KR20120030442A

KR20120030442A - 인플루엔자 바이러스 혈구응집소에 대한 분석

Info

Publication number: KR20120030442A
Application number: KR1020117030681A
Authority: KR
Inventors: 필립 도르미트제르; 잉시아 웬; 진 팔머; 파올라 리넬라; 핑 우
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2009-05-29
Filing date: 2010-05-28
Publication date: 2012-03-28
Also published as: WO2010136896A1; EA201171491A1; AU2010252661A1; AU2010252661B2; JP2015098479A; NZ596671A; HK1168795A1; JP2012528139A; JP5823379B2; CN103764160A; US20120237545A1; EP2435066A1; EP2435066B1; CA2763440A1

Abstract

초미세여과와 HPLC의 조합은 인플루엔자 바이러스를 분석하기 위해 사용된다. 이 조합은 혈구응집소(HA)를 정량화할 수 있고 일원방사면역확산법(SRID) 결과와 잘 관련되지만, 면역화학적 SRID 시약에 대한 기다림의 지연 없이 수행될 수 있다.

Description

인플루엔자 바이러스 혈구응집소에 대한 분석{ASSAYS FOR INFLUENZA VIRUS HEMAGGLUTININS}

이 특허 출원은 완전한 내용이 본원에 참고로써 포함되어 있는, 2009년 5월 29일 출원된 미국 가특허 출원 61/217,405으로부터 우선권을 주장한다.

본 발명은 인플루엔자 바이러스 혈구응집소에 대한 분석, 예를 들어 백신을 분석하기 위한 분야에 속한다.

불활성화된 인플루엔자 백신 내 혈구응집소(HA) 함량에 대한 표준 분석은, 적혈구의 응집반응에 기반한 시험을 대신하기 위해 1978년에 WHO에 의해 추천된 일원방사면역확산법(SRID; Single radial immunodiffusion assay)을 기반으로 한다[1,2].

SRID 분석이 잘 확립되었지만, 이것은 실행이 느리고, 불량한 다이나믹 레인지(dynamic range), 상당한 가변성을 가지며, 요구되는 특이적 항-HA 혈청을 준비한 다음 이 혈청을 조정하는(calibrate) 것에서 오랜 시간이 걸릴 수 있다. 따라서 사람들은 인플루엔자 HA를 정량화하기 위한 비-SRID 분석을 찾고 있었다.

한 접근은 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하였다. 예를 들어, 참고문헌 3은 HA가 세제의 존재하에서 환원되고, 알킬화되어 그것의 술프히드릴 기를 보호하고, RP-HPLC 컬럼에 적용된 다음, 유기 이동상에서 이온 짝짓기 약제(ion pairing agent)와 함께 용리된다는 것을 개시한다. 발명자들은 인플루엔자 항원 정제를 위한 이전의 RP-HPLC 방법이 관심의 단백질 피크의 불량한 해상도를 가지고, 낮은 회수를 제공하며, 정량적이지 않다는 것을 불평하였다. 그러나 50-70℃로 용리 온도를 증가시킴으로써, 그들은 인플루엔자 HA에 대한 RP-HPLC의 회수 및 재현성을 증가시킬 수 있었다. 이 방법은 참고문헌 4에서 더욱 상세하게 개시된다. 또한 유행성 균주에 의한 작업을 포함하는 참고문헌 5를 참조.

크기-배제 HPLC를 RP-HPLC와 결합하는 2D-HPLC는 인플루엔자 백신 구성성분을 특성화하기 위해 사용되었다[6]. 이 방법은 HA를 정량화할 수 있지만 포름알데히드-처리된 항원에서 수행되지 않았다. 이러한 처리는 HA를 비가역적으로 교차결합하고, 따라서 2D-HPLC 방법이 벌크 불활성화된 백신 항원을 시험하는데 적당한지 여부는 불확실하다.

크기-배제 HPLC 그 자제는 또한 유행성 균주를 위해 포함하는 불활성화된 분할 백신에서 HA 검출과 정량화를 위해 사용되었다[7].

HA를 정량하기 위한 SRID 분석에 대해 추가적이고 개선된 대안의 필요가 남아있다.

본 발명은 인플루엔자 HA를 분석하기 위한 초미세여과(UF)와 RP-HPLC의 조합을 사용한다. 이들 2 기술의 조합은 HA를 정량할 수 있고, 작용 항체들을 유발하는 백신을 능력을 결정하는 것에서 SRID보다 더 믿을 수 있다. 게다가, 면역화학적 SRID 시약에 대한 기다림을 지연시키지 않고 수행될 수 있지만, SRID 결과와 연관성이 있다.

SRID의 한 가지 이점은 그것이 HA의 두 가지 형태가 구별되도록 허용한다는 것이다: 면역학적으로-활성인 HA는 검출되는 반면, 면역학적으로-불활성인 HA(변성/응집/미스폴딩)는 그렇지 않다. 따라서, SRID는 주로 백신에서 "유용한" HA를 검출한다. 그러나 HPLC는 변성 기술이기 때문에, 이 장점은 없어지고, 인플루엔자 HA를 정량하기 위한 이전의 HPLC-기반 방법은 2형태의 HA 사이를 구별할 수 없었다. 따라서 이전의 HPLC-기반 방법은 기대보다 더 낮은 면역학적 활성을 가지는 백신을 제공하여, "유용한" HA의 함량을 과대평가할 수도 있었다. 이 단점을 처리하기 위해, UF 단계는 변성/응집된 HA를 제거하기 위해 사용될 수 있고, 그 다음에 RP-HPLC가 남아있는 HA를 정제, 검출, 분석 및/또는 정량화하기 위해 사용될 수 있다.

따라서 본 발명은 (i) 샘플의 초미세여과로 여과액을 제공하는 단계; 및 (ii) 여과액의 RP-HPLC로 그 안의 어떤 다른 성분들로부터 임의의 HA를 분리하는 단계를 포함하는, 샘플에서 인플루엔자 바이러스 HA를 정제하는 방법을 제공한다. 단계 (ii)에서 분리된 HA는 그 다음에 검출될 수 있으며, 이 검출은 정량적일 수 있고, 따라서 원래 샘플 내 활성 HA의 양의 계산을 허용할 수 있다. 이러한 계산 후, 샘플(또는 보통 샘플이 취해지는 벌크 물질)은 이어서 희석되어 원하는 HA 농도를 가지는 물질을 제공할 수 있다. 이 물질은 백신 제조를 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 RP-HPLC에 의해 샘플 내 인플루엔자 바이러스 HA를 정제하는 방법을 제공하며, 이 개선은 샘플이 RP-HPLC 전 초미세여과를 받는 단계로 이루어진다.

본 발명은 또한 인플루엔자 HA를 함유하는 벌크 항원을 제공하며, 벌크 재료의 샘플은 본 발명의 방법에 의해 분석되었다.

참고문헌 3 내지 5의 방법과 비교하여, 본 발명은 술프히드릴이 유도체화되는 단계를 필요로 하지 않고, 높은 용리 온도를 필요로 하지 않는다. 이 특징들 중 하나 또는 둘 다는 원한다면, 본 발명과 함께 사용될 수 있지만(예를 들어 높은 용리 온도는 유용할 수 있다), 그것들이 요구되지는 않는다.

초미세여과

UF는 정수압이 반투성 막에 대해 액체를 강요하는 막 여과 기술이다. 현탁된 고체 및 고분자량의 용질이 막을 통과할 수 있다. UF 막의 컷오프분자량(molecular weight cutoff; MWCO)은 용질이 막을 통과할 수 있고(즉, 여과액으로) 남겨지는 것을(즉, 잔류물에) 결정한다.

본 발명에 대해, 막은 임의의 변성/응집된 HA를 보유하는 반면, 임의의 활성 HA의 통과를 허용하도록 선택된다. 300kDa 컷오프가 이 분리에 대해 편리하지만, 다른 컷오프도 또한 사용될 수 있다. 인플루엔자 HA 글리코단백질은 모노머로서 약 75kDa이지만, 이것들은 약 230kDA의 호모트라이머(homotrimer)로서 비리온에서 조립한다. 정확한 분자량은 바이러스 균주 및 글리코실화에 따라서 다양하지만, UF 막 컷오프는 원하는 모노머 및/또는 트라이머의 통과를 허용하는 한편 더 높은 분자량 덩어리를 보유하도록 용이하게 선택될 수 있다. HA 단편이 정제된다면(하기 참조) 컷오프는 그에 따라서 감소될 수 있다.

