CN103764160A - 流感病毒血凝素试验 - Google Patents

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Abstract

超滤和HPLC联用于分析流感病毒。该组合可定量血凝素(HA)并与单径向免疫扩散(SRID)结果良好相关，但其实施可不用等待免疫化学SRID的延迟。

Description

流感病毒血凝素试验
本专利申请要求2009年5月29日提交的美国临时专利申请61/217,405号的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。
技术领域
本发明涉及流感病毒血凝素如分析疫苗的试验领域。
背景技术
灭活流感疫苗中血凝素(HA)含量的标准试验是基于单径向免疫扩散(“SRID”)[1，2]，WHO在1978年建议用其替代基于红细胞凝集的试验。尽管所述SRID试验已良好建立，但其进行缓慢、动态范围差、具有显著易变性，且制备所需特异性抗HA血清然后校准该血清需要很长时间。因此人们已寻找定量流感HA的非SRID试验。
已使用的一种方法是反相高效液相色谱(RP-HPLC)。例如，参考文献3公开了一种方法，所述方法中HA在烷基化以保护其巯基团的去污剂存在下还原，并用于RP-HPLC柱，然后用有机移动相中的离子配对试剂洗脱。本发明人抱怨之前用于流感抗原纯化的RP-HPLC方法中感兴趣的蛋白质峰值的分辨力低，造成回收率低且不能定量。但通过增加洗脱温度到50-70℃，其能增加流感HA的RP-HPLC的回收率和可重复性。本方法的其它细节在参考文献4中公开。也可参见参考文献5，包括大流行毒株的工作。
将尺寸排阻HPLC与RP-HPLC偶联的2D-HPLC也用于表征流感疫苗组分[6]。本方法能定量HA而不用于甲醛处理的抗原。该处理不可逆地交联HA，因此不确定所述2D-HPLC方法是否适于检测大批灭活疫苗抗原。
尺寸排阻HPLC自身也用于灭活裂解疫苗的HA检测和定量，包括大流行毒株[7]。
定量HA的SRID试验仍然需要进一步的和改善的替代方案。
发明内容
本发明使用超滤(UF)和RP-HPLC的组合来分析流感HA。这两种技术的组合能定量HA且在测定疫苗激发有功能抗体的能力上可能比SRID更可靠。此外，其可不用等待免疫化学SRID试剂的延迟而进行，但能很好地与SRID结果相关联。
SRID的一个优点是其能区分两种形式的HA：检测免疫活性HA而不检测免疫失活的HA(变性/聚集/错误折叠)。因此SRID主要测量疫苗中“有用”的HA。但由于HPLC是变性技术，没有这种优点，且之前定量流感HA的基于HPLC的方法不能区分所述两种形式的HA。因此之前基于HPLC的方法可能过高估计“有用的”HA的含量，使疫苗具有低于预期的免疫活性。为了解决这种劣势，可用UF步骤移除变性/聚集的HA，然后用RP-HPLC纯化、检测、分析和/或定量所剩的HA。
因此，本发明提供纯化样品中流感病毒HA的方法，其包括以下步骤：(i)超滤所述样品获得滤液；和(ii)对所述滤液进行RP-HPLC以从其中任何其他组分中分离其中任何HA。然后可检测步骤(ii)中所分离的HA，且该检测可定量，因此可计算所述初始样品中的活性HA量。所述计算后，可稀释所述样品(或更通常为获取所述样品的大批材料)以产生含所需HA浓度的材料。所述材料可用于疫苗制造。
本发明还提供在用RP-HPLC纯化样品中流感病毒HA的过程中，由RP-HPLC前对样品进行超滤所组成的改进。
本发明还提供含流感HA的大批抗原，其中所述大批材料的样品已用本发明的方法分析。
与参考文献3-5的方法相比，本发明不需要巯基衍生步骤且不需要高洗脱温度。这些特性之一或二者可按需(如，高洗脱温度可能有用)与本发明一起使用，但其并不必需。
超滤
UF是一种膜过滤技术，其中流体静压迫使液体对抗半透性膜。悬浮固体和高分子量溶质保留，而水和低分子量溶质可穿过所述膜。UF膜的分子量截止值(MWCO)确定了哪种溶质能穿过所述膜(即进入滤液)和哪种溶质保留(即留在滞留物中)。
对于本发明，所选膜保留任何变性/聚集HA而允许任何活性HA穿过。300kDa截止值适宜于该分离，但也可使用其他截止值。流感HA糖蛋白作为单体时约为75kDa，但这些集合在病毒颗粒中作为同源三体时约为230kDa。精确的分子量根据病毒株和糖蛋白而不同，但能容易地选出UF膜截止值以使所需单体和/或三体能穿过而保留较高分子量的聚集体。若要纯化HA片段(见下)，则所述截止值可相应降低。
UF可以各种形式操作如交叉流(切向流；TFUF)或正常流(端闭)。尽管可使用任一形式，但正常流更适宜于本发明分析方法。可使用离心管中的UF膜(如离心UF浓缩器)。
可获得各种UF膜类型，如缠绕螺旋模块(大的连续层膜和围绕管卷起的支持材料)、管膜(样品流过孔且滤液穿出进入管状外壳)、中空纤维膜(样品流过纤维开孔且滤液收集在围绕所述纤维的筒区域)、和垂直膜(样品装载入管且流过垂直的膜，进入基本平行于所述管长轴的平面)。可使用任何这些膜排列。UF可在压力下进行。通常通过泵送给所述样品加压而所述滤液留在常压下。
UF膜中使用各种材料。本方法可方便地使用聚醚砜膜。
RP-HPLC
UF从所述初始样品中移除变性/聚集HA，而活性HA穿入所述滤液。然后该滤液进行RP-HPLC以从所述滤液的任何其他蛋白中分离所述HA(如从其他流感病毒抗原，或从非流感蛋白)。该分离产生所述HA纯化且所述纯化的材料可进行分析如其可定量。
HPLC是在色谱柱(静止相)中应用液体(移动相，如溶剂)的一种色谱形式，保留在柱上取决于静止相和样品中存在组分之间的相互作用。泵将所述液相移动穿过所述柱且随着条件改变，不同分子可在不同时间从所述柱洗脱出来。RP-HPLC具有非极性静止相和水性中度急性移动相。RP-HPLC的保留时间通常可通过增加所述移动相中水的比例(因此使疏水分析物对疏水静止相的亲合力比所述当前更亲水的移动相更强)而增加；相反其可通过增加非极性或较低极性有机溶剂(如甲醇、乙腈)的比例而降低。
所述RP-HPLC阶段从其他蛋白中分离所述UF处理样品中的任何HA。因此选择RP-HPLC柱和洗脱条件以使所述HA可从这些其他蛋白中分辨出来。从例如参考文献4中已知RP-HPLC实现所述分辨的能力。
