-	-	-	-	-	-	-	-
10μg	27	-	-	-	-	-	-			-	-
								SBA(C)
1μg	26	3(11.5)	-	-	-	-	-			4(15.4)	5(19.2)
								4μg	28			-	1(3.6)	-	-	2(7.1)	-	1(3.6)	1(3.6)
10μg	27	-	-	1(3.7)	-	-	2(7.4)			1(3.7)	4(14.8)
								SBA(Y)
1μg	26	4(15.4)	1(3.8)	-	4(15.4)	5(19.2)	4(15.4)			1(3.8)	2(7.7)
								4μg	28			3(10.7)	1(3.6)	-	4(14.3)	1(3.6)	1(3.6)	-	3(10.7)
10μg	27	3(11.1)	-	-	2(7.4)	5(18.5)	-			1(3.7)	4(14.8)
								SBA(W-135)
1μg	26	3(11.5)	-	-	2(7.7)	-	1(3.8)			1(3.8)	4(15.4)
								4μg	28			4(14.3)	-	-	-	-	1(3.6)	2(7.1)	3(10.7)
10μg	27	-	-	-	-	-	2(7.4)			2(7.4)	2(7.4)

表A-2：I期(成人)-按照TetraMenD剂量水平的注射后28天的SBA效价分布(符合方案人群)
									血清群和剂量水平	ND28 _	效价结果§1024-65536的参与者数量n*(％)
1024	2048	4096	8192	16384	32768	65536
							SBA(A)
1μg	26	-	7(26.9)	6(23.1)	7(26.9)	2(7.7)			-	-
							4μg	28			1(3.6)	5(17.9)	8(28.6)	2(7.1)	11(39.3)	1(3.6)	-
10μg	27	1(3.7)	1(3.7)	4(14.8)	5(18.5)	13(48.1)			2(7.4)	1(3.7)
							SBA(C)
1μg	26	5(19.2)	6(23.1)	2(7.7)	1(3.8)	-			-	-
							4μg	28			6(21.4)	7(25.0)	4(14.3)	4(14.3)	2(7.1)	-	-
10μg	27	3(11.1)	5(18.5)	4(14.8)	2(7.4)	5(18.5)			-	-
							SBA(Y)
1μg	26	1(3.8)	3(11.5)	-	1(3.8)	-			-	-
							4μg	28			4(14.3)	6(21.4)	1(3.6)	27.1)	2(7.1)	-	-
10μg	27	1(3.7)	4(14.8)	4(14.8)	2(7.4)	1(3.7)			-	-
							SBA(W-135)
1μg	26	3(11.5)	9(34.6)	2(7.7)	1(3.8)	-			-	-
							4μg	28			3(10.7)	10(35.7)	4(14.3)	1(3.6)	-	-	-
10μg	27	7(25.9)	1(3.7)	5(18.5)	8(29.6)	-			-	-

表A-3：I期(成人)-按照TetraMenD剂量水平的基线期和注射后28天达到SBA阈值的比例(符合方案人群)

血清群和剂量水平	ND0/ND28	达到阈值的％
										≥1∶8		≥1∶16		≥1∶32		≥1∶64
		0天	28天	0天	28天	0天	28天	0天	28天
										SBA(A)
1μg	26/26	96.2	100.0	92.3	100.0	92.3	100.0	88.5	100.0
										4μg	28/28	92.9	100.0	92.9	100.0	92.9	100.0	89.3	100.0
10μg	27/27	100.0	100.0	96.3	100.0	96.3	100.0	92.6	100.0
										SBA(C)
1μg	26/26	42.3	88.5	42.3	88.5	42.3	88.5	38.5	88.5
										4μg	28/28	35.7	100.0	32.1	96.4	32.1	96.4	28.6	96.4
10μg	27/27	37.0	100.0	37.0	100.0	33.3	96.3	33.3	96.3
										SBA(Y)
1μg	26/26	42.3	84.6	38.5	80.8	23.1	80.8	15.4	65.4
										4μg	28/28	46.4	89.3	46.4	85.7	46.4	85.7	32.1	71.4
10μg	27/27	63.0	88.9	59.3	88.9	51.9	88.9	44.4	81.5
										SBA(W-135)
1μg	26/26	30.8	88.5	26.9	88.5	26.9	88.5	23.1	80.8
										4μg	28/28	53.6	85.7	25.0	85.7	17.9	85.7	14.3	85.7
10μg	27/27	29.6	100.0	25.9	100.0	18.5	100.0	18.5	100.0

N：在每一时间点(0天；28天)的可评价参与者的数量

表A-4：I期(成人)-按照TetraMenD剂量水平的基线期和注射后28天的SBA和IgG ELISA结果(符合方案人群)

血清群和剂量水平	ND0/ND2 8	GMT/GMC*(95％CI)		在28天的平均上升倍数(95％CI)	≥4倍升高的％
						0天	28天
		SBA(A)
1μg	26/26							460.2(223.0-949.7)	3054.9(1872.9-4982.9)	6.6(2.9-15.4)	65.4
		4μg	28/28	487.3(231.2-1027.2)	6720.2(4666.5-9677.7)	13.8(6.0-31.7)	71.4
10μg	27/27							525.3(286.6-962.9)	10865.1(7651.5-15428.2)	20.7(11.7-36.6)	96.3
		SBA(C)
1μg	26/26							20.9(8.8-49.6)	540.0(238.1-1224.7)	25.9(9.7-68.6)	73.1
		4μg	28/28	16.4(7.1-37.7)	1559.8(799.9-3041.5)	95.1(39.7-227.7)	89.3
10μg	27/27							19.2(8.0-45.8)	1755.6(880.5-3500.4)	91.7(37.6-223.5)	96.3

表A-4：I期(成人)-按照TetraMenD剂量水平的基线期和注射后28天的SBA和IgG ELISA结果(符合方案人群)

血清群和剂量水平	ND0/ND2 8	GMT/GMC*(95％CI)		在28天的平均上升倍数(95％CI)	≥4倍升高的％
						0天	28天
		SBA(Y)
1μg	26/26							9.4(5.9-14.9)	95.5(40.5-225.0)	10.2(4.9-20.9)	73.1
		4μg	28/28	19.0(8.8-41.2)	390.0(143.3-1061.3)	20.5(8.9-47.4)	82.1
10μg	27/27							28.1(12.9-61.6)	386.0(145.2-1026.2)	13.7(5.8-32.7)	66.7
		SBA(W-135)
1μg	26/26							13.6(5.7-32.4)	498.5(203.2-1223.2)	36.6(13.7-97.7)	76.9
		4μg	28/28	10.0(5.9-16.9)	608.9(250.3-1480.9)	60.9(23.7-156.7)	85.7
10μg	27/27							9.8(5.0-19.1)	1848.1(1075.4-3176.2)	188.1(94.0-376.7)	100.0
		IgGELISA(A)
1μg	26/26							3.4(1.8-6.6)	19.4(11.6-32.3)	5.7(3.8-8.3)	69.2
		4μg	28/28	3.3(2.3-4.8)	38.4(22.2-66.4)	11.5(7.4-18.0)	75.0
10μg	27/27							3.1(1.7-5.6)	56.4(31.8-99.9)	18.1(12.2-26.9)	88.9
		IgGELISA(C)
1μg	26/26							0.3(0.2-0.5)	2.2(1.2-4.1)	7.3(4.0-13.4)	61.5
		4μg	28/28	0.4(0.2-0.7)	5.5(3.0-10.1)	14.2(8.7-23.2)	82.1
10μg	27/27							0.5(0.3-0.9)	11.1(5.5-22.5)	22.8(13.4-38.8)	88.9
		IgGELISA(Y)
1μg	26/26							0.6(0.4-1.0)	2.8(1.5-5.2)	4.6(2.7-7.6)	53.8
		4μg	28/28	1.3(0.7-2.5)	6.8(3.2-14.6)	5.4(3.2-9.0)	53.6
10μg	27/27							1.0(0.5-2.1)	7.7(3.4-17.2)	7.4(5.1-10.8)	77.8

表A-4：I期(成人)-按照TetraMenD剂量水平的基线期和注射后28天的SBA和IgG ELISA结果(符合方案人群)

血清群和剂量水平	ND0/ND2 8	GMT/GMC*(95％CI)		在28天的平均上升倍数(95％CI)	≥4倍升高的％
						0天	28天
		IgG ELISA(W-135)
1μg	26/26							0.5(0.3-0.9)	2.3(1.0-5.3)	4.4(2.4-7.9)	46.2
		4μg	28/28	0.6(0.3-1.0)	5.8(2.9-11.7)	10.2(6.1-16.9)	71.4
10μg	27/27							0.4(0.2-0.7)	9.3(4.8-18.1)	22.7(11.9-43.2)	85.2

0天：在接种前抽取的基线期血样。

28天：在接种后28天抽取的血样。

≥4倍升高的％：与0天相比接种后28天GMT值具有≥4倍升高的的成人的百分率。

N：可评价参与者的数量。

^*对SBA数据计算GMT；对IgG ELISA数据计算GMC。

表A-5列出了按照剂量、患者年龄和血清群的GMT值。

表A-5:按照剂量、患者年龄和血清群的GMT
								年龄	剂量TetraMenD	受试者编号	取血天数	A GMT	C GMT	W GMT	YGMT
19	1μg	2	0	1024.00	512.00	45.25	8.00
								1μg	2	28	2896.31	2048.00	2048.00	362.04
	4μg	2	0	2048.00	64.00	16.00	181.02
								4μg	2	28	8192.00	8192.00	2048.00	2048.00
	10μg	10	0	1097.50	34.30	21.11	128.00
								10μg	10	28	18820.27	3821.70	2352.53	1176.27
	20	1μg	3	0	322.54	10.08	10.08								12.70
1μg								3	28	3251.00	203.19	2048.00	203.19
		4μg	2	0	512.00	4.00	4.00							4.00
4μg								2	28	5792.62	128.00	22.63	22.63
		10μg	1	0	128.00	4.00	4.00							4.00
10μg								1	28	16384.00	4096.00	128.00	2048.00
		21	1μg	2	0	1024.00	22.63							32.00	256.00
1μg	1							28	8192.00	8192.00	2048.00	1024.00
			4μg	3	0	812.75	12.70						4.00	256.00
4μg	3							28	10321.27	1024.00	5160.64	8192.00
			22	1μg	2	0	1024.00						4.00	11.31	16.00
1μg	2	28						4096.00	362.04	2048.00	512.00
				4μg	2	0	128.00					45.25	5.66	16.00
4μg	2	28						8192.00	2896.31	1024.00	2048.00
				10μg	2	0	2048.00					90.51	4.00	22.63
10μg	2	28						16384.00	8192.00	512.00	512.00
				23	1μg	1	0					512.00	2048.00	2048.00	16.00
1μg	1	28	512.00					2048.00	2048.00	64.00

	4μg	2	0	1448.15	4.00	4.00	45.25
								4μg	2	28	4096.00	1448.15	1024.00	256.00
	10μg	1	0	1024.00	128.00	4.00	64.00
								10μg	1	28	16384.00	512.00	8192.00	2048.00
	24	4μg	2	0	181.02	11.31	90.51								4.00
4μg								2	28	11585.24	2896.31	1448.15	512.00
		10μg	1	0	1024.00	4.00	4.00							4.00
10μg								1	28	16384.00	2048.00	4096.00	4.00
		25	1μg	1	0	128.00	4.00							4.00	4.00
1μg	1							28	4096.00	4096.00	2048.00	32.00
			10μg	2	0	1024.00	32.00						4.00	22.63
10μg	2							28	8192.00	2896.31	1448.15	2048.00
			26	1μg	2	0	2048.00						4.00	64.00	4.00
1μg	2	28						4096.00	512.00	2896.31	1448.15
				10μg	2	0	362.04					45.25	22.63	4.00
10μg	2	28						5792.62	2048.00	1448.15	32.00
				27	1μg	1	0					512.00	128.00	1024.00	4.00
1μg	1	28	4096.00					1024.00	4096.00	4.00
					4μg	2	0				90.51	22.63	64.00	16.00
4μg	2	28	16384.00					4096.00	1448.15	90.51
					10μg	1	0				512.00	4.00	128.00	64.00
10μg	1	28	8192.00					16384.00	8192.00	16384.00
					28	1μg	1				0	4.00	4.00	4.00	4.00
1μg	1	28	16384.00	1024.00				2048.00	256.00
						4μg	2			0	724.08	64.00	8.00	11.31
4μg	2	28	5792.62	1448.15				2048.00	2048.00
						10μg	1			0	64.00	4.00	4.00	4.00
10μg	1	28	4096.00	16.00				1024.00	4.00
						30	4μg			1	0	32.00	4.00	16.00	32.00
4μg	1	28	16384.00	16384.00	8192.00			4096.00
							31		1μg	1	0	32.00	4.00	4.00	4.00
1μg	1	28	8192.00	512.00	4.00	4.00
								32	4μg	2	0	724.08	64.00	8.00	11.31
4μg	2	28	4096.00	1024.00	1148.15	128.00
							33		1μg	2	0	2896.31	4.00	4.00	22.63
1μg	2	28	2048.00	204 8.00	724.08	512.00
								4μg	1	0	1024.00	4.00	8.00	4.00
4μg	1	28	32768.00	1024.00	4096.00	8192.00
								34	4μg	1	0	64.00	128.00	4.00	32.00
4μg	1	28	16384.00	8192.00	2048.00	512.00
							35		1μg	2	0	724.08	16.00	5.66	32.00
1μg	2	28	2896.31	362.04	724.08	181.02
								4μg	2	0	90.51	5.66	11.31	4.00
4μg	2	28	5792.62	5792.62	32.00	181.02
								36	10μg	2	0	256.00	22.63	4.00	4.00
10μg	2	28	11585.24	512.00	5792.62	256.00
							37		1μg	1	0	4096.00	4.00	4.00	32.00
1μg	1	28	8192.00	2048.00	2048.00	64.00

	10μg	1	0	2048.00	4.00	8.00	4.00
								10μg	1	28	16384.00	2048.00	4096.00	64.00
	39	1μg	2	0	512.00	4.00	45.25								4.00
1μg								2	28	5792.62	724.08	512.00	11.31
		4μg	1	0	8192.00	4.00	8.00							4.00
4μg								1	28	16384.00	2048.00	256.00	1024.00
		40	1μg	1	0	2048.00	4.00							4.00	4.00
1μg	1							28	8192.00	4.00	128.00	64.00
			41	1μg	2	0	724.08						128.00	4.00	11.31
1μg	2	28						2896.31	362.04	128.00	128.00
				42	4μg	2	0					362.04	45.25	22.63	128.00
4μg	2	28	2048.00					4096.00	2896.31	724.08
					10μg	1	0				128.00	4.00	4.00	8.00
10μg	1	28	8192.00					2048.00	512.00	512.00
					44	1μg	1				0	8.00	32.00	4.00	4.00
1μg	1	28	2048.00	512.00				4.00	8.00
						4μg	1			0	512.00	4.00	16.00	4.00
4μg	1	28	2048.00	512.00				2048.00	8.00
						45	4μg			2	0	2048.00	4.00	5.66	4.00
4μg	2	28	2896.31	128.00	4.00			16.00
							10μg		2	0	724.08	45.25	128.00	11.31
10μg	2	28	2896.31	724.08	2896.31			181.02
							46		1μg	1	0	2048.00	128.00	4.00	4.00
1μg	1	28	2048.00	256.00	4.00	4.00
								47	10 μg	1	0	8.00	4.00	4.00	16.00
10μg	1	28	1024.00	128.00	512.00	4096.00
							48		1μg	1	0	128.00	512.00	4.00	16.00
1μg	1	28	128.00	2048.00	512.00	128.00
								49	10μg	1	0	32.00	512.00	4.00	4.00
10μg	1	28	8192.00	16384.00	4096.00	64.00
							52		10μg	1	0	512.00	4.00	4.00	16.00
10μg	1	28	32768.00	256.00	1024.00	32.00
								54	1μg	1	0	512.00	4.00	4.00	16.00
1μg	1	28	256.00	4.00	32.00	64.00

II期  在12月龄至22月龄的学步儿童中的剂量研究

此临床试验是给予3个年龄组的参与者三个剂量水平TetraMenD疫苗的非盲、开放标记的、剂量递增的试验。在II期中，30个健康儿童(12-22月龄)接受单剂水平TetraMenD疫苗的两次注射。

对于学步儿童参与者，在三个时间点获取用于血清学分析的血清样品：第一次注射TetraMenD之前的基线期(0天)、入选后60天(第一次注射后60天并刚好在第二次注射TetraMenD之前)和入选后90天(第二次注射之后30天)。分析所有可得样品的抗脑膜炎球菌多糖血清群A、C、Y和W-135的SBA，并通过ELISA分析抗这些血清群的IgG抗体。下文总结了所有血清群的SBA和IgG ELISA结果。结果总结于下表。

表A-6：II期(学步儿童)-按照TetraMenD剂量水平在基线期(0天)的SBA效价分布(符合方案人群)
											效价结果§＜8至256的参与者数量n*(％)
血清群和剂量水平	ND0 _
		＜8	8	16	32	64	128	256
									SBA(A)
1μg	9	4(44.4)	2(22.2)	-	-	1(11.1)	-	1(11.1)
									4μg	8	7(87.5)	-	-	-	-	-	-
10μg	10	8(80.0)	-	-	1(10.0)	-	-	-
									SBA(C)
1μg	9	9(100.0)	-	-	-	-	-	-
									4μg	8	7(87.5)	-	-	-	-	-	1(12.5)
10μg	10	7(70.0)	-	1(10.0)	-	220.0)	-	-
									SBA(Y)
1μg	9	4(44.4)	1(11.1)	1(11.1)	2(22.2)	1(11.1)	-	-
									4μg	8	5(62.5)	2(25.0)	1(12.5)	-	-	-	-
10μg	10	8(80.0)	1(10.0)	-	-	1(10.0)	-	-
									SBA(W-135)
1μg	9	7(77.8)	-	-	-	1(11.1)	-	-
									4μg	8	7(87.5)	-	-	-	-	1(12.5)	-
10μg	10	8(80.0)	-	-	1(10.0)	-	1(10.0)	-

表A-6：II期(学步儿童)-按照TetraMenD剂量水平在基线期(0天)的SBA效价分布(符合方案人群)
												效价结果§512-65536的参与者数量n*(％)
血清群和剂量水平	ND0 _
		512	1024	2048	4096	8192	16384	32768	65536
										SBA(A)
1μg	9	1(11.1)	-	-	-	-	-	-	-
										4μg	8	-	-	1(12.5)	-	-	-	-	-
10μg	10	-	-	1(10.0)	-	-	-	-	-
										SBA(C)
1μg	9	-	-	-	-	-	-	-	-
										4μg	8	-	-	-	-	-	-	-	-
10μg	10	-	-	-	-	-	-	-	-
										SBA(Y)
1μg	9	-	-	-	-	-	-	-	-
										4μg	8	-	-	-	-	-	-	-	-
10μg	10	-	-	-	-	-	-	-	-
										SBA(W-135)
1μg	9	1(11.1)	-	-	-	-	-	-	-
										4μg	8	-	-	-	-	-	-	-	-
10μg	10	-	-	-	-	-	-	-	-

表A-7：II期(学步儿童)-按照TetraMenD剂量水平在第一次注射后60天(60天)的SBA效价分布(符合方案人群)
											效价结果§＜8至256的参与者数量n*(％)
血清群和剂量水平	ND60 _
		＜8	8	16	32	64	128	256
									SBA(A)
1μg	9	-	-	-	-	1(11.1)	1(11.1)	1(11.1)
									4μg	8	1(12.5)	-	-	-	-	-	-
10μg	10	-	-	-	-	-	-	1(10.0)
									SBA(C)
1μg	9	3(33.3)	1(11.1)	-	1(11.1)	2(22.2)	1(11.1)	-
									4μg	8	-	1(12.5)	-	-	2(25.0)	2(25.0)	1(12.5)
10μg	10	2(20.0)	-	-	1(10.0)	1(10.0)	220.0)	1(10.0)
									SBA(Y)
1μg	9	2(22.2)	-	1(11.1)	2(22.2)	1(11.1)	2(22.2)	1(11.1)
									4μg	8	1(12.5)	-	1(12.5)	-	1(12.5)	3(37.5)	-
10μg	10	4(40.0)	-	2(20.0)	1(10.0)	3(30.0)	-	-
									SBA(W-135)
1μg	9	5(55.6)	-	-	-	3(33.3)	-	-
									4μg	8	5(62.5)	-	-	-	-	1(12.5)	1(12.5)
10μg	10	2(20.0)	-	-	1(10.0)	3(30.0)	-	-

表A-7：II期(学步儿童)-按照TetraMenD剂量水平在第一次注射后60天(60天)的SBA效价分布(符合方案人群)
												效价结果§512-65536的参与者数量n*(％)
血清群和剂量水平	ND60 _
		512	1024	2048	4096	8192	16384	32768	65536
										SBA(A)
1μg	9	2(22.2)	-	4(44.4)	-	-	-	-	-
										4μg	8	-	-	4(50.0)	2(25.0)	1(12.5)	-	-	-
10μg	10	2(20.0)	-	5(50.0)	2(20.0)	-	-	-	-
										SBA(C)
1μg	9	-	-	1(11.1)	-	-	-	-	-
										4μg	8	2(25.0)	-	-	-	-	-	-	-
10μg	10	1(10.0)	2(20.0)	-	-	-	-	-	-
										SBA(Y)
1μg	9	-	-	-	-	-	-	-	-
										4μg	8	-	2(25.0)	-	-	-	-	-	-
10μg	10	-	-	-	-	-	-	-	-
										SBA(W-135)
1μg	9	-	-	1(11.1)	-	-	-	-	-
										4μg	8	-	-	1(12.5)	-	-	-	-	-
10μg	10	3(30.0)	-	1(10.0)	-	-	-	-	-

表A-8：II期(学步儿童)-按照TetraMenD剂量水平在第二次注射后30天(90天)的SBA效价分布(符合方案人群)
											效价结果§＜8至256的参与者数量n*(％)
血清群和剂量水平	ND90 _
		＜8	8	16	32	64	128	256
									SBA(A)
1μg	9	-	-	-	-	-	-	-
									4μg	8	-	-	-	-	-	-	-
10μg	10	-	-	-	-	-	-	-
									SBA(C)
1μg	9	2(22.2)	-	1(11.1)	-	1(11.1)	2(22.2)	1(11.1)
									4μg	8	-	-	-	-	1(12.5)	2(25.0)	1(12.5)
10μg	10	3(30.0)	1(10.0)	-	1(10.0)	-	-	2(20.0)
									SBA(Y)
1μg	9	-	-	-	3(33.3)	-	2(22.2)	1(11.1)
									4μg	8	-	-	-	1(12.5)	-	2(25.0)	1(12.5)
10μg	10	1(10.0)	-	1(10.0)	3(30.0)	2(20.0)	2(20.0)	-
									SBA(W-135)
1μg	9	1(11.1)	1(11.1)	1(11.1)	-	1(11.1)	2(22.2)	-
									4μg	8	-	-	-	-	1(12.5)	1(12.5)	-
10μg	10	-	-	-	1(10.0)	1(10.0)	3(30.0)	1(10.0)

表A-8：II期(学步儿童)-按照TetraMenD剂量水平在第二次注射后30天(90天)的SBA效价分布(符合方案人群)
												效价结果§512-65536的参与者数量n*(％)
血清群和剂量水平	ND90 _
		512	1024	2048	4096	8192	16384	32768	65536
										SBA(A)
1μg	9	-	-	8(88.9)	-	1(11.1)	-	-	-
										4μg	8	-	-	5(62.5)	1(12.5)	2(25.0)	-	-	-
10μg	10	2(20.0)	-	4(40.0)	4(40.0)	-	-	-	-
										SBA(C)
1μg	9	1(11.1)	1(11.1)	-	-	-	-	-	-
										4μg	8	2(25.0)	2(25.0)	-	-	-	-	-	-
10μg	10	-	2(20.0)	1(10.0)	-	-	-	-	-
										SBA(Y)
1μg	9	1(11.1)	1(11.1)	1(11.1)	-	-	-	-	-
										4μg	8	2(25.0)	1(12.5)	1(12.5)	-	-	-	-	-
10μg	10	1(10.0)	-	-	-	-	-	-	-
										SBA(W-135)
1μg	9	-	2(22.2)	1(11.1)	-	-	-	-	-
										4μg	8	4(50.0)	1(12.5)	1(12.5)	-	-	-	-	-
10μg	10	1(10.0)	1(10.0)	2(20.0)	-	-	-	-	-

表A-9：II期(学步儿童)-按照TetraMenD剂量水平在基线期、第一次注射后60天和第二次注射后30天达到SBA阈值的比例(符合方案人群)
								血清群和剂量水平	ND0/ND60/ND9 0	达到≥1∶8阈值的％			达到≥1∶16阈值的％
基线期(D0)	第1次注射后(D60)	第2次注射后(D90)	基线期(D0)	第1次注射后(D60)	第2次注射后(D90)
						SBA血清群A
1μg	9/9/9	55.6	100.0	100.0	33.3									100.0	100.0
						4μg	8/8/8	12.5	87.5	100.0	12.5	87.5	100.0
10μg	10/10/10	20.0	100.0	100.0	20.0									100.0	100.0
						SBA血清群C
1μg	9/9/9	0.0	66.7	77.8	0.0									55.6	77.8
						4μg	8/8/8	12.5	100.0	100.0	12.5	87.5	100.0
10μg	10/10/10	30.0	80.0	70.0	30.0									80.0	60.0
						SBA血清群Y
1μg	9/9/9	55.6	77.8	100.0	44.4									77.8	100.0
						4μg	8/8/8	37.5	87.5	100.0	12.5	87.5	100.0
10μg	10/10/10	20.0	60.0	90.0	10.0									60.0	90.0
						SBA血清群W-135
1μg	9/9/9	22.2	44.4	88.9	22.2									44.4	77.8
						4μg	8/8/8	12.5	37.5	100.0	12.5	37.5	100.0
10μg	10/10/10	20.0	80.0	100.0	20.0									80.0	100.0