UF는 다양한 형식, 예를 들어 크로스 플로(수평적 흐름; TFUF) 또는 노멀 플로(막다른 길)로 작동될 수 있다. 어느 한쪽의 형식이 사용될 수 있다 해도, 노멀 플로가 본 발명의 분석 방법에 더 편리하다. 원심분리 튜브 내부에 UF 막이 사용될 수 있다(예를 들어, 원심분리 UF 농축기).

다양한 형태의 UF 막이 이용가능하며, 예컨대 와권형(spiral wound) 모듈(막의 거대한 연속층 및 튜브 주위를 감은 지지체 물질), 튜브형 막(샘플은 코어를 통과하여 흐르고, 여과액은 튜브 덮개에 바깥쪽으로 통과한다), 중공사막(hollow fiber membrane)(샘플은 섬유의 개방 코어를 통해 흐르고, 여과액은 섬유를 둘러싸는 카트리지 영역에서 수집된다), 및 수직막(샘플은 튜브에 부하되고, 실질적으로 튜브의 긴 축에 평행인 평면에서 수직인 막을 통해 흐른다)이 이용가능하다. 이들 중 임의의 막 배열이 사용될 수 있다.

UF는 압력하에서 수행될 수 있다. 전형적으로 여과액이 대기압에 남아있는 동안 펌핑에 의해 압력이 가해진다.

다양한 물질이 UF 막에서 사용된다. 본 방법은 폴리에테르술폰 막을 편리하게 사용할 수 있다.

RP - HPLC

UF는 원래 샘플로부터 변성/응집된 HA를 제거하는 반면, 활성 HA는 여과액으로 통과한다. 이 여과액은 이어서 RP-HPLC되어 여과액에서 HA를 임의의 다른 단백질들로부터 분리한다(예를 들어, 다른 인플루엔자 바이러스 항원, 또는 비-인플루엔자 단백질). 이 분리는 HA의 정제를 초래하고 정제된 물질은 분석될 수 있고, 예를 들어 정량화될 수 있다.

HPLC는 샘플 내 존재하는 정지상과 성분 사이의 상호작용에 의존하여 컬럼에서 체류와 함께, 크로마토그래피 컬럼(정지상)에 액체(이동상, 예컨대 용매)를 적용하는 크로마토그래피의 형태이다. 펌프는 컬럼을 통해 액체상을 이동시키고, 조건이 변화함에 따라서, 다른 분자들이 다른 시간에 컬럼으로부터 용리될 수 있다. RP-HPLC는 비-극성 고정상 및 수성의, 적당히 극성인 이동상을 가진다. RP-HPLC 체류 시간은 일반적으로 이동상 내 물의 비율을 증가시킴으로써 증가될 수 있고(따라서 소수성 분석물의 친화도를 현재 더 친수성인 이동상에 비해 소수성인 정지상에 대해 더 강하게 만드는 것); 반대로 그것들은 비-극성 또는 덜-극성인 유기 용매(예를 들어, 메탄올, 아세토니트릴)의 비율을 증가시킴으로써 감소될 수 있다.

RP-HPLC 단계는 다른 단백질로부터 UF-처리된 샘플에서 임의의 HA를 분리한다. 따라서, RP-HPLC 컬럼 및 용리 조건은 HA가 이들 다른 단백질로부터 분해될 수 있도록 선택된다. 이 분해를 이루기 위한 RP-HPLC의 능력은, 예를 들어 참고문헌 4로부터 이미 알려져 있다.

RP-HPLC의 다양한 형태가 이용가능하다. 본 발명은 4000Å 기공 크기를 가지는 10μm 폴리스티렌디비닐벤젠(PSDVB) 입자의 컬럼에서 편리하게 수행될 수 있지만, 다른 지지체 물질(예를 들어, 다른 소수성 폴리머, 예컨대 실리카 내 실란올기에 공유적으로 결합된 옥타데실, 데실 또는 부틸의 n-알킬 소수성 사슬), 입자 크기(예를 들어, 3-50μm) 및 기공 크기(예를 들어 250-5000Å)가 사용될 수 있고, PSDVB의 특성은 공중합 또는 β-유도체화(예를 들어, 술포아실화) 동안 PS 및 DVB의 비율을 변화시킴으로써 변경될 수 있다. 적당한 RP-HPLC 지지체는 HA를 보유하고 용리하고, 샘플 내 존재하는 다른 물질로부터 그것을 분리하는 능력을 기준으로 용이하게 선택될 수 있다. 2개의 기공 종류를 가지는 비드가 있는 지지체가 사용될 수 있다: 대류를 허용하는 거대한 "스루포어(throughpore)"는 짧은 "확산" 기공 내부로 샘플 분자들을 빠르게 이동시키면서, 입자 자체를 통해 생기도록 흐른다. 이 기공 배열은 확산이 일어나는데 필요한 거리를 감소시키고, 샘플 분자가 결합 자리와 상호작용하는데 필요로 되는 시간을 감소시킨다. 따라서 확산은 비-제한적일 수 있고 유속은 절충의 해결책 또는 용량 없이 증가될 수 있다(예를 들어, 1000-5000 cm/시간).

다양한 용리 버퍼가 예를 들어 아세토니트릴 기울기를 사용하여 사용될 수 있다. 적당한 유속은 예를 들어, 0.1 내지 5ml/분(예를 들어, 0.5 내지 1.5ml/분, 또는 약 0.8ml/분)에서 용이하게 선택될 수 있다. 용리는 참고문헌 3에서 설명한 바와 같이 실온에서 일어날 수 있지만, 50-70℃, 예를 들어 55-65℃, 또는 약 60℃범위의 용리가 도움이 된다.

RP-HPLC 용리물은 UF-처리된 샘플에서 임의의 HA를 검출하기 위해 모니터링될 수 있다(예를 들어, 약 214nm에서 UV 흡광도에 대해, 또는 약 290nm에서 여기 및 약 335nm에서 방출을 사용하여 고유형광에 대해). HPLC 용리 크로마토그램에서 HA 피크 하 영역은 HA를 정량하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 본 방법은 UF-처리된 샘플 내 HA의 양, 및 UF 전 샘플 내 활성 HA의 양의 계산을 허용한다. 알려진 부피의 샘플을 사용함으로써, 이 방법에 의해 결정된 HA의 양은 그 다음에, 예를 들어, 벌크 항원 제조, 또는 개개의 백신 용량에서 샘플이 취해지는 원래 물질 내 HA 농도를 계산하기 위해 사용될 수 있다.

UF 여과액은 RP-HPLC에 직접 공급될 수도 있고(예를 들어, 일직선 배치) 또는 수집된 다음 개별적으로 도입될 수도 있다.일부 구체예에서, 여과액은 RP-HPLC 전에 처리된다. 예를 들어, 참고문헌 3은 RP-HPLC 전 알킬화 단계를 수행하고, 이 단계는 필요하지는 않지만(따라서 바람직하지 않다) 본 발명과 함께 수행될 수 있다. UF와 RP-HPLC 사이의 한 유용한 단계는 세제로 여과액을 처리하는 것이다. 세제의 첨가는 하나가 아닌, 예를 들어, 지질 이중층에서 장미모양인 임의의 여과액 HA를 용해할 수 있다. 이런 이유로, UF 후 RP-HPLC 전에 일어나며, UF전 처리가 비-천연 HA를 용해할 수 있기 때문에, UF 필터를 통과하도록 하고, 따라서 애매한 결과를 제공한다.

적당한 가용성 세제는 이온성, 비-이온성 또는 쯔비터이온성일 수 있고, 제한되는 것은 아니지만, 데옥시콜레이트; 트리-N-부틸 포스페이트; 세틸트리메틸암모늄 브로마이드; Tergitol NP9; 알킬글리코사이드; 알킬티오글리코사이드; 아실 당; 술포베타인; 베타인; 폴리옥시에틸렌알킬에테르; N,N-디알킬-글루카미드; Hecameg; 알킬-페녹시-폴리에톡시에탄올; 사르코실; 미리스틸트리메틸암모늄 염; 리포펙틴; 리포펙타민; 및 DOT-MA; 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올(예를 들어, Triton 계면활성제; 예컨대, Triton X100 또는 Triton N101); 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(Tween 계면활성제, 예컨대, 폴리소르베이트 80); 폴리옥시에틸렌 에테르; 폴리옥시에틸렌 에스테르; 양쪽성 Zwittergent 세제, 예컨대 'Zwittergent 3-14'™ (n-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트; CAS 14933-09-6; 'TDAPS'); 알킬렌 글리콜 모노도데실 에테르, 예컨대 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르('C12E8') 등을 포함한다. 이것들은 HA를 가용화할 만큼 충분히 높은 수준에서(예를 들어, 5% (v/v) 이하이지만, 전형적으로 약 1%) 첨가되지만, 이후의 분석을 방해할 만큼 높지는 않다. 관심의 2가지의 특이적 세제는 Zwittergent 3-14™ 및 C12E8이다. 예를 들어, 실온에서 30분 동안 1% Zwittergent으로 처리는 양호한 분석 결과를 제공한다.