有多种形式的RP-HPLC。本发明适于在具有
Figure BDA0000130431890000041
孔径的10μm聚苯乙烯二乙烯基苯(PSDVB)颗粒柱中进行，但也可使用其他支持材料(如其他疏水聚合物，如与二氧化硅中硅烷醇基共价结合的十八烷基、癸基或丁基的n-烷基疏水链)、颗粒大小(如3-50μm)和孔径(如
Figure BDA0000130431890000042
)，且PSDVB的特性可通过在共聚合或β-衍生期间(磺基乙酰化作用)改变PS和DVB比而改变。合适的RP-HPLC支持物可容易地基于其保留和洗脱HA的能力和从样品中存在的其他材料中分离HA的能力而选择。可使用的支持物含具有两种级别孔的珠：能通过颗粒自身产生对流的大“穿透孔”，快速携带样品分子到短“扩散”孔内部。这种孔排列降低了发生扩散所需的距离并减少了样品分子与结合位点相互作用所需的时间。因此扩散可为非限制性的且流速可增加(如1000-5000cm/小时)而不影响分辨力或能力。
可用各种洗脱缓冲液如使用乙腈梯度。可在0.1-5ml/分钟之间容易地选择合适的流速(如0.5和1.5ml/分钟，或约0.8ml/分钟)。可在室温下进行洗脱但如参考文献3所述，在50-70℃范围洗脱是有用的，如55-65℃或约60℃。
可监控RP-HPLC洗脱(如约214nm处UV吸收，或使用约290nm激发和约335nm发射的固有荧光)以检测所述UF处理样品中的任何HA。HPLC洗脱色谱上的HA峰下的面积可用于定量所述HA。因此本方法可计算所述UF处理样品中的HA含量，且因而可计算所述UF前样品中的活性HA含量。通过使用已知体积的样品，由这些方法测量的HA含量能用于计算获取所述样品的初始材料如大批抗原制品或个体疫苗剂量中的HA浓度。UF滤液可直接加入RP-HPLC(如直通设置(in-line setup)中)或可收集然后单独导入。在一些实施方式中，所述滤液在RP-HPLC前处理。例如，参考文献3在RP-HPLC前进行烷基化步骤，且该步骤可与本发明一起进行，尽管其不是必需的(且因此不优选)。UF和RP-HPLC之间的有用步骤为用去污剂处理所述滤液。加入去污剂能溶解任何非单体滤液HA如脂双层中的玫瑰花结形式。由于该原因，所述去污剂处理在UF后但RP-HPLC前进行，因为UF前处理能溶解非天然HA(变性/聚集)，这使其能穿透所述UF滤器且因此误导结果。
合适的溶解去污剂可为离子、非离子或两性离子型，且包括但不限于：脱氧胆酸盐；三正丁基磷酸酯；溴化十六烷基三甲基铵；Tergitol(乙氧基壬基酚)NP9；烷基糖苷；烷基硫苷；酰基糖；磺基甜菜碱；甜菜碱；聚氧乙烯烷基醚；N，N-二烷基-葡糖酰胺；Hecameg(6-O-(N-庚甲酰)甲基葡萄糖苷)；烷基-苯氧基-聚乙氧基乙醇；肌氨酰；十四烷基三甲铵盐；脂质体转染试剂；脂质体转染胺试剂(lipofectamine)；和DOT-MA；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通(Triton)表面活性剂；如曲通X100或曲通N101)；聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(吐温(Tween)表面活性剂，如聚山梨酯80)；聚氧乙烯酯；聚氧乙烯醚；两性‘Zwittergent’去污剂如‘Zwittergent 3-14’TM(n-十四烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸酯；CAS14933-09-6；‘TDAPS’)；亚烷基二醇单十二烷基酯，如八乙二醇单十二烷基酯(‘C12E8’)；等。这些加入的水平高至足以溶解HA(如至多5％(v/v)，但通常为1％)但没有高到干扰随后的分析。感兴趣的两种具体去污剂为Zwittergent 3-14TM和C12E8。例如，用1％的Zwittergent(两性去污剂)室温处理30分钟提供良好的分析结果。
样品
进行UF和RP-HPLC的样品含有(或至少疑似含有)流感病毒HA。SRID常用在含来自数种毒株HA的材料上(如三价材料)。本发明可使用多价材料但不能从各毒株中分离定量抗原，除非所述不同HA能被HPLC柱分辨。尽管在一些情况下，不必要知道各毒株的作用已足够定量多价混合物中的总HA。但通常，样品含仅来自一种流感病毒株的HA，即其为单价。
本发明可使用各种类型样品。其可用于分析最终疫苗，但由于所述分析方法具有破坏性，所以这通常为同批次单一疫苗，分析结果表明所述批次的性质。所述样品可取自大批疫苗材料，分析结果表明所述大批整体性质。在其他实施方式中，所述样品甚至可为含病毒液体，如其可为来自细胞培养物或来自鸡蛋的含病毒收获液。因此所述样品可为起始材料、最终疫苗材料、或病毒培养物和最终疫苗之间的任何生产中间物。所述样品通常包括来自流感病毒颗粒的HA，但作为替代，其也可以包含在重组宿主中(例如用杆状病毒载体的昆虫细胞系中)表达并纯化的HA[8，9，10]，或以病毒样颗粒形式(VLP；例如见参考文献11和12)。但通常，抗原会来自病毒颗粒且因此所述样品除了HA还包括其他流感病毒蛋白(如PB1、PB2、PA、NP、NA、M1、M2、NS1和/或NS2蛋白)，且也可包括流感病毒液体。
病毒颗粒衍生的流感病毒抗原是基于活病毒或灭活病毒(例如参见参考文献13的第17和18章)。尽管本发明可用于测量活病毒的HA水平，但活疫苗的剂量是基于组织培养感染剂量中值而不是HA含量，且因此本发明通常用于测定灭活材料中的HA水平。灭活疫苗可基于全病毒颗粒、‘裂解’病毒颗粒、纯化表面抗原(包括HA且通常也包括神经氨酸酶)或病毒体(无核酸的病毒样脂质体颗粒[14])。本发明可使用所有这种疫苗。BEGRIV ACTM、FLUARIXTM、PREPANDRIXTM、FLUZONETM和FLUSHIELDTM产品是裂解疫苗。FLUVIRINTM、AGRIPPALTM、FLUADTM和INFLUVACTM产品是表面抗原疫苗。INFLEXAL VTM和INVAV ACTM产品是病毒体疫苗。本发明对测量裂解和表面抗原疫苗中的HA含量最有用。
本发明可使用来自任何流感病毒类型的HA，包括A型流感病毒和B型流感病毒。