表A-9：II期(学步儿童)-按照TetraMenD剂量水平在基线期、第一次注射后60天和第二次注射后30天达到SBA阈值的比例(符合方案人群)
								血清群和剂量水平	ND0/ND60/ND 90	达到≥1∶8阈值的％			达到≥1∶16阈值的％
基线期(D0)	第1次注射后(D60)	第2次注射后(D90)	基线期(D0)	第1次注射后(D60)	第2次注射后(D90)
						SBA血清群A
						1μg	9/9/9	33.3	100.0	100.0	33.3	100.0	100.0
4μg	8/8/8	12.5	87.5	100.0	12.5									87.5	100.0
						10μg	10/10/10	20.0	100.0	100.0	10.0	100.0	100.0
SBA血清群C
1μg	9/9/9	0.0	55.6	66.7	0.0	44.4	66.7
								4μg	8/8/8	12.5	87.5	100.0	12.5	87.5	100.0
10μg	10/10/10	20.0	80.0	60.0	20.0	70.0	50.0
								SBA血清群Y
								1μg	9/9/9	33.3	66.7	100.0	11.1	44.4	66.7
4μg	8/8/8	0.0	75.0	100.0	0.0	75.0	87.5
								10μg	10/10/10	10.0	40.0	80.0	10.0	30.0	50.0
SBA血清群W-135
								1μg	9/9/9	22.2	44.4	66.7	22.2	44.4	66.7
4μg	8/8/8	12.5	37.5	100.0	12.5	37.5	100.0
								10μg	10/10/10	20.0	80.0	100.0	10.0	70.0	90.0

表A-10：II期(学步儿童)-按照TetraMenD剂量水平在基线期、第一次注射后60天和第二次注射后30天学步儿童中的SBA和IgG ELISA结果(符合方案人群)

血清群和剂量水平	ND0/ND60/ND90	GMT/GMC*(95％CI)			平均升高倍数(自基线期起)		≥4倍升高的％(自基线期起)
									基线期(D0)	第1次注射后(D60)	第2次注射后(D90)	第1次注射后(D60)	第2次注射后(D90)	第1次注射后(D60)	第2次注射后(D90)
		SBA(A)
1μg	9/9/9										17.3(3.9-77.0)	597.3(214.5-1663.1)	2389.1(1674.8-3407.9)	34.6	138.2	100.0	100.0
		4μg	8/8/8	8.7(1.4-55.1)	1328.0(178.7-9870.5)	3158.4(1857.4-5370.7)	152.2	362.0	75.0	87.5
10μg	10/10/10										9.2(2.2-38.7)	1448.2(740.0-2833.9)	2048.0(1155.2-3630.7)	157.6	222.9	90.0	90.0
		SBA(C)
1μg	9/9/9										4.0(4.0-4.0)	29.6(5.9-148.0)	69.1(14.8-322.6)	7.4	17.3	55.6	77.8
		4μg	8/8/8	6.7(2.0-23.0)	117.4(37.7-365.3)	304.4(128.5-721.1)	17.4	45.3	75.0	100.0
10μg	10/10/10										8.0(3.4-18.6)	97.0(22.9-411.4)	68.6(11.0-428.6)	12.1	8.6	80.0	50.0
		SBA(Y)
1μg	9/9/9										10.9(4.7-25.4)	34.6(11.0-108.5)	174.2(52.7-575.2)	3.2	16.0	44.4	77.8
		4μg	8/8/8	5.7(3.7-8.8)	98.7(20.4-478.0)	304.4(100.7-920.1)	17.4	53.8	87.5	100.0
10μg	10/10/10										5.7(3.0-10.6)	14.9(6.1-36.3)	48.5(18.9-124.3)	2.6	8.6	50.0	80.0

表A-10：II期(学步儿童)-按照TetraMenD剂量水平在基线期、第一次注射后60天和第二次注射后30天学步儿童中的SBA和IgG ELISA结果(符合方案人群)

血清群和剂量水平	ND0/ND60/ND90	GMT/GMC*(95％CI)			平均升高倍数(自基线期起)		≥4倍升高的％(自基线期起)
									基线期(D0)	第1次注射后(D60)	第2次注射后(D90)	第1次注射后(D60)	第2次注射后(D90)	第1次注射后(D60)	第2次注射后(D90)
		SBA (W-135)
1μg	9/9/9										9.3(2.4-36.1)	20.2(3.7-108.7)	101.6(18.1-571.0)	2.2	10.9	33.3	66.7
		4μg	8/8/8	6.2(2.2-17.2)	22.6(2.8-184.9)	430.5(172.2-1076.3)	3.7	69.8	37.5	100.0
10μg	10/10/10										7.0(2.9-16.6)	90.5(20.2-406.1)	274.4(97.9-769.2)	13.0	39.4	70.0	100.0
		IgGELISA(A)
1μg	9/9/9										0.3(0.1-0.7)	0.8(0.3-1.9)	1.9(0.6-6.0)	2.6	6.3	22.2	44.4
		4μg	8/8/8	0.2(0.1-0.4)	2.1(0.9-4.8)	4.4(2.1-9.1)	12.4	26.1	87.5	100.0
10μg	10/10/10										0.2(0.1-0.3)	4.4(2.9-6.5)	6.2(4.2-9.1)	23.4	33.1	100.0	100.0
		IgGELISA(C)
1μg	9/9/9										0.1(0.1-0.2)	0.3(0.1-0.9)	0.5(0.2-1.3)	2.6	3.8	33.3	44.4
		4μg	8/8/8	0.2(0.0-0.7)	1.0(0.3-3.1)	1.5(0.6-3.6)	5.6	8.3	75.0	87.5
10μg	10/10/10										0.2(0.1-0.3)	0.7(0.3-1.5)	1.2(0.7-2.0)	4.3	7.5	60.0	70.0

表A-10：II期(学步儿童)-按照TetraMenD剂量水平在基线期、第一次注射后60天和第二次注射后30天学步儿童中的SBA和IgG ELISA结果(符合方案人群)

血清群和剂量水平	ND0/ND60/ND90	GMT/GMC*(95％CI)			平均升高倍数(自基线期起)		≥4倍升高的％自基线期起)
									基线期(D0)	第1次注射后(D60)	第2次注射后(D90)	第1次注射后(D60)	第2次注射后(D90)	第1次注射后(D60)	第2次注射后(D90)
		IgGELISA(Y)
1μg	9/9/9										0.4(0.2-0.6)	0.7(0.5-1.0)	1.4(0.8-2.4)	1.9	3.8	11.1	33.3
		4μg	8/8/8	0.3(0.2-0.4)	1.2(0.5-2.8)	4.5(2.7-7.6)	4.4	16.4	37.5	100.0
10μg	10/10/10										0.2(0.1-0.3)	0.8(0.4-1.3)	1.8(0.7-4.5)	4.3	10.2	70.0	90.0
		IgG ELISA(W-135)
1μg	9/9/9										0.2(0.1-0.3)	0.3(0.2-0.5)	0.8(0.4-1.6)	1.9	5.2	22.2	55.6
		4μg	8/8/8	0.1(0.1-0.2)	0.6(0.2-1.9)	1.5(0.8-3.1)	5.3	12.7	62.5	100.0
10μg	10/10/10										0.1(0.1-0.2)	0.5(0.3-0.9)	1.3(0.8-2.2)	4.5	11.8	60.0	80.0

0天：在第1次注射前抽取的基线期血样。

60天：在第1次注射后60天并在第2次注射前抽取的血样。

90天：在第2次注射后30天抽取的血样。

≥4倍升高的％：第1次注射后：与0天相比在60天时GMT具有≥4倍升高的学步儿童的百分比；第2次注射后：与0天相比在90天时GMT具有≥4倍升高的学步儿童的百分比。

N：可评价参与者的数量

^*对SBA数据计算GMT；对IgG ELISA数据计算GMC。

表A-11总结了按照剂量、患者年龄和血清群的GMT。

表A-11：按照患者年龄和血清群的GMT总结
								年龄	TetraMenD剂量	受试者数量	取血天数	A GMT	C GMT	W GMT	Y GMT
12	4μg	4	0	13.45	4.00	4.00	4.00
								4μg	4	60	1448.15	107.63	32.00	53.82
	4μg	4	90	4096.00	215.27	724.08	304.44
								10μg	6	0	16.00	12.70	10.08	4.00
		10μg	6	60	1448.15	64.00	101.59								12.70
10μg								6	90	2298.80	80.63	256.00	40.32
		13	4μg	1	0	4.00	4.00							4.00	16.00
4μg	1							60	4.00	64.00	4.00	128.00
			4μg	1	90	2048.00	64.00						512.00	128.00
10μg	1							0	4.00	4.00	4.00	64.00
			10μg	1	60	4096.00	256.00						512.00	4.00
10μg	1							90	4096.00	1024.00	1024.00	16.00
			14	10μg	2	0	4.00						4.00	4.00	5.66
10μg	2	60						724.08	181.02	128.00	32.00
				10μg	2	90	1024.00					5.66	512.00	128.00
15	4μg	2						0	90.51	4.00	4.00				5.66
			4 μg	2	60	2896.31	45.25					32.00	256.00
	4μg	2						90	2896.31	362.04	181.02			362.04
			16	4μg	2	0	4.00					4.00	4.00		4.00
4μg	2	60						2896.31	90.51	4.00	45.25
				4μg	2	90	4096.00					256.00	256.00	128.00
18	4μg	1						0	4.00	256.00	128.00				8.00
			4μg	1	60	2048.00	512.00					2048.00	1024.00
	4μg	1						90	2048.00	1024.00	2048.00			2048.00
			10μg	1	0	4.00	4.00					4.00	4.00
	10μg	1						60	2048.00	128.00	4.00			32.00
			10μg	1	90	2048.00	256.00					32.00	64.00

III期在婴儿中的剂量研究

此临床试验是给予3个年龄组的参与者三个剂量水平TetraMenD疫苗的非盲的、开放标记的、剂量递增的试验。在III期中，90个健康婴儿(6-12周龄)接受单剂水平TetraMenD疫苗的三次注射。

婴儿参与者分别在2月龄(第1次注射)、4月龄(第2次注射)和6月龄(第3次注射)时接受TetraMenD注射。在两个时间点抽取用于血清学分析的血清样品：6月龄(第2次注射后2个月)和7月龄(第3次注射后1个月)。分析所有可得样品的抗脑膜炎球菌多糖血清群A、C、Y和W-135的SBA，并通过ELISA分析抗相同血清群的IgG抗体。下文总结了所有血清群的SBA和IgG ELISA结果。结果总结于下表。

表A-13：III期(婴儿)-按照TetraMenD剂量水平在7月龄(第3次注射后1个月)时的SBA效价分布(符合方案人群)
												效价结果§的参与者数量n*(％)
血清群和剂量水平	N7m _	＜8
			8	16	32	64	128	256
									SBA(A)
1μg	23	5(21.7)	3(13.0)	2(8.7)	2(8.7)	4(17.4)	1(4.3)	1(4.3)
									4μg	24	2(8.3)	-	2(8.3)	2(8.3)	6(25.0)	3(12.5)	3(12.5)
10μg	21	3(14.3)	-	2(9.5)	3(14.3)	3(14.3)	3(14.3)	5(23.8)
									SBA(C)
1μg	23	5(21.7)	1(4.3)	3(13.0)	2(8.7)	4(17.4)	5(21.7)	2(8.7)
									4μg	24	11(45.8)	1(4.2)	1(4.2)	2(8.3)	4(16.7)	1(4.2)	3(12.5)
10μg	21	6(28.6)	1(4.8)	-	3(14.3)	3(14.3)	5(23.8)	2(9.5)
									SBA(Y)
1μg	23	7(30.4)	2(8.7)	3(13.0)	4(17.4)	3(13.0)	2(8.7)	1(4.3)
									4μg	24	8(33.3)	3(12.5)	-	5(20.8)	4(16.7)	3(12.5)	1(4.2)
10μg	21	4(19.0)	1(4.8)	5(23.8)	4(19.0)	4(19.0)	1(4.8)	1(4.8)
									SBA(W-135)
1μg	23	5(21.7)	1(4.3)	3(13.0)	3(13.0)	5(21.7)	3(13.0)	2(8.7)
									4μg	24	9(37.5)	4(16.7)	2(8.3)	1(4.2)	1(4.2)	6(25.0)	1(4.2)
10μg	21	5(23.8)	-	3(14.3)	3(14.3)	4(19.0)	3(14.3)	2(9.5)

表A-13：III期(婴儿)-按照TetraMenD剂量水平在7月龄(第3次注射后1个月)时的SBA效价分布(符合方案人群)
												效价结果§的参与者数量n*(％)
		血清群和剂量水平	N7m _
512	1024			2048	4096	8192	16384	32768	65536
										SBA(A)
1μg	23	3(13.0)	2(8.7)	-	-	-	-	-	-
										4μg	24	3(12.5)	3(12.5)	-	-	-	-	-	-
10μg	21	-	2(9.5)	-	-	-	-	-	-
										SBA(C)
1μg	23	-	1(4.3)	-	-	-	-	-	-
										4μg	24	1(4.2)	-	-	-	-	-	-	-
10μg	21	1(4.8)	-	-	-	-	-	-	-
										SBA(Y)
1μg	23	1(4.3)	-	-	-	-	-	-	-
										4μg	24	-	-	-	-	-	-	-	-
10μg	21	1(4.8)	-	-	-	-	-	-	-
										SBA(W-135)
1μg	23	-	-	1(4.3)	-	-	-	-	-
										4μg	24	-	-	-	-	-	-	-	-
10μg	21	1(4.8)	-	-	-	-	-	-	-

表A-14：III期(婴儿)-按照TetraMenD剂量水平在6月龄(第3次注射前)和7月龄(第3次注射后)时达到SBA阈值的比例(符合方案人群)

血清群和剂量水平	N6m/N7m	达到阈值的％
										≥1∶8		≥1∶16		≥1∶32		≥1∶64
		6月龄	7月龄	6月龄	7月龄	6月龄	7月龄	6月龄	7月龄
										SBA(A)
1μg	22/23	54.5	78.3	36.4	65.2	27.3	56.5	13.6	47.8
										4μg	23/24	69.6	91.7	69.6	91.7	56.5	83.3	30.4	75.0
10μg	21/21	85.7	85.7	66.7	85.7	52.4	76.2	19.0	61.9
										SBA(C)
1μg	22/23	54.5	78.3	50.0	73.9	45.5	60.9	40.9	52.2
										4μg	23/24	60.9	54.2	52.2	50.0	47.8	45.8	43.5	37.5
10μg	21/21	85.7	71.4	81.0	66.7	71.4	66.7	61.9	52.4
										SBA(Y)
1μg	22/23	40.9	69.6	27.3	60.9	18.2	47.8	9.1	30.4
										4μg	23/24	34.8	66.7	26.1	54.2	21.7	54.2	21.7	33.3
10μg	21/21	47.6	81.0	42.9	76.2	23.8	52.4	4.8	33.3
										SBA(W-135)
1μg	22/23	27.3	78.3	18.2	73.9	4.5	60.9	4.5	47.8
										4μg	23/24	30.4	62.5	21.7	45.8	17.4	37.5	8.7	33.3
10μg	21/21	42.9	76.2	38.1	76.2	23.8	61.9	19.0	47.6

N：在每一时间点(6月龄；7月龄)可评价参与者的数量。

表A-15：III期(婴儿)-按照TetraMenD剂量水平在6月龄(第3次注射前)和7

月龄(第3次注射后)婴儿中的SBA和IgG ELISA结果(符合方案人群)

血清群和剂量水平	N6m/N7m	GMT/GMC*(95％CI)
				6月龄	7月龄
		SBA(A)
1μg	22/23					11.3(6.2-20.6)	40.7(17.6-94.0)
		4μg	23/24	25.1(12.9-49.0)	101.6(51.9-199.0)
10μg	21/21					18.9(12.2-29.1)	68.4(32.2-145.1)

表A-15：III期(婴儿)-按照TetraMenD剂量水平在6月龄(第3次注射前)和7月龄(第3次注射后)婴儿中的SBA和IgG ELISA结果(符合方案人群)

血清群和剂量水平	N6m/N7m	GMT/GMC*(95％CI)
				6月龄	7月龄
		SBA (C)
1μg	22/23					19.3(9.3-40.1)	37.2(18.6-74.5)
		4μg	23/24	24.4(11.0-54.1)	19.6(9.4-40.6)
10μg	21/21					43.1(23.2-80.0)	35.3(16.6-75.2)
		SBA(Y)
1μg	22/23					7.8(5.0-11.9)	21.0(11.0-40.0)
		4μg	23/24	8.5(5.0-14.4)	19.6(10.7-35.7)
10μg	21/21					9.1(5.9-14.2)	26.3(14.2-48.6)
		SBA(W-135)
1μg	22/23					5.8(4.2-8.1)	35.0(17.3-71.1)
		4μg	23/24	6.9(4.6-10.4)	17.4(9.1-33.5)
10μg	21/21					9.8(5.6-16.9)	34.2(17.0-68.7)
		IgGELISA(A)
1μg	22/22					0.5(0.4-0.6)	0.5(0.4-0.6)
		4μg	21/21	0.7(0.4-1.3)	0.8(0.5-1.3)
10μg	19/19					1.3(1.0-1.8)	1.3(0.8-2.1)
		IgG ELISA(C)
1μg	21/21					0.5(0.4-0.8)	0.7(0.5-0.9)
		4μg	21/21	0.4(0.3-0.7)	0.8(0.5-1.1)
10μg	19/19					1.1(0.8-1.6)	1.2(0.7-2.0)

表A-15：III期(婴儿)-按照TetraMenD剂量水平在6月龄(第3次注射前)和7月龄(第3次注射后)婴儿中的SBA和IgG ELISA结果(符合方案人群)

血清群和剂量水平	N6m/N7m	GMT/GMC*(95％CI)
				6月龄	7月龄
		IgGELISA(Y)
1μg	20/20					0.5(0.3-0.8)	1.2(0.8-1.6)
		4μg	20/21	0.7(0.4-1.2)	1.0(0.6-1.8)
10μg	18/19					1.2(0.8-1.8)	1.8(1.1-3.1)
		IgG ELISA(W-135)
1μg	20/20					0.5(0.3-0.8)	1.1(0.8-1.6)
		4μg	20/21	0.5(0.3-0.9)	0.9(0.6-1.3)
10μg	18/19					0.9(0.7-1.3)	1.5(0.8-2.5)

N：可评价参与者的数量

^*对SBA数据计算GMT；对IgG ELISA结果计算GMC。

表A-16列出了按照患者年龄和血清群的GMT总结。

表A-16：按照患者年龄和血清群的GMT总结

表A-16：按照患者年龄和血清群的GMT总结
								年龄(周)	剂量TetraMenD	受试者数量	取血天数	AGMT	CGMT	WGMT	YGMT
7	4μg	1	6-12周	512.00	128.00	4.00	4.00
								4μg	1	6个月	512.00	128.00	4.00	32.00
	8	1μg	1	6-12周	4.00	4.00	4.00								4.00
1μg								1	6个月	32.00	16.00	16.00	4.00
		4μg	6	6-12周	11.31	7.13	5.66							4.49
4μg								6	6个月	71.84	7.13	22.63	6.35
		10μg	1	6-12周	9.51	19.03	5.66							9.51
10μg								1	6个月	32.00	38.05	19.03	32.00
		9	1μg	13	6-12周	11.02	18.78							5.51	7.58

	1μg	14	6个月	55.17	55.17	40.99	22.63
								4μg	13	6-12周	30.34	27.27	7.19	14.38
	4μg	13	6个月	60.66	19.80	14.38	27.27
								10μg	1	6-12周	21.53	35.33	10.25	7.61
	10μg	1	6个月	70.66	26.25	26.25	22.63
								10	1μg	10	6-12周	19.70	29.86	12.13	7.46
1μg	10	6个月	39.40	19.70	45.25	14.93
							4μg		1	6-12周	12.13	32.00	4.00	4.00
4μg	1	6个月	114.04	22.63	28.51	25.40
							10μg		1	6-12周	19.50	43.07	8.00	14.49
10μg	1	6个月	52.50	35.33	39.01	32.00
							11		1μg	1	6-12周	4.00	4.00	4.00	16.00
1μg	1	6个月	8.00	4.00	4.00	32.00
								4μg	1	6-12周	512.00	512.00	64.00	64.00
4μg	1	6个月	1024.00	256.00	128.00	128.00
								12	4μg	1	6-12周	32.00	4.00	4.00	64.00
4μg	1	6个月	1024.00	64.00	256.00	256.00
							13		10μg	1	6-12周	512.00	45.25	64.00	22.63
10μg	1	6个月	724.08	90.51	256.00	181.02

在婴儿中与TetraMenD共同给予的儿科疫苗

目前，按照现行ACIP推荐和当地规范，婴儿接受常规儿科疫苗接种。在本研究中，婴儿接受TetraMenD和儿科疫苗接种。在2、4和6月龄时给予DTacP(Tripedia_)和Hib(ActHIB_)。可给予IPV或OPV；IPV在第一次和第二次注射TetraMenD时(在2月龄和4月龄时)给予。按照当地规范接种乙肝疫苗；乙肝疫苗在2月龄时给予一些参与者，但在4月龄或6月龄时不给予任何参与者。在进行该试验的婴儿期期间，RotaShield_得到许可并且ACIP推荐用于常规用途。在本试验中一个参与者在4月龄和6月龄时接受RotaShield_。

在6月龄和7月龄时评价对常规给予的儿科疫苗抗原的抗体反应。结果总结于各表中。

该试验中的婴儿参与者在2、4和6月龄时接受DTacP和PRP疫苗；在第3次注射这些疫苗后一个月抽取7月龄血液。对于这些疫苗抗原(白喉、破伤风、百日咳FHA、百日咳PT和PRP)的每一种，所观察到的抗体水平在3个TetraMenD剂量组中未显示出统计学显著差异(所有p值均＞0.05)。(见表A-17)

在本试验当中，在2月龄和4月龄时给予IPV。在第2次注射IPV后3个月抽取7月龄血液。对于1型和2型脊髓灰质炎，所观察到的GMT、NA≥1∶4的比例以及NA≥1∶8的比例在3个TetraMenD剂量组中未显示出统计学显著差异(所有p值均＞0.05)。根据NA≥1∶8的比例，全部3个TetraMenD剂量组有至少95.0％表现出抗1型和2型脊髓灰质炎的保护作用。对于3型眷髓灰质炎，1μg、4μg和10μg组的GMT分别为562.7、164.0和113.3。3型眷髓灰质炎各组间GMT的差异是统计学显著的(p＝0.001，ANOVA)。但是，依据NA≥1∶8的比例(分别为100.0％[22/22]、100.0％[21/21]和94.1％[16/17])，全部3个TetraMenD剂量组中都表现出抗3型脊髓灰质炎的保护作用。这些比例没有统计学差异(p＝0.283，Fisher恰当检验)。而且，在本试验所用IPV接种程序2月龄和4月龄的两剂IPV之后，对这三种脊髓灰质炎血清型所观察到的GMT完全处于所公开的范围之内。

在最近一次乙肝疫苗接种后的最少5个月时抽取7月龄血液。通过GMT和≥10mIU/mL的比例所观察到的乙肝表面抗体水平在3个TetraMenD剂量组中未显示出统计学显著差异(两个的p值均≥0.649)。值得注意的是，本试验中没有婴儿在6个月随访时接受乙肝疫苗，6个月是第3剂乙肝疫苗的最早推荐时期。这可以解释为什么乙肝表面抗体效价≥10mIU/mL的7月龄婴儿比例与首剂乙肝疫苗后产生的可检测抗体的公开范围一致，但低于预期在完整的三次接种系列后应具有保护性抗体水平的婴儿比例。本研究结果总结于下表。

表A-17：III期(婴儿)-按照TetraMenD剂量水平在7月龄婴儿中的共同给予疫苗的免疫原性(符合方案人群)

抗原和免疫原性标准	N7m1μg/4μg/10μg	TetraMenD剂量水平			p值*
						1μg	4μg	10μg
		白喉(IU/mL)
GMT(95％CI)％≥0.01	23/23/21							0.16(0.10-0.25)	0.09(0.06-0.14)	0.08(0.05-0.15)	0.150
			100.0	100.0	95.2	0.313
％≥0.10							56.5	43.5	47.6	0.750
		破伤风(IU/mL)
GMT(95％CI)	23/24/21							1.52(1.08-2.15)	1.26(0.88-1.78)	1.23(0.88-1.74)	0.618
		％≥0.01	100.0	100.0	100.0	不可计算
％≥0.10							100.0	100.0	100.0	不可计算
		百日咳FHA ELISA
GMC(95％CI)	20/20/19							81.6(61.4-108.4)	69.6(55.6-87.2)	63.4(43.5-92.3)	0.455

表A-17：III期(婴儿)-按照TetraMenD剂量水平在7月龄婴儿中的共同给予疫苗的免疫原性(符合方案人群)

抗原和免疫原性标准	N7m1μg/4μg/10μg	TetraMenD剂量水平			p值*
						1μg	4μg	10μg
		百日咳PTELISA(EU/ml)
GMC(95％CI)	20/21/19							66.4(43.6-101.2)	56.5(37.2-85.8)	80.0(56.7-112.7)	0.441
		百日咳PT CHO(效价)
GMT(95％CI)	20/20/16							222.9(130.8-379.6)	256.0(175.2-374.2)	332.0(200.9-548.7)	0.476
		1型脊髓灰质炎(效价)
GMT(95％CI)	22/22/20							169.9(95.3-303.0)	122.1(72.6-205.4)	93.7(46.5-188.7)	0.350
		％NA≥1∶4	100.0	100.0	100.0	不可计算
％NA≥1∶8							100.0	95.5	95.0	0.760
		2型脊髓灰质炎(效价)
GMT(95％CI)	22/21/18							183.9(96.2-351.4)	220.7(135.9-358.5)	211.2(107.3-415.6)	0.893
		％NA≥1∶4	100.0	100.0	100.0	不可计算
％NA≥1∶8							100.0	100.0	100.0	不可计算
		3型脊髓灰质炎(效价)
GMT(95％CI)	22/21/17							562.7(363.3-871.8)	164.0(97.8-274.8)	113.3(44.6-287.7)	0.001_
		％NA≥1∶4	100.0	100.0	94.1	0.283
％NA≥1∶8							100.0	100.0	94.1	0.283
		PRP(μg/mL)
GMT(95％CI)	23/22/19							4.87(3.04-7.78)	4.41(2.52-7.69)	3.39(1.64-6.99)	0.648
		％≥0.15	100.0	100.0	100.0	不可计算
％≥1.0μg/mL							95.7	81.8	78.9	0.209

表A-17：III期(婴儿)-按照TetraMenD剂量水平在7月龄婴儿中的共同给予疫苗的免疫原性(符合方案人群)