샘플

UF 및 RP-HPLC를 받는 샘플은 인플루엔자 바이러스 HA를 함유한다(또는 적어도 함유하는 것으로 의심된다). SRID는 종종 몇몇 균주로부터 HA를 함유하는 물질(예를 들어, 3가 물질)에서 수행된다. 본 발명은 다가의 물질과 함께 사용될 수 있지만, 다른 HA가 HPLC 컬럼에 의해 해결될 수 없다면, 각 균주로부터 항원을 개별적으로 정량화할 수 없다. 그래도 일부 환경에서, 각 균주로부터의 원인제공을 알지 못하고 다가의 혼합물에서 전체 HA를 정량하는 것은 적합하다. 그러나, 일반적으로 샘플은 단지 하나의 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 HA를 함유하며, 즉 1가이다.

본 발명은 다양한 종류의 샘플과 함께 사용될 수 있다. 최종 백신을 분석하기 위해 사용될 수 있지만, 분석 방법이 파괴적이기 때문에, 이는 보통 배치의 특성을 나타내는 분석 결과들을 가지는 배치로부터의 하나의 백신일 것이다. 샘플은 전체로서 벌크의 특성을 나타내는 분석결과를 가지는, 벌크 백신 물질로부터 취해질 수 있다. 다른 구체예에서, 샘플은 심지어 바이러스-함유 유체일 수 있고, 예를 들어, 세포 배양물 또는 난으로부터의 바이러스-함유 수확 유체일 수 있다. 샘플은 따라서 출발 물질, 최종 백신 물질, 또는 바이러스 배양물과 최종 백신 사이의 어떤 제조 중간체일 수 있다.

샘플은 전형적으로 인플루엔자 비리온으로부터 HA를 포함할 것이지만, 대안으로서, 재조합 숙주에서(예를 들어 바큘로바이러스 벡터를 사용하는 곤충 셀 라인에서) 발현되고 정제된 HA를 포함할 수 있고 또는 바이러스-유사 입자의 형태로 있을 수 있다(VLP; 예를 들어, 참고문헌 11 및 12 참조). 그러나, 일반적으로, 항원은 비린온으로부터 나올 것이고, 따라서 샘플은 HA에 더하여 다른 인플루엔자 바이러스 단백질(예를 들어, PB1, PB2, PA, NP, NA, M1, M2, NS1 및/또는 NS2 단백질)을 포함하고, 또한 인플루엔자 바이러스 지질을 포함할 수 있다.

비리온-유래된 인플루엔자 바이러스 항원은 생바이러스 또는 불활성화된 바이러스 중 하나를 기반으로 한다(예를 들어, 참고문헌 13의 chapters 17 & 18 참조). 본 발명의 생바이러스로부터 HA 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있지만, 생바이러스의 투여량은 HA 함량보다는 오히려 50% 조직 배양 감염량(median tissue culture infectious dose)을 기준으로 하고, 따라서 본 발명은 보통 불활성화된 물질에서 HA 수준을 결정하기 위해 사용될 것이다.

불활성화된 백신은 전체 비리온, '분할' 비리온, 정제된 표면 항원(HA를 포함하며, 보통 또한 뉴라미니다아제를 포함한다) 또는 바이로좀(무핵산 바이러스-유사 리포좀 입자[14])을 기반으로 할 수 있다. 본 발명은 모든 이러한 백신들과 함께 사용될 수 있다. BEGRIVAC™, FLUARIX™, PREPANDRIX™, FLUZONE™ 및 FLUSHIELD™ 생성물은 분할 백신이다. FLUVIRIN™, AGRIPPAL™, FLUAD™ 및 INFLUVAC™ 생성물은 표면 항원 백신이다. INFLEXALV™ 및 INVAVAC™ 생성물은 비로좀 백신이다. 본 발명은 분할 및 표면 항원 백신에서 HA 함량을 측정하는데 가장 유용하다.

본 발명은 인플루엔자 A 바이러스와 인플루엔자 B 바이러스를 포함하는 임의의 인플루엔자 바이러스 종류로부터의 HA와 함께 사용될 수 있다.

인플루엔자 A 바이러스에 대해, 본 발명은 임의의 알려진 HA 서브타입(Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H1O, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16)으로부터의 HA와 함께 사용될 수 있고, 이는 H1, H3 및 H5 균주와 함께 특히 유용하다. 균주는 임의의 NA 서브타입 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 또는 N9를 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 H1N1 균주, H3N2 균주, H5N1 균주로부터 물질을 분석하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 H1 균주에 대해 특히 유용하고, 일부 구체예에서, 균주는 SEQ ID NO: 2 (A/Chile/1/1983로부터의 HA1) 보다는 SEQ ID NO:1 (A/Califomia/04/2009로부터의 HA1)과 더 밀접하게 관련되는 HA를 가지는 H1 균주(예를 들어, H1N1 균주)이며, 즉, 동일한 비교 알고리즘과 변수를 사용하여 SEQ ID NO: 2보다는 SEQ ID NO: 1과 비교하였을 때, 더 높은 정도의 서열 동일성을 가진다. 다른 구체예에서, H1 HA는 SEQ ID NO: 1보다 SEQ ID NO: 2와 더 밀접하게 관련되어 있다.

인플루엔자 B 바이러스에 대해 본 발명은 B/Victoria/2/87-유사 균주 또는 B/Yamagata/16/88-유사 균주로부터의 HA와 함께 사용될 수 있다. 이들 2 그룹의 균주는 보통 항원적으로 구별되지만, 아미노산 서열 사이의 차이점은 또한 2 계통을 구별하기 위해 설명되었고, 예를 들어, B/Yamagata/16/88-유사 균주는 종종(항상은 아님) 'Lee40' HA 서열에 대해 넘버링된 아미노산 잔기 164에서 결실이 있는 HA 단백질을 가진다[15].

본 발명의 방법에 의해 분석되는 HA는 HA0로서 알려진 전장 전구체 HA일 수 있다. 그러나 일부 구체예에서, HA는 HAO의 단편이다. HA0은 트립신과 같은 세린 프로테아제에 의해 단편화되어 이황화 브릿지에 의해 결합을 유지할 수 있는 N-말단 단편(HA1)과 C-말단 단편(HA2)를 얻을 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 HA0, HA1 또는 HA2를 정제할 수 있고, 단지 하나의 이러한 단편(예를 들어 HA1)의 검출과 분석을 수반할 수 있다. 정제되고 분석되는 다른 HA 단편은, 예를 들어, 브로멜라인으로 처리에 의해 방출된 단편, 또는 브로멜라인과 트립신 둘 다의 처리에 의해 얻은 단편을 포함한다. 전형적으로, 본 발명은 HA1을 정제할 것이고, 따라서 적어도 RP-HPLC 단계는 환원 조건하에서 수행되어(예를 들어, DTT를 사용), HA1과 HA2가 분리되는 것을 보장하여야 하고, 선택적으로 정제전 분해 단계를 수반하여(예를 들어, 트립신을 사용) HA2로부터 HA1의 완전해 분해를 보장할 수 있다(그러나 이 분해는 종종 불필요하며, 분해가 유용하다면 임의의 전장 HA0의 존재는 결정하는 것이 용이하게 시험될 수 있다). 참고문헌 4는 HA1이 RP-HPLC에 의해 HA2 및 다른 백신 성분으로부터 잘 분리된다는 것을 보고한다.

샘플 내 HA는 HA1/HA2 분해자리 주변의 초-염기성 영역을 포함할 수 있지만, 다른 구체예에서 이 영역은 없다.