对于A型流感病毒，本发明使用来自任何已知HA亚型的HA(H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16)，且H1、H3和H5毒株特别有用。所述毒株可具有任何NA亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9。例如，本发明可用于分析来自H1N1毒株、H3N2毒株、H5N1毒株等的材料。本发明对H1毒株特别有用，且在一些实施方式中所述毒株为具有与SEQ ID NO：1(A/加利福尼亚/04/2009的HA1)较SEQ ID NO：2(A/智利/1/1983的HA1)更密切相关的HA的H1毒株(如H1N1毒株)，即使用相同比对算法和参数下，其与SEQ ID NO：1比较时的序列相同性高于SEQ ID NO：2。在另一些实施方式中，H1HA与SEQ ID NO：2较SEQ ID NO：1更密切相关。
对于B型流感病毒，本发明可使用源自B/维多利亚/2/87样毒株或B/山方/16/88样毒株的HA。通常可从抗原性区分这两组毒株，但氨基酸序列的差异也可以区分这两种谱系，例如B/山方/16/88样毒株常常(但并非总是)具有氨基酸残基164缺失(相对‘Lee40’HA序列进行编号)的HA蛋白[15]。
本发明方法分析的HA可为全长前体HA，称为HA0。然而在一些实施方式中，所述HA为HA0的片段。HA0可被丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶切断以产生N末端片段(HA1)和C末端片段(HA2)，其仍可通过二硫桥连接。因此本发明方法可纯化HA0、HA1或HA2，且可包括仅一种该片段(如HA1)的检测和分析。可纯化并分析的其他HA片段包括例如菠罗蛋白酶处理释放的片段，或获自用菠萝蛋白酶和胰蛋白酶共同处理的片段。通常本方法纯化HA1，且因此至少需在还原条件下(如用DTT)进行RP-HPLC步骤以确保分离HA1和HA2，并且任选地可包括纯化前的消化步骤(如用胰蛋白酶)以确保HA1完全从HA2上切离(但该消化通常不必需，且可容易地检测任何全长HA0的存在以确定消化是否有用)。参考文献4报道通过RP-HPLC将HA1从HA2和其他疫苗组分中很好地分离。
样品中的HA可包括HA1/HA2切割位点周围的超碱性区域(hyper-basicregion)，但其他实施方式中该区域缺失。
样品中的HA可对具有Sia(α2，6)Gal末端二糖的寡糖较具有Sia(α2，3)Gal末端二糖的寡糖有结合偏好，或反之亦然，或其可显示出无此偏好。该偏好的试验在参考文献16中讨论。人流感病毒结合具有Sia(α-2，6)Gal末端二糖(经α-2，6连接至半乳糖的唾液酸)的受体寡糖，而蛋和Vero细胞具有含Sia(α2，3)Gal末端二糖的受体寡糖。
在一些实施方式中，HA与鸡蛋衍生的病毒具有不同的糖基化模式。因此，所述HA可包含鸡蛋中未见的糖形。有用的HA包括犬糖形如所述病毒可生长在MDCK细胞中。其他有用的HA包括人糖形如所述病毒可生长在PER.C6细胞中。其他有用的HA包括猿糖形如所述病毒可生长在Vero细胞中。这些细胞系可由各种来源获得，例如美国典型细胞培养物保藏中心(ATCC)、Coriell细胞库、或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供各种不同Vero细胞，目录号为CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586和CRL-1587；并提供MDCK细胞，目录号为CCL-34。PER.C6可获自ECACC，保藏号为96022940。一种合适的MDCK细胞系是‘MDCK 33016’，保藏号DSM ACC 2219[17]。
样品中HA可来自野生型病毒或来自重组病毒，特别是对于A型流感病毒。可通过反向遗传学技术获得重配病毒。因此样品可包括来自一种病毒株的HA但来自不同毒株如来自A/PR/8/34、A/AA/6/60或A/WSN/33的其他流感抗原(如PB1、PB2、PA、NP、M1、M2、NS1和/或NS2蛋白)。
样品中的HA浓度通常为0.1μg/ml-10mg/ml，如1μg/ml-1mg/ml或10μg/ml-100μg/ml。在一些实施方式中，所述浓度为约30μg/ml、约15μg/ml或约7.5μg/ml。所述样品可包括血清组分但优选不含该组分。
所述样品可包括卵蛋白(如卵白蛋白和卵类粘蛋白)和/或鸡DNA，但在一些实施方式中不含这些组分如当病毒生长在细胞培养物中时。
所述样品可包括DNA如鸡DNA或哺乳动物DNA(如衍生自MDCK细胞、Vero细胞、PER.C6细胞等)。但理想地，样品含少于600ngDNA/mg HA(优选少于60ng，且更优选少于6ng)。
所述样品优选不包括除流感病毒蛋白外的病毒蛋白。
所述样品可包含去污剂，如聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(称为′吐温′，例如聚山梨醇酯80)、辛苯聚糖(如辛苯聚糖-9(曲通X-100)或-10、或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、溴化十六烷基三甲铵(′CTAB′)或脱氧胆酸钠，特别用于裂解或表面抗原疫苗样品。去污剂可仅以痕量存在，如从抗原制造中残留。其它痕量的样品组分可以是抗生素(如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。
下游步骤
本发明方法可测量感兴趣材料中的HA浓度。然后该材料，特别是大批疫苗，可稀释以产生所需的最终HA浓度。