抗原和免疫原性标准	N7m1μg/4μg/10μg	TetraMenD剂量水平			p值*
						1μg	4μg	10μg
		乙肝表面抗原(mIU/mL)
GMT(95％CI)	21/23/19							46.9(12.9-170.1)	36.9(12.4-110.2)	48.3(28.1-83.2)	0.916
		％≥10	81.0	78.3	89.5	0.649

^*GMT比较使用F-检验。百分比的比较使用Fisher恰当检验。

^_p-值＜0.05

实施例11研究B  在2-10岁儿童中的1个月和6个月研究

本研究是对2-10岁健康儿童进行的随机化的、阳性对照的研究，比较了单剂TetraMenD和单剂Menomune。分别在接种前D0、D0后28天和6个月抽取血液样品。TetraMenD的总体安全性与Menomune相比是相当的。本研究的结果总结于下表。

SBA-BR抗体效价分布

表B-1显示了对于每一血清群的基线期、28天和6个月SBA-BR抗体效价的频率分布。

表B-1：0天、接种后28天和6个月时SBA-BR抗体效价的分布(符合方案人群)
														SBA效价＜8至512
测试类型	测试日期	组(N)
			＜8n(％)	8n(％)	16n(％)	32n(％)	64n(％)	128n(％)	256n(％)	512n(％)
											SBA(A)	0天	TetraMenD(638)	280(43.9)	20(3.1)	15(2.4)	24(3.8)	44(6.9)	63(9.9)	64(10.0)	56(8.8)
Menomune(655)	281(42.9)	26(4.0)	12(1.8)	52(7.9)	43(6.6)	64(9.8)	49(7.5)	56(8.5)

表B-1：0天、接种后28天和6个月时SBA-BR抗体效价的分布(符合方案人群)
														SBA效价＜8至512
则试类型	测试日期	组(N)
			＜8n(％)	8n(％)	16n(％)	32n(％)	64n(％)	128n(％)	256n(％)	512n(％)
											28天	TetraMenD(637)	3(0.5)	0(0.0)	2(0.3)	4(0.6)	11(1.7)	30(4.7)	35(5.5)	69(10.8)
	Menomune(654)	11(1.7)	6(0.9)	3(0.5)	8(1.2)	18(2.8)	45(6.9)	66(10.1)	90(13.8)
										6个月		TetraMenD(607)	17(2.8)	6(1.0)	1(0.2)	9(1.5)	16(2.6)	31(5.1)	52(8.6)	64(10.5)
	Menomune(623)	99(15.9)	13(2.1)	15(2.4)	23(3.7)	29(4.7)	52(8.3)	70(11.2)	99(15.9)

表B-1：0天、接种后28天和6个月时SBA-BR抗体效价的分布(符合方案人群)
														SBA效价＜8至512
测试类型	测试日期	组(N)
			＜8n(％)	8n(％)	16n(％)	32n(％)	64n(％)	128n(％)	256n(％)	512n(％)
											SBA(C)	0天	TetraMenD(638)	339(53.1)	30(4.7)	18(2.8)	30(4.7)	31(4.9)	51(8.0)	61(9.6)	37(5.8)
Menomune(655)	368(56.2)	34(5.2)	12(1.8)	21(3.2)	43(6.6)	54(8.2)	51(7.8)	25(3.8)
									28天	TetraMenD(636)			24(3.8)	10(1.6)	13(2.0)	27(4.2)	44(6.9)	85(13.4)	102(16.0)	97(15.3)
Menomune(653)	69(10.6)	10(1.5)	6(0.9)	34(5.2)	55(8.4)	87(13.3)	90(13.8)	96(14.7)
										6个月		TetraMenD(607)	85(14.0)	19(3.1)	17(2.8)	35(5.8)	67(11.0)	90(14.8)	88(14.5)	66(10.9)
Menomune(623)	185(29.7)	30(4.8)	14(2.2)	35(5.6)	54(8.7)	68(10.9)	61(9.8)	73(11.7)

表B-1：0天、接种后28天和6个月时SBA-BR抗体效价的分布(符合方案人群)
														SBA效价＜8至512
测试类型	测试日期	组(N)
			＜8n(％)	8n(％)	16n(％)	32n(％)	64n(％)	128n(％)	256n(％)	512n(％)
											SBA(Y)	0天	TetraMenD(637)	88(13.8)	13(2.0)	17(2.7)	40(6.3)	82(12.9)	113(17.7)	107(16.8)	68(10.7)
Menomune(654)	96(14.7)	11(1.7)	12(1.8)	42(6.4)	81(12.4)	116(17.7)	124(19.0)	66(10.1)
									28天	TetraMenD(636)			11(1.7)	3(0.5)	5(0.8)	8(1.3)	19(3.0)	69(10.8)	100(15.7)	121(19.0)
Menomune(654)	16(2.4)	4(0.6)	7(1.1)	20(3.1)	43(6.6)	85(13.0)	121(18.5)	102(15.6)
										6个月		TetraMenD(608)	25(4.1)	3(0.5)	3(0.5)	17(2.8)	23(3.8)	46(7.6)	72(11.8)	110(18.1)
Menomune(622)	62(10.0)	17(2.7)	7(1.1)	24(3.9)	38(6.1)	73(11.7)	98(15.8)	114(18.3)

表B-1：0天、接种后28天和6个月时SBA-BR抗体效价的分布(符合方案人群)
														SBA效价＜8至512
测试类型	测试日期	组(N)
			＜8n(％)	8n(％)	16n(％)	32n(％)	64n(％)	128n(％)	256n(％)	512n(％)
											SBA(W-135)	0天	TetraMenD(638)	401(62.9)	28(4.4)	24(3.8)	21(3.3)	51(8.0)	45(7.1)	43(6.7)	15(2.4)
Menomune(654)	403(61.6)	36(5.5)	22(3.4)	30(4.6)	52(8.0)	48(7.3)	34(5.2)	17(2.6)
									28天	TetraMenD(636)			22(3.5)	2(0.3)	1(0.2)	9(1.4)	24(3.8)	39(6.1)	73(11.5)	108(17.0)
Menomune(653)	43(6.6)	3(0.5)	4(0.6)	8(1.2)	33(5.1)	61(9.3)	88(13.5)	130(19.9)
										6个月		TetraMenD(607)	46(7.6)	9(1.5)	3(0.5)	10(1.6)	31(5.1)	69(11.4)	96(15.8)	107(17.6)
Menomune(624)	82(13.1)	12(1.9)	11(1.8)	23(3.7)	66(10.6)	111(17.8)	120(19.2)	100(16.0)

表B-1：0天、接种后28天和6个月时SBA-BR抗体效价的分布(符合方案人群)
														SBA效价1024至＞65536
测试类型	测试日期	组(N)
			1024n(％)	2048n(％)	4096n(％)	8192n(％)	16384n(％)	32768n(％)	65536n(％)	＞65536n(％)
											SBA(A)	0天	TetraMenD(638)	40(6.3)	26(4.1)	2(0.3)	3(0.5)	1(0.2)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)
Menomune(655)	51(7.8)	19(2.9)	0(0.0)	1(0.2)	1(0.2)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)
									28天	TetraMenD(637)			120(18.8)	151(23.7)	79(12.4)	71(11.1)	39(6.1)	20(3.1)	1(0.2)	1(0.2)
Menomune(654)	122(18.7)	162(24.8)	62(9.5)	44(6.7)	16(2.4)	1(0.2)	0(0.0)	0(0.0)
										6个月		TetraMenD(607)	129(21.3)	139(22.9)	48(7.9)	52(8.6)	27(4.4)	16(2.6)	0(0.0)	0(0.0)
Menomune(623)	94(15.1)	93(14.9)	17(2.7)	9(1.4)	8(1.3)	2(0.3)	0(0.0)	0(0.0)

表B-1：0天、接种后28天和6个月时SBA-BR抗体效价的分布(符合方案人群)
														SBA效价1024至＞65536
测试类型	测试日期	组(N)
			1024n(％)	2048n(％)	4096n(％)	8192n(％)	16384n(％)	32768n(％)	65536n(％)	＞65536n(％)
											SBA(C)	0天	TetraMenD(638)	22(3.4)	16(2.5)	3(0.5)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)
Menomune(655)	20(3.1)	22(3.4)	3(0.5)	0(0.0)	1(0.2)	1(0.2)	0(0.0)	0(0.0)
									28天	TetraMenD(636)			95(14.9)	92(14.5)	19(3.0)	16(2.5)	6(0.9)	6(0.9)	0(0.0)	0(0.0)
Menomune(653)	86(13.2)	91(13.9)	10(1.5)	9(1.4)	7(1.1)	3(0.5)	0(0.0)	0(0.0)
										6个月		TetraMenD(607)	62(10.2)	56(9.2)	17(2.8)	3(0.5)	1(0.2)	1(0.2)	0(0.0)	0(0.0)
Menomune(623)	42(6.7)	45(7.2)	6(1.0)	7(1.1)	1(0.2)	1(0.2)	1(0.2)	0(0.0)

表B-1：0天、接种后28天和6个月时SBA-BR抗体效价的分布(符合方案人群)
														SBA效价1024至＞65536
测试类型	测试日期	组(N)
			1024n(％)	2048n(％)	4096n(％)	8192n(％)	16384n(％)	32768n(％)	65536n(％)	＞65536n(％)
											SBA(Y)	0天	TetraMenD(637)	62(9.7)	37(5.8)	5(0.8)	2(0.3)	3(0.5)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)
Menomune(654)	50(7.6)	43(6.6)	10(1.5)	2(0.3)	1(0.2)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)
									28天	TetraMenD(636)			111(17.5)	113(17.8)	29(4.6)	21(3.3)	17(2.7)	9(1.4)	0(0.0)	0(0.0)
Menomune(654)	127(19.4)	86(13.1)	23(3.5)	13(2.0)	5(0.8)	2(0.3)	0(0.0)	0(0.0)
										6个月		TetraMenD(608)	123(20.2)	111(18.3)	34(5.6)	22(3.6)	13(2.1)	6(1.0)	0(0.0)	0(0.0)
Menomune(622)	80(12.9)	84(13.5)	13(2.1)	7(1.1)	3(0.5)	2(0.3)	0(0.0)	0(0.0)

表B-1：0天、接种后28天和6个月时SBA-BR抗体效价的分布(符合方案人群
														SBA效价1024至＞65536
测试类型	测试日期	组(N)
			1024n(％)	2048n(％)	4096n(％)	8192n(％)	16384n(％)	32768n(％)	65536n(％)	＞65536n(％)
											SBA(W-135)	0天	TetraMenD(638)	4(0.6)	5(0.8)	1(0.2)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)
Menomune(654)	6(0.9)	3(0.5)	2(0.3)	0(0.0)	1(0.2)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)
									28天	TetraMenD(636)			108(17.0)	160(25.2)	36(5.7)	32(5.0)	16(2.5)	6(0.9)	0(0.0)	0(0.0)
Menomune(653)	117(17.9)	129(19.8)	24(3.7)	9(1.4)	3(0.5)	1(0.2)	0(0.0)	0(0.0)
										6个月		TetraMenD(607)	101(16.6)	92(15.2)	16(2.6)	16(2.6)	8(1.3)	3(0.5)	0(0.0)	0(0.0)
Menomune(624)	67(10.7)	25(4.0)	5(0.8)	2(0.3)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)

表B-2总结了按照受试者年龄和TetraMenD血清群的几何平均效价(GMT)。

表B-2：按照受试者年龄和TetraMenD血清群的几何平均效价(GMT)的总结)
							年龄(岁)	取血天数	受试者数量	血清群AGMT	血清群C GMT	血清群WGMT	血清群Y-135GMT
2	0天	264	20.59	16.04	8.75	91.23
							28天	260	940.26	151.41	332.43	393.88
	6个月	244	460.92	64.92	153.52	312.95
							3	0天	235	33.84	14.60	12.64	148.78
28天	228	1610.74	292.64	795.64	662.97
						6个月		228	1033.38	105.69	408.85	631.50
4	0天	35	74.99	29.56	9.95								128.00
						28天	34	3479.60	795.86	1731.22	906.10
	6个月	29	3812.58	302.62	634.88							908.65
						5	0天	27	118.51	32.00	29.63		121.59
28天	27	3010.02	612.79	1323.71	1050.63
							6个月	27	3010.02	406.37	679.07	948.10
6	0天	38	38.40	34.42	13.83								112.66
						28天	37	4414.32	950.07	2086.73	898.15
	6个月	37	3729.75	386.57	1005.00							849.06
						7	0天	30	111.43	78.79	16.00		111.43
28天	29	3999.26	1612.60	1691.56	1537.33
							6小月	28	2375.94	524.83	1049.67	1638.97
8	0天	18	118.51	54.86	17.28								188.13

	28天	16	6049.08	1878.02	2543.32	1069.34
							6个月	17	2837.86	453.05	1111.00	1418.93
	9	0天	29	116.33	91.60	21.31							87.32
28天							28	4870.99	2825.49	3119.59	1521.66
		6个月	28	3995.85	974.54	1187.97						1412.75
10							0天	21	98.30	27.13	18.26		45.25
	28天	21	4233.45	3251.00	2337.06	1333.45
							6个月	20	3821.70	989.12	1782.89	1499.22

表B-3显示了对于血清群A、C、Y和W-135从基线期到28天SBA-BR效价具有≥4倍升高的参与者数量和比例。对于每一血清群，TetraMenD组中的这些百分比高于Menomune_组中的百分比。对于血清群A、C、Y和W-135，比例的差异分别为：-0.0397、-0.0452、-0.1092和-0.0562。

表B-3：符合方案人群的主要(primary hypothesis)假设检测的总结

血清群	SBA效价≥4倍升高
						TetraMenDn/N  Pt	Menomune_n/N  Pm	差值(Pm-Pt)	差值的95％单侧置信上限
血清群A	558/636 0.8774	547/653 0.8377	-0.0397	-0.0077
					血清群C	466/635 0.7339	449/652 0.6887	-0.0452	-0.0037
血清群Y	359/634 0.5662	298/652 0.4571	-0.1092	-0.0636
					血清群W-135	578/635 0.9102	556/651 0.8541	-0.0562	-0.0267

n：从基线效价起具有≥4倍升高的参与者数量。

N：所使用群体中的参与者总数。

P_t和P_m：分别为TetraMenD和Menomune_组中接种后SBA效价具有≥4倍升

高的参与者比例。

表B-3总结了接种后28天SBA抗体效价≥32的参与者比例。

表B-3：接种后28天SBA抗体效价≥32的参与者的百分比和数量(符合方案人群)
						TetraMenD		Menomune_
％*(n_/N_)	百分比的95％CI	％*(n_N_)	百分比的95％CI
				血清群A		99.22(632/637)	(98.18，100.00)	96.94(634/654)	(95.32，100.00)
血清群C	92.61(589/636)	(90.29，100.00)	86.98(568/653)		(84.16，100.00)
				血清群Y		97.01(617/636)	(95.37，100.00)	95.87(627/654)	(94.05，100.00)
血清群W-135	96.07(611/636)	(94.25，100.00)	92.34(603/653)		(90.03，100.00)

％：n/N。

^_n：接种后28天效价≥32的参与者数量。

^_N：该组中在28天时具有有效血液样品的参与者总数。

表B-4总结了接种后28天SBA抗体效价≥128的参与者比例。

表B-4：接种后28天SBA-SR抗体效价≥128的参与者的百分比和数量(符合方案人群)。

	TetraMenD	Menomune_
			％*       百分比的(n_/N_    95％CI	％*(n_/N_)百分比的95％CI
	血清群A血清群C血清群Y血清群W-135	96.86    (95.19，100.00)(617/637)81.45     (78.20，100.00)(518/636)92.77     (90.47，100.00)(590/636)90.88    (88.37，100.00)(578/636)			92.97    (90.73，100.00)(608/654)73.35    (69.79，100.00)(479/653)86.24    (83.36，100.00)(564/654)86.06    (83.17，100.00)(562/653)

％：n/N。

^_n：接种后28天效价≥128的参与者数量。

^_N：该组中在28天时具有有效血液样品的参与者总数。SBA-BR抗体效价具有至少4倍升高的参与者比例

表B-5显示了在28天和6个月时SBA抗体效价由基线起具有≥4倍升高的参与者比例。在接受TetraMenD后的28-56天，大多数参与者体验了针对疫苗中所含的每种血清群的SBA-BR抗体效价的≥4倍升高。

表B-5：在28天和6个月时SBA-BR抗体效价由基线起具有≥4倍升高的参与者百分比和数量(符合方案人群)

测试类型	测试日期	TetraMenD		Menomune_
						％*(n_/N_)	(95％CI)	％*(n_/N_)	(95％CI)
		血清群ASBA	28天	87.7(558/636)	(84.9，90.2)					83.8(547/653)	(80.7，86.5)
6个月	79.1(480/607)					(75.6，82.2)	56.9(354/622)	(52.9，60.8)
			血清群CSBA	28天	73.4(466/635)				(69.8，76.8)	68.9(449/652)	(65.2，72.4)
6个月	55.7(338/607)	(51.6，59.7)				43.7(272/622)	(39.8，47.7)
				血清群YSBA	28天			56.6(359/634)	(52.7，60.5)	45.7(298/652)	(41.8，49.6)
6个月	57.3(348/607)	(53.3，61.3)	39.2(243/620)			(35.3，43.2)
					血清群W-135 SBA		28天	91.0(578/635)	(88.5，93.1)	85.4(556/651)	(82.5，88.0)

测试类型	测试日期	TetraMenD		Menomune_
						％*(n_/N_)	(95％CI)	％*(n_/N_)	(95％CI)
			6个月	82.7(502/607)	(79.5，85.6)					69.5(432/622)	(65.7，73.1)

％：n/N。

^_n：由基线效价起具有≥4倍升高的参与者数量。

^_N：所用群体中的参与者总数。

在0天检测不到效价(＜8)的参与者在28天时SBA-BR抗体效价得到

≥4倍升高的比例

在两个处理组中并对于所有疫苗血清群，在基线期检测不到SBA-BR效价(＜8)的大部分参与者在28天时获得了SBA效价的≥4倍升高(表B-6)。在TetraMenD组中，在0天时SBA效价＜8的参与者在28天时由基线起具有≥4倍升高的比例在86.21％-98.57％的范围内；在Menomune_组中，该比例在75.00-94.64的范围内。

表B-6：在0天检测不到效价(＜8)的参与者在28天时SBA抗体效价得到≥4倍升高的数量和百分率。

	TetraMenD		Menomune_
					血清群	％(n/N*)	95％Cr*	％(n/N)	95％CI_
A	98.57(275/279)	(96.37，100.00)	94.64(265/280)	(91.32，100.00)
					C	87.87(297/338)	(83.91，100.00)	80.05(293/366)	(75.59，100.00)
Y	86.21(75/87)	(77.15，100.00)	75.00(72/96)	(65.12，100.00)
					W-135	96.00(384/400)	(93.59，100.00)	89.53(359/401)	(86.11，100.00)

^*n＝每一血清群中在0天时效价＜8而在28天时效价≥32的参与者数量。

N＝每一血清群中在0天时效价＜8的参与者数量。

^_百分比的确切95％置信区间。

SBA-BR抗体GMT和平均升高倍数

表B-7显示了基线期、接种后28天和6个月时的SBA GMT以及SBA GMT的升高倍数。

表B-7：基线期、接种后28天和6个月时SBA-BR血清学结果(符合方案人群)

测试类型	参数*	取血	TetraMenD			Menomune_
									N_	几何均数	(95％CI)	N_	几何均数	(95％CI)
			血清群A SBA	效价升高倍数	0天28天6个月0天28天	638637607638636	35.441700.271053.651.0035.18	(29.77，42.20)(1512.07，1911.89)(912.93，1216.07)(1.00，1.00)(29.72，41.65)							655654623655653	32.72892.20214.971.0020.21	(27.71，38.63)(789.97，1007.66)(179.84，256.97)(1.00，1.00)(17.43，23.44)

测试类型	参数*	取血	TetraMenD			Menomune_
								N_	几何均数	(95％CI)	N_	几何均数(95％CI)
			6个月	607	23.19	(19.20，28.00)	622						5.04      (4.21，6.03)
		血清群CSBA						效价升高倍数	0天28天6个月0天28天6个月	638636607638635607	20.63353.85136.921.0011.864.49	(17.59，24.20)(307.95，406.58)(116.40，161.06)(1.00，1.00)(10.19，13.81)(3.85，5.25)		655653623655652622	18.69     (15.95，21.90)230.71    (197.72，269.20)65.51     (54.64，78.55)1.00      (1.001.00)8.40      (7.23，9.77)2.41      (2.05，2.83)
血清群YSBA	效价升高倍数		0天28天6个月0天28天6个月	637636608637634607	118.61636.70591.771.004.834.63	(102.49，137.27)(563.06，719.97)(514.65，680.43)(1.00，1.00)(4.25，5.49)(4.00，5.37)	654654622654652620						117.84    (101.98，136.18408.10    (362.1 9，459.84)239.18    (204.91，279.17)1.00      (1.00，1.00)3.14      (2.79，3.52)1.85      (1.60，2.14)
		血清群W-135SBA						效价	0天28天6个月	638636607	12.09749.78362.25	(10.62，13.76)(657.37，855.18)(311.67，421.03)		654653624	12.15     (10.69，13.80)424.75    (371.47，485.67)136.06    (118.08，156.78)
升高倍数	0天28天6个月		638635607	1.0040.2419.19	(1.00，1.00)(34.30，47.21)(16.31，22.56)	654651622	1.00      (1.00，1.00)22.98     (19.73，26.76)7.42     (6.33，8.69)

^*效价或升高倍数，其中升高倍数＝28天时的效价/0天时的效价

^_N：计算所用的参与者总数。

血清群A、C、W-135和Y的ELSIA IgG

表B-8显示了基线期、接种后28天和6个月时的IgG GMC以及IgG GMC的升高倍数。

表B-8：基线期、接种后28天和6个月的IgG血清学结果(符合方案人群)

测试类型	参数*	取血	TetraMenD			Menomune_
									N_	几何均数	(95％CI)	N_	几何均数	（95％CI)
			血清群A(IgGELISA)	效价	0天	115	0.36	(0.31，0.43)							113	0.33	(0.28，0.38)
28天	115	7.65							(6.27，9.33)	110	6.81	(5.51，8.42)
					6个月	112	1.70	(137，2.11)					109	4.53	(3.60，5.70)
升高倍数	0天	115							1.00	(1.00，1.00)	113	1.00				(1.00，1.00)
				28天	115	21.00	(16.60，26.58)	108					21.09	(16.78，26.50)
	6个月	112							4.58	(3.65，5.75)	107	14.40			(11.22，18.49)
				血清群C(IgGELISA)	效价	0天	115	0.23					(0.20，0.25)	113		0.25	(0.22，0.29)
28天	115	1.24	(1.03，1.50)						110	7.62	(6.33，9.19)
						6个月	111	0.36				(0.31，0.43)	109	3.49	(2.82，4.32)
升高倍数	0天	115	1.00						(1.00，1.00)	113	1.00					(1.00，1.00)
					28天	115	5.50	(4.58，6.62)				109	30.18	(24.26，37.55)
	6个月	111	1.60						(1.36，1.89)	107	14.42				(11.46，18.15)

表B-8：基线期、接种后28天和6个月的IgG血清学结果(符合方案人群)

测试类型	参数*	取血	TetraMenD			Menomune_
									N_	几何均数	(95％CI)	N_	几何均数	(95％CI)
			血清群Y(IgGELISA)	效价	0天	115	0.38	(0.34，0.43)							114	0.34	(0.31，0.38)
28天	115	1.54							(1.26，1.88)	110	4.15	(3.30，5.22)
					6个月	112	0.76	(0.65，0.89)					109	2.90	(2.25，3.73)
升高倍数	0天	115							1.00	(1.00，1.00)	114	1.00				(1.00，1.00)
				28天	115	4.04	(3.30，4.93)	109					12.43	(9.85，15.68)
	6个月	112							1.98	(1.68，2.32)	108	8.72			(6.79，11.21)
				血清群W-135(IgGELISA)	效价	0天	115	0.25					(0.22，0.28)	113		0.22	(0.19，0.25)
28天	115	0.90	(0.72，1.12)						110	2.53	(2.06，3.11)
						6个月	112	0.55				(0.47，0.65)	109	1.88	(1.53，2.31)
升高倍数	0天	115	1.00						(1.00，1.00)	113	1.00					(1.00，1.00)
					28天	115	3.60	(2.90，4.47)				108	11.67	(9.34，14.58)
	6个月	112	2.18						(1.84，2.58)	107	8.70				(6.96，10.87)

^*效价或升高倍数，其中升高倍数＝28天时的效价/0天时的效价

^_N：计算所用的参与者总数。

接受本研究接种TetraMenD后28-56天，大多数参与者都体验到对疫苗中所包含的每一血清群的SBA-BR抗体效价的≥4倍升高。总体来说，有77％的TetraMenD接受者体验到抗所有血清群的抗体效价的4倍升高。观察到对血清群Y的接种前抗体水平高于对血清群C或W-135的接种前抗体水平。这可能与这样一种事实相关：即在此年龄对血清群Y的天然暴露可能比先前预想的更普遍。较高的循环抗体水平反映了近期天然暴露的情况，并可能降低呈现出4倍以上抗体反应的疫苗接种者比例。与其它血清群相比，这种现象看起来明显是血清群Y反应的情况。对于血清群Y，4倍升高为56.6％，相比之下血清群C为73.4％，血清群A为87.7％，血清群W-135为91.0％。还观察到对血清群A的高接种前抗体水平。这可能是在延长的时间段内间断性接触几种天然交叉反应抗原的结果。

为了进一步评价既存效价的影响并研究血清阳转率(定义为：当对任一血清群的接种前效价＜1∶8时抗体效价获得4倍升高的疫苗接受者比例)，对疫苗所含4种血清群中的任一种的接种前抗体效价＜1∶8的参与者进行单独分析。就使用幼兔作为补体源的SBA测定法来说，＜1∶8的抗体效价被认为是代表不可检测的循环抗体水平。当用此标准来评价参与者时，在接种TetraMenD后观察到对血清群A的血清阳转率为98.6％，对血清群C为87.9％，对血清群W-135为96.0％，对血清群Y为86.2％。