샘플 내 HA는 Sia(α2,3)Gal 말단의 이당류를 가지는 올리고당과 비교하여 Sia(α2,6)Gal 말단의 이당류를 가지는 올리고당에 대해, 또는 그 반대의 경우에 결합 선호도를 가질 수 있고, 또는 이러한 선호도를 나타내지 않을 수도 있다. 이 선호도에 대한 분석은 참고문헌 16에서 논의된다. 인간 인플루엔자 바이러스는 Sia(α2,6)Gal 말단 이당류(갈락토오스에서 α-2,6에 연결된 시알산)를 가지는 수용체 올리고당에 결합하지만, 난 및 베로 세포는 Sia(α2,3)Gal 말단 이당류를 가지는 수용체 올리고당을 가진다.

일부 구체예에서 HA는 난-유래 바이러스에서 보이튼 패턴과 다른 글리코실화 패턴을 가진다. 따라서, HA는 계란에서 보이지 않는 글리코형태를 포함할 수 있다. 유용한 HA는 개 글리코형태를 포함하고, 예를 들어, 바이러스는 MDCK 세포에서 성장될 수 있었다. 다른 유용한 HA는 인간 글리코형태를 포함하며, 예를 들어, 바이러스는 PER.C6 세포에서 성장되었다. 다른 유용한 HA는 원숭이 글리코형태를 포함하며, 예를 들어, 바이러스는 베로세포에서 성장될 수 있었다. 이들 셀 라인은 예를 들어 ATCC(American Type Cell Culture) 컬렉션, Coriell Cell Repositories 또는 ECACC(European Collection of Cell Cultures)로부터 널리 이용가능하다. 예를 들어, ATCC는 카탈로그 번호 CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 및 CRL-1587 하의 다양한 다른 베로 세포들을 공급하고, 카탈로그 번호 CCL-34 하의 MDCK 세포를 공급한다. PER.C6은 기탁 번호 96022940 하에 ECACC로부터 이용가능하다. 한 적당한 MDCK 셀 라인은 DSM ACC 2219로서 기탁된 'MDCK 33016'이다[17].

샘플 내 HA는 야생형 바이러스 또는 재교배(reassortant) 바이러스, 특히 인플루엔자 A 바이러스로부터 일 수 있다. 재교배 바이러스는 역 유전학 기술에 의해 얻어질 수 있었다. 따라서 샘플은 한 바이러스 균주로부터 HA를 포함할 수 있지만, 다른 인플루엔자 항원들(예를 들어, PB1, PB2, PA, NP, M1, M2, NS1 및/또는 NS2 단백질)은 다른 균주, 예를 들어, A/PR/8/34, A/AA/6/60, 또는 A/WSN/33로부터 일 수 있다.

샘플 내 HA 농도는 보통 O.1μg/ml 내지 10mg/ml, 예를 들어, 1μg/ml 내지 1mg/ml, 또는 10μg/ml 내지 100μg/ml일 것이다. 일부 구체예에서, 농도는 약 30μg/ml, 약 15μg/ml 또는 약 7.5μg/ml이다.

샘플은 혈청 성분을 포함할 수 있지만, 바람직하게는 이러한 성분이 없다.

샘플은 난 단백질(예를 들어, 오발부민 및 오보뮤코이드) 및/또는 닭 DNA를 포함할 수 있지만, 일부 구체예에서, 예를 들어 바이러스가 세포 배양물에서 성장될 때, 이들 성분은 없다.

샘플은 DNA, 예를 들어 닭 DNA 또는 포유동물 DNA(예를 들어 MDCK 세포, 베로 세포, PER.C6 세포 등으로부터 유래)를 포함할 수 있다. 그러나 이상적으로, 샘플은 HA의 mg 당 600ng 미만의 DNA를 함유한다(바람직하게는 60ng 미만, 더 바람직하게는 6ng 미만).

샘플은 바람직하게는 인플루엔자 바이러스 단백질을 제외한 바이러스 단백질을 포함하지 않는다.

샘플은 특히 분할 또는 표면 항원 백신 샘플에 대해 세제, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제('Tweens'로서 알려짐, 예를 들어 폴리소르베이트 80), 옥톡시놀(예컨대 옥톡시놀-9 (Triton X-100) 또는 -10, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올), 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드('CTAB'), 또는 소듐 데옥시콜레이트를 포함할 수 있다. 세제는 단지 미량으로, 예를 들어 항원 제조로부터의 잔여물로 존재할 수 있다. 미량의 다른 샘플 성분은 항생제일 수 있다(예를 들어, 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B).

다운스트림 단계

본 발명의 방법은 관심의 물질에서 HA 농도의 측정을 허용한다. 이 물질, 특히 벌크 백신은 그 다음에 희석되어 원하는 최종 HA 농도를 제공할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 HA 정제의 결과를 기반으로 한 백신을 희석하는 단계를 더 포함할 수 있고, 본 발명은 (a) 본원에 개시되는 방법에 의해 백신 또는 그것의 샘플 내의 HA를 정제하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 결과를 사용하여 백신 내 HA 농도를 계산하는 단계를 포함하는 백신을 분석하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 단계 (a)와 (b), 및 단계 (b)의 결과를 사용하여 벌크 백신을 희석하여 원하는 HA 농도를 제공하는 추가 단계 (c)를 포함하는 원하는 HA 농도를 가지는 벌크 백신을 제공하기 위한 방법을 제공한다. 희석된 벌크 백신의 단위 용량은 그 다음에 추출될 수 있고, 따라서 본 발명은 상기 단계 (a) 내지 (c), 및 희석된 벌크로부터 백신의 하나 이상의 단위 용량을 추출하며, 각 단위 용량은 원하는 HA 함량을 가지는 추가 단계 (d)를 포함하는, 환자 사용을 위한 백신을 제공하는 방법을 제공한다. 추출한 물질은 용기, 예를 들어 바이알 또는 주사기에 넣을 수 있다.

희석된 벌크는 단위 용량 추출 전 다른 성분들, 예컨대 보조제와 혼합될 수 있다. 따라서 본 발명은 단계 (a) 내지 (c), 및 희석된 벌크 백신을 면역증강제(adjuvant)와 혼합하는 추가 단계 (d)를 포함하는 벌크 면역증강된 백신을 제공하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 단계 (a) 내지 (d), 및 희석된 벌크로부터 백신의 하나 이상의 단위 용량을 추출하며, 각 단위 용량은 원하는 HA 함량을 가지는 추가 단계 (e)를 포함하는, 환자 사용을 위한 면역증강된 백신을 제공하는 방법을 제공한다. 추출된 물질은 용기, 예를 들어 바이알 또는 주사기에 넣을 수 있다.

추출한 용량과 면역증강제를 혼합하기 위한 대안으로서, 추출된 용량은 대신에 제2 키트 구성요소와 조합하여 제1 키트 구성요소로서 포장될 수 있으며, 이때 제2 키트 구성요소는 백신 면역증강제이다. 2가지의 키트 구성요소는 사용 시 혼합되어 면역증강된 백신을 제공할 수 있다. 키트는 면역증강제 및 항원이 사용시까지 개별적으로 유지되도록 한다(예를 들어, PREPANDRIX™ 제품과 같이). 성분들은 키트 내에서 서로 물리적으로 분리되고, 이 분리는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 2 성분은 2개의 개별 용기, 예컨대 바이알에 있을 수 있다. 두 바이알의 내용물은 그 다음에, 예를 들어 한 바이알의 내용물을 제거하고 그것을 다른 바이알에 첨가함으로써, 또는 두 바이알의 내용물을 모두 개별적으로 제거하고 그것들을 제3의 용기에서 혼합함으로써 혼합될 수 있다. 한 배열에서, 키트 성분 중 하나는 주사기에 있고, 나머지는 바이알과 같은 용기에 있다. 주사기는 혼합을 위해 그것의 내용물을 제2 용기에 삽입하기 위해 사용될 수 있고(예를 들어, 바늘로), 혼합물은 그 다음에 주사기에 회수될 수 있다. 주사기의 혼합된 내용물은 그 다음에 환자에게, 전형적으로 새로운 멸균 바늘을 통해 투여될 수 있다. 주사기 내에 한 성분을 포장하는 것은 환자에 투여를 위한 개별 주사기를 사용하는 필요를 제거한다. 다른 배열에서, 두 키트 성분들은 함께 그러나 개별적으로 동일한 주사기에 담길 수 있다, 예를 들어, 듀얼-챔버 주사기[18]. 주사기가 작동될 때(예를 들어 환자에게 투여하는 동안), 두 챔버의 내용물은 혼합된다. 이 배열은 사용시 개별 혼합 단계에 대한 필요를 피한다.