因此本发明方法可包括基于HA纯化的结果稀释疫苗的其他步骤，且本发明提供分析疫苗的方法，包括步骤：(a)用本文公开的方法纯化疫苗中或其样品中的HA；和(b)用步骤(a)的结果计算所述疫苗中所述HA浓度。本发明还提供了提供具有所需HA浓度的大批疫苗的方法，包括所述步骤(a)和(b)，和其他步骤(c)：用步骤(b)的结果稀释所述大批疫苗以产生所需的HA浓度。然后可提取稀释的大批疫苗的单位剂量，且因此本发明提供了将疫苗用于患者的方法，包括所述步骤(a)-(c)，和其他步骤(d)：从所述稀释的批料中提取一或多单位剂量的疫苗，各单位剂量具有所需的HA含量。所述提取的材料可置于容器如瓶子或注射器中。稀释的批料可在单位剂量提取前与其他组分如佐剂混合。因此本发明提供用于产生大批加佐剂疫苗的方法，包括所述步骤(a)-(c)，和其他步骤(d)：将该稀释的大批疫苗与佐剂混合。本发明还提供了将加佐剂疫苗用于患者的方法，包括所述步骤(a)-(d)，和其他步骤(e)：从所述稀释的批料中提取一或多单位剂量的疫苗，各单位剂量具有所需的HA含量。所述提取的材料可置于容器如瓶子或注射器中。
作为将提取剂量与佐剂混合的替代，所述提取剂量也可包装为结合第二药盒组分的第一药盒组分，其中所述第二药盒组分为疫苗佐剂。可在使用时结合两种药盒组分，得到加佐剂的疫苗。该药盒可将佐剂和抗原单独保存直到使用(如在PREPANDRIXTM产品中)。在药盒中，这些组分在物理上相互分离，这种分离可通过多种方式实现。例如，这两种组分可以装在两个不同的容器，如药瓶中。然后可通过(例如)取出一个药瓶的内含物并将其加入另一个药瓶，或者分别取出两个药瓶的内含物并在第三个容器中将它们混合在一起，来混合两个药瓶的内含物。在一种配置中，药盒的一种组分在注射器中，另一种组分在容器如药瓶中。可使用该注射器(例如装有针头的注射器)将其内含物注入第二个容器中混合，然后将该混合物抽回注射器中。然后，一般通过新的无菌针头将该注射器中的混合成分给予患者。将一种组分包装到注射器中无需用单独注射器对患者给药。在另一配置中，这两种药盒组分在同一注射器如双室注射器中但分开保存[18]。当注射器致动时(例如给予患者时)，将这两室中的内含物混合。这种配置在使用时无需单独的混合步骤。
无论抗原和佐剂是在制造中还是递送给患者时混合，抗原通常为水性且因此所述混合步骤包括混合两种液体。所述两种液体的混合体积比可变(例如5∶1-1∶5)，但通常约为1∶1。因此两种药盒组分可含体积彼此基本相同的液体。
佐剂可提高在接受该组合物的患者中引发的免疫应答(体液和/或细胞)。用于此目的的佐剂通常为水包油乳液。已知各种合适的乳液，其通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是生物可降解(可代谢)和生物相容的。乳液中的油滴直径通常小于5μm，优选乳液包含具有亚微米直径的油滴，这种小尺寸通过微流化床实现以提供稳定乳液。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。
所述乳液可以包含来自动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的代表例子。也可使用获自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。尽管甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯不是种籽油中天然产生的，也可以从坚果和种籽油开始，通过对合适的原料进行水解、分离和酯化而制备。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程在本领域熟知。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和如鲸蜡的鲸油是可以用于本发明的几种鱼油的代表例子。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，它们总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为鲨烯的支链不饱和萜类化合物，即2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯。其它优选油是生育酚，包括DL-α-生育酚。特别优选包含角鲨烯的乳液。可以使用油的混合物。
可通过‘HLB’(亲水/亲脂平衡)对表面活性剂分类。本发明优选的表面活性剂的HLB为至少10，优选至少15，更优选至少16。合适的表面活性剂的例子包括但不局限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWF AXTM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；以及去水山梨糖醇酯(通常称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液中包含的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯；聚山梨酯80)、司盘85(去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。优选包含聚山梨酯80。
可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的组合也适合。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚-9和聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。
优选的表面活性剂的含量(重量％)为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1％，特定是约0.1％；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1％，特定是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，特定是0.1-1％或约0.5％。
可用于本发明的特定水包油乳液佐剂包括但不限于：
●鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约5％鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例为4.3％鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％司盘85。该佐剂称为‘MF59’[19-21]，更详细的描述见参考文献22第10章和参考文献23第12章。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。