根据对军队新兵的观测结果，Goldschneider提出，使用采用人补体源的SBA测定法得到的≥1∶4的最小效价与抗血清群C的、免遭侵袭性疾病的保护作用相关联。但是，由于测定标准化的需要以及缺乏可靠的人类补体源，所以建议将幼兔补体作为备选来源。脑膜炎球菌似乎对幼兔补体比对人补体更敏感，产生更高的检测抗体效价。一些作者建议，在使用幼兔补体测定时≥1∶128的效价预示着具有保护作用，而＜1∶8的效价预示着至少对血清群C有易感性。尽管该水平在评价多糖疫苗时可能是适合的，但其可能不适用于缀合疫苗。Borrow指出，在接受单价C缀合疫苗、表现出接种后SBA效价在8-64之间的受试者中，几个月后使用降低剂量(10μg)的脑膜炎球菌多糖疫苗给予表现出记忆应答，这表明这些个体也受到了保护，抗体水平达到≥1∶128。对于接种TetraMenD疫苗并且针对每种血清群的SBA-BR效价≥1∶128的受试者结果列于表中。当对疫苗中所包含的每一种血清群都使用这些标准时，总体来说，接种TetraMenD的参与者有96.2％获得≥1∶32的接种后SBA-BR效价，有90.5％获得≥1∶128的效价。此临床研究中的一部分血清还用于评价使用幼兔补体和人补体的SBA测定法间的关联，结果在随后的研究中提供。

在Menomune_组中抗血清群C、Y和W-135的总IgG反应明显高于TetraMenD接种组。但是，在TetraMenD组中抗血清群A、C、Y和W-135的接种后SBA GMT水平明显较高。

表B-9提供了依据血清群的GMC和GMT效价的比较。

表B-9依据血清群的IgG GMC和SBA GMT效价的对比
				血清群	28天的结果：	IgG GMC	SBA GMT
A	TetraMenD	7.65	1700.3
				Menomune_	6.81	892.2
	C	TetraMenD	1.24				353.9
Menomune_				7.62	230.7
		Y	TetraMenD			1.54	636.7
Menomune_	4.15			408.1
			W-135		TetraMenD	0.90	749.8
Menomune_	2.53	424.8

缀合物产生的较低水平IgG却产生了比多糖疫苗更高的杀菌活性水平，此观察结果强有力地表明，缀合疫苗抗体反应的质量和亲和性优于非缀合多糖疫苗产生的抗体反应。高亲和性抗体与功能活性和记忆应答相关。该作用在一些已公开的研究中也可以见到。这些资料证实TetraMenD在2-10岁的儿童中是高免疫原性的，对于四个血清群中的每一种，在TetraMenD组中所观察到的GMT均优于Menomune组中所观察到的GMT，并且所获得的效价预示着具有保护作用。最后，看起来TetraMenD产生了针对疫苗中所包含的每一种血清群的更高亲和性抗体反应。

在试验过程中，在4个特定时间点监测安全性：报告即时反应(接种后30分钟内)、接种后的前7天中诉求的局部和全身反应、接种后的28天时间内的所有不良事件以及由0天至接种后6个月的持续AE(0-28天)和严重不良事件。

对于所有参与者，两个处理组中所报告的大多数诉求的局部反应是轻微的，在接种3天内消退。每一处理组的局部反应的频率是相似的。在TetraMenD接受组中有58.8％报告了至少1种局部反应，而Menomune_接受组有58.3％报告了至少1种局部反应。此外，对青少年肌内给予单价C CRM₁₉₇缀合疫苗的经验表明，局部反应的比率与本研究中对TetraMenD所观察到的局部反应比率非常相似。

大多数报告的AE是不严重的、可逆的并且与接种无关的。本研究中没有报告新发支气管哮喘、糖尿病或自身免疫病。

实施例12  研究C  对11-18岁的儿童进行1个月的研究

研究C是对0天接受单剂TetraMenD与单剂Menomune_的11-18岁健康儿童进行的随机化阳性对照研究。在0天(接种前)和28天抽取血清并分析，如结果中所描述进一步评价一部分患者血清。

对于所有参与者，两个处理组中报告的大多数诉求的局部反应是轻微的，在接种2天内消退。TetraMenD接受组的局部反应频率(72.4％)比Menomune_接受组(34.7％)更普遍。此结果可能是由于缀合疫苗(白喉载体蛋白质)的性质而不是由于给药途径(肌内给予)造成的。该研究的结果总结于下表。

表C-1显示了基线期和28天时对每一血清群的SBA-BR抗体效价的频率分布。

表C-1：0天和接种后28天时SBA-BR抗体效价的分布(符合方案人群)
														SBA-BR效价＜8至512
测试类型	测试日期	组(N)*
			＜8n(％)_	8n(％)	16n(％)	32n(％)	64n(％)	128n(％)	256n(％)	512n(％)
											SBA(A)	0天	TetraMenD(425)	81(19.1)	19(4.5)	4(0.9)	9(2.1)	33(7.8)	76(17.9)	86(20.2)	51(12.0)
Menomune_(423)	93(22.0)	12(2.8)	10(2.4)	13(3.1)	38(9.0)	72(17.0)	72(17.0)	56(13.2)
									28天	TetraMenD(423)			-_	-	-	-	1(0.2)	-	1(0.2)	15(3.5)
Menomune_(423)	-	-	-	-	-	8(1.9)	12(2.8)	19(4.5)
										SBA(C)		0天	TetraMenD(425)	157(36.9)	37(8.7)	18(4.2)	24(5.6)	36(8.5)	40(9.4)	39(9.2)	35(8.2)
Menomune_(423)	152(35.9)	35(8.3)	15(3.5)	19(4.5)	40(9.5)	46(10.9)	42(9.9)	25(5.9)
									28天		TetraMenD(423)		1(0.2)	1(0.2)	-	1(0.2)	2(0.5)	17(4.0)	33(7.8)	58(13.7)
Menomune_(423)	1(0.2)	-	1(0.2)	1(0.2)	4(0.9)	26(6.1)	47(11.1)	56(13.2)

表C-1：0天和接种后28天时SBA-BR抗体效价的分布(符合方案人群)
														SBA-BR效价＜8至512
测试类型	测试日期	组(N)*
			＜8n(％)_	8n(％)	16n(％)	32n(％)	64n(％)	128n(％)	256n(％)	512n(％)
											SBA(Y)	0天	TetraMenD(425)	61(14.4)	6(1.4)	1(0.2)	22(5.2)	64(15.1)	94(22.1)	101(23.8)	50(11.8)
Menomune_(423)	47(11.1)	3(0.7)	7(1.7)	27(6.4)	74(17.5)	94(22.2)	85(20.1)	51(12.1)
									28天	TetraMenD(423)			-	-	1(0.2)	-	1(0.2)	23(5.4)	53(12，5)	71(16.8)
Menomune_(423)	1(0.2)	-	-	-	2(0.5)	11(2.6)	59(13.9)	81(19.1)
										SBA(W-135)		0天	TetraMenD(425)	165(38.8)	37(8.7)	28(6.6)	36(8.5)	60(14.1)	56(13.2)	22(5.2)	15(3.5)
Menomune_(423)	139(32.9)	52(12.3)	25(5.9)	34(8.0)	67(15.8)	43(10.2)	46(10.9)	11(2.6)
									28天		TetraMenD(423)		4(0.9)	-	1(0.2)	-	1(0.2)	19(4.5)	34(8.0)	63(14.9)
Menomune_(423)	1(0.2)	1(0.2)	-	1(0.2)	2(0.5)	12(2.8)	21(5.0)	51(12.1)

表C-1：0天和接种后28天时SBA-BR抗体效价的分布(符合方案人群)
														SBA-BR效价1024至＞65536
测试类型	测试日期	组(N)*
			1024n(％)	2048n(％)	4096n(％)	8192n(％)	16384n(％)	32768n(％)	65536n(％)	＞65536n(％)
											SBA(A)	0天	TetraMenD(425)	32(7.5)	29(6.8)	2(0.5)	1(0.2)	2(0.5)	-	-	-
Menomune_(423)	3g(9.0)	14(3.3)	2(0.5)	2(0.5)	1(0.2)	-	-	-
									28天	TetraMenD(423)			36(8.5)	66(15.6)	90(21.3)	108(25.5)	63(14.9)	37(8.7)	4(0.9)	2(0.5)
Menomune_(423)	46(10.9)	100(23.6)	108(25.5)	76(18.0)	43(10.2)	11(2.6)	-	-
										SBA(C)		0天	TetraMenD(425)	20(4.7)	13(3.1)	4(0.9)	2(0.5)	-	-	-	-
Menomune_(423)	23(5.4)	22(5.2)	2(0.5)	1(0.2)	1(0.2)	-	-	-
									28天		TetraMenD(423)		66(15.6)	82(19.4)	66(15.6)	45(10.6)	24(5.7)	21(5.0)	4(0.9)	2(0.5)
Menomune_(423)	70(16.5)	64(15.1)	55(13.0)	41(9.7)	35(8.3)	19(4.5)	3(0.7)	-

表C-1：0天和接种后28天时SBA-BR抗体效价的分布(符合方案人群)
														SBA-BR效价1024至＞65536
测试类型	测试日期	组(N)*
			1024n(％)	2048n(％)	4096n(％)	8192n(％)	16384n(％)	32768n(％)	65536n(％)	＞65536n(％)
											SBA(Y)	0天	TetraMenD(425)	13(3.1)	6(1.4)	2(0.5)	2(0.5)	2(0.5)	1(0.2)	-	-
Menomune_(423)	24(5.7)	6(1.4)	2(0.5)	1(0.2)	1(0.2)	1(0.2)	-	-
									28天	TetraMenD(423)			77(18.2)	80(18.9)	52(12.3)	41(9.7)	16(3.8)	7(1.7)	1(0.2)	-
Menomune_(423)	90(21.3)	74(17.5)	53(12.5)	35(8.3)	11(2.6)	6(1.4)	-	-
										SBA(W-135)		0天	TetraMenD(425)	4(0.9)	2(0.5)	-	-	-	-	-	-
Menomune_(423)	4(0.9)	1(0.2)	1(0.2)	-	-	-	-	-
									28天		TetraMenD(423)		90(21.3)	88(20.8)	64(15.1)	36(8.5)	16(3.8)	6(1.4)	1(0.2)	-
Menomune_(423)	103(24.3)	114(27.0)	67(15.8)	42(9.9)	6(1.4)	2(0.5)	-	-

表C-2总结了按照受试者年龄及TetraMenD血清群的GMT水平。

表C-2：按照受试者年龄及TetraMenD血清群的GMT总结
							年龄(岁)	取血天数	受试者数量	血清群A GMT	血清群C GMT	血清群W GMT	血清群Y-135GMT
11	0天	45	101.59	37.33	21.77	91.21
							28天	45	4705.07	1372.15	1482.00	1024.00
	12	0天	54	104.24	42.99	14.63							72.77
28天							53	5049.37	2157.99	1245.94	1198.00
		13	0天	65	145.47	32.34						20.23	128.00

	28天	65	7363.39	1880.53	2206.73	1782.89
							14	0天	67	85.50	31.67	24.71	107.36
28天	67	5124.87	2006.06	1753.62	1159.35
						15		0天	70	129.27	42.22	27.31	126.74
28天	68	4870.99	2090.18	1193.17	1193.17
							16	0天	69	103.66	21.41	22.74	129.29
28天	69	7189.09	2357.27	1455.45	2068.68
						17		0天	69	85.64	38.73	13.90	72.93
28天	67	4269.06	1665.21	841.27	904.45
							18	0天	1	4	8	16	64
28天	1	8192.00	256.00	512.00	8192.00

表C-3显示了从基线到28天时对血清群A、C、Y、W-135的SBA-BR效价具有≥4倍升高的参与者数量和百分比。对于每一种血清群，在TetraMenD组中的这些百分比都高于Menomune_组。

表C-3：从基线到28天时SBA-BR效价具有≥4倍升高的参与者数量和百分比

对血清群的SBA效价的≥4倍升高	TetraMenDn/N  Pt比例	Menomune_n/N  Pm比例	差值(Pm-Pt)	差值的单侧95％CI上限
					A	392/423  0.9267	391/423  0.9243	NA	NA
C	388/423  0.9173	375/423  0.8865	-0.0307	0.0029
					Y	346/423  0.8180	339/423  0.8014	-0.0165	0.0278
W-135	409/423  0.9669	403/423  0.9527	-0.0142	0.0080

SBA-BR抗体效价≥32的频率

接种后28天时SBA抗体效价≥32的参与者比例总结于表C-4。

表C-4：接种后28天SBA抗体效价≥32的参与者百分比和数量(符合方案人群)

	TetraMenD		Menomune_
					％*(n_/N_)	百分比的95％CI	％*(n_/N_)	百分比的95％CI
	血清群A	100.00(423/423)	(99.13，100.00)	100.00(423/423)					(99.13，100.00)
血清群C					99.53(421/423)	(98.30，100.000	99.53(421/423)	(98.30，100.00)
	血清群Y	99.76(422/423)	(98.69，100.00)	99.76(422/423)					(98.69，100.00)
血清群W-135					98.82(418/423)	(97.26，100.00)	99.53(421/423)	(98.30，100.00)

％：n/N。

^_n：接种后28天效价≥32的参与者数量。

^_N：该组中在28天时具有有效血样的参与者总数。

SBA-BR抗体效价≥128的频率

接种后28天SBA抗体效价≥128的参与者比例总结于表C-5。

表C-5：接种后28天SBA抗体效价≥128的参与者百分比和数量(符合方案人群)

	TetraMenD		Menomune_
					％*(n_/N_)	百分比的95％CI	％*(n_/N_)	百分比的95％CI
	血清群A	99.76(422/423)	(98.69，100.00)	100.00(423/423)					(99.13，100.00)
血清群C					98.82(418/423)	(97.26，100.00)	98.35(416/423)	(96.62，100.00)
	血清群Y	99.53(421/423)	(98.30，100.00)	99.29(420/423)					(97.94，100.00)
血清群W-135					98.58(417/423)	(96.94，100.00)	98.82(418/423)	(97.26，100.00)

％：以百分率表示的n/N。

^_n：接种后28天效价≥128的参与者数量。

^_N：该组中在28天具有有效血样的参与者总数。

SBA-BR抗体效价具有≥4倍升高的参与者百分比

表C-6显示了28天时SBA抗体效价由基线起具有≥4倍升高的参与者比例。

表C-6：28天时SBA抗体效价由基线起具有≥4倍升高的参与者百分比和数量

测试类型	TetraMenD		Menomune_
					％*(n_/N_)	(95％CI)	％*(n_/N_)	(95％CI)
	血清群A SBA	92.7(392/423)	(89.8，95.0)	92.4(391/423)					(89.5，94.8)
血清群CSBA					91.7(388/423)	(88.7，94.2)	88.7(375/423)	(85.2，91.5)
	血清群YSBA	81.8(346/423)	(77.8，85.4)	80.1(339/423)					(76.0，83.8)
血清群W-135 SBA					96.7(409/423)	(94.5，98.2)	95.3(403/423)	(92.8，97.1)

％：以百分率表示的n/N。

^_n：由基线效价起具有≥4倍升高的参与者数量。

^_N：所使用群体中的参与者总数。

在0天无法检测到效价(＜8)的参与者在28天时SBA-BR效价获得≥4倍升高的百分比

在两个处理组以及对于所有疫苗血清群，在基线期具有不可检测的SBA效价(＜8)的大部分参与者在28天时SBA效价获得≡4倍升高。在0天SBA效价＜8的参与者从基线期到28天SBA效价具有≥4倍升高的比例在98.17％-100.0％的范围内(表C-7)。

表C-7：在0天具有不可检测效价(＜8)的参与者在28天时SBA-BR抗体效价获得≥4倍升高的数量和百分比

	TetraMenD			Menomune_
							血清群	百分率	n/N*	95％CI*	百分率	n/N	95％CI*
A	100.00	81/81	(95.55，100.00)	100.00	93/93	(96.11，100.00)
							C	98.71	153/155	(95.42，100.00)	99.34	151/152	(96.39，100.00)
Y	98.17	161/164	(94.75，100.00)	99.28	138/139	(96.06，100.00)
							W-135	98.36	60/61	(91.20，100.00)	100.00	47/47	(92.45，100.00)

^*n＝在每一种血清群中0天时效价＜8且28天时效价≥32的参与者数量。

N＝在每一血清群中0天时效价＜8的参与者数量。

^_百分比的确切95％置信区间

SBA-BR抗体GMT和平均升高倍数

表C-8显示了基线期和接种后28天的SBA GMT以及SBA GMT的升高倍数。

表C-8：基线期和接种后28天的SBA血清学结果(符合方案人群)

测试类型血清群A SBA		参数*	取血	TetraMenD			Menomune_
										N_	几何均数	(95％CI)	N_	几何均数	(95％CI)
				效价	0天	425	106.28	(87.60，128.95)	423							88.67	(73.05，107.64)
		28天	423							5483.21	(4920.12，6110.74)	423	3245.67	(2909.97，3260.11)
					升高倍数	28天	423	44.92	(36.98，54.57)						423	31.43	(26.62，37.10)
		血清群C SBA		效价						0天	425	33.71	(27.54，41.28)	423				37.39	(30.40，45.98)
28天	423				1924.36	(1662.08，2228.03)	423	1638.87	(1405.55，1910.93)
										升高倍数	28天	423	43.83	(36.40，52.78)	423	34.17	(28.31，41.24)
血清群Y SBA				效价	0天	425	103.21	(87.80，121.32)	423									111.91	(96.03，130.41)
		28天	423							1322.26	(1161.85，1504.82)	423	1228.27	(1088.20，1386.37)
					升高倍数	28天	423	11.62	(9.94，13.60)						423	10.16	(8.76，11.79)
		血清群W-135SBA		效价						0天	425	20.70	(17.70，24.22)	423				23.90	(20.40，28.02)
28天	423				1407.22	(1232.07，1 607.27)	423	1544.99	(1383.63，1725.16)
										升高倍数	28天	423	51.98	(44.36，60.90)	423	51.47	(44.32，59.76)

^*效价或升高倍数，其中升高倍数＝28天时效价/0天时效价。

^_N：计算所用的参与者总数。

血清群A、C、W-135和Y的ELISA IgG

表C-9显示了基线期和接种后28天的IgG GMC(μg/mL)以及IgGGMC的升高倍数。

表C-9：基线期和接种后28天的IgG血清学结果(符合方案人群)

测试类型	参数*	取血	TetraMenD			Menomune_
									N_	几何均数	(95％CI)	N_	几何均数	(95％CI)
			血清群A(IgG)ELISA	效价	0天	82	0.84	(0.61，1.16)							79	0.62	(0.45，0.84)
28天	82	18.09							(13.56，24.12)	79	11.61	(8.81，15.29)
					升高倍数	28天	82	21.49					(16.35，28.24)	79	18.87	(14.23，25.00)
血清群C(IgG)ELISA	效价	0天		82					0.27	(0.23，0.31)	79	0.30					(0.24，0.37)
			28天		82	5.54	(3.85，7.97)	79					8.08	(5.37，12.18)
		升高倍数		28天					82	20.78	(14.74，29.28)	79			26.97	(18.93，38.41)
	血清群Y(IgG)ELISA		效价		0天	82	0.41	(0.32，0.53)					79	0.39			(0.30，0.50)
28天		82		4.41					(2.74，7.08)	79	9.17	(6.58，12.78)
					升高倍数	28天	82	10.81					(7.32，15.95)	79	23.55	32.75)(16.93，
血清群W-135(IgG)ELISA		效价	0天	82					0.24	(0.20，0.29)	79	0.24					(0.19，0.30)
	28天				82	2.95	(2.02，4.30)	79					4.93	(3.47，7.00)
			升高倍数	28天					82	12.26	(8.48，17.73)	79			20.40	(14.62，28.46)

^*效价或升高倍数，其中升高倍数＝28天时效价/0天时效价。

^_N：计算所用的参与者总数。

血清群A、C、Y和W-135的ELISA IgM

表C-10显示了基线期和接种后28天时的IgM GMC以及IgMGMC的升高倍数。

表C-10：基线期和接种后28天的IgM血清学结果(符合方案人群)

测试类型	参数*	取血	TetraMenD			Menomunc_
									N_	几何均数	(95％CI)	N_	几何均数	(95％CI)
			血清群A(IgM)ELISA	效价	0天	81	1.66	(1.34，2.06)							79	1.42	(1.15，1.75)
28天	80	17.80							(14.67，21.59)	79	12.00	(9.67，14.89)

表C-10：基线期和接种后28天的IgM血清学结果(符合方案人群)

测试类型	参数*	取血	TetraMenD			Menomune_
									N_	几何均数	(95％CI)	N_	几何均数	(95％CI)
			升高倍数	28天	79	11.22	(8.54，14.73)	79							8.47	(7.06，10.16)
	血清群C(IgM)ELISA	效价							0天	82	0.19	(0.14，0.24)	79	0.16			(0.12，0.22)
28天			80	1.55	(1.20，2.00)	79	1.71	(1.39，2.10)
									升高倍数	28天	80	8.42	(6.34，11.18)	79	10.60	(8.04，13.97)
血清群Y(IgM)ELISA		效价	0天	82	0.37	(0.29，0.46)	79	0.40									(0.32，0.50)
	28天								80	3.47	(2.81，427)	79	3.45	(2.85，4.17)
			升高倍数	28天	80	9.47	(7.43，12.05)	79							8.65	(6.79，11.03)
	血清群W-135(IgM)ELISA	效价							0天	82	0.17	(0.15，0.20)	79	0.18			(0.16，0.21)
28天			82	1.92	(1.60，2.29)	79	1.68	(1.41，1.99)
									升高倍数	28天	82	11.01	(9.06，13.39)	79	9.16	(7.61，11.03)

^*效价或升高倍数，其中升高倍数＝28天时的效价/0天时的效价

^_N：计算所用的参与者总数。

接受本研究疫苗TetraMenD后28-56天，大多数参与者均经历了对疫苗中所含的每种血清群的SBA-BR抗体效价的≥4倍升高。总体来说，有90.7％的TetraMenD接受者经历了抗所有血清群的抗体效价的4倍升高。观察到对血清群Y的接种前抗体水平高于对血清群C或W-135的接种前抗体水平。这可能与这样一种事实相关：即血清群Y是目前在美国与该年龄组中的侵袭性脑膜炎球菌性疾病相关的最常见血清群，对该血清群的天然暴露可能更普遍。较高的循环抗体水平反映了近期天然暴露的情况，并可能降低表现出4倍或更高抗体反应的疫苗接种者的比例。与其它血清群相比，这种现象看起来是血清群Y反应的情况。对于血清群Y，4倍升高的比例为81.8％，相比之下血清群C为91.7％，血清群W-135为96.7％。对血清群A也观察到高接种前抗体水平。这可能是在延长的时间内间断性接触几种天然交叉反应抗原的结果。

为了进一步评价既存效价的影响并研究血清阳转率(定义为：当对任一血清群的接种前效价＜1∶8时抗体效价获得4倍升高的疫苗接受者比例)，对疫苗中所含的4种血清群中的任一种的接种前抗体效价＜1∶8的参与者进行单独分析。就使用幼兔作为补体源的SBA测定来说，＜1∶8的效价被认为是代表不可检测的循环抗体水平。当用此标准评价参与者时，在接种TetraMenD后观察到对血清群A的血清阳转率为100％，对血清群C为98.1％，对血清群W-135为98.1％，对血清群Y为98.3％。

如先前在另一个研究中所讨论的一样，根据在军队新兵中的观测结果，Goldschneider提出，使用采用人补体源的SBA测定得到的≥1∶4的最小效价与抗血清群C的、免遭侵袭性疾病的保护作用相关联。但是，由于测定标准化的需要以及缺乏可靠的人类补体源，所以建议将幼兔补体作为备选来源。脑膜炎球菌似乎对幼兔补体比对人补体更敏感，产生更高的检测抗体效价。一些作者提出，使用幼兔补体测定时≥1∶128的效价预示着具有保护作用，而＜1∶8的效价预示着至少对血清群C有易感性。尽管该水平在评价多糖疫苗时可能适合，但可能不适于缀合疫苗。Borrow指出，在显示出8-64的接种后SBA效价的单价C缀合疫苗接受受试者中，几个月后使用降低剂量(10μg)的脑膜炎球菌多糖疫苗给予表现出记忆应答，这表明这些个体也受到了保护，抗体水平达到≥1∶128。对每种血清群的SBA-BR效价≥1∶128的TetraMenD疫苗接受受试者的结果列于表中。当对疫苗中所含的每种血清群使用这些标准时，总体来说，接种TetraMenD的参与者有99.2％获得了≥1∶128的接种后SBA-BR效价。

使用标准ELISA测定评价部分参与者的IgG和IgM反应。接种后，TetraMenD接种者对每一血清群的平均IgG抗体水平均＞2μg。在两个处理臂中对每一血清群的IgM反应非常相似。Menomune_组中对血清群C、Y和W-135的IgG反应一般高于TetraMenD接受组。然而，对血清群C、Y和W-135的接种后SBA GMT水平在各个处理组中非常相似，表C-11。

表C-11：IgG和IgM对总杀菌活性的相对贡献

血清群	28天的结果	IgG GMC*	IgM GMC	SBA GMC
					A	TetraMenD	18.09	17.80	5483.21
Menomune_	11.61	12.00	3245.67
				C		TetraMenD	5.54	1.55	1924.36
Menomune_	8.08	1.71	1638.87
					Y	TetraMenD	4.41	3.47	1322.26
Menomune_	9.17	3.45	1228.27
				W-135		TetraMenD	2.95	1.92	1407.22
Menomune_	4.93	1.68	1544.99

^*GMC单位是μg/mL。

缀合物产生的较低水平IgG产生了与多糖疫苗相似水平的杀菌活性，此观察结果强有力地表明，对缀合疫苗的抗体反应的质量和亲和性优于多糖产生的抗体反应。正是高亲和性抗体与功能活性和记忆应答相关。该作用在一些已公开的研究中也可以见到。

这些数据表明TetraMenD在青少年群体中是高免疫原性的。对于两种疫苗中四个血清群中的每一个，GMT都基本相同，所达到的效价预示着存在保护作用，并且似乎TetraMenD针对疫苗中所含的每一种血清群都产生了较高亲和性的抗体反应。

研究D

研究D是对0天接受单剂TetraMenD与单剂Menomune_的18-55岁健康成人进行的随机化阳性对照研究。在0天(接种前)和28天抽取血清并分析。

一般来说，TetraMenD的安全性模式与Menomune相当，具体地说，报告的诉求局部反应(0-7天)、诉求全身反应(0天-)、未诉求的不良事件(0-28天)、未诉求的明显不良事件和SAE(29天-6个月)以及严重不良事件(0天-6个月)的百分率均在Menomune所报告百分率的2-3％之内。本研究的结果提供于下表。