항원과 면역증강제가 제조 동안 혼합되든 또는 환자에게 전달시 혼합되든, 항원은 일반적으로 수성일 것이고 따라서 혼합 단계는 2가지 액체를 혼합하는 것을 수반한다. 혼합에 대한 2액체의 부피 비율은 다양할 것이지만(예를 들어, 5:1 내지 1:5) 일반적으로 약 1:1이다. 따라서 2 키트 성분들은 실질적으로 서로 동일한 액체 부피를 포함할 수 있다.

면역증강제는 조성물을 받는 환자에서 유발되는 면역 반응(체액성 및/또는 세포성)을 향상시킬 수 있다. 이 목적을 위한 전형적인 면역증강제는 수중유 에멀젼이다. 다양한 적당한 에멀젼이 알려져 있고, 그것들은 전형적으로 적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 계면활성제를 생분해가능하고(대사가능한) 생체에 적합한 오일(들) 및 계면활성제(들)과 함께 포함한다. 에멀젼 내 오일 방울은 일반적으로 직경이 5μm 미만이고, 유리하게는 에멀젼은 서브미크론 직경으로 오일 방울을 포함하며, 이 작은 크기는 마이크로플루이다이저로 달성되어 안정한 에멀젼을 제공한다. 200nm 미만의 크기를 가지는 방울들은 그것들이 필터 멸균을 받을 수 있기 때문에 바람직하다.

에멀젼은 동물(예컨대 어류) 또는 식물성 공급원으로부터 오일을 포함할 수 있다. 식물성 오일에 대한 공급원은 견과, 종자 및 곡물을 포함한다. 피넛 오일, 대두 오일, 코코넛 오일, 및 올리브 오일, 가장 흔히 이용가능한 견과류 오일이 예시된다. 호호바 오일은, 예를 들어 호호바 콩으로부터 얻어져서 사용될 수 있다. 종자유는 홍화유, 면실유, 해바라기씨유, 참깨 종자유 등을 포함한다. 곡물 군에서, 옥수수 오일이 가장 용이하게 이용가능하지만, 밀, 귀리, 호밀, 쌀, 테프, 라이밀 등과 같은 다른 곡물의 오일이 또한 사용될 수 있다. 종자유에서 자연적으로 발생하지는 않지만, 글리세롤 및 1,2-프로판디올의 6-10개 탄소 지방산 에스테르는 견과 및 종자유로부터 출발하는 적절한 물질의 가수분해, 분리 및 에스테르화에 의해 제조될 수 있다. 포유동물 우유로부터 지방과 오일은 대사가능하고 따라서 본 발명의 실행에 사용될 수 있다. 동물 공급원으로부터 순수한 오일을 얻기 위해 필요한 분리, 정제, 비누화 및 기타 수단을 위한 과정은 당업계에 잘 알려져 있다. 대부분의 어류는 용이하게 회수될 수 있는 대사가능한 오일을 함유한다. 예를 들어, 대구간유, 상어간유 및 고래 오일, 예컨대 경납이 본원에서 사용될 수 있는 몇몇 어류 오일로 예시된다. 다수의 분지쇄 오일이 5-탄소 이소프렌 단위에서 생화학적으로 합성되고, 일반적으로 테르피노이드로서 언급된다. 상어간유는 스쿠알렌으로서 알려진, 분지된, 불포화 테르피노이드, 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔을 함유한다. 다른 바람직한 오일은 DL-α-토코페롤을 포함하는 토코페롤이다. 스쿠알렌을 포함하는 에멀젼이 특히 바람직하다. 오일의 혼합물이 사용될 수 있다.

계면활성제는 그것의 'HLB'(친수/친유기 평형)에 의해 분류될 수 있다. 본 발명의 바람직한 계면활성제는 적어도 10, 바람직하게는 적어도 15, 및 더 바람직하게는 적어도 16의 HLB를 가진다. 적당한 계면활성제의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제(보통 Tweens로서 언급됨), 특히 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; DOWFAX™ 상표명하에 판매되는 에틸렌 옥사이드(EO), 프로필렌 옥사이드(PO), 및/또는 부틸렌 옥사이드(BO)의 공중합체, 예컨대, 선형 EO/PO 차단 공중합체; 반복되는 에톡시(옥시-1,2-에탄디일) 기의 수가 특정 관심이 되는 옥톡시놀-9(Triton X-1OO, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)로 다양할 수 있는 옥톡시놀, (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올(IGEPAL CA-630/NP-40); 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린(레시틴); 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알코올로부터 유래된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르(Brij 계면활성제로서 알려짐), 예컨대 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르(Brij 30); 및 소르비탄 에스테르(보통 SPAN으로서 알려짐), 예컨대 소르비탄 트리올레이트(Span 85) 및 소르비탄 모노라우레이트를 포함한다. 에멀젼에 포함을 위한 바람직한 계면활성제는 Tween 80 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트; 폴리소르베이트 80), Span 85(소르비탄 트리올레이트), 레시틴 및 Triton X-1OO이다. 폴리소르베이트 80의 포함이 바람직하다.

계면활성제의 혼합물, 예를 들어 Tween 80/Span 85 혼합물이 사용될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Tween 80) 및 옥톡시놀, 예컨대 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(Triton X-100)의 조합이 또한 적당하다. 다른 유용한 조합은 라우레스 9 + 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및/또는 옥톡시놀을 포함한다.

계면활성제의 바람직한 양(중량%)은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(예컨대 Tween 80) 0.01 내지 1%, 특히 약 0.1 %; 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올(예컨대 Triton X-100, 또는 Triton 시리즈의 다른 세제) 0.001 내지 0.1 %, 특히 0.005 내지 0.02%; 폴리옥시에틸렌 에테르(예컨대 라우레스 9) 0.1 내지 20 %, 바람직하게는 0.1 내지 10% 및 특히 0.1 내지 1% 또는 약 0.5%이다.

본 발명에 유용한 구체적 수중유 에멀젼 면역증강제는, 제한되는 것은 아니지만:

● 스쿠알렌, Tween 80, 및 Span 85의 서브미크론 에멀젼. 부피로써 에멀젼의 조성물은 약 5% 스쿠알렌, 약 0.5% 폴리소르베이트 80 및 약 0.5% Span 85일 수 있다. 중량 용어에서, 이 비율들은 4.3% 스쿠알렌, 0.5% 폴리소르베이트 80 및 0.48% Span 85가 된다. 이 면역증강제는 'MF59'로서 알려져 있고[19-21], 참고문헌 22의 Chapter 10 및 참고문헌 23의 chapter 12에서 더욱 상세하게 설명된다. MF59 에멀젼은 유리하게는 시트레이트 이온, 예를 들어 1OmM 시트르산 나트륨 버퍼를 포함한다.

● 스쿠알렌, α-토코페롤, 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 에멀젼. 이 에멀젼들은 2 내지 10% 스쿠알렌, 2 내지 10% 토코페롤 및 0.3 내지 3% Tween 80을 가질 수 있고, 스쿠알렌:토코페롤의 중량비율은 바람직하게는 ≤ 1(예를 들어 0.90)인데, 이것이 더 안정한 에멀젼을 제공하기 때문이다. 스쿠알렌 및 Tween 80은 약 5:2의 부피비, 또는 약 11:5의 중량비로 존재할 수 있다. 하나의 이러한 에멀젼은 PBS 중에서 Tween 80을 용해하여 2% 용액을 제공한 다음, 이 용액의 90ml와 (5g의 DL-α-토코페롤 및 5ml 스쿠알렌)의 혼합물을 혼합하고, 이어서 혼합물을 마이크로플루이다이징함으로써 만들어질 수 있다. 결과 에멀젼은 서브미크론 오일 방울, 예를 들어 100 내지 250nm, 바람직하게는 약 180nm의 평균 직경을 가질 수 있다.

● 스쿠알렌, 토코페롤 및 Triton 세제(예를 들어, X-100)의 에멀젼. 에멀젼은 또한 3d-MPL을 포함할 수 있다(하기 참조). 이 에멀젼은 포스페이트 버퍼를 함유할 수 있다.