●包含鲨烯、α-生育酚和聚山梨酯80的乳液。这些乳液可含有2-10％鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，鲨烯∶生育酚的重量比优选≤1(例如0.90)，因为这能使乳液更稳定。鲨烯和吐温80的体积比可以约为5∶2，或者重量比约为11∶5。可通过下述方法制备一种这样的乳液：将吐温80溶解于PBS得到2％溶液，然后将90ml该溶液与(5g DL-α-生育酚和5ml鲨烯)的混合物混合，然后使该混合物微流体化。得到的乳液可含有(如)平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。
●鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。所述乳液还可包含3d-MPL(见下)。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。
●含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如α-生育酚琥珀酸盐)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75∶11∶10(如750μg/ml聚山梨酯80，110μg/ml曲通X-100和100μg/mlα-生育酚琥珀酸盐)，这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。所述乳液还可包含鲨烯。所述乳液还可包含3d-MPL(见下)。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。
●鲨烯、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(″PluronicTM L121″)的乳液。所述乳液可用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水配制。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽的递送载体，已与苏氨酰-MDP一起使用，例如″SAF-I″佐剂(0.05-1％Thr-MDP、5％鲨烯、2.5％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)[24]。也可不与Thr-MDP一起使用，如“AF”佐剂中[25](5％鲨烯、1.25％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)。优选微流体化。
●含有鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或其中至少90％油滴(以体积计)的尺寸小于200nm[26]。该乳液也可含有以下一种或多种物质：糖醇；低温保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基多糖苷。这类乳液可冻干。
●含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献27所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。
●不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，如参考文献28所述)、二甲基双十八烷基溴化铵和/或N，N-双十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。
●包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[29]。
●包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[29]。
●皂苷(例如QuilA或QS21)和固醇(例如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[30]。
由于灭活的流感疫苗根据其HA水平标准化，所以疫苗中测量HA含量和稀释大批疫苗到所需HA含量的重要性上升。目前疫苗一般含有约30μg HA/株，尽管例如儿童使用时，或者在大流行情况下，也可采用较低剂量。已使用过部分剂量，例如1/2(即15μg/ml HA，如FOCETRIATM中)、1/4(即7.5μg/ml，如给药时的PREPANDRIXTM中)和1/8[31，32]，以及更高的剂量(例如3x或9x剂量[33，34])。因此可进行稀释以产生每种流感病毒株0.1-200μg/ml的HA浓度，优选1-150μg/ml如1-90μg/ml、1-20μgml、0.1-15μg/ml、0.1-10μg/ml、0.1-7.5μg/ml、0.5-5μg/ml、3.75-15μg/ml等。具体的稀释后浓度包括例如约90μg/ml、约45μg/ml、约30μg/ml、约15μg/ml、约10μg/ml、约7.5μg/ml、约5μg/ml、约3.8μg/ml、约3.75μg/ml、约1.9μg/ml、约1.5μg/ml等。所述疫苗中存在佐剂时低浓度(例如＜30μg/ml)最有用。虽然在一些研究中使用过高达180μg/ml的浓度(例如参考文献35)，本发明的组合物通常含有≤30μg/ml的HA浓度。
药物组合物
用于给予患者的含HA的组合物药学上可接受。除HA和任选的佐剂外，它们通常还包含其它组分，例如它们一般包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。对这类组分的充分讨论参见参考文献36。
药物组合物通常以水性形式(如用于注射)但也可使用固体剂型，且已知其用于流感疫苗接种。