SBA-BR抗体效价的分布

表D-1显示了基线期和28天时各血清群的SBA-BR抗体效价的频率分布。

表D-1：在0天和接种后28天时SBA-BR抗体效价的分布(符合方案人群)
														SBA效价＜8至512
测试类型	测试日期	组(N)*
			＜8n(％)_	8n(％)	16n(％)	32n(％)	64n(％)	128n(％)	256n(％)	512n(％)
											SBA(A)	0天	TetraMenD(1279)	156(12.2)	36(2.8)	15(1.2)	37(2.9)	96(7.5)	122(9.5)	176(13.8)	217(17.0)
Menomune_(1099)	144(13.1)	35(3.2)	11(1.0)	41(3.7)	77(7.0)	105(9.6)	134(12.2)	201(18.3)
									28天	TetraMenD(1278)			0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)	1(0.1)	1(0.1)	19(1.5)	28(2.2)	50(3.9)
Menomune_(1099)	1(0.1)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)	10(0.9)	23(2.1)	51(4.6)
										SBA(C)		0天	TetraMenD(1279)	343(26.8)	124(9.7)	73(5.7)	65(5.1)	91(7.1)	115(9.0)	142(11.1)	120(9.4)
Menomune_(1099)	304(27.7)	107(9.7)	60(5.5)	60(5.5)	90(8.2)	115(10.5)	108(9.8)	97(8.8)
									28天		TetraMenD(1278)		2(0.2)	1(0.1)	3(0.2)	4(0.3)	6(0.5)	45(3.5)	60(4.7)	110(8.6)
Menomune_(1099)	3(0.3)	5(0.5)	4(0.4)	1(0.1)	4(0.4)	32(2.9)	51(4.6)	67(6.1)
											SBA(Y)	0天	TetraMenD(1279)	279(21.8)	22(1.7)	17(1.3)	52(4.1)	105(8.2)	137(10.7)	165(12.9)	186(14.5)
Menomune_(1099)	228(20.7)	18(1.6)	20(1.8)	43(3.9)	77(7.0)	145(13.2)	143(13.0)	160(14.6)
									28天	TetraMenD(1278)			21(1.6)	4(0.3)	3(0.2)	5(0.4)	6(0.5)	51(4.0)	98(7.7)	148(11.6)
Menomune_(1099)	10(0.9)	1(0.1)	1(0.1)	2(0.2)	3(0.3)	28(2.5)	65(5.9)	111(10.1)
										SBA(W-135)		0天	TetraMenD(1279)	372(29.1)	134(10.5)	91(7.1)	98(7.7)	152(11.9)	148(11.6)	134(10.5)	87(6.8)
Menomune_(1099)	328(29.8)	114(10.4)	62(5.6)	92(8.4)	144(13.1)	145(13.2)	115(10.5)	63(5.7)
									28天		TetraMenD(1278)		9(0.7)	6(0.5)	2(0.2)	7(0.5)	13(1.0)	67(5.2)	116(9.1)	203(15.9)
Menomune_(1099)	3(0.3)	3(0.3)	3(0.3)	1(0.1)	7(0.6)	38(3.5)	67(6.1)	133(12.1)

表D-1：在0天和接种后28天时SBA-BR抗体效价的分布(符合方案人群)
														SBA效价1024至＞65536
测试类型	测试日期	组(N)*
			1024n(％)	2048n(％)	4096n(％)	8192n(％)	16384n(％)	32768n(％)	65536n(％)	＞65536n(％)
											SBA(A)	0天	TetraMenD(1279)	209(16.3)	173(13.5)	25(2.0)	10(0.8)	2(0.2)	5(0.4)	0(0.0)	0(0.0)
Menomnne_(1099)	196(17.8)	131(11.9)	10(0.9)	8(0.7)	4(0.4)	2(0.2)	0(0.0)	0(0.0)
									28天	TetraMenD(1278)			140(10.9)	260(20.3)	287(22.4)	241(18.8)	179(14.0)	69(5.4)	3(0.2)	0(0.0)
Menomune_(1099)	115(10.5)	194(17.7)	266(24.2)	209(19.0)	168(15.3)	60(5.5)	1(0.1)	1(0.1)
										SBA(C)		0天	TetraMenD(1279)	96(7.5)	80(6.3)	15(1.2)	10(0.8)	2(0.2)	2(0.2)	1(0.1)	0(0.0)
Menomune_(1099)	70(6.4)	65(5.9)	8(0.7)	12(1.1)	3(0.3)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)
									28天		TetraMenD(1278)		138(10.8)	213(16.7)	225(17.6)	178(13.9)	140(10.9)	119(9.3)	21(1.6)	13(1.0)
Menomune_(1099)	133(12.1)	162(14.7)	190(17.3)	199(18.1)	120(10.9)	100(9.1)	15(1.4)	13(1.2)
											SBA(Y)	0天	TetraMenD(1279)	180(14.1)	111(8.7)	11(0.9)	8(0.6)	4(0.3)	2(0.2)	0(0.0)	0(0.0)
Menomune_(1099)	147(13.4)	88(8.0)	15(1.4)	9(0.8)	5(0.5)	1(0.1)	0(0.0)	0(0.0)
									28天	TetraMenD(1278)			211(16.5)	216(16.9)	221(17.3)	145(11.3)	94(7.3)	51(4.0)	2(0.2)	2(0.2)
Menomune_(1099)	141(12.8)	200(18.2)	206(18.7)	165(15.0)	119(10.8)	45(4.1)	1(0.1)	1(0.1)
										SBA(W-135)		0天	TetraMenD(1279)	43(3.4)	17(1.3)	1(0.1)	0(0.0)	1(0.1)	1(0.1)	0(0.0)	0(0.0)
Menomune_(1099)	26(2.4)	8(0.7)	1(0.1)	1(0.1)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)
									28天		TetraMenD(1278)		252(19.7)	244(19.1)	178(13.9)	100(7.8)	59(4.6)	21(1.6)	1(0.1)	0(0.0)
Menomune_(1099)	183(16.7)	242(22.0)	195(17.7)	134(12.2)	57(5.2)	32(2.9)	1(0.1)	0(0.0)

表D-2提供了按照受试者年龄及TetraMenD血清群的几何平均效价(GMT)的总结。

表D-2：按照受试者年龄及TetraMenD血清群的GMT总结
							年龄(岁)	取血天数	受试者数量	血清群AGMT	血清群C GMT	血清群WGMT	血清群Y-135GMT
18	0天	127	238.47	45.63	42.04	111.67
							28天	122	5170.42	2690.10	1613.23	2556.00
	19	0天	132	224.51	40.96	37.66							244.18
28天							127	4421.24	2425.55	1786.78	2492.65
		20	0天	107	193.76	69.62						41.73	108.16
28天	103						5080.24	3193.18	1766.17	1966.95
			21	0天	106	239.80					57.27	32.42	122.27
28天	105	3911.03					2447.58	1521.66	1725.00
				22	0天	84				371.11	47.95	34.18	175.14
28天	82	4649.72	3151.78				1729.45	3151.78
					23	0天			81	219.45	54.40	50.80	180.25
28天	80	4664.48	3788.73	1620.81			1961.17
						24		0天	66	223.33	71.84	42.49	124.03
28天	64	3922.34	3057.48	1479.87	1562.21
							25	0天	62	289.50	48.94	29.26	148.02
28天	59	4771.87	3685.02	2121.47	1563.07
						26		0天	29	131.10	37.83	17.19	73.87
28天	26	4936.36	4320.32	1170.01	2673.69
							27	0天	20	315.17	45.25	28.84	445.72
28天	20	5042.77	5595.30	803.41	2702.35
						28		0天	33	593.10	72.60	55.25	157.92
28天	33	6640.01	4948.33	1558.63	2091.47
							29	0天	26	270.02	29.54	28.76	51.71
28天	26	4936.36	2534.86	1201.62	2278.46
						30		0天	19	229.46	68.84	25.71	99.15
28天	19	5287.69	5687.92	1645.39	1529.61
							31	0天	17	138.88	52.20	27.18	226.53
28天	17	2314.48	3340.58	1111.00	1966.18
						32		0天	24	362.04	58.69	64.00	50.80
28天	24	4732.32	3545.24	1448.15	1933.05
							33	0天	22	329.39	109.34	68.16	164.69
28天	22	2989.02	3499.00	1317.54	1749.50
						34		0天	16	534.67	51.54	41.50	112.40
28天	15	3734.42	4096.00	741.00	1415.08
							35	0天	17	369.50	156.95	19.62	48.11
28天	16	4096.00	6888.62	824.57	1649.14
						36		0天	17	192.44	69.44	20.43	156.95
28天	17	3078.98	7864.70	1362.24	2410.80

37	0天	20	238.86	78.79	20.39	73.52
							28天	19	1835.69	4406.03	637.28	1474.81
	38	0天	24	203.19	90.51	15.54							78.34
28天							24	3158.45	4216.02	558.34	1824.56
		39	0天	18	376.25	61.58						33.26	143.68
28天	18						4778.10	4096.00	1824.56	1970.63
			40	0天	25	249.00					71.51	25.63	86.82
28天	25	3983.99					3769.09	916.51	1112.82
				41	0天	26				242.71	60.68	23.24	131.46
28天	26	3681.69	2403.25				1201.62	1336.84
					42	0天			24	128.00	71.84	25.40	32.94
28天	24	2435.50	2169.78	542.45			574.70
						43		0天	23	144.40	51.83	33.99	72.70
28天	23	2453.92	1815.42	1120.89	1515.12
							44	0天	27	19 8.04	101.59	47.03	99.02
28天	27	2647.42	3335.54	1194.53	998.05
						45		0天	23	158.06	53.41	31.05	79.03
28天	23	2241.79	2686.11	453.85	1561.48
							46	0天	28	204.87	55.17	21.53	68.93
28天	28	2205.89	1680.05	927.46	1217.75
						47		0天	20	187.40	81.57	32.00	87.43
28天	20	2352.53	4544.80	652.58	1351.18
							48	0天	32	94.52	38.05	25.22	139.58
28天	32	3158.45	2435.50	939.01	1299.51
						49		0天	19	114.73	33.19	24.79	137.69
28天	19	2048.00	4096.00	951.95	1586.44
							50	0天	16	145.76	94.52	34.90	98.70
28天	16	3922.34	2048.00	693.38	1024.00
						51		0天	15	73.52	29.18	27.86	67.03
28天	15	1702.38	2702.35	280.79	370.50
							52	0天	12	135.61	90.51	11.99	95.89
28天	12	2169.78	3251.00	542.45	542.45
						53		0天	11	272.65	128.00	49.74	105.95
28天	11	1922.93	1922.93	423.81	350.81
							54	0天	10	84.45	90.51	9.19	238.86
28天	10	2702.35	3104.19	222.86	1176.27
						55		0天	6	71.84	22.63	57.02	50.80
28天	6	812.75	3649.12	512.00	724.08

表D-3显示了由基线期到28天时对血清群A、C、Y和W-135的SBA-BR效价具有≥4倍升高的参与者数量和百分比。在TetraMenD组中针对血清群A(1028/1278，80.4％)、C(1131/1278，88.5％)、Y(941/1278，73.6％)和W-135(1142/1278，89.4％)的数量和百分比与Menomune_组中针对血清群A(929/1099，84.5％)、C(985/1099，89.6％)、Y(872/1099，79.3％)和W-135(1036/1099，94.3％)的数量和百分比相当。

表D-3：按照血清群*SBA-BR效价由基线起具有≥4倍升高的参与者数量和百分比

对血清群的SBA-BR效价的	TetraMenD		Menomune_		差值(PMenomune_-PTetraMenD)的％	差值的95％单侧置信上限
							n/N_	PTetraMenD_	n/N	PMenomune_
	A	1028/1278	80.4	929/1099							84.5	4.1	7.1
C					1131/1278	88.5	985/1099	89.6	1.1	3.6
	Y	941/1278	73.6	872/1099							79.3	5.7	9.1
W-135					1142/1278	89.4	1036/1099	94.3	4.9	7.1

^*检定虚假设H₀：P_{Menomune_}-P_TetraMenD≥0.10对H_a：P_{Menomune_}-P_TetraMenD＜0.10

^_n/N：n＝从基线效价起具有≥4倍升高的参与者数量/N＝符合方案人群的参与者总数。

^_P_TetraMenD：TetraMenD组中SBA-BR接种后效价由基线起具有≥4倍升高的参与者百分比。

^§P_{Menomune_}：Menomune_组中SBA-BR接种后效价由基线起具有≥4倍升高的参与者百分比。

SBA-BR抗体效价≥32的频率

接种后28天SBA抗体效价≥32的参与者比例总结于表D-4。

表D-4：接种后28天SBA抗体效价≥32的参与者百分比和数量(符合方案人群)

	TetraMenD		Menomune_
					％*(n/N)_	百分比的95％CI	％*(n/N)_	百分比的95％CI
	血清群A	100.0(1278/1278)	(99.77％，100.00％)	99.9(1098/1099)					(99.49％，100.00％)
血清群C					99.5(1272/1278)	(98.98％，99.83％)	98.9(1087/1099)	(98.10％，99.43％)
	血清群Y	97.8(1250/1278)	(96.85％，98.54％)	98.9(1087/1099)					(98.10％，99.43％)
血清群W-135					98.7(1261/1278)	(97.88％，99.22％)	99.2(1090/1099)	(98.45％，99.62％)

^*％：＝n/N

^_n：接种后28天时效价≥32的参与者数量/N：该组在28天时具有有效血样的参与者总数。

SBA-BR抗体效价≥128的频率

接种后28天SBA抗体效价≥128的受试者比例总结于表D-5。

表D-5：接种后28天SBA抗体效价≥128的参与者百分比和数量(符合方案人群)

	TetraMenD		Menomune_
					％*(n/N)_	百分比的95％CI	％*(n/N)_	百分比的95％CI
	血清群A	99.8(1276/1278)	(99.44％，99.98％)	99.9(1098/1099)					(99.49％，100.00％)
血清群C					98.7(1262/1278)	(97.97％，99.28％)	98.5(1082/1099)	(97.53％，99.10％)
	血清群Y	96.9(1239/1278)	(95.85％，97.82％	98.5(1082/1099)					(97.53％，99.10％)
血清群W-135					97.1(1241/1278)	(96.03％，97.95％)	98.5(1082/1099)	(97.53％，99.10％)

^*％：n/N。

^_n：接种后28天效价≥128的参与者数量。

^_N：该组在28天时具有有效血样的参与者总数。

表D-6：对通过基线共变量调整的GMT的处理作用的分析：从0天到28天的效价差值的反应(符合方案人群)^*

血清群	基线GMT	基线GMT作用的估计	处理作用差值(Menomune_-TetraMenD)	处理作用(Menomune_-TetraMenD)的反对数*	处理作用(Menomune_-TetraMenD)的反对数的95％CI
						SBA血清群A
TetraMenD	223.6	-0.850	0.096	1.069	(0.973，1.175)
						Menomune_	203.9
SBA血清群C
						TetraMenD	57.2	-0.772	0.130	1.094	(0.965，1.240)
Menomune_	51.8
						SBA血清群Y
TetraMenD	122.9	-0.743	0.469	1.384	(1.225，1.563)
						Menomune_	127.4
SBA血清群W-135
						TetraMenD	33.2	-0.766	0.576	1.491	(1.334，1.666)
Menomune_	31.0

^*处理作用的反对数以2的所述处理作用(Menomune_-TetraMenD)次幂来计算。SBA-BR抗体效价具有至少4倍升高的参与者比例

表D-7显示了在28天时SBA抗体效价由基线起具有≥4倍升高的参与者比例。

表D-7：在28天时SBA抗体效价由基线起具有≥4倍升高的参与者的数量和百分比

测试类型	TetraMenD			Menomune_
							％*	(n_/N_)	(95％CI)	％*	(n_/N_)	(95％CI)
	SBA(A)	80.4	(1028/1278)	(78.16％，82.58％)	84.5	(929/1099)							(82.26％，86.62％)
SBA(C)							88.5	(1131/1278)	(86.62％，90.20％)	89.6	(985/1099)	(87.67％，91.37％)
	SBA(Y)	73.6	(941/1278)	(71.12％，76.03％)	79.3	(872/1099)							(76.83％，81.70％)
SBA(W-135)							89.4	(1142/1278)	(87.54％，91.00％)	94.3	(1036/1099)	(92.72％，95.57％)

^*％：n/N。

^_n：由基线效价起具有≥4倍升高的参与者数量。

^_N：各血清群中抽取血液的参与者数量。

在0天未检测到效价(＜8)的参与者在28天时SBA-BR抗体效价获得≥4倍升高的比例

表D-8显示了在0天未检测到效价(＜8)的参与者在28天时SBA-BR抗体效价获得≥4倍升高的比例。在两个处理组中并且对于所有疫苗血清群，大部分在基线期具有不可检测(＜8)的SBA效价的参与者在28天时SBA效价获得了≥4倍升高。在0天时SBA效价＜8的参与者从基线期到28天具有≥4倍升高的比例在TetraMenD组中为90.7％-100.0％，在Menomune_组中为96.9％-99.3％。

表D-8：在0天时具有不可检测效价(＜8)的参与者在28天时SBA-BR抗体效价获得≥4倍升高的比例

测试类型	TetrnMenD			Menomune_
							％*	(n_/N_)	(95％CI)	％*	(n_/N_)	(95％CI)
	SBA(A)	100.0	(156/156)	(98.10％，100.00％)	99.3	(143/144)							(96.19％，99.98％)
SBA(C)							99.4	(341/343)	(97.91％，99.93％)	97.7	(297/304)	(95.31％，99.07％)
	SBA(Y)	90.7	(253/279)	(86.64％，93.82％)	96.9	(221/228)							(93.78％，98.76％)
SBA(W-135)							96.5	(359/372)	(94.10％，98.13％)	99.1	(325/328)	(97.35％,99.81％)

^*％：n/N。

^_n：在每一血清群中0天时效价＜1∶8、28天时效价≥1∶32的参与者数量。

^_N：在每一血清群中0天时效价＜1∶8的参与者数量。

表D-9显示了基线期和接种后28天的SBA GMT以及SBA GMT的升高倍数。

表D-9：按照血清学的几何平均抗体效价(GMT)和GMT升高倍数的总结(符合方案人群)

测试类型	参数*	取血	TetraMenD			Menomune_
									N_	GMT	(95％CI)_	N_	GMT	(95％CI)_
			血清群ASBA	效价	0天	1279	223.6	(199.86，250.08)							1099	203.9	(180.53，230.23)
28天	1278	3896.6							(3646.33，4164.11)	1099	94108.	(3827.43，4411.15)
					升高倍数	28天	1278	16.0					(14.39，17.84)	1099	18.4	(16.39，20.67)
血清群CSBA	效价	0天		1279					57.2	(50.50，64.73)	1099	51.8					(45.47，59.11)
			28天		1278	3235.2	(2958.46，3537.76)	1099					3463.4	(3143.05，3816.34)
		升高倍数		28天					1278	47.1	(41.74，53.05)	1099			55.1	(48.53，62.67)
	血清群YSBA		效价		0天	1279	122.9	(108.89，138.72)					1099	127.4			(111.97，145.03)
28天		1278		1751.8					(1598.14，1920.30)	1099	2446.7	(2235.36，2677.93)
					升高倍数	28天	1278	12.3					(10.97，13.68)	1099	16.6	(14.68，18.83)
血清群W-135SBA		效价	0天	1279					33.2	(29.95，36.73)	1099	31.0					(27.90，34.46)
	28天				1278	1270.7	(1171.59，1378.22)	1099					1865.5	(1717.28，2026.48)
			升高倍数	28天					1278	31.4	(28.35，34.70)	1099			48.9	(44.07，54.30)

^*效价或升高倍数，其中升高倍数＝28天时效价/0天时效价。

^_N：每一血清群中抽取血液的参与者数量。 注意：有一个参与者没有第二次血样进行分析。

^_根据正常分布的近似值计算GMT的95％CI。

接种本研究疫苗TetraMenD后28-56天，大多数参与者经历了对疫苗中所含每一血清群的SBA-BR抗体效价的≥4倍升高。对于血清群A、C、Y和W-135，抗体效价获得≥4倍升高的TetraMenD接种者比例分别是80.4％、88.5％、73.6％和89.4％。观察到对血清群Y的接种前抗体水平比对血清群C或W-135的接种前抗体水平高。这可能与这样一种事实相关：即血清群Y是目前在美国与该年龄组中的侵袭性脑膜炎球菌性疾病相关的最常见血清群，对该血清群的天然暴露可能更普遍。较高的循环抗体水平反映了近期天然暴露的情况，并可能降低表现出4倍或更高抗体反应的疫苗接种者的比例。与其它血清群相比，这种现象看起来是血清群Y反应的情况。针对血清群Y的4倍升高比例为73.6％，相比之下血清群C为88.5％，血清群W-135为89.4％。对血清群A也观察到高接种前抗体水平。这可能是在延长的时间段内间断性接触几种天然交叉反应抗原的结果。

为了进一步评价既存效价的影响并研究血清阳转率(定义为：当对任一血清群的接种前效价＜1∶8时抗体效价获得4倍升高的疫苗接种者比例)，对疫苗中所含的4种血清群中任一种的接种前抗体效价＜1∶8的参与者进行单独分析。就使用幼兔作为补体源的SBA测定来说，＜1∶8的抗体效价被认为是代表不可检测的循环抗体水平。当用此标准来评价参与者时，在接种TetraMenD后观察到对血清群A的血清阳转率为100％，对血清群C为99.4％，对血清群W-135为96.5％，对血清群Y为90.7％。

如先前在本文另一个研究中所讨论的一样，根据对军队新兵的观测结果，Goldschneider提出，使用采用人补体源的SBA测定得到的≥1∶4的最小效价与抗血清群C的、免于感染侵袭性疾病的保护作用相关联。建议将幼兔补体作为备选来源，但脑膜炎球菌似乎对幼兔补体比对人补体更敏感，产生更高的检测抗体效价。一些作者建议，在使用幼兔补体测定时≥1∶128的效价预示着具有保护作用，而＜1∶8的效价预示着至少对血清群C有易感性。尽管该水平在评价多糖疫苗时可能适合，但可能不适于缀合疫苗。Borrow指出，在接受单价C缀合疫苗、表现出接种后SBA效价在8-64之间的受试者中，几个月后使用降低剂量(10μg)的脑膜炎球菌多糖疫苗给予表现出记忆应答，这表明这些个体也受到了保护，抗体水平达到≥1∶128。当对疫苗中所含的所有血清群应用此标准时，针对血清群A、C、Y和W-135，接种后SBA-BR效价达到≥1∶128的TetraMenD接受参与者的百分率分别是99.8％、98.7％、96.9％和97.1％。

实施例13  研究E  在10-18岁儿童中进行的Td加强免疫研究

以就各自的破伤风和白喉效价而言具有可接受反应的参与者比例进行的测定为依据，本研究比较了在接受试验性四价脑膜炎球菌白喉缀合疫苗TetraMenD并共同接受Td的组中的破伤风和白喉类毒素(Td)加强反应与在接受Td和安慰剂的组中的该反应。可接受反应定义为：在接种后28天，在具有预定低接种前效价的参与者中由基线起至少4倍升高，在具有预定高接种前效价的参与者中由基线起至少2倍升高。

为了比较TetraMenD和Td共同给予时对血清群A、C、Y和W-135的抗体反应与Td疫苗给予后28天给予TetraMenD时的反应，测定了针对每一血清群的效价具有至少4倍升高的参与者比例。

本实验是随机、改良双盲、阳性对照的多中心试验，将总共1024位参与者随机分入两个处理组A和B之一。

	0天V1	28天V2	56天V3
				A组	BS-1 Td+TetraMenD	BS-2安慰剂	BS-3
B组	BS-1 Td+安慰剂	BS-2 TetraMenD	BS-3

选择11-17岁的年龄范围，以获得那些一般应接受Td疫苗作为常规儿童免疫接种程序一部分的个体。此外，该年龄范围人群已经被确认为发生侵袭性脑膜炎球菌性疾病的高危人群，并会是脑膜炎球菌缀合疫苗一经许可后最可能接种的候选人群。为了正确评价安全性，利用使用安慰剂对照的改良双盲设计。第一次随访时，接种护士是非盲的，按照方案在每一手臂给予疫苗；TetraMenD(IM)或安慰剂接种于右臂，Td接种于左臂。第二次随访时，每一处理组均左臂接种疫苗。监测局部和全身反应和不良事件的评价护士是不知情的。

选择11-17岁的年龄范围，以获得那些一般应接受Td疫苗作为常规儿童免疫接种程序一部分的个体。此外，此年龄范围人群已经被确认为发生侵袭性脑膜炎球菌性疾病的高危人群，并会是脑膜炎球菌缀合疫苗一经许可后最可能接种的候选人群。

在接种前0天(基线期)和第1次接种后28天，抽取用于血清学检验的血液样品(至少5mL全血)。在第二次随访后28天从参与者第3次取血。在这些时间点中的每个时间点，分析血清的脑膜炎球菌血清群A、C、Y和W-135、抗白喉抗体以及抗破伤风抗体。

为了评价TetraMenD接种者的抗体功能，对所有可得样品进行针对每一疫苗血清群的利用幼兔补体的SBA(SBA-BR)测定。一个免疫学终点是每一处理组中SBA-BR效价具有≥4倍升高的参与者比例。通过测试血清保护Vero细胞免受白喉毒素攻击的能力来测定抗白喉抗体水平。通过间接酶联免疫吸附测定(ELISA)测量抗破伤风抗体水平。

本研究依据对GMT的检测，对比了接受一剂TetraMenD的早前研究(研究C)参与者对TetraMenD血清群A、C、Y和W-135的抗体反应与接种Td后28天接受与Td共同给予的TetraMenD的参与者的反应。

用于血清学分析的血清样品得自接种前基线期(0天)、接种后28天(窗口期：+28天)和6个月。在接种前以及接种后28天检测针对破伤风类毒素和白喉类毒素(Td)疫苗的抗体效价。

测定接种前和接种后28天所有可得血液样品中抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、Y和W-135的SBA-BR抗体效价。总体上，组A和组B的安全性模式是相当的。该研究的结果总结于下表。