● 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 80), Triton 세제(예를 들어, Triton X-100) 및 토코페롤(예를 들어 α-토코페롤 숙시네이트)를 포함하는 에멀젼. 이 에멀젼은 약 75:11:10의 질량비로(예를 들어, 750μg/ml 폴리소르베이트 80, 110μg/ml Triton X-100 및 100μg/ml α-토코페롤 숙시네이트) 이들 3가지 성분을 포함할 수 있고, 이 농도는 항원으로부터 이들 성분의 어떤 기여를 포함하여야 한다. 에멀젼은 또한 스쿠알렌을 포함할 수 있다. 에멀젼은 또한 3d-MPL을 포함할 수 있다(하기 참조). 수성상은 포스페이트 버퍼를 함유할 수 있다.

● 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 401("Pluronic™ L121")의 에멀젼. 이 에멀젼은 인산완충식염수, pH 7.4에서 조제될 수 있다. 이 에멀젼은 무라밀 디펩티드에 대한 유용한 전달 비히클이고, "SAF-1" 면역증강제에서 트레오닐-MDP와 함께 사용되었다[24] (0.05-1% Thr-MDP, 5% 스쿠알렌, 2.5% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 또한 "AF" 면역증강제에서와 같이 Thr-MDP가 없이 사용될 수 있다[25](5% 스쿠알렌, 1.25% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 마이크로유동화가 바람직하다.

● 스쿠알렌, 수성 용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 친수성 비이온성 계면활성제(예를 들어, 폴리옥시에틸렌(12) 세토스테아릴 에테르) 및 소수성 비이온성 계면활성제(예를 들어, 소르비탄 에스테르 또는 만니드 에스테르, 예컨대 소르비탄 모노올레이트 또는 'Span 80')을 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 바람직하게는 열가역적이고 및/또는 200nm 미만의 크기를 가지는 적어도 90%의 오일 방울(부피)을 가진다[26]. 에멀젼은 또한 하나 이상의 알디톨; 동결보호제(예를 들어, 도데실말토사이드 및/또는 수크로오스와 같은 당); 및/또는 알킬폴리글리코사이드를 포함한다. 이러한 에멀젼은 동결건조될 수 있다.

● 0.5-50%의 오일, 0.1-10%의 인지질, 및 0.05-5%의 비-이온성 계면활성제를 가지는 에멀젼. 참고문헌 27에서 설명되는 바와 같이, 바람직한 인지질 성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 스핑고미엘린 및 카르디올리핀이다. 서브미크론 방울 크기가 유리하다.

● 대사가능하지 않은 오일(예컨대 경유) 및 적어도 하나의 계면활성제(예컨대 레시틴, Tween 80 또는 Span 80)의 서브미크론 수중유 에멀젼. QuilA 사포닌, 콜레스테롤, 사포닌-친유성 콘쥬게이트(예컨대 참고문헌 28에서 설명되고, 글루쿠론산의 카르복실기를 통해 데스아실사포닌에 지방족 아민의 첨가에 의해 만들어지는 GPI-0100), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 및/또는 N,N-디옥타데실-N,N-비스(2-히드록시에틸)프로판디아민과 같은 첨가제가 포함될 수 있다.

● 미네랄 오일, 비-이온성 친유성 에톡실화된 지방 알코올, 및 비-이온성 친수성 계면활성제(예를 들어, 에톡실화된 지방 알코올 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 차단 공중합체)를 포함하는 에멀젼[29].

● 미네랄 오일, 비-이온성 친수성 에톡실화된 지방 알코올, 및 비-이온성 친유성 계면활성제(예를 들어, 에톡실화된 지방 알코올 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 차단 공중합체)를 포함하는 에멀젼[29].

● 사포닌(예를 들어 QuilA 또는 QS21) 및 스테롤(예를 들어 콜레스테롤)이 나선형 미셀로서 관련되는 에멀젼[30].

불활성화된 인플루엔자 백신이 그것의 HA수준에 의해 표준화되기 때문에 백신 내 HA 함량을 측정하고, 원하는 HA 함량으로 벌크 백신을 희석하는 것의 중요성이 생겼다. 현재 백신들은 더 낮은 용량이 또한, 예를 들어 어린이에 대해, 또는 응급 상황에서 사용될 수 있지만, 균주 당 약 30μg/ml의 HA를 전형적으로 함유한다. 더 높은 용량을 가짐에 따라(예를 들어 3x 또는 9x 용량 [33,34]) ¹/₂ (즉, FOCETRIA™과 같이 15μg/ml HA), ¹/₄(즉, 투여될 때 PREPANDRIX™와 같이 7.5μg/ml) 및 ¹/₈과 같은 부분적 용량이 사용되었다[31,32]. 따라서 희석은 인플루엔자 균주 당 0.1 내지 200μg/ml, 바람직하게는 1 내지 150μg/ml, 예를 들어 1-90μg/ml, 1-20μgml, 0.1-15μg/ml, 0.1-1Oμg/ml, 0.1-7.5μg/ml, 0.5-5μg/ml, 3.75-15μg/ml 등의 HA 농도를 제공하도록 수행될 수 있다. 특정 희석 후 농도는, 예를 들어, 약 90μg/ml, 약 45μg/ml, 약 30 μg/ml, 약 15 μg/ml, 약 10 μg/ml, 약 7.5 μg/ml, 약 5 μg/ml, 약 3.8 μg/ml, 약 3.75 μg/ml, 약 1.9 μg/ml, 약 1.5 μg/ml 등을 포함한다. 면역증강제가 백신 내에 존재할 때 더 낮은 농도(예를 들어 <30μg/ml)가 가장 유용하다. 일부 연구들에서 180μg/ml 만큼 높은 농도가 사용되었지만(예를 들어, 참고문헌 35), 본 발명의 조성물은 ≤ 30μg/ml의 HA 농도를 가질 것이다.

약제학적 조성물

환자에 투여를 위한 HA-함유 조성물은 약제학적으로 허용가능하다. 그것들은 보통 HA에 추가적인 성분 및 선택적 면역증강제를 포함하며, 예를 들어, 그것들은 전형적으로 하나 이상의 약제학적 담체(들) 및/또는 부형제(들)을 포함한다. 이러한 성분의 철저한 논의는 참고문헌 36에서 이용가능하다.

약제학적 조성물은 일반적으로 수성형태일 것이지만(예를 들어, 주사), 고체 제형이 또한 사용될 있고, 인플루엔자 백신접종용으로 알려져 있다.

약제학적 조성물은 티메로살(예를 들어 10μg/ml) 또는 2-페녹시에탄올과 같은 보존제를 포함할 수 있다. 그러나, 백신은 수은함유 물질이 실질적으로 없는(즉, 5 μg/ml 미만), 예를 들어 무 티메로살이어야 하는 것이 바람직하다. 수은이 없는 백신은 더 바람직하다. 무 보존제 백신이 특히 바람직하다.

등장성을 조절하기 위해, 수성 약제학적 조성물은 나트륨 염과 같은 생리적 염을 포함할 수 있다. 염화나트륨(NaCl)이 바람직하며 1 내지 20 mg/ml에서 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 염은 염화칼륨, 인산이수소칼륨, 디소듐 포스페이트 디하이드레이트, 염화마그네슘, 염화칼슘 등을 포함한다.

수성 약제학적 조성물은 일반적으로 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 바람직하게는 240-360 mOsm/kg의 삼투압을 가질 것이고, 더 바람직하게는 290-310 mOsm/kg의 범위 내에 속할 것이다. 삼투압은 백신접종에 의해 야기되는 통증에 영향을 가지지 않는 것으로 이전에 보고되었지만[38], 그럼에도 불구하고 이 범위에서 유지되는 삼투압은 바람직하다.

약제학적 조성물은 하나 이상의 버퍼를 포함할 수 있다. 전형적인 버퍼는 포스페이트 버퍼; Tris 버퍼; 보레이트 버퍼; 숙시네이트 버퍼; 히스티딘 버퍼; 또는 시트레이트 버퍼를 포함한다. 버퍼는 전형적으로 5-2OmM 범위 내에 포함될 것이다. 버퍼는 에멀젼의 수성 상에 있을 것이다.

약제학적 조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1, 더 전형적으로 6.0 내지 8.0, 예를 들어 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8일 것이다. 본 발명의 과정은 따라서 용량 추출 또는 포장 전 벌크의 pH를 조절하는 단계를 포함할 것이다.

약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균이다. 약제학적 조성물은 바람직하게는 무글루텐이다.