药物组合物可含有防腐剂如硫柳汞(例如10μg/ml)或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本不含(即小于5μg/ml)含汞物质，如不含硫柳汞[37]。更优选无汞的疫苗。特别优选不含防腐剂的疫苗。
为了控制张力，水性药物组合物可包含生理盐如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其浓度可为1-20mg/ml。可以存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。
水性药物组合物的渗透压通常为200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选为240-360mOsm/kg，更优选为290-310mOsm/kg。虽然以前报道过渗透压对疫苗接种引起的疼痛无影响[38]，但优选将渗透压保持在此范围内。
药物组合物可含有一种或多种缓冲剂。缓冲剂一般包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸缓冲剂。包含的缓冲剂的浓度一般是5-20mM。缓冲剂可以在乳液水相内。
药物组合物的pH通常为5.0-8.1，更常为6.0-8.0例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。因此，本发明方法可包括在剂量提取或包装前调整批料的pH的步骤。
药物组合物优选无菌。药物组合物优选不含谷蛋白。
优选的药物组合物具有低内毒素含量，例如低于1IU/ml，优选低于0.5IU/ml。内毒素测量的国际单位是公知的，且可简单通过例如与国际标准[39，40]，如来自NIBBC的第2次国际标准(编码94/580-IS)比较来计算样品的内毒素。从在鸡蛋中生长的病毒制备的现有疫苗的内毒素水平为0.5-5IU/ml。
药物组合物可不含抗生素(例如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。
药物组合物可包含用于单一免疫的材料或可包含用于多重免疫的材料(即‘多剂量’组合物，其中提取的单位剂量含有用于多于一个患者剂量的足够材料)。多剂量配置通常在疫苗中包含防腐剂。为了避免这种需要，疫苗可装在具有用于除去物质的无菌适配器的容器中。
流感病毒通常以约0.5ml的剂量体积通过肌肉注射施用，尽管可对儿童施用半剂量(即约0.25ml)，且因此可选择单位剂量例如对单一病人施用0.5ml剂量的单位剂量。可使用较低的药剂体积，例如0.1ml体积用于肌肉注射。
组合物或药盒组分的包装
本发明的方法可包括将疫苗置于容器中的步骤，特别是置于为医师使用配制的容器中。该步骤通常包括从批料中提取物质和将其注入容器中。
水性疫苗的合适容器包括药瓶、鼻喷雾剂和一次性注射器，其应是无菌的。
组合物/组分装在药瓶中时，药瓶优选由玻璃或塑料材料制成。在将组合物加入药瓶之前，优选对其进行灭菌。为了避免对胶乳过敏患者可能产生的问题，药瓶可用无胶乳塞子密封，且优选所有包装材料均不含胶乳。药瓶可包括单一剂量的疫苗，或者可以包括一个以上剂量(′多剂量′药瓶)，如10个剂量。优选的药瓶由无色玻璃制成。
药瓶可以有适合的帽(如鲁尔锁)，以便将注射器插入其中。药瓶，特别是多剂量药瓶可装有允许无菌地取出其内含物的瓶帽。
某组合物/组分包装到注射器中时，该注射器可连有针头。如果未连接针头，可随注射器提供单独的针头以便组装和使用。这种针头可装在护罩中。优选安全性针头。一般是1-英寸23号、1-英寸25号和5/8-英寸25号针头。可提供有剥离标签的注射器，该标签上可打印上内含物的批号、流感季节和过期日期，以帮助记录保存。注射器的活塞优选带有防脱装置，以防止活塞在吸出时偶然脱出。注射器可以有胶乳橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注射器通常带有顶帽，以在连接针头前密封顶端，所述顶帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，则针头优选装有丁基橡胶护罩。有用的注射器是以商品名″Tip-Lok″TM销售的注射器。其他有用的注射器包括那些适于皮内给药的如具有约1.5mm长针头的微注射设备。
容器可标注有半剂量体积，以例如利于递送给儿童。例如，含有0.5ml剂量的注射器可标有0.25ml体积的标记。采用玻璃容器(如注射器或药瓶)时，优选采用由硼硅酸盐玻璃，而非钠钙玻璃制成的容器。
可将组合物与单页宣传品合并在一起(如在同一个盒子中)，所述单页宣传品包括疫苗的详细情况如给药说明书、疫苗内所含抗原的详情等。说明书也可包含警告，(例如)准备好肾上腺素溶液以应对疫苗接种后发生过敏反应的情况等。
治疗方法和所述疫苗给予
本发明组合物适合给予动物如人，且本发明提供了在动物中产生免疫应答的方法，包括将本发明组合物给予患者的步骤。本发明还提供本发明的药盒或组合物用作药物，如在动物中引起免疫应答。本发明也提供本发明组合物在用于产生动物免疫应答的药物制造中的应用。
本发明的方法和应用引起的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。评价接种流感病毒疫苗后抗体应答、中和能力和保护水平的方法为本领域熟知。人类研究表明，对人流感病毒HA的抗体效价与保护作用相关联(约30-40的血清样品血凝反应-抑制效价对同源病毒感染产生约50％保护作用)[41]。一般通过血凝反应抑制、微量中和、单径向免疫扩散(SRID)和/或单径向溶血(SRH)来测定抗体应答。本领域熟知这些测定技术。
可以各种方式给予流感疫苗。最优选的免疫途径是肌肉内注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[42-44]、皮内[45，46]、口服[47]、经皮、透皮[48]等。皮内和鼻内途径很吸引人。皮内给药可能涉及微注射装置，例如具有约1.5mm长的针头。