表E-1按照受试者年龄和血清群总结了GMT水平。

1)表E-1按照受试者年龄和血清群的GMT总结
								年龄	剂量TetraMenD	受试者数量	取血天数	A GMT	C GMT	W GMT	Y GMT
10	1μg	1	0	2048.00	512.00	512.00	256.00
								4μg	1	28	8192.00	1024.00	4096.00	1024.00
	10μg	1	56	32768.00	4096.00	16384.00	8192.00
								11	1μg	273	0	186.38	63.35	23.06	140.97
4μg	267	28	2331.86	513.33	339.73	775.64
							10μg		265	56	10668.96	2005.59	2285.81	2203.62
12	1μg	236	0	185.87	56.24	27.23									138.56
							4μg	229	28	1672.07	516.67	280.33	752.00
	10μg	226	56	10030.01	2522.93	2164.24								2231.65
							13	1μg	172	0	219.65	60.25	20.46		128.00
4μg	170	28	2562.84	664.66	372.52	898.74
								10μg	168	56	10493.02	2700.12	2346.72	2289.34
14	1μg	128	0	326.64	65.05	30.81									107.63
							4μg	126	28	1896.19	597.26	388.88	752.50
	10μg	126	56	9044.70	2375.94	2248.77								1885.79
							15	1μg	101	0	223.17	83.07	47.00		114.69
4μg	95	28	2352.53	716.20	504.58	776.05
								10μg	94	56	9424.03	4575.06	2356.01	1988.48
16	1μg	71	0	393.36	46.83	24.11									70.56
							4μg	70	28	2399.59	783.77	450.16	512.00
	10μg	69	56	8527.88	3154.48	1908.93								1833.75
							17	1μg	35	0	358.47	107.10	28.41		79.58
4μg	35	28	2173.36	403.70	156.70	411.78
								10μg	34	56	7398.11	3340.58	1418.93	1390.30

表E-2显示了在28天时破伤风和白喉抗体具有至少4倍或2倍升高的参与者的数量和比例。

表E-2：在28天时破伤风和白喉抗体具有至少4倍或2倍升高的参与者的数量和比例
					抗原反应	Td+TetraMenD，安慰剂n/N(％＝Pa)	Td+安慰剂，TetraMenDn/N(％＝Pb)	差值(Pb-Pa)	差值百分率的95％CI
破伤风
					2倍(接种前效价＞5.3 IU/ml)	0/24(0.00)	2/23(8.70)
4倍(接种前效价≤5.3 IU/ml)	399/439(90.89)	417/448(93.08)
					合计应答者	399/463(86.18)	419/471(88.96)	2.78	(-1.45，7.01)
白喉
					2倍(接种前效价＞1.28 IU/ml)	44/47(93.62)	42/49(85.71)
4倍(接种前效价≤1.28IU/ml)	419/419(100.00)	416/425(97.88)
					合计应答者	463/466(99.36)	458/474(96.62)	-2.73	(-4.51，-0.95)

破伤风和白喉抗体效价以及抗血清群A、C、Y和W-135的SBA抗体效价

表E-2显示了在28天时破伤风和白喉抗体具有至少4倍或2倍升高的参与者的数量和比例。对于破伤风和白喉，比例差异分别为：2.78和-2.73。

表E-2：破伤风和白喉疫苗接种后28天破伤风和白喉抗体反应具有至少4倍或2倍升高的参与者的总数和比例，主要假设1(符合方案数据分析)
					抗原反应	Td+TetraMenD，安慰剂n/N (％＝Pa)	Td+安慰剂，TetraMenDn/N(％＝Pb)	差值(Pb-Pa)	差值百分率的95％CI
破伤风
					2倍(接种前效价＞5.3IU/ml)	0/24(0.00)	2/23(8.70)
4倍(接种前效价≤5.3IU/ml)	399/439(90.89)	417/448(93.08)
					合计应答者	399/463(86.18)	419/471(88.96)	2.78	(-1.45，7.01)
白喉
					2倍(接种前效价＞1.28IU/ml)	44/47(93.62)	42/49(85.71)
4倍(接种前效价≤1.28IU/ml)	419/419(100.00)	416/425(97.88)
					合计应答者	463/466(99.36)	458/474(96.62)	-2.73	(-4.51，-0.95)

表E-3显示了28天时抗血清群A、C、Y和W-135的抗体效价具有至少4倍升高的参与者的数量和比例。

表E-3：在TetraMenD接种后28天SBA-BR效价具有≥4倍升高的参与者的数量和比例，主要假设2(符合方案人群)
					血清群	Td+TetraMenD，安慰剂n/N(％＝Pa)	Td+安慰剂，TetraMenDn/N (％＝Pb)	差值(Pb-Pa)	差值百分率的95％CI
血清群A	419/466(89.91)	433/478(90.59)	0.67	(-3.11，4.46)
					血清群C	424/466(90.99)	394/478(82.43)	-8.56	(-12.85，-4.27)
血清群Y	399/466(85.62)	311/478(65.06)	-20.56	(-25.89，-15.23)
					血清群W-135	448/466(96.14)	419/478(87.66)	-8.48	(-11.91，-5.05)

表E-4显示了在基线期具有高白喉和破伤风效价的参与者数量以及在28天时具有2倍升高的参与者数量和比例。

表E-4：在基线期具有高白喉和破伤风接种前效价的参与者数量(％)以及在28天时具有2倍升高的参与者数量和比例，符合方案人群
										Td+TetraMenD，安慰剂				Td+安慰剂，TetraMenD
	基线效价		≥2倍升高		基线效价		≥2倍升高
										n/N	％	n/N	％	n/N	％	n/N	％
破伤风＞5.3IU/ml	24/648	5.13	0/24	0.00	23/472	4.87	2/23	8.70
									白喉＞1.28IU/ml	47/469	10.02	44/47	93.62	49/476	10.29	42/49	85.71

表E-5显示了在基线期具有低白喉和破伤风效价的参与者数量以及在28天时具有4倍升高的参与者数量和比例。

表E-5：在基线期具有低白喉和破伤风接种前效价的参与者数量(％)以及在28天时具有4倍升高的参与者数量和比例，符合方案人群
										Td+TetraMenD，安慰剂				Td+安慰剂，TetraMenD
	基线效价		≥4倍升高		基线效价		≥4倍升高
										n/N	％	n/N	％	n/N	％	n/N	％
破伤风≤5.3 IU/ml	444/468	94.87	399/439	90.89	449/472	95.13	417/448	93.08
									白喉≤1.28 IU/ml	422/469	89.98	419/419	100.00	424/476	89.71	416/425	97.88

表E-6显示了与TetraMenD或安慰剂共同给予破伤风和白喉接种后28天时破伤风和白喉抗体效价≥1.0 IU/ml的参与者的数量和比例。

表E-6：破伤风和白喉接种后28天时破伤风和白喉抗体效价≥1.0 IU/ml的参与者的数量和比例，(符合方案人群)
						Td+TetraMenD，安慰剂n/N(％＝Pa)	Td+安慰剂，TetraMenDn/N(％＝Pb)	差值(Pb-Pa)	差值百分率的95％CI
破伤风≥1.0IU/ml	461/465(99.14)	470/477(98.53)	-0.61	(-1.97，  0.76)

白喉≥1.0IU/ml

467/467(100.00)

474/476(99.58)

-0.42

(-1.00，0.16)

表E-7显示了在破伤风和白喉接种(与TetraMenD或安慰剂共同给予)后28天时对破伤风和白喉的几何平均抗体效价(GMT)。

表E-7：在破伤风和白喉接种后28天时对破伤风和白喉的几何平均抗体效价(GMT)比较，(符合方案人群)[1]
								Td+TetraMenD，安慰剂		Td+安慰剂，TetraMenD
	GMTa	(95％CI)	GMTb	(95％CI)	GMT比率GMTb/GMTa	GMT比率的95％CI
							破伤风	11.46	(10.79，12.18)	13.56	(12.73，14.44)	1.18	(1.08，1.29)
白喉	304.69	(221.69，418.78)	10.60	(9.23，12.18)	0.03	(0.02，0.05)

表E-8显示了接种TetraMenD后28天时对血清群A、C、Y和W-135的SBA-BR的几何平均抗体效价(GMT)。对于血清群A、C、Y和W-135，GMT比率分别是0.92、0.42、0.39和0.32。

表E-8：在接种TetraMenD后28天时SBA-BR的几何平均抗体效价(GMT)的比较，(符合方案人群)[1]
								Td+TetraMenD，安慰剂		Td+安慰剂，TetraMenD
	GMTa	(95％CI)	GMTb	(95％CI)	GMT比率GMTb/GMTa	GMT比率的95％CI
							血清群A	11321.8	(10173.2，12600.0)	10391.4	(9523.1，11338.8)	0.92	(0.8.1.1)
血清群C	5042.0	(4389.4，5791.7)	2136.0	(1810.8，2519.4)	0.42	(0.3，0.5)
							血清群Y	3387.3	(2978.2，3852.5)	1331.3	(1170.2，1514.6)	0.39	(0.3，0.5)
血清群W-135	4175.8	(3702.1，4710.1)	1339.1	(1161.8，1543.4)	0.32	(0.3，0.4)

表E-9显示了在Td+TetraMenD，安慰剂组接种TetraMenD后28天时对血清群A、C、Y和W-135的SBA-BR的几何平均抗体效价(GMT)，以及研究MTA02中的相应结果。对于血清群A、C、Y和W-135，GMT比率分别为0.48、0.38、0.34和0.39。

表E-9：在Td+TetraMenD、安慰剂组中接种TetraMenD后28天时SBA-BR的几何平均抗体效价(GMT)与研究C中相应结果的比较，(符合方案人群)
								Td+TetraMenD，安慰剂		研究C
	GMTa	(95％CI)	GMT研究C	(95％Cl)	GMT比率GMTmta02/GMTa	GMT比率的95％CI
							血清群A	11321.8	(10173.2，12600.0)	5483.2	(4920.1，6110.7)	0.48	(0.4，0.6)
血清群C	5042.0	(4389.4，5791.7)	1924.4	(1662.1，22228.0)	0.38	(0.3，0.5)
							血清群Y	3387.3	(2978.2，3852.5)	1322.3	(1161.9，1504.8)	0.39	(0.3，0.5)
血清群W-135	4175.8	(3702.1，4710.1)	1407.2	(1232.1，1607.3)	0.34	(0.3，0.4)

表E-10显示了在Td+安慰剂，TetraMenD组接种TetraMenD后28天时对血清群A、C、Y和W-135的SBA-BR的几何平均抗体效价(GMT)和研究MTA02中的相应结果。对于血清群A、C、Y和W-135，GMT比率分别是0.53、0.90、0.99和1.05。

表E-10：在组B中接种TetraMenD后28天时SBA-BR的几何平均抗体效价(GMT)和研究C中的相应结果的比较，观察假设(符合方案人群)[1]
								Td+安慰剂，TetraMenD		研究C
	GMTb	(95％Cl)	GMT研究C	(95％Cl)	GMT比率GMTmta02/GMTb	GMT比率的95％CI
							血清群A	10391.4	(9523.1，11338.8)	5483.2	(4920.1，6110.7)	0.53	(0.5，0.6)
血清群C	2136.0	(1810.8，2519.4)	1924.4	(1662.1，2228.0)	0.90	(0.7，1.1)
							血清群Y	1331.3	(1170.2，1514.6)	1322.3	(1161.9，1504.8)	0.99	(0.8，1.2)
血清群W-135	1339.1	(1161.8，1543.4)	1407.2	(1232.1，1607.3)	1.05	(0.9，1.3)

表E-11显示了符合方案人群中按照血清群的TetramenD接种后0天和28天时的SBA-BR抗体效价分布(SBA-BR效价＜8至1024)。

表E-12显示了符合方案人群中按照血清群的TetramenD接种后0天和28天时的SBA-BR抗体效价分布(SBA-BR效价2048至524288)。

表E-11：按照血清群0天和TetraMenD接种后28天时的SBA-BR抗体效价分布(符合方案人群)(SBA-BR效价＜8至1024)
																	SBA效价
				＜8	8	16	32	64	128	256	512	1024
													测试类型	测试日期	组	N	n％	n％	n％	n％	n％	n％	n％	n％	n％
血清群A	0天		470	9019.1	132.8	51.1	20.4	91.9	255.3	6012.8	6814.5	9720.6
														478	5311.1	61.3	20.4	00.0	51.0	367.5	7415.5	7315.3	10321.5
		28天		470	00.0	00.0	00.0	00.0	00.0	30.6	30.6	71.5												102.1
													478	00.0	00.0	00.0	00.0	00.0	00.0	10.2	40.8	61.3
			血清群C	0天		470	15132.1	275.7	153.2	275.7	183.8	316.6											388.1	5211.1	6413.6
	478	15332.0											316.5	204.2	132.7	122.5	5511.5	4910.3	428.8	459.4

表E-11：按照血清群0天和TetraMenD接种后28天时的SBA-BR抗体效价分布(符合方案人群)(SBA-BR效价＜8至1024)
																	SBA效价
				＜8	8	16	32	64	128	256	512	1024
													测试类型	测试日期	组	N	n％	n％	n％	n％	n％	n％	n％	n％	n％
	28天		470	10.2	00.0	00.0	20.4	10.2	51.1	112.3	265.5	398.3
														478	20.4	20.4	20.4	91.9	40.8	204.2	357.3	5210.9	6714.0
		血清群Y	0天		470	10121.5	51.1	61.3	224.7	306.4	5311.3	8117.2												6714.3	5211.1
	478												9319.5	10.2	20.4	81.7	204.2	8417.6	6914.4	7114.9	6914.4
				28天		470	10.2	10.2	10.2	20.4	30.6	71.5										122.6	234.9	6513.8
	478		40.8										30.6	10.2	20.4	51.0	204.2	387.9	6914.4	8517.8
					血清群W-135	0天		470	20543.6	306.4	173.6	337.0									377.9	418.7	398.3	316.6	173.6
	478	21344.6	296.1	91.9									142.9	265.4	6914.4	4810.0	326.7	245.0
							28天		470	10.2	00.0	00.0							00.0	10.2	40.9	71.5	245.1	6213.2
	478	71.5	30.6	10.2		20.4							10.2	214.4	428.8	7215.1	8718.2
								A组：接种1＝Td+TetraMenD    接种2＝安慰剂B组：接种1＝Td+安慰剂       接种2＝TetraMenD

表E-12：根据血清群0天和TetraMenD接种后28天时SBA-BR抗体效价的分布(符合方案人群) (SBA-BR效价2048-524288)
																	SBA效价
				2048	4096	8192	16384	32768	65536	131072	524288	Miss-ing
													测试类型	测试日期	组	N	n％	n％	n％	n％	n％	n％	n％	n％	D％
血清群A	0天	A	470	7014.9	163.4	102.1	30.6	10.2	00.0	00.0	00.0	10.2
													B	478	7515.7	296.1	132.7	40.8	51.0	00.0	00.0	00.0	00.0
		28天	A	470	296.2	6012.8	10923.2	10221.7	11724.9	173.6	102.1	00.0												30.6
	B												478	387.9	7515.7	11223.4	14730.8	8317.4	71.5	51.0	00.0	00.0
			血清群C	0天	A	470	367.7	40.9	20.4	30.6	10.2	00.0											00.0	00.0	10.2
B	478	326.7											142.9	81.7	20.4	20.4	00.0	00.0	00.0	00.0
					28天	A	470	8017.0	7916.8	7716.4	7415.7	5110.9									102.1	102.1	10.2	30.6
B	478	7916.5		6213.0									5912.3	367.5	357.3	51.0	91.9	00.0	00.0
						血清群Y	0天	A	470	377.9	91.9	40.9								20.4	00.0	00.0	00.0	00.0	10.2
B	478	357.3	153.1	61.3	51.0								00.0	00.0	00.0	00.0	00.0
								28天	A	470	7415.7	11424.3						7716.4	5611.9	286.0	10.2	20.4	00.0	30.6
B	478	11323.6	7315.3	479.8	153.1		30.6						00.0	00.0	00.0	00.0
									血清群W-135	0天	A	470					153.2	30.6	10.2	00.0	00.0	00.0	00.0	00.0	10.2
B	478	112.3	10.2	20.4	00.0	00.0	00.0	00.0					00.0	00.0
											28天	A			470	8518.1	9019.1	7716.4	7415.7	377.9	30.6	20.4	00.0	30.6

表E-12：根据血清群0天和TetraMenD接种后28天时SBA-BR抗体效价的分布(符合方案人群)(SBA-BR效价2048-524288)
																	SBA效价
				2048	4096	8192	16384	32768	65536	131072	524288	Miss-mg
													测试类型	测试日期	组	N	n％	n％	n％	n％	n％	n％	n％	n％	n％
		B	478	10922.8	6012.6	398.2	194.0	122.5	20.4	10.2	00.0	00.0
													A组：接种1＝Td+TetraMenD    接种2＝安慰剂B组：接种1＝Td+安慰剂       接种2＝TetraMenD

表E-13：抗体效价总结：破伤风和白喉效价的分布(符合方案人群)[1]
								Td+TetraMenD，安慰剂		Td+安慰剂，TetraMenD
抗体效价	测试日期	n/N	(％)	n/N	(％)
						破伤风
＜0.11U/ml	0天	5/468	(1.1)	3/472	(0.6)
							28天	0/465	(0.0)	0/477	(0.0)
						≥0.1-＜1.0IU/ml	0天	281/468	(60.0)	274/472	(58.1)
	28天	4/465	(0.9)	7/477	(1.5)
≥1.0 IU/ml	0天	182/468	(38.9)	195/472	(41.3)
							28天	461/465	(99.1)	470/477	(98.5)
						白喉
＜0.1IU/ml	0天	87/469	(18.6)	103/476	(21.6)
							28天	0/467	(0.0)	0/476	(0.0)
						≥0.1-＜1.0IU/ml	0天	255/469	(54.4)	267/476	(56.1)
	28天	0/467	(0.0)	2/476	(0.4)
≥1.0IU/ml	0天	127/469	(27.1)	106/476	(22.3)
							28天	467/467	(100.0)	474/476	(99.6)

为了获取与获颁许可的Td疫苗同时给予的MCV-4疫苗的安全性和免疫原性，在健康的10-17岁青少年中进行相关研究。简而言之，在多中心随机试验中，健康的10-17岁(平均年龄12.9岁)青少年同时(n＝509)或在相隔一个月的单独随访时(n＝512)接种TetraMenD(MCV-4)+Td。在接种后8天和28天收集对分别给予和同时给予的这两种疫苗的安全评价。通过抗白喉和破伤风的抗体效价以及抗脑膜炎球菌血清群的血清杀菌活性(SBA)，来评价接种前和接种后4周的免疫应答。对仅给予Td的受试者的安全性与给予Td+TetraMenD的受试者中的安全性相似。Td+TetraMenD的共同给予并不干扰对破伤风或者白喉类毒素的免疫应答。对四种血清群的SBA反应总结于下示表E-14。

表E-14：对四种血清群的SBA反应

血清群	SBA(GMT)
					同时给予		分别给予
	接种前(N＝468)	接种后(N＝466)	接种前(N＝477)	接种后(N＝478)
					A	232	11313	228	10391
C	66	5059	57	2136
					Y	124	3391	115	1331
W-135	26	4195	27	1339

该研究表明，同时给予Td和TetraMenD是安全的，在所测试受试者中被良好耐受。同时给予TetraMenD+Td不会对针对破伤风和白喉类毒素的免疫应答产生不利影响。MCV-4与Td共同给予时增强对血清群C、Y和W-135多糖的免疫应答。该研究中所观察到的增强免疫应答是令人惊讶和出乎意料的。

实施例14  对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C、W-135和Y进行的用幼兔补体和用人补体的血清杀菌活性测定的比较

来自研究A中III期的一部分血清样品用于本研究，以对比用针对血清群C、W-135和Y的SBA-BR效价所获结果与SBA-HC效价所获结果。入选本试验的受试者至少为2岁，但尚不满11岁，将每位受试者随机指定入两个疫苗组之一。在基线期(接种疫苗前)和接种后28天从每位受试者收集约5mL全血。在收集后4小时内，将来自受试者的血液样品离心。从血凝块中取出血清，转移至标记过的冷冻管并贮存于-20℃或更冷的温度监视冰箱中。本报告分析中使用的所有样品均来自由入选临床研究的第一批受试者所获并具有足够的血清量来完成全部计划测试的成对血清。除了一个样品来自一名4岁的受试者以外，其余所有样品均来自2岁至3岁的受试者。有两个受试者为意向治疗类。其中一个来自TetraMenD疫苗组(接种后28天的血液样品在24天时就收集了)，另一个来自Menomune_疫苗组(接种后28天的血液样品在9天时就收集了)。

预筛选幼兔补体(Pel-Freez_，Clinical Systems LLC，Brown Deer，WI，产品编号31038)对每一血清群特异性测定的适宜性。适宜性标准包括：与使用先前合格批次的兔补体对所限定部分的血清样品(两倍稀释度内)获得的SBA-BR检测结果相一致。也可以使用满足参考血清和对照样品的预先确定效价的标准。将等份的2.5ml兔补体贮存于-70℃或更低温度，直至准备使用。等份试样一旦融化就要使用，否则废弃。

通过ELISA筛选入选受试者血清的抗脑膜炎球菌多糖的IgG和IgM水平，并用SBA-BR测试功能性抗体，以鉴定用于SBA-H的潜在补体源。建立的选择人类来源补体的标准如下：(1)当以SBA-BR测定法测定时无可检测抗体；(2)当在测定法中用作补体源时缺乏内在杀菌活性；(3)当用作补体源与一组阴性对照一起使用时结果可接受，所述阴性对照使用之前由Ray Borrow博士在独立外部实验室确定的具有阴性测试结果的血清，和(4)用一组24个样品测试时重现性可以接受。用于每一血清群特异性测定法的外源补体源来自不同受试者。没有一种补体源用于超过一种血清群的测定。同样，在SBA测定中使用的三个补体源对每一血清群而言来自单一供体。

血清群C

来自具有可接受的低ELISA值(对于IgG和IgM都小于0.5μg/ml)的几个受试者的血清证实了杀菌活性。

血清群Y

用于血清群Y SBA-H的补体源选自入选收集方案的受试者。来自补体源的血清通过ELISA显示出低水平的血清群YIgG和IgM抗体，在SBA-BR测定中是阴性的。当该来源的血清用于SBA时未显示出内在杀菌活性。

血清群W-135

用于血清群W-135 SBA-H的补体源选自入选收集方案的受试者。来自补体源的血清通过ELISA显示出低水平的血清群W-135 IgG和IgM抗体，在SBA-BR测定中是阴性的。当该来源的血清用于SBA时未显示出内在杀菌活性。

血清杀菌测定

简而言之，脑膜炎球菌血清群C、Y和W-135菌株得自美国疾病控制中心(Centers for Disease Control，Atlanta，GA(CDC))。由刚刚融化的血清群C、Y和W-135工作种子批料小瓶制备用于测定的细菌靶菌株。每瓶用于划线接种Thayer Martin平板，于37℃±0.5℃、5％CO₂条件下培养过夜。第二天，用无菌拭子收获分离的菌落，并用于接种已预热至室温的新鲜Thayer Martin平板的整个表面。将平板于37℃±0.5℃、5％CO₂下培养4小时，以获取细菌生长汇合的亮菌幕，用无菌拭子收集亮菌幕，并悬浮于Dulbecco PBS+0.1％葡萄糖缓冲液中，直至规定的光密度(600nm吸光度)。用Dulbecco PBS+0.1％葡萄糖缓冲液制备含规定浓度细菌的工作液，工作液维持于室温，在制备后30分钟内使用。

将测试样品于56℃热处理30分钟，以失活内源性补体。向96孔微量滴定板的所有孔中加入Dulbecco PBS+0.1％葡萄糖缓冲液，然后将测试血清以2倍连续稀释度分配于板内，留下最后两列孔作为补体和血清对照孔。每块板中的列都包括一个补体列([第11列]-血清/+补体)和一个血清对照列([第12列]+血清/-补体)。

将刚刚融化的补体与工作浓度的细菌混合，并将混合物分配入微量滴定板除血清对照孔之外的所有孔中。将未添加补体的细菌分配入血清对照孔中。盖上滴定板，置于板振荡器上1分钟，然后转移至37℃±0.5℃的CO₂培养箱。对于血清群A测定板，培养时间是90分钟，而对于血清群C、Y和W-135测定板，培养时间是60分钟。培养后，向所有孔中小心加入100μl的50℃±1℃的琼脂糖覆层培养基，避免形成气泡。在室温下将微量滴定板盖板微微敞开(避免形成水蒸汽)10分钟后，盖上平板并转移到干的(未加湿)5％CO₂培养箱中，于37℃±0.5℃培养20±4小时。在此培养后，计数每孔中细菌菌落数。计算每个补体对照孔的菌落平均数，除以2得到T₀时的50％存活率。

每一未知血清的杀菌效价表示为与T₀时的50％存活率值相比产生≥50％致死的最末血清稀释度的倒数。在SBA-BR中，样品的起始稀释度为1∶8稀释度。对于SBA-H，如原测定法中所述，起始稀释度降低至1∶4稀释度。

表14-1提供了本文描述的用于血清群A测定的SBA-BR法与标准化的SBA法(CDC)以及Manchester Public Health Laboratory Services，Meningococcal Reference Unit，Manchester，UK(PHLS)所执行的SBA法的对比。