바람직한 약제학적 조성물은 낮은 엔도톡신 함량, 예를 들어 1 IU/ml, 및 바람직하게는 0.5 IU/ml 미만을 가진다. 엔도톡신 측정을 위한 국제적인 단위는 잘 알려져 있고, 예를 들어, NIBSC로부터 이용가능한 2 nd International Standard (Code 94/580 - IS)와 같은 국제 표준과 비교하여 계산될 수 있다[39,40]. 난에서 성장한 바이러스로부터 제조된 현재 백신은 0.5-5 IU/ml의 영역에서 엔도톡신을 가진다.

약제학적 조성물은 항생제가 없을 수 있다(예를 들어, 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B).

약제학적 조성물은 1회 면역화를 위한 물질을 포함할 수 있고 또는 다회 면역화를 위한 물질을 포함할 수도 있다(즉, '다회용량' 조성물, 이 경우에 추출된 단위 용량은 한 명 이상의 환자 투여를 위해 충분한 물질을 함유한다). 다회용량 배열은 보통 백신 내 보조제를 포함한다. 이 필요를 피하기 위해, 백신은 물질의 제거를 위한 무균성 어댑터를 가지는 용기에 함유될 수 있다.

인플루엔자 백신은, 비록 절반의 투여량(즉, 약 0.25ml)이 어린이에게 투여될 수 있지만, 약 0.5ml의 투약 부피로 근육내 주사에 의해 전형적으로 투여되고, 단위 용량은 따라서, 예를 들어 한명의 환자에게 투여를 위한 0.5ml 용량을 제공하는 단위 용량이 선택될 것이다. 더 낮은 투약 부피가 사용될 수 있으며, 예를 들어 0.1 부피가 피내 주사에 유용하다.

조성물 또는 키트 성분의 포장

본 발명의 과정은 백신이 용기, 특히 의사에 의한 사용을 위한 유통을 위한 용기에 넣어지는 단계를 포함할 수 있다. 이 단계는 보통 벌크로부터 물질의 추출 및 용기에 그것의 삽입을 수반할 것이다.

수성 백신을 위한 적당한 용기는 바이알, 비강 스프레이 및 일회용 주사기를 포함하며, 이는 멸균이어야 한다.

조성물/성분이 바이알에 위치되는 경우, 바이알은 바람직하게는 유리 또는 플라스틱 재료로 만들어진다. 바이알은 조성물이 그것에 첨가되기 전에 멸균된다. 라텍스-민감성 환자의 문제를 피하기 위해, 바이알은 무 라텍스 마개로 밀봉될 수 있고, 모든 포장 재료에서 라텍스가 없는 것이 바람직하다. 바이알은 1회 용량의 백신을 포함할 수 있고, 또는 1회 용량 이상('다회 용량' 바이알), 예를 들어 10회 용량을 포함할 수도 있다. 바람직한 바이알은 무색의 유리로 만들어진다.

바이알은 주사기가 그 안에 삽입될 수 있도록 적합하게 된 캡을 가질 수 있다(예를 들어, 루어 락(Luer lock)). 바이알은, 특히 다회용량 바이알에 대해, 그것의 내용물의 무균성 제거를 허용할 수 있는 캡을 가질 수 있다.

조성물/성분이 주사기에 포장될 경우, 주사기는 그것에 부착된 바늘을 가질 수 있다. 바늘이 부착되지 않는다면, 개개의 바늘은 조립 및 사용을 위해 주사기와 함께 공급될 수 있다. 이러한 바늘은 덮개로 보호될 수 있다. 안전한 바늘이 바람직하다. 1-인치 23-게이지, 1-인치 25-게이지 및 5/8-인치 25-게이지 바늘이 전형적이다. 주사기는 로트(lot) 번호, 인플루엔자 시즌 및 내용물의 유효기간이 인쇄되어 기록 유지를 가능하게 할 수 있는 필-오프 라벨이 공급될 수 있다. 주사기의 플런저는 바람직하게는 플런저가 흡입 동안 우연하게 제거되는 것을 막는 마개를 가진다. 주사기는 라텍스 고무 캡 및/또는 플런저를 가질 수 있다. 일회용 주사기는 1회 용량의 백신을 함유한다. 주사기는 일반적으로 바늘의 부착 전 팁을 밀봉하기 위한 팁 캡을 가질 것이고, 팁 캡은 바람직하게는 부틸 고무로 만들어진다. 주사기와 바늘이 개별적으로 포장되면, 이어서 바늘은 바람직하게는 부틸 고무 쉴드로 적합하게 된다. 유용한 주사기는 상표명 "Tip-Lok"™ 하에서 시판되는 것이다. 다른 유용한 시린지는 피내 투여를 위해 적당한 것, 예를 들어, 약 1.5mm 길이의 바늘이 있는 마이크로주사 장치를 포함한다.

용기는 절반-용량의 부피를 나타내도록, 예를 들어 어린이에게 전달이 가능하도록 표시될 수 있다. 예를 들어, 0.5ml 용량을 함유하는 주사기는 0.25ml 부피를 나타내는 표시를 가질 수 있다.

유리 용기(예를 들어, 주사기 또는 바이알)이 사용된다면, 이는 소다석회 유리보다는 붕규산유리로 만들어진 용기를 사용하는 것이 바람직하다.

조성물은 백신의 세부사항, 예를 들어, 투여를 위한 설명서, 백신 내 항원의 세부사항 등을 포함하는 리플렛이 포함될 수 있다(예를 들어, 작은 박스 안에). 설명서는 또한 예를 들어 백신접종 후 과민성 반응의 경우에 용이하게 이용가능한 아드레날린의 용액을 유지하기 위한 경고를 함유할 수 있다.

치료 방법, 및 백신의 투여

본 발명의 조성물은 인간과 같은 동물에 투여에 적당하며, 본 발명은 환자에 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서 면역반응을 상승시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 예를 들어, 동물에서 면역반응을 상승시키기 위한 약제로서 사용을 위한 본 발명의 키트 또는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 동물에서 면역 반응을 상승시키기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 조성물의 사용을 제공한다.

본 발명의 방법 및 사용에 의해 상승되는 면역 반응은 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 보호 항체 반응을 포함할 것이다. 항체 반응을 평가하는 방법, 중화 능력 및 인플루엔자 바이러스 백신 접종 후 보호는 당업계에 잘 알려져 있다. 인간 연구는 인간 인플루엔자 바이러스의 HA에 대한 항체 역가가 보호와 관련된다는 것을 나타내었다(약 30-40의 혈청 샘플 혈구응집소-억제 역가는 상동성 바이러스에 의한 감염으로부터 약 50% 보호를 제공한다)[41]. 항체 반응은 전형적으로 혈구응집소 억제, 마이크로중화, 일원방사면역확산법(SRID), 및/또는 단순 방사 용형(SRH)에 의해 측정된다. 이 분석 기술들은 당업계에 잘 알려져 있다.

인플루엔자 백신은 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 가장 바람직한 면역화 경로는 근육내 주사에 의하지만(예를 들어 팔 또는 다리에), 다른 이용가능한 경로는 피하 주사, 비강[42-44], 경피내[45,46], 경구[47], 피부경유, 경피[45,46] 등을 포함한다. 경피내 및 비강내 경로가 매력적이다. 경피내 투여는 예를 들어 약 1.5mm 길이의 바늘을 가지는 마이크로주사 장치를 수반할 수 있다.

본 발명에 따르는 바람직한 백신은 어린이와 성인 둘 다를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 인플루엔자 백신은 6개월령부터 소아 및 성인 면역화에서 사용을 위해 현재 추천된다. 따라서 환자는 1세 미만, 1-5세, 5-15세, 15-55 세, 또는 적어도 55세일 수 있다. 백신을 투여받기 위한 바람직한 환자는 노인(예를 들어, ≥ 50세, ≥ 60세, 및 바람직하게는 ≥ 65세), 영아(예를 들어, ≤ 5세), 입원환자, 병원 노동자, 군부 및 군 인사, 임산부, 만성적 질환, 면역결핍 환자, 백신접종 7일 전에 항바이러스 화합물(예를 들어, 오셀타미비르 또는 자나미비르 화합물; 하기 참조)을 받은 환자, 계란 알레르기가 있는 사람 및 해외여행자이다. 그러나 백신들은 이 오직 이 그룹들에 대해서 적당하지 않고, 모집단 내에서 더욱 일반적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 조성물은 효능을 위한 CPMP 기준의 1, 2 또는 3을 만족시킨다. 성인(18-60세)에서, 이 기준은: (1) ≥ 70% 예방효과; (2) ≥ 40% 혈청전환; 및/또는 (3) ≥ 2.5-배의 GMT 증가이다. 노인에서(> 60 세), 이 기준은 (1) ≥ 60% 혈청전환; (2) ≥ 30% 혈청전환; 및/또는 (3) ≥ 2-배의 GMT 증가이다. 이 기준은 적어도 50명의 환자에서 개방 표지 연구를 기준으로 한다. 이 기준은 백신 내 각 균주에 대해 적용한다.