可用按照本发明制备的疫苗治疗儿童和成年人。目前，推荐将流感疫苗用于年龄大于6个月的儿童和成年人免疫。因此，患者可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受该疫苗的优选患者是老年人(例如≥50岁、≥60岁，优选≥65岁)、年轻人(如≤5岁)、住院患者、健康护理工作人员、军队服务人员和军人、妊娠妇女、慢性疾病患者、免疫缺陷患者、在接受该疫苗前7天接受过抗病毒化合物(如奥塞米韦或扎那米韦化合物；见下)的患者、对鸡蛋过敏的人和出国旅行者。然而所述疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的人群。
本发明优选组合物满足1、2或3个CPMP功效标准。在成年人(18-60岁)中，这些标准是：(1)≥70％血清保护；(2)≥40％血清转化；和/或(3)GMT增加≥2.5倍。在老年人(＞60岁)中，这些标准是：(1)≥60％血清保护；(2)≥30％血清转化；和/或(3)GMT增加≥2倍。这些标准基于至少50位患者的开放标记研究。标准用于疫苗中的每一毒株。
可通过单剂量方案或多剂量方案进行治疗。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同途径给予各种剂量，例如采用胃肠道外初次免疫和粘膜加强免疫、粘膜初次免疫和胃肠道外加强免疫等。给予一个以上剂量(一般是两个剂量)特别可用于未曾免疫接触的患者，例如从未接受过流感疫苗的人，或者用于接种免疫抵抗新HA亚型。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。
可将本发明产生的疫苗与其它疫苗基本上同时(例如在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一用药咨询或就诊期间)给予患者，例如与麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的B型流感嗜血杆菌(H.influenzae)疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗、肺炎球菌偶联疫苗等同时给药。在老年患者中特别有用的是与肺炎球菌疫苗和/或脑膜炎球菌疫苗基本同时给药。
相似地，可将本发明疫苗与抗病毒化合物，具体是对流感病毒有活性的抗病毒化合物(如奥塞米韦和/或扎那米韦)基本上同时给予患者(在向健康护理专业人员进行的同一用药咨询或就诊期间)。
概述
术语“包含”涵盖“含有”以及“由……组成”，例如“包含”X的组合物可仅由X组成或可含有其它物质，例如X+Y。
词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。在必要时，词语“基本上”可从本发明的定义中省略。
与数值x相关的术语“约”是任选的并表示例如x±10％。上文使用“GI”编号。GI号码，或者“基因信息识别号”(GenInfo Identifier)是NCBI将序列加入其数据库时，连续对每一序列记录指定的一串数字。GI编号与序列记录登录号没有相似之处。序列更新(如纠正或加入更多注释或信息)后，将接受新GI编号。因此与给定GI编号相关的序列是不变的。
除非另有说明，包括混合两种或多种组分的步骤的过程不要求任何特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。在有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后可将合并的组分再与第三种组分混合等。将动物(特别是牛)材料用于培养细胞时，其应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，特别是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。总之，优选在完全不含动物来源材料的情况下培养细胞。
在将化合物作为组合物的一部分给予机体时，该化合物可被合适的前药所替代。
当细胞底物用于重组或反向遗传学方法时，优选批准用于人类疫苗生产的细胞底物，例如Ph Eur(《欧洲药典》)总纲5.2.3所述的细胞底物。
优选通过MPSRCH程序(牛津分子科技公司(Oxford Molecular))执行的Smith-Waterman同源性搜索算法，利用仿射缺口搜索测定多肽序列之间的相同性，其中参数为缺口开放罚分＝12、缺口延伸罚分＝1。
具体实施方式
RP-HPLC检测作为定量单价流感病毒抗原批料(“单批”)的流感HA的方法。发现当所述单批具有高特异纯度和稳定的HA时，RP-HPLC能良好定量HA，且所述定量结果严格匹配标准SRID结果。但在所述疫苗包含显著量的变性HA的情况下，RP-HPLC法不再匹配SRID试验。
例如，下表显示四种A/H3N2单批的结果。用BCA评估总蛋白浓度(μg/ml)，然后用SRID(标准实验方案)和RP-HPLC分析HA浓度(μg/ml)。RP-HPLC在2.1mm x 100mm的PorosTM Rl/10柱上进行，以60℃和0.8ml/分钟的流速操作。所述移动相为：(A)溶于水的0.1％TFA，5％乙腈；和(B)溶于100％乙腈的0.1％TFA(溶剂B)，6.5分钟内将A/B混合物由20％/80％变为0％/100％。
RP-HPLC前，所述单批中的HA已被切为HA1和HA2并加入DTT(终浓度24mM，然后90℃加热10分钟)确保这些被分离开。样品用PBS稀释到校准范围。所述方法用NIBSC的HA参比样品(未过滤)校准。
RP-HPLC可容易地分辨所述HA1峰且因而用于定量。结果如下：
  单批   总蛋白   HA(SRID) HA(HPLC)
  A   1256   336 358
  B   645   192 266
  C   728   134 298
  D   830   68 302
因此单批A的HPLC与SRID较好一致，但B、C或D不如此。发现这三种单批质量较差。因此需改进RP-HPLC法使其产生与所述单批质量无关的良好结果。
引入使用超滤的HPLC前处理步骤。发现具有PES膜的500μl体积VivaSpinTM300kD MWCO旋转柱能捕获单批中聚集的HA且所述滤液易用RP-HPLC分析以产生与SRID良好一致的结果。