表14-1：血清杀菌活性测定方法比较

	AvP-US	CDC	PHLS
				冷冻母液	含10％甘油的Greaves溶液	含10％甘油的Greaves溶液	在甘油(15％)培养液中冻存
杀菌缓冲液	含0.1％葡萄糖的Dulbecco	含0.1％葡萄糖的Dulbecco	含0.5％BSA的Geys
				过夜生长培养基	Thayer Martin(MR0232)	含1％马血清的脑心浸液	含5％马血液的血液琼脂
过夜生长条件	37℃、5％CO2	37℃、5％CO2	37℃、5％CO2
				补体	幼兔(Pel-Freez)	幼兔(Pel-Freez)	幼兔(Pel-Freez)
血清群A菌株	F8238	F8238	F8238
				测定日培养基	Thayer Martin(MR0232)	含1％马血清的脑心浸液	血液琼脂
测定日培养条件	37℃、5％CO2，4小时	37℃、5％CO2，4小时	37℃、5％CO2，4小时
				目标T0(每毫升)	4000 CFU/ml	4000 CFU/ml	80000CFU/ml
血清初始启动稀释度	1∶4	1∶4	1∶2
				血清处理	56℃，30分钟	56℃，30分钟	56℃，30分钟
培养步骤时总体积	50μl	50μl	40μl
				血清混合物占总的百分数(体积)	50％(25μl)	50％(25μl)	50％(20μl)
细胞悬液的百分数(体积)	25％(12.5μl)	25％(12.5μl)	25％(10μl)
				补体的百分数(体积)	25％(12.5μl)	25％(12.5μl)	25％(10μl)
在r’xn混合物中的CFU/孔(理论值)	50	50	800
				最终的启动稀释度	1∶8	1∶8	1∶4
血清培养条件	37℃、5％CO2，90分钟	37℃、90分钟	37℃、不含5％CO2，90分钟
				过夜培养方法	加入100μlTSB覆层琼脂(在96孔板中)，37℃、5％CO2	加入100μlTSBNoble覆层琼脂，37℃、5％CO2(在96孔板中)	在琼脂板上10μl(Tilt法)37℃
T0条件	37℃，90分钟(即补体对照平均值)	37℃，90分钟(即补体对照平均值)	在90分钟培养之前置于37℃、5％CO2过夜
				终点效价	50％杀死	50％杀死	50％杀死

参考血清(CDC供体-R21654-3430107)得自CDC的GeorgeCarlone博士，为瓶装冻干粉末，贮存于2-8℃，直至使用。需要时，每瓶用0.5ml无菌水再水化，并以100μl工作等份贮存于-80℃至-40℃。在这些条件下重新配制的参考血清效价是1∶256±1，这在针对血清群A、C、Y和W-135的标准化SBA-BR中为两倍稀释度。参考血清样品在每天测定中的一组板的不同板中测定两次。

对于血清群A、C、Y和W-135的群特异兔抗血清从Difco购得，为瓶装冻干粉末，使用前贮存于2-8℃。需要时，每瓶用1ml无菌水再水化，并以50μl等份贮存于-80℃至-40℃，以用作SBA中的质量控制样品。

本文提供的使用幼兔补体的血清杀菌活性测定(SBA-BR)用于测定临床血清样品中对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C、Y和W-135的补体介导型抗多糖杀菌活性，该血清杀菌活性测定的结果在精度、可稀释性(线性)、特异性和检测限度方面是完全有效的。为确立该测定的精度，使用同一组血清样品在连续5天内重复进行SBA-H测定(针对血清群C)。

SBA＝BR灵敏度和特异性的计算

使用1∶4和1∶8的SBA-H基准效价，将在SBA-BR中得到的效价分成真阳性(TP)(和假阳性[FP])以及真阴性(TN)(和假阴性[FN])。灵敏度按照TP/(TP+FN)来计算，特异性按照TN/(TN+FP)来计算。这些计算的结果以百分数表示。

SBA＝BR对SBA-H的SBA效价分布比较

免疫前和免疫后28天的SBA效价示于表1和表4(针对血清群C)、表2和表5(针对血清群Y)以及表3和表6(针对血清群W-135)。对比两种补体源(BR对H)所获得的结果分析免疫前和免疫后的SBA效价，该分析总结于下面的小节中。

血清群C的SBA效价分布

在101个免疫前血清样品中，有63个依据＜1∶4的SBA＝H效价和＜1∶8的SBA-BR效价而被定义为阴性。有27个免疫前样品用SBA-H测定时为阴性(＜1∶4)，但用SBA-BR测定时为阳性(≥1∶8)。使用＜1∶8的SBA-BR截止效价时假阳性率为30％。在较高SBA-BR截止效价时假阳性率降低，在1∶128的截止效价时降低至小于20％，在1∶512的截止效价时降低至小于10％。有7个样品SBA-H测定阳性(≥1∶4)，而SBA-BR测定阴性(＜1∶8)。

在免疫后血清中，48个样品为SBA-H阴性，仅有11个为SBA-BR阴性。SBA-BR测定为阴性的11个样品中，有3个为SBA-H阳性。在缀合物组中的51个免疫后样品中有17个(32％)为SBA-H阴性，但为SBA-BR测定阳性(≥1∶8)。对于多糖组，50个免疫后样品中有23个(46％)为SBA-H阴性但SBA-BR效价为阳性(≥1∶8)。根据免疫后血清的阳性反应，101个样品中有90个(89％)为SBA-BR阳性(≥1∶8)，但是101个中只有53个(52％)为SBA-H阳性(≥1∶4)。当比较得自两个疫苗组的SBA效价(BR对H)时，发现它们的阳性反应率具有明显差异。对于缀合物组中的51个免疫后样品，51个中的33个(65％)为SBA-H阳性(≥1∶4)且SBA-BR阳性(≥1∶8)。在SBA-BR阈值效价为≥1∶64或更高时，SBA效价间(BR对H)的一致性提升。在多糖组的50个免疫后样品中，50个中的17个(34％)为SBA-H阳性(≥1∶4)且SBA-BR阳性(≥1∶8)。当SBA-BR阈值效价为≥1∶512或更高时，SBA效价间(BR对H)的一致性提升。

血清群Y的SBA效价分布

与血清群C免疫前血清不同，血清群Y免疫前样品仅有9个依据＜1∶4的SBA-H效价和＜1∶8的SBA-BR效价而被定义为阴性。在61个免疫前样品中有52个为SBA-H阴性(＜1∶4)但SBA-BR阳性(≥1∶8)。使用＜1∶8的SBA-BR截止效价时假阳性率为85％。在较高的SBA-BR截止效价时假阳性率降低，在1∶256的截止效价时降低至小于15％，在1∶512时降低至小于2％。2个样品为SBA-H阳性(≥1∶4)但SBA-BR阴性(＜1∶8)。

没有SBA-H效价＜1∶4且SBA-BR效价＜1∶8的免疫后血清样品。19个SBA-H阴性(＜1∶4)样品为SBA-BR阳性(≥1∶8)。如对于血清群C所指出的，假阴性结果的比例有差异。在缀合物组中，48个样品中有5个(9％)为SBA-H阴性(＜1∶4)但SBA-BR阳性。在多糖组中，52个样品中有14个(27％)为SBA-H阴性(＜1∶4)但SBA-BR阳性。

免疫后血清对血清群Y的阳性反应的两种SBA效价(BR对H)具有良好的一致性。对于整组的100个样品，所有100个免疫后样品均具有≥1∶8的SBA-BR效价，100个样品中有81个具有≥1∶4的SBA-H效价。如对于血清群C的SBA反应所指出的，与多糖组所获得的SBA效价(BR对H)相比，缀合物组的SBA效价(BR对H)间具有更好的相关性。在缀合物组的48个免疫后样品中，有43个(90％)为SBA-H阳性(≥1∶4)且SBA-BR阳性(≥1∶8)。在48个样品中只有一个具有小于1∶32的SBA-BR效价，且该样品为SBA-H阳性(≥1∶4)。多糖组中SBA效价间(BR对H)的一致性没有那么好。52个样品中只有38个(73％)具有≥1∶4的免疫后SBA-H效价和≥1∶8的免疫后SBA-BR效价。在SBA-BR效价≥1∶128时，多糖组中免疫后血清的SBA效价间(BR对H)的一致性得到改善。

血清群W-135的SBA效价分布

对于血清群W-135，100个样品中有54个(54％)为SBA-H效价＜1∶4且SBA-BR效价＜1∶8的阴性。在81个免疫前样品中，有27个为SBA-H阴性(＜1∶4)但SBA-BR阳性(≥1∶8)。使用＜1∶8的SBA-BR截止效价时假阳性率为33％。在较高的SBA-BR截止效价时假阳性率降低，在1∶128的截止效价下降至小于15％，在1∶256的截止效价下降至小于5％。11个样品为SBA-H阳性(≥1∶4)但SBA-BR阴性(＜1∶8)。

3个免疫后样品为SBA-H阴性(＜1∶4)且SBA-BR阴性(＜1∶8)。39个免疫后样品为SBA-H阴性(＜1∶4)但SBA-BR阳性(≥1∶8)。在缀合物组中，47个样品中有11个(23％)为SBA-H阴性但SBA-BR阳性。在多糖组中，53个样品中有28个(53％)为SBA-H阴性但SBA-BR阳性。

免疫后SBA-BR和SBA-H效价间的一致性与血清群C相当，但不如血清群Y好。如同血清群C和血清群Y这二者一样，在比较两个疫苗组时，两种SBA效价间(BR对H)的一致性有显著差异。与多糖组相比，缀合物组中两种SBA效价间(BR对H)的一致性较好。在缀合物组的免疫后SBA效价中，47个样品中有36个(77％)具有≥1∶4的SBA-H效价，并且全部样品均为SBA-BR阳性(≥1∶8)。缀合物组所有样品都具有≥1∶32的接种后SBA-BR效价。对于多糖组的免疫后效价，两种效价间的相关性没有那么好，53个样品中仅有22个(42％)具有≥1∶4的SBA-H效价，53个中有50个(94％)具有≥1∶8的SBA-BR效价。

表1.对于血清群C，通过SBA-H测定为阳性和阴性的血清中的SBA-BR效价的比较

1/SBA-BR效价	具有指定SBA-H效价的血清数量：
									免疫前		免疫后28天
	TetraMenD		Menomune_		组合
							＜4	＞＝4			＜4	＞＝4	＜4	＞＝4	＜4	＞＝4
	＜8	63	7	1	0	7			3	8							3
8							4	0			1	0	1	0	2	0
	16	1	1	1	0	1			1	2							1
32							2	0			5	3	1	1	6	4
	64	4	0	4	6	5			2	9							8
128							3	2			3	9	8	2	11	11
	256	11	1	1	3	4			3	5							6
512							1	0			0	5	1	3	1	8
	1024	0	0	2	6	1			4	3							10
2048							1	0			0	1	1	0	1	1
	4096	0	0	0	0	0			1	0							1
合计							90	11			18	33	30	20	48	53

表2.对于血清群Y，通过SBA-H测定为阳性和阴性的血清中的SBA-BR效价的比较

1/SBA-BR效价	具有指定SBA-H效价的血清数量：
									免疫前		免疫后28天
	TetraMenD		Menomune_		组合
							＜4	＞＝4			＜4	＞＝4	＜4	＞＝4	＜4	＞＝4
	＜8	9	2	0	0	0			0	0							0
8							1	1			0	1	0	0	0	1
	16	4	2	0	0	0			0	0							0
32							10	6			1	1	3	2	4	3
	64	14	6	1	3	4			2	5							5
128							15	12			1	9	4	6	5	15
	256	7	9	1	13	2			16	3							29
512							1	0			1	7	1	6	2	13
	1024	0	0	0	5	0			4	0							9
2048							0	1			0	3	0	1	0	4
	4096	0	0	0	1	0			1	0							2
合计							61	39			5	43	14	38	19	81

表3.对于血清群W-135，通过SBA-H测定为阳性和阴性的血清中的SBA-BR效价的比较

	具有指定SBA-H效价的血清数量：
											免疫后28天
	1/SBA-BR效价	免疫前		TetraMenD		Menomume_		组合
＜4										＞＝4	＜4	＞＝4	＜4	＞＝4	＜4	＞＝4
		＜8	54	11	0	0	3	0	3								0
8	1									3	0	0	0	0	0	0
		16	3	0	0	0	1	0	1								0
32	2									0	0	1	0	0	0	1
		64	11	2	1	2	3	3	4								5
128	7									1	2	2	7	2	9	4
		256	3	2	4	3	6	5	10								8
512	0									0	4	13	5	4	9	17
		1024	0	0	0	3	5	3	5								6
2048	0									0	0	11	1	5	1	16
		4096	0	0	0	1	0	0	0								1
合计	81									19	11	36	31	22	42	58

表4.通过SBA-BR和SBA-H检测的血清群C效价分布的总结

1/杀菌效价	具有指定效价的样品1的数量(免疫前或免疫后的％)
							SBA-BR			SBA-H
	免疫前	免疫后		免疫前	免疫后
							Menomune_	TetraMenD	Menomune_	TetraMenD
		＜4									90(89.11)	30(60.00)	18(35.29)
4								2(1.98)	1(2.00)	1(1.96)
		＜8	70(69.31)		10(20.00)	1(1.96)
8	4(3.96)			1(2.00)			1(1.96)	0	2(4.00)	1(1.96)
		16	2(1.98)		2(4.00)	1(1.96)					3(2.97)	2(4.00)	5(9.80)
32	2(1.98)			2(4.00)			8(15.69)	1(0.99)	3(6.00)	3(5.88)
		64	4(3.96)		7(14.00)	10(19.61)					1(0.99)	0	5(9.80)
128	5(4.95)			10(20.00)			12(23.53)	3(2.97)	3(6.00)	5(9.80)
		256	12(11.88)		7(14.00)	4(7.84)					1(0.99)	1(2.00)	5(9.80)
512	1(0.99)			4(8.00)			5(9.8)	0	5(10.00)	2(3.92)
		1024	0		5(10.00)	8(15.69)					0	1(2.00)	5(9.80)
2048	1(0.99)			1(2.00)			1(1.96)	0	0	1(1.96)
		4096	0		1(2.00)	0					0	1(2.00)	0
8192	0			0			0	0	1(2.00)	0

¹样品总数为101。

表5.通过SBA-BR和SBA-H检测的血清群Y效价分布的总结

1/杀菌效价	具有指定效价的样品1的数量(免疫前或免疫后的％)
							SBA-BR    SBA H
	免疫前	免疫后		免疫前	免疫后
							Menomune_	TetraMenD	Menomune_	TetraMenD
		＜4									61(61.00)	14(26.92)	5(10.42)
4								1(1.00)	0	1(2.08)
		＜8	11(11.00)		0	0
8	2(2.00)			0			1(2.08)	3(3.00)	1(1.92)	4(8.33)
		16	6(6.00)		0	0					11(11.00)	12(23.08)	2(4.17)
32	16(16.00)			5(9.62)			2(4.17)	12(12.00)	11(21.15)	11(22.92)
		64	20(20.00)		6(11.54)	4(8.33)					5(5.00)	9(17.31)	5(10.42)
128	27(27.00)			10(19.23)			10(20.83)	6(6.00)	2(3.85)	8(16.67)
		256	16(16.00)		18(34.62)	14(29.17)					1(1.00)	1(1.92)	6(12.50)
512	1(1.00)			7(13.46)			8(16.67)	0	1(1.92)	4(8.33)
		1024	0		4(7.69)	5(10.42)					0	1(1.92)	2(4.17)
2048	1(1.00)			1(1.92)			3(6.25)	0	0	0
		4096	0		1(1.92)	1(2.08)					0	0	0

¹样品总数为100。

表6.通过SBA-BR和SBA-H检测的血清群W-135效价分布的总结

1/杀菌效价	具有指定效价的样品1的数量(免疫前或免疫后的％)
							SBA-BR			SBA-H
	免疫前	免疫后		免疫前	免疫后
							Menomune_	TetraMenD	Menomune_	TetraMenD
		＜4									81(81.00)	31(58.49)	11(23.40)
4								4(4.00)	5(9.43)	6(12.77)
		＜8	65(65.00)		3(5.66)	0
8	4(4.00)			0			0	10(10.00)	7(13.21)	2(4.26)
		16	3(3.00)		1(1.89)	0					2(2.00)	5(9.43)	11(23.40)
32	2(2.00)			0			1(2.13)	3(3.00)	1(1.89)	5(10.64)
		64	13(13.00)		6(11.32)	3(6.38)					0	3(5.66)	2(4.26)

128	8(8.00)	9(16.98)	4(8.51)	0	0	5(10.64)
							256	5(5.00)	11(20.75)	7(14.89)	0	0	3(6.38)
512	0	9(16.98)	17(36.17)	0	1(1.89)	1(2.13)
							1024	0	8(15.09)	3(6.38)	0	0	1(2.13)
2048	0	6(11.32)	11(23.40)	0	0	0
							4096	0	0	1(2.13)	0	0	0

¹样品总数为100。

SBA-BR和SBA-H效价的灵敏度和特异性比较

在进行两组效价间的灵敏度和特异性评价时，将SBA-BR效价与1∶4和1∶8的SBA-H保护效价进行比较。在该分析中使用免疫前和免疫后两种血清。使用1∶4和1∶8的SBA-H基准效价，计算对全部3个血清群的特异性和灵敏度，并总结于表7、9和10。依次讨论对每一血清群的灵敏度和特异性的分析。

对于血清群C，相对于1∶4和1∶8两个SBA-H效价，1∶8、1∶16和1∶32的SBA-BR阈值效价的灵敏度大于80％。但是，这些SBA-BR效价的特异性低于60％，在1∶64的SBA-BR效价时特异性增加超过60％，在1∶128的SBA-BR效价时特异性超过70％。对于后面的这两个SBA-BR效价，其特异性开始降低。在1∶64的SBA-BR阈值效价时，灵敏度在75-78％之间，但在1∶128的SBA-BR效价时灵敏度降至62-65％之间。在SBA-BR效价＞1∶64时特异性继续提升，范围分别从1∶128时的73％升至1∶256时的83％。但是，灵敏度由43％降至不足20％。对于血清群C，在灵敏度和特异性间达到最佳平衡的SBA-BR效价在1∶32至1∶128的SBA-BR效价范围内。发现血清群C的灵敏度和特异性结果与Santos GF等，2001. Clin.Diagn.Lab. Immunol.8：616-623通过不同组的血清样品和试剂得到的结果(表8)相当近似。就Santos的结果而言，相对于1∶4和1∶8这两个SBA-H效价，在1∶64至1∶128的SBA-BR效价之间观察到灵敏度和特异性的最佳平衡。

表7.对于血清群C，在SBA-H保护效价时SBA-BR的灵敏度和特异性

1/SBA-BR效价	≥1∶4的SBA-H效价		≥1∶8的SBA-H效价
					灵敏度(％)	特异性(％)	灵敏度(％)	特异性(％)
	8	84	51	88					53
16					84	56	88	56
	32	81	58	85					58
64					75	64	78	64
	128	62	73	65					73
256					42	83	43	83
	512	31	95	33					95
1024					19	96	20	96

表8.Santos等，2001. Clin.Diagn.Lab.Immunol.8：616-623中所报道的，对于血清群C，在SBA-H保护效价时SBA-BR的灵敏度和特异性

1/SBA-BR效价	≥1∶4的SBA-H效价		≥1∶8的SBA-H效价
					灵敏度(％)	特异性(％)	灵敏度(％)	特异性(％)
	32	85	61	91					58
64					78	73	86	68
	128	69	83	78					81
256					54	87	63	88
	512	41	92	49					94

对于血清群Y，当SBA-BR阈值效价在1∶8至1∶64的范围内时灵敏度最高，但正如所料，在更高的SBA-BR阈值效价时灵敏度降低。血清群Y的特异性结果开始时远比血清群C的结果低，直到SBA-BR阈值效价为1∶128时特异性才达到高于50％的水平。对于血清群Y，灵敏度和特异性达到最佳平衡的SBA-BR效价处于1∶64至1∶256之间。在1∶256时，灵敏度降至大约55％，但特异性从30％区间的中段升至约82-83％。

表9.对于血清群Y，在SBA-H保护效价时SBA-BR的灵敏度和特异性

	≥1∶4的SBA-H效价		≥1∶8的SBA-H效价
					灵敏度(％)	特异性(％)	灵敏度(％)	特异性(％)
	8	98	11	98					1 1
16					97	12	97	12
	32	95	17	95					17
64					87	35	87	34
	128	78	59	78					57
256					56	84	55	82
	512	56	84	55					82
1024					13	100	14	100

对于血清群W-135，灵敏度值更接近于血清群C所获值，但对于所有三种血清群而言总体模式相同。灵敏度在1∶8的SBA-BR阈值效价时开始高，在效价≥1∶128时下降。同样，特异性在1∶8的SBA-BR效价时开始低，在1∶256的效价时开始稳定。如对血清群Y所观察到的，对于血清群W-135，灵敏度和特异性之间达到最佳平衡的SBA-BR处于1∶64和1∶256之间。

表10：对于血清群W-135，在SBA-H保护效价时SBA-BR的灵敏度和特异性

1/SBA-BR效价	≥1∶4的SBA-H效价		≥1∶8的SBA-H效价
					灵敏度(％)	特异性(％)	灵敏度(％)	特异性(％)
	8	86	46	87					43
16					82	48	82	44
	32	82	50	82					47
64					80	52	81	49
	128	71	64	73					61
256					65	77	64	72
	512	52	88	50					83
1024					30	95	34	94

表11总结了使用幼兔补体或人补体时针对血清群C、Y和W-135的SBA效价相对于免疫后SBA效价升高达4倍的比例。分别对缀合物组(TetraMenD)和多糖组(Menomune_)进行该分析，两组分析都纳入表11中。当比较两个疫苗组中所诱导的针对三个血清群的杀菌反应时，在四-四升高模式中存在一些可观察到的差异。依次讨论对于每一血清群和两个疫苗组的反应模式.

表11：通过SBA-BR和SBA-H测定的脑膜炎球菌多糖效价升高4倍的分层比较比率¹

	血清群C				血清群Y				血清群W-135
													TetraMenD		Menomune_		TetraMenD		Menomune_		TetraMenD		Menomune_
	1/SBA-	SBA-BR	SBA-H	SBA-BR	SBA-H	SBA-BR	SBA-H	SBA-BR	SBA-H	SBA-BR	SBA-H	SBA-BR													SBA-H
BR效价
	＜8	0/1(0％)	0/1(0％)	0/10(0％)	1/10(0％)	na	na	na	na	na	na	0/3(0％)													0/3(0％)
8													0/1(0％)	0/1(0％)	0/1(0％)	0/1(0％)	0/1(0％)	1/1(100％)	na	na	na	na	na	na
	16	0/1(0％)	0/1(0％)	0/2(0％)	1/2(50％)	Na	na	na	na	na	na	0/1(0％)													0/1(0％)
32													7/8(87％)	3/8(37％)	2/2(100％)	1/2(50％)	1/2(50％)	0/2(0％)	2/5(40％)	1/5(20％)	0/1(0％)	1/1(100％)	na	na
	64	9/10(90％)	6/10(60％)	6/7(86％)	2/7(29％)	1/4(25％)	0/4(0％)	2/6(33％)	0/6(0％)	3/3(100％)	0/3(0％)	6/6(100％)													0/6(0％)
128													11/12(92％)	7/12(58％)	8/10(80％)	2/10(20％)	5/10(50％)	6/10(60％)	4/10(40％)	2/10(20％)	2/4(50％)	1/4(25％)	8/9(89％)	2/9(22％)
	＞＝256	11/18(61％)	14/18(78％)	12/18(67％)	7/18(39％)	28/31(90％)	23/31(74％)	17/31(55％)	18/31(58％)	36/39(92％)	23/39(59％)	32/34(94％)													6/34(18％)
合计													38/51	30/51	28/50	14/50	35/48	30/48	25/52	21/52	41/47	25/47	46/53	8/53

¹此表显示为SBA效价升高达4倍的比率(和百分比)，所述SNA效价以SBA-BR效价、疫苗和血清群分层次进行的每一测定(来自免疫前和免疫后28天的成对样品)来测定。

对于血清群C，缀合物组SBA-BR对SBA-H之间的4倍升高密切一致。在此疫苗组内似乎有这样一种趋势：在低免疫后效价如1∶32-1∶128时，SBA-H的4倍升高滞后于SBA-BR中的4倍升高。但是，当免疫后SBA-BR效价≥1∶256时，SBA-H获得4倍升高的受试者数量看起来多于SBA-BR获得4倍升高的受试者数量。对比两种补体源，升高倍数的这种差异较小，这可能归因于较高免疫前SBA-BR效价，这改变了SBA-BR获得4倍升高的百分率。对于多糖组，SBA-BR和SBA-H间4倍升高的一致性不如缀合物组那样相近。另外，没有明显趋势表明在较高免疫后SBA-BR效价时SBA-H的4倍升高变得比缀合物组所观察到的更为灵敏。

对于血清群Y，两个疫苗组中SBA-H和SBA-BR的4倍升高间的一致性非常接近。对于血清群C，与免疫后SBA-BR效价相比，两个疫苗组中任一个的免疫后SBA-BR效价很少低于1∶32。因为该原因，与血清群C相比，对于血清群Y达到SBA-BR和SBA-H均升高达4倍的受试者比例出现在较高的免疫接种后SBA-BR效价。对于血清群Y，免疫后SBA-BR效价为1∶128时缀合物组的4倍升高比例增加至≥50％，而对于血清群C，缀合物组的SBA-BR阈值效价是1∶32。

与其它两种血清群相比，对于血清群W-135，SBA-H和SBA-BR的4倍升高之间的一致性不够接近。如对血清群Y所观察到的，对于两个疫苗组中的任一个，只有有限数量受试者的免疫后SBA-BR效价小于1∶32。在SBA-BR效价≥1∶256时，SBA效价4倍升高(BR对H)间存在一致性。如对血清群C所提到的，两个疫苗组之间4倍升高(BR对H)的比例存在差异，这种差异对血清群Y不太明显。与多糖疫苗所获其它两种血清群的SBA效价(BR对H)的4倍升高相比，多糖组中血清群W-135 SBA效价(BR对H)中4倍升高间的一致性是最差的。

为了测定用获颁许可的四价脑膜炎球菌多糖疫苗(Menomune_)或者用试验性四价脑膜炎球菌多糖缀合疫苗(TetraMenD)接种的2-3岁受试者血清样品的效价，将使用幼兔补体的血清杀菌活性测定(SBA-BR)与相应的使用人补体的SBA(SBA-H)相比较。对用于血清群C、Y和W-135的人补体源进行鉴定过，并将其用于支持SBA中的该比较。通过2种方法分析该比较研究的SBA结果。在一种方法中，通过测定两个疫苗组的免疫前和免疫后效价得到SBA-BR和SBA-H数据，将数据合并用于分析。在第二种方法中，对来自两个疫苗组的免疫前和免疫后效价分别进行分析。该研究的目标之一是描述与阴性SBA-H血清效价具有最佳相关性的SBA-BR血清效价。第二个目标是确定与测定中使用人补体的阳性效价具有最佳相关性的使用幼兔补体的效价，作为抗血清群C的保护作用之相关物，并外推至对于血清群Y和W-135的保护性杀菌效价。其它实验室已经公布了尝试建立针对血清群C的SBA-BR之保护性阈值相关物的结果。本研究的结果将与那些公布的结果相对比。最后，针对两种补体源，对比在免疫前和免疫后血清中检测的SBA效价的4倍升高。

仅仅针对血清群C建立了SBA效价与对抗疾病的保护作用之间的关联。在SBA测定中使用人补体确定针对血清群C的保护作用的SBA关联性。对于其它血清群，假设针对血清群C的保护作用的SBA-H关联性(SBA效价为1∶4)对其它血清群同样适用。对与1∶4的抗血清群C SBA效价相关联的SBA-BR效价的确定在血清群间可能有差异。就确定与阴性SBA-H血清效价最佳关联的SBA-BR效价来说，＜1∶8的SBA-BR效价好比是免疫前和免疫后血清中＜1∶4的SBA-H效价。使用＜1∶8的SBA-BR效价部分地基于WHO/CDC的血清群C SBA效价(BR对H)比较研究的结果，以及部分地基于以下最新研究结果：＜1∶4的SBA-BR效价与英国大学爆发的血清群C疾病的易感性相关(Jones，G.R.等，2000. J.Infect.181：1172-1175)。

根据本研究得到的SBA效价(BR对H)，对于血清群C使用＜1∶8的SBA-BR截止效价的假阳性率为30％。使用较高的SBA-BR截止效价如下改善了假阳性率：在≥1∶16时假阳性率降至26％，在≥1∶32时假阳性率降至24％，在≥1∶64时假阳性率降至22％，在≥1∶128时假阳性率降至18％，在≥1∶256时假阳性率降至14％，在≥1∶512时假阳性率降至2％。升高SBA-BR截止效价的确可用于改善确定对应于＜1∶4的SBA-H效价的阴性效价的准确性，但是当使用较高的SBA-BR截止效价时，区分阳性反应和阴性反应的灵敏度低得多。本报告的资料表明，当截止效价为1∶8、1∶16或1∶32时，SBA-BR的灵敏度最高(81-84％)。SBA-BR效价大于1∶32时，其灵敏度降至低于80％。但是，当截止效价为1∶8、1∶16和1∶32时，该测定法的特异性为最低，范围在51-58％之间。在选择与人补体测定中的阴性效价相关联的截止效价时，要在灵敏度、特异性和假阳性率之间取得平衡。指定1∶32作为SBA-BR截止效价将导致不必要地舍弃真阳性应答者。该研究结果表明，≥1∶16的SBA-BR效价可能是更合适的截止效价。根据WHO/CDC的研究分析(＜1∶8)和英国大学爆发分析(＜1∶4)，该效价之上至少2倍稀释度被看作是保护性的。

用于血清群W-135和Y的测定法中的保护性截止效价的鉴别来自这样一种假设：杀菌抗体保护作用类似于血清群C疾病和对应于人补体测定中阴性效价的杀菌效价。对于血清群Y，使用＜1∶8的SBA-BR截止效价的假阳性率相当高，达到85％，相比之下对血清群C为30％。但是，和血清群C一样，增加SBA-BR截止效价可降低假阳性率。SBA-BR截止效价为1∶16时假阳性率降至84％，在1∶32时假阳性率是75％，在1∶64时假阳性率是61％，在1∶128时假阳性率是38％，在1∶256时假阳性率是13％，在1∶512时假阳性率是2％。尽管血清群Y的假阳性率在开始时比血清群C高很多，但是当截止效价≥1∶128时，两种血清群测定中的假阳性率就变得相当接近了。然而，如此高的截止效价可能夸大了阳性反应的阈值效价。根据灵敏度和特异性分析，当SBA-BR截止效价为1∶8-1∶32时灵敏度最大化，其中灵敏度在95-98％的范围内。但是，和血清群C一样，在这些SBA-BR效价时特异性相应地较低，范围为11-18％。当SBA-BR效价为次高(1∶64)时，灵敏度从95％降至88％，但特异性急剧升至35％。在血清群Y测定中＜1∶64的截止效价与人补体测定中的阴性效价似乎最相当。

对于血清群W-135，在＜1∶8的SBA-BR截止效价时假阳性率为33％，这与血清群C相似。就像对血清群C和Y这二者所提到的一样，在较高的SBA-BR截止效价时，假阳性率降至较低水平。当SBA-BR截止效价为1∶16时假阳性率降至32％，在1∶32时假阳性率降至28％，在1∶64时假阳性率降至26％，在1∶128时假阳性率降至12％，在1∶256时假阳性率降至4％，在1∶512时假阳性率最小，为0％。SBA-BR效价范围在1∶8-1∶64之间时灵敏度最高(86％-81％)。正如所料，在此SBA-BR效价范围内特异性最低(46％-52％)。尽管血清群W-135的假阳性率开始时比血清群Y低很多，但是与人补体测定的阴性效价最相当的截止效价是＜1∶64。

对于三个血清群，已经确定了对应于人补体测定中阴性效价的效价，对超过这些水平的SBA-BR效价进行了认作阳性反应的阈值效价分析。对于血清群C，阳性反应的阈值效价是≥1∶16，对于血清群Y，阳性反应的阈值效价是≥1∶64，对于血清群W-135，阳性反应的阈值效价是≥1∶64。看起来对于血清群C来说，≥1∶128的SBA-BR阈值效价提供了良好保证，即相对于1∶4或1∶8的SBA-H效价获得了保护性效价，并且保护性效价与血清群C的1∶4的有效SBA-H效价相关联。此阈值效价与对血清群C的WHO/CDC数据集和Santos的数据集进行的分析非常相近。就象这两个研究中提到的那样，效价≥1∶128高度预示着具有保护作用，但是SBA-BR效价小于1∶128可能也具有保护性。对于WHO/CDC和Santos的数据集，1∶8、1∶16、1∶32、1∶64的SBA-BR效价被称为不确定效价。因为对于本文提出的血清群C的数据集而言，小于1∶16的SBA-BR效价被视为阴性，该分析的不确定效价为1∶16-1∶64，而1∶16-1∶64的效价是另外两个研究的一部分。在所有的这些分析中，正在对SBA-BR效价与二十世纪60年代所收集的天然保护性数据相关联的SBA-H效价(1∶4或1∶8)进行比较。

最近，人们一直努力将单价血清群C缀合物的英国效力数据同SBA-BR效价直接联系起来(Miller E等，2002， Vaccine 20：S58-S67)。在此分析中，发现≥1∶8和≥1∶128的SBA-BR效价与迄今针对接种该单剂单价血清群C缀合物的15-17岁受试者所收集的效力数据有很好的相关性。但是，当Miller及其同事对幼儿组(12-30月龄)进行相同分析时，他们发现≥1∶8的SBA-BR效价与效力之间有很好的一致性，但是当SBA-BR效价≥1∶128时没有如此接近的一致性。Miller于2002年9月1-6日在挪威奥斯陆举行的第13届国际致病性奈瑟菌属(Neisseria)大会(the 13^th International Pathogenic Neisseria Conference)上提供了另外的数据，其中在接种后一个月达到SBA-BR效价≥1∶64的受试者的预测效力处于对该年龄组所观察到的效力的95％置信区间之外。这些数据有助于支持这样一种观点：1∶8-1∶64的不确定区域内的SBA-BR效价可保证有保护作用。根据该研究的分析，1∶16-1∶64的SBA-BR效价同样可为抗血清群C的保护作用提供保证。

在1∶64的SBA-BR效价时，血清群Y测定的特异性仅为35％，但是当截止效价升高到1∶128和1∶256时，特异性分别升高至59％和84％。≥1∶256的阈值效价为在人补体测定中有1∶4和1∶8的保护性效价提供了良好保证。但是，对于血清群Y，在1∶128的阈值效价时，灵敏度和特异性达到了较好的平衡。与已和SBA-H保护效价相关联的血清群C的1∶16-1∶64 SBA-BR效价的相应范围相比，血清群Y的1∶64-1∶128 SBA-BR效价范围代表了效价的不确定范围。

在1∶64的SBA-BR效价时，血清群W-135测定具有的特异性为52％，但是当效价升高到1∶128和1∶256时，特异性分别升高至64％和77％。和血清群Y一样，≥1∶256的阈值效价为人补体测定中1∶4和1∶8的保护性效价提供了良好保证。与血清群Y一样，当对于血清群W-135阈值效价为1∶128时，灵敏度和特异性达到了较好平衡。与和本研究中的SBA-H保护效价相关联的血清群C的1∶1 6-1∶64SBA-BR效价范围相比，血清群W-135的1∶64-1∶128 SBA-BR效价范围代表了效价的不确定范围。

对每一血清群计算了杀菌效价的4倍升高，并且使用两种测定法按照疫苗组分别进行分析。一般来说，有迹象表明，对于全部三种血清群，当免疫后SBA-BR效价较高时，检测到较高的SBA效价(BR和H)的4倍升高比例。依照血清群和疫苗组计，SBA效价(BR对H)的4倍升高比例皆有差异。对于血清群C，当免疫后SBA-BR效价较低时，与使用幼兔补体之测定中的效价相比，使用人补体测定中的4倍升高比例似乎较低。然而，当免疫后SBA-BR效价较高时，使用人补体之测定中的效价4倍升高比例看起来较高。该模式似乎提示，在免疫后SBA-BR效价低时，使用人补体时的测定灵敏度低于使用幼兔补体的情况，但在免疫后SBA-BR效价高时，情况相反，也就是说，使用人补体的测定法变得更灵敏。当测定样品来自多糖疫苗组时，这种模式不明显。当在测定中使用人补体时，这些样品中效价的4倍升高比例似乎较低。尽管还无法解释样品类型间出现的这种观察结果，但这的确表明对于含低效价杀菌活性的血清样品，使用人补体进行的测定缺乏灵敏度。

对于血清群Y，在对比两种补体源时发现SBA效价的4倍升高有良好一致性。与多糖组相比，缀合物组中SBA效价(BR和H)的4倍升高比例稍高，但是这种差异不如血清群C所示的大。

对于血清群W-135，在针对两个疫苗组中任一个的测定中，使用人补体或幼兔补体时SBA效价4倍升高之间的一致性不如用其它两种血清群测定获得的结果好。这两个疫苗组的SBA-BR效价的4倍升高非常好，但是SBA-H效价4倍升高的比例比其它两个血清群低。在多糖组中SBA-H的4倍升高比例相当低，并且比较而言比其它两个血清群SBA-H效价的4倍升高比例都低。

使用BR补体的SBA效价4倍升高已经成为注册脑膜炎球菌多糖疫苗的基准。最近，人们已努力将SBA-BR效价的4倍升高与临床效力结合起来，此临床效力来自英国对单价血清群C缀合物注册后的监视资料(Borrow R等，2001， Infect.Immun.69：1568-1573)。根据本分析，单价血清群C缀合物在12-30月龄幼儿中的效力在第一剂后的16个月内估计为88％(69-95％)。对于该年龄组，在单剂单价C缀合疫苗后，SBA-BR效价获得4倍升高的受试者比例为89-100％。

文中提供的SBA-BR资料提供了杀菌效价值，其与使用人补体作为针于血清群C的测定法中的补体源所获值相当。因此，这些SBA-BR效价与确定对血清群C脑膜炎球菌性疾病的保护性免疫的替代物的初步研究相关，并支持将文中提供的临床结果外推至保护作用，对血清群C的SBA-BR效价与其它实验室报道的那些结果相当。通过与血清群C模型的类比，使用人补体的SBA在确定针对血清群Y和W-135荚膜多糖的血清群特异性反应中的表现，支持SBA-BR在测定抗血清群Y和W-135杀菌效价方面的相关性。

实施例15 TetraMenD(Menomune^TM)和Typhim Vi_在成人中的共同给予

本实施例描述了在美国的18-55岁健康人中进行的、单独给予或与已获颁许可的Typhim Vi_疫苗共同给予TetraMenD的改良双盲安全性和免疫原性2b期研究中获得的结果。

Typhim Vi_在美国可商购。每0.5ml剂量的Typhim Vi_含25μg纯化的Vi多糖、等渗的磷酸缓冲盐水和加入作为防腐剂的0.25％苯酚。Typhim Vi_疫苗还包含残留的聚二甲基硅氧烷或脂肪酸酯消泡剂。共有945名参与者入选该研究。简单地讲，将研究参与者随机分入两个治疗组中的任一个；A组在第一次随访时共同接受Menactra^TM和Typhim Vi_，在28天后的第二次随访时接受盐水安慰剂；B组在第一次随访时接受Typhim Vi_和安慰剂，在28天后的第二次随访时接受Menactra^TM。共有469名参与者入选A组，476名参与者入选B组。

在本研究中有两个主要的免疫原性目标。第一个目标是描述和对比各个研究组中接种后28天给予1剂Typhim Vi_后的抗体反应。如果B组达到抗体水平＞1.0mg/mL的接受者比例减去A组的该比例的差值低于10％，则A组参与者中针对Typhim Vi_的抗体反应应被看作类似于B组针对Typhim Vi_的抗体反应。选择＞1.0μg/mL的抗Vi抗体水平作为初免血清学终点，因为该抗体水平被看作是保护性的。两个主要目标中的第二个是描述和对比接种后28天Menactra^TM接受者中针对4个血清群中每一个的SBA抗体反应。参与者按照年龄、性别和人种在两个研究组之间平均分配。69％的参与者为女性，全部受试者的平均年龄为31岁。符合方案人群在A组中有432人(92.1％)满足纳入符合方案人群(per protocol population)的标准，B组为439人(92.2％)。

1.免疫原性结果

用Typhim Vi_疫苗接种后28天，A组81.6％的参与者和B组78.5％的参与者获得＞1.0μg/mL的抗体水平。结果概述于下表1。

表1

在Typhim Vi_接种后28天时Typhoid Vi抗体效价＞1.0μg/mL的参与者百分率(符合方案人群体)

	A组Typhim Vi+Menactra	B组TyphimVi+安慰剂
			抗ViPS效价＞1.0μg/ml的百分率	(418人中有341人)81.6％	(418人中有328人)78.5％

在使用双侧I型误差率α＝0.05和10％界限的情况下，Typhim Vi_当与Menactra^TM共同给予时，针对Typhim Vi_的抗体反应类似于单独给予Typhim Vi_时的对应反应(图1)。这些结果与基于Typhim Vi_单独给予或连同其它普通的四价疫苗(包括多糖脑膜炎球菌和甲肝疫苗)一起给予时文献中报告的血清阳转率的预期值一致。图1显示了来自这些研究的结果：在成人中于第28天时用＞1.0μg/ml的TyphimVi抗体效价测试时差值百分率的95％CI(％Typhim Vi+安慰剂，Menactra-％Typhim Vi+Menactra，安慰剂)。

图2表明，Menactra与Typhim Vi_共同给予时A组SBA抗体效价获得4倍升高的参与者比例，与在Typhim Vi_接种后1个月给予Menactra时在B组表现出的比例相当(符合方案人群)。在使用双侧I型误差率α＝0.05和10％界限的情况下，当Menactra^TM与TyphimVi_共同给予时针对Menactra^TM的抗体反应类似于单独给予Menactra^TM时的对应反应(图3)。

2.GMT

加入观察目标，以比较入选健康成人的独立安全性和免疫原性试验的参与者中对Menactra^TM反应的GMT和本实验中两个研究组的Menactra接受者的GMT。将在第二个(secondary)免疫原性假设中使用的相同标准应用于此比较。在每种情况下，有利地将在安全性和免疫原性研究(MTA09)参与者中针对各个血清群的GMT与本试验中A组或B组中任一组的Menactra^TM接受者的GMT相比较。对任一血清群而言，GMT比率的97.5％置信上限(其等同于双侧95％置信上限)决没有超过2。另外，对于全部4个血清群来说，两个研究组中95％以上的参与者都表现出高于保护水平的抗体效价(图4)。

监视研究参与者接种后30分钟的即时反应以及接种后7天中的局部和系统性反应原性。事先确定的不良事件包括局部反应(例如红斑、肿胀、硬化和疼痛)和系统症状(例如通过口部温度检测的发热、头疼、疲劳、寒战、关节痛、厌食、呕吐、腹泻、癫痫发作、不适和皮疹)，其在每次接种后评价。这些事件每天记录在日记卡上，还通过每次接种后8天的电话访问由研究人员收集。如果报告有皮疹，则提醒研究人员在单独的病例记录表上记录额外的细节。其它的非严重的、预料外不良事件通过在每次接种后8天和20天的电话访问获得。在整个研究过程中报告和记录严重不良事件。研究表明，与其它疫苗如Typhim Vi_共同给予Menactra^TM是安全的，不会使严重不良反应率显著增加。

这些数据表明，Menactra^TM在单独给予或与旅行疫苗Typhim Vi_共同给予时在成年人群中是高度免疫原性的。当这些数据应用于主要假设时，满足所有标准。

Claims (68)

1.一种多糖-蛋白质缀合物，其中缀合物包含缀合至一种或多种载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清群A、C、W-135或Y的荚膜多糖，组合物包含平均大小低于100,000道尔顿的0.5-15μg/ml的每种英膜多糖。

2.权利要求1的缀合物，其中所述荚膜多糖衍化至5,000-75,000道尔顿的平均大小。

3.权利要求2的缀合物，其中所述荚膜多糖衍化至7,000-50,000道尔顿的平均大小。

4.权利要求3的缀合物，其中所述荚膜多糖衍化至8,000-35,000道尔顿的平均大小。

5.权利要求4的缀合物，其中所述荚膜多糖衍化至12,000-25,000道尔顿的平均大小。

6.权利要求5的缀合物，其中所述荚膜多糖衍化至15,000-22,000道尔顿的平均大小。

7.权利要求1的缀合物，其中衍生多糖与载体蛋白的平均比率为约1∶1至约1∶20(重量/重量)。

8.权利要求7的组合物，其中衍生多糖与载体蛋白的平均比率为约1∶2至约1∶10(重量/重量)。

9.权利要求8的组合物，其中衍生多糖与载体蛋白的平均比率为约1∶2至约1∶6(重量/重量)。

10.权利要求9的组合物，其中衍生多糖与载体蛋白的平均比率为约1∶(4±1)(重量/重量)。

11.权利要求10的组合物，其中衍生多糖与载体蛋白的平均比率为约1∶(4±0.5)(重量/重量)。

12.权利要求11的组合物，其中衍生多糖与载体蛋白的平均比率为约1∶(4±0.25)(重量/重量)。

13.权利要求1的缀合物，其中所述载体蛋白包含细菌毒素或类毒素或细菌外膜蛋白。

14.权利要求1的缀合物，其中所述载体蛋白包含白喉毒素、白喉类毒素、CRM₁₉₇、破伤风类毒素、百日咳类毒素、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、外毒素A、外膜复合体c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附素蛋白质(PsaA)、卵清蛋白、匙孔_血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)。

15.权利要求14的缀合物，其中所述载体蛋白包含白喉毒素、白喉类毒素、CRM₁₉₇、破伤风类毒素、外毒素A或外膜复合体c(OMPC)。

16.权利要求15的缀合物，其中所述载体蛋白包含白喉毒素、白喉类毒素或CRM₁₉₇。

17.权利要求16的缀合物，其中所述载体蛋白包含白喉毒素或白喉类毒素。

18.权利要求17的缀合物，其中所述荚膜多糖衍化至8,000-35,000道尔顿的平均大小。

19.权利要求17的缀合物，其中衍生多糖与载体蛋白的平均比率为约1∶2至约1∶10(重量/重量)。

20.权利要求19的缀合物，其中衍生多糖与载体蛋白的平均比率为约1∶(4±1)(重量/重量)。

21.一种含多糖-蛋白质缀合物的组合物，其中缀合物包含缀合至一种或多种载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的两种或多种荚膜多糖，所述组合物包含平均大小低于100,000道尔顿的0.5-15μg/ml的每种荚膜多糖。

22.权利要求21的组合物，其中所述荚膜多糖衍化至5,000-75,000道尔顿的平均大小。

23.权利要求22的组合物，其中所述荚膜多糖衍化至7,000-50,000道尔顿的平均大小。

24.权利要求23的组合物，其中所述荚膜多糖衍化至8,000-35,000道尔顿的平均大小。

25.权利要求24的组合物，其中所述荚膜多糖衍化至12,000-25,000道尔顿的平均大小。

26.权利要求25的组合物，其中所述荚膜多糖衍化至15,000-22,000道尔顿的平均大小。

27.权利要求21的组合物，其中每种衍生多糖与载体蛋白的平均比率为约1∶1至约1∶20(重量/重量)。

28.权利要求27的组合物，其中每种衍生多糖与载体蛋白的平均比率为约1∶2至约1∶10(重量/重量)。

29.权利要求28的组合物，其中每种衍生多糖与载体蛋白的平均比率为约1∶2至约1∶6(重量/重量)。

30.权利要求29的组合物，其中每种衍生多糖与载体蛋白的平均比率为约1∶(4±1)(重量/重量)。

31.权利要求30的组合物，其中每种衍生多糖与载体蛋白的平均比率为约1∶(4±0.5)(重量/重量)。

32.权利要求31的组合物，其中每种衍生多糖与载体蛋白的平均比率为约1∶(4±0.25)(重量/重量)。

33.权利要求31的组合物，其中所述组合物为液体。

34.权利要求33的组合物，所述组合物在每毫升液体中包含约0.5至约15μg血清群A、C、W-135或Y的脑膜炎奈瑟氏球菌衍生多糖。

35.权利要求33的组合物，所述组合物在每毫升液体中包含约0.5至约15μg血清群W-135或Y的脑膜炎奈瑟氏球菌衍生多糖。

36.权利要求31的组合物，其中所述载体蛋白为白喉毒素或类毒素。

37.权利要求36的组合物，所述组合物进一步包含佐剂。

38.权利要求37的组合物，其中所述佐剂包括氢氧化铝、磷酸铝或其组合。

39.权利要求31的组合物，其中所述组合物包含磷酸钠、氯化钠或其组合。

40.免疫人类患者以对抗脑膜炎奈瑟氏球菌的方法，所述方法包括给予所述人类患者权利要求21-39的组合物。

41.权利要求40的方法，其中所述组合物包含白喉、破伤风、百日咳FHA、百日咳PT或PRP的抗原。

42.权利要求40的方法，其中所述权利要求21的组合物是第一组合物，在给予第一组合物后的6个月内给予第二组合物，所述第二组合物包含白喉、破伤风、百日咳FHA、百日咳PT或PRP的抗原。

43.权利要求42的方法，其中所述包含白喉、破伤风、百日咳FHA、百日咳PT或PRP的抗原的第二组合物在给予所述第一组合物后的3个月内给予人类患者。

44.权利要求43的方法，其中所述包含白喉、破伤风、百日咳FHA、百日咳PT或PRP的抗原的第二组合物与所述第一组合物的给予一起共同给予给予人类患者。

45.权利要求40的方法，其中所述人类患者在60岁以下。

46.权利要求45的方法，其中所述人类患者在35-60岁之间。

47.权利要求45的方法，其中所述人类患者在35-60岁之间。

48.权利要求45的方法，其中所述人类患者在18-35岁之间。

49.权利要求45的方法，其中所述人类患者在18-25步之间。

50.权利要求45的方法，其中所述人类患者在15-18岁之间。

51.权利要求45的方法，其中所述人类患者在10-15岁之间。

52.权利要求45的方法，其中所述人类患者在11岁以下。

53.权利要求45的方法，其中所述人类患者在2-10岁之间。

54.权利要求45的方法，其中所述人类患者在2岁以下。

55.权利要求45的方法，其中所述人类患者在6周龄至1岁之间。

56.权利要求21的组合物，其中所述荚膜多糖选自：A和W-135；Y和W-135、C和Y、C和W-135；A、C和Y，A、C和W-135，(7)C、Y和W-135，A、Y和W-135以及A、C、Y和W-135。

57.在人类患者中诱导抗脑膜炎球菌A的免疫应答的方法，其中所述方法包括给予所述人类患者含多糖-蛋白质缀合物的疫苗组合物，其中所述缀合物包含衍化至平均大小低于100,000道尔顿的0.5-15μg/ml脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A的荚膜多糖。

58.在人类患者中诱导抗脑膜炎球菌C的免疫应答的方法，其中所述方法包括给予所述人类患者含多糖-蛋白质缀合物的疫苗组合物，其中所述缀合物包含衍化至平均大小低于100,000道尔顿的0.5-15μg/ml脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C的荚膜多糖。

59.在人类患者中诱导抗脑膜炎球菌Y的免疫应答的方法，其中所述方法包括给予所述人类患者含多糖-蛋白质缀合物的疫苗组合物，其中所述缀合物包含衍化至平均大小低于100,000道尔顿的0.5-15μg/ml脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y的荚膜多糖。

60.在人类患者中诱导抗脑膜炎球菌W-135的免疫应答的方法，其中所述方法包括给予所述人类患者含多糖-蛋白质缀合物的疫苗组合物，其中所述缀合物包含衍生至平均大小低于100,000道尔顿的0.5-15μg/ml脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W-135的荚膜多糖。

61.权利要求57-60中任一项的方法，其中所述疫苗组合物不包含佐剂。

62.免疫人类患者以对抗脑膜炎奈瑟氏球菌的方法，所述方法包括给予含权利要求1-20的缀合物的疫苗组合物，由此和免疫前血清GMT或IgG效价相比，所述人类患者的血清GMT或IgG效价在接种的28天内增至4倍以上。

63.免疫人类患者以对抗脑膜炎奈瑟氏球菌的方法，所述方法包括给予含权利要求1-20的缀合物的疫苗组合物，由此和免疫前SBA-BR效价相比，所述人类患者在接种的20-40天内具有1∶32或更高的血清SBA-BR效价。

64.免疫人类患者以对抗脑膜炎奈瑟氏球菌的方法，所述方法包括给予含权利要求1-20的缀合物的疫苗组合物，由此和免疫前SBA-BR效价相比，所述人类患者在接种的20-40天内具有1∶64或更高的血清SBA-BR效价。

65.免疫人类患者以对抗脑膜炎奈瑟氏球菌的方法，所述方法包括给予含权利要求1-20的缀合物的疫苗组合物，由此和免疫前SBA-BR效价相比，所述人类患者在接种的20-40天内具有1∶128或更高的血清SBA-BR效价。

66.免疫人类患者以对抗脑膜炎奈瑟氏球菌的方法，所述方法包括与一种或多种非脑膜炎球菌疫苗一起共同给予所述人类患者权利要求21-39的组合物。

67.权利要求66的方法，其中所述非脑膜炎球菌疫苗包含抗伤寒疾病的疫苗。

68.权利要求67的方法，其中所述抗伤寒疾病的疫苗为TyphimVi_。

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