所述超滤前，稀释样品(若需要)以使蛋白浓度＜100μg/ml。所述超滤和RP-HPLC步骤之间，所述滤液与终浓度为1％的Zwittergent(9份滤液+1份10％的Zwittergent 10％)室温孵育30分钟。如前进行RP-HPLC。
下表显示SRID或有UF预处理步骤的RP-HPLC测量的HA含量，与没有所述UF步骤测量的HA含量作比较：
因此所述UF预处理步骤使RP-HPLC结果与SRID结果基本一致。
初步实验也用A/H1N1毒株进行。尽管所述方法能成功纯化HA1且所述UF预处理移除聚集物，但RP-HPLC测量的抗原含量不能与SRID很好地相关。但当测量所述相关抗原标准时，其含量与其参考值差异＞2倍。因此所述抗原标准似乎有缺陷且因此这些实验的结果是不可靠的。
总之，RP-HPLC系统地过高估计HA含量，特别是在具有显著量变性HA的单批中。但UF预处理步骤后，所述值与SRID非常一致。
应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可对之进行修改而仍在本发明的范围和精神内。
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Figure IDA0000130431930000021
Figure IDA0000130431930000031

Claims (24)

1.一种纯化样品中流感病毒HA的方法，所述方法包括步骤：(i)超滤所述样品获得滤液；和(ii)对所述滤液进行RP-HPLC以从其中任何其他组分中分离其中任何HA。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(i)使用具有300kDa截止值的超滤膜。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(ii)使用具有
Figure FDA0000130431880000011
孔径的聚苯乙烯二乙烯基苯颗粒的RP-HPLC支持物。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品含仅来自一种流感病毒株的HA。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述HA包括A型流感病毒HA。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述HA为H1、H3或H5HA。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述HA包括B型流感病毒HA。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品中的HA来自流感病毒颗粒。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品包括(i)流感病毒HA和(ii)流感病毒抗原PB1、PB2、PA、NP、NA、M1、M2、NS1和/或NS2。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品包含完整流感病毒颗粒。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品包含裂解流感病毒颗粒。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品包含来自流感病毒颗粒的纯化表面抗原。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述HA为HA1。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品不含(i)血清组分，(ii)卵蛋白，和/或(iii)鸡DNA。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品除了流感病毒蛋白外不包含病毒蛋白。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品包含去污剂。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品为大批疫苗。
18.一种分析疫苗的方法，所述方法包括步骤：(a)用前述权利要求任一项所述的方法纯化疫苗中或其样品中的HA；和(b)用步骤(a)的结果计算所述疫苗中的所述HA浓度。
19.一种提供具有所需HA浓度的大批疫苗的方法，所述方法包括步骤：(a)用权利要求16所述的方法纯化疫苗中或其样品中的HA；和(b)用步骤(a)的结果计算所述大批疫苗中的所述HA浓度；和(c)用步骤(b)的结果稀释所述大批疫苗以产生所需的HA浓度。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述需要的HA浓度为1-150μg/ml如90μg/ml、45μg/ml、30μg/ml、15μg/ml、10μg/ml、7.5μg/ml、5μg/ml、3.8μg/ml、3.75μg/ml、1.9μg/ml、或1.5μg/ml。
21.一种提供疫苗给患者使用的方法，所述方法包括步骤：用权利要求19或20所述的方法制备具有所需HA含量的大批疫苗；然后从所述稀释的批料中提取一或多单位剂量的疫苗。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述提取的单位剂量作为药盒组分与第二种药盒组分一起包装，其中所述第二种药盒组分为疫苗佐剂。
23.一种提供大批加佐剂疫苗的方法，所述方法包括步骤：用权利要求19或20所述的方法制备具有所需HA含量的大批疫苗；然后用佐剂混合所述稀释的大批疫苗。
24.一种提供加佐剂的疫苗给患者使用的方法，所述方法包括步骤：提供用权利要求23所述方法制备的大批加佐剂的疫苗；然后从所述批料中提取一或多单位剂量的疫苗。
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