치료는 1회 투여 스케줄 또는 다회 투여 스케줄에 의할 수 있다. 다회 투여는 프라이머리 면역화 스케줄 및/또는 부스터 면역화 스케줄에서 사용될 수 있다. 다회 투여 스케줄에서, 다양한 투여량이 동일 또는 다른 경로, 예를 들어 비경구 프라임 및 점막 부스트, 점막 프라임 및 비경구 부스트 등에 의해 주어질 수 있다. 1회 이상의 투여량(전형적으로 2회 투여량)의 투여가 면역적으로 나이브한 환자, 예를 들어 새로운 HA 서브타입에 대한 백신 접종 전, 또는 백신접종 동안 인플루엔자 백신을 투여받은 적이 결코 없는 사람에서 특히 유용하다. 다회 투여량은 전형적으로 적어도 1주 간격(예를 들어, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약8주, 약12주, 약16주 등)으로 투여될 것이다.

본 발명에 의해 만들어지는 백신은 다른 백신, 예를 들어 홍역 백신, 볼거리 백신, 풍진 백신, MMR 백신, 수두백신, MMRV 백신, 디프테리아 백신, 파상풍 백신, 백일해 백신, DTP 백신, 접합된 헤모필루스 인플루엔자 b형 백신, 불활성화된 폴리오바이러스 백신, B형 간염 바이러스 백신, 수막구균 접합 백신(예컨대, 4가의 A-C-W135-Y 백신), 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 폐렴구균 단백접합백신 등과 실질적으로 동시에(예를 들어, 동일한 의학적 상담 또는 보건의료인 또는 백신접종 센터를 방문하는 동안) 투여될 수 있다. 폐구균 백신 및/또는 수막구균과 실질적으로 동시에 투여는 노인 환자에게서 특히 유용하다.

유사하게, 본 발명의 백신은 항바이러스 화합물, 특히 인플루엔자 바이러스에 대해 활성인 항바이러스 화합물(예를 들어 오셀타미비르 및/또는 자나미비르)과 실질적으로 동시에(예를 들어, 동일한 의학적 상담 또는 보건의료인 또는 백신접종 센터를 방문하는 동안) 환자에게 투여될 수 있다

일반

용어 "포함하는"은 "포함하는"뿐만 아니라 "이루어지는"을 포함하며, 예를 들어 X를 "포함하는 조성물"은 X로 배타적으로 이루어질 수도 있고, 또는 부가적인 것, 예를 들어 X+Y를 포함할 수도 있다.

용어 "실질적으로"는 "완전히"를 제외하지는 않으며, 예를 들어 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요하다면, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.

수치적 값 x에 대한 용어 "약"은 선택적이고, 예를 들어 x±10%을 의미한다.

"GI" 넘버링이 상기에 사용되었다. GI 넘버, 또는 "Genlnfo Identifier"는 서열이 그것의 데이터베이스에 부가될 때 NCBI에 의해 처리된 각 서열 기록에 연속하여 부여된 일련의 숫자이다. GI 번호는 서열 기록의 등록 번호와 유사성이 없다. 서열이 업데이트되면(예를 들어, 보정, 또는 더 많은 주석 또는 정보의 부가), 그것은 신규 GI 숫자를 받는다. 따라서 주어진 GI번호와 관련되는 서열은 결코 변하지 않는다.

달리 구체적으로 언급되지 않는다면, 2이상의 성분을 혼합하는 단계를 포함하는 과정은 혼합의 어떤 구체적 순서를 필요로 하지 않는다. 따라서 성분들은 임의의 순서로 혼합될 수 있다. 3가지 성분들이 있다면, 2성분들이 서로 합쳐질 수 있고, 이 혼합물은 제3 성분 등과 합쳐질 수 있다.

동물(및 특히 소) 물질이 세포의 배양물에서 사용되는 경우, 그것들은 전염성 해면양뇌증(TSE)이 없는, 특히 광우병이 없는 공급원으로부터 얻어져야 한다. 전반적으로 동물-유래 물질의 전체적 부재에서 배양물 세포가 바람직하다.

화합물이 조성물의 부분으로서 신체에 투여되는 경우, 이 화합물은 대안으로 적당한 프로드러그에 의해 치환될 수 있다.

세포 기질이 재교배 또는 역유전학 과정을 위해 사용되는 경우, 예를 들어, Ph Eur general chapter 5.2.3에 따라서 인간 백신 생성에서 사용을 위해 승인된 것이 바람직하다.

폴리펩티드 서열 사이의 동일성은 변수 갭 오픈 페널티=12 및 갭 확장 페널티=1로 아핀 갭 검색을 사용하여 MPSRCH 프로그램 (Oxford Molecular)에서 보충된 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘에 의해 바람직하게 결정된다.

본 발명을 수행하기 위한 방식

RP-HPLC를 1가의 인플루엔자 바이러스 항원 벌크("1가벌크(monobulks")에서 인플루엔자 HA를 정량화하는 방법으로서 시험하였다. RP-HPLC는 1가벌크가 높은 특이적 순도 및 안정한 HA를 가질 때 양호한 정량화를 제공하고, 정량 결과는 표준 SRID 결과와 밀접하게 매칭되는 것으로 발견되었다. 그러나 백신이 변형된 HA의 상당한 양에 포함될 때의 환경에서, RP-HPLC 방법은 더 이상 SRID 분석과 매칭되지 않는다.

예를 들어, 하기 표는 4개의 A/H3N2 모노벌크로부터 결과를 나타낸다. 전체 단백질 농도 (μg/ml)를 BCA에 의해 평가한 다음, HA 농도(μg/ml)를 SRID(표준 프로토콜)와 RP-HPLC에 의해 평가하였다. RP-HPLC를 Poros™ R1/10 column, 2.1 mm x 100 mm에서 수행하였고 0.8ml/분의 유속으로 60℃에서 작동시켰다. 이동상은 6.5분에 걸쳐 20%/80% 내지 0%/100%의 A/B 혼합물로부터 변화하는 (A) 0.1% TFA, 물 중의 5% 아세토니트릴; 및 (B) 100% 아세토니트릴 중의 0.1% TFA(용매 B)이었다.

RP-HPLC 전에, 1가벌크의 HA는 이미 HA1 및 HA2로 분해되었다는 것을 발견하였고 DTT(25mM의 최종 농도 후 10분 동안 90℃에서 가열)의 첨가는 이것들이 분리되었다는 것을 보장하였다. 샘플을 조정된 범위안으로 PBS에 의해 희석하였다. 본 방법을 HA(여과하지 않음)의 NIBSC 기준을 사용하여 조정하였다.

RP-HPLC는 HA1 피크를 용이하게 해상할 수 있었고, 따라서 이는 정량화를 위해 사용하였다. 결과는 하기와 같다:

따라서 HPLC는 1가벌크 A에 대해 SRID와 일치하였지만, B, C 또는 D에 대해서는 아니었다. 이 세 개의 1가벌크는 불량한 품질이 된다는 것을 발견하였다. 따라서 RP-HPLC 방법은 개선되어야 하고, 따라서 1가벌크의 품질과 관계없이 양호한 결과를 제공하였다.

예비-HPLC 처리 단계를 초미세여과를 사용하여 도입하였다. VivaSpin™ 30OkD MWCO 스핀 컬럼, PES 막과 함께 500μl 부피를 1가벌크에서 응집된 HA를 모으는 것을 발견하였고, 여과액을 RP-HPLC에 의해 용이하게 분석하여 SRID로 양호한 일치의 결과를 제공하였다.

초미세여과 전에, 샘플을 희석하여(필요하다면), < 100μg/ml의 단백질 농도를 제공하였다. 초미세여과와 RP-HPLC 단계 사이에, 여과액을 1% 최종 농도의 Zwittergent (9 부분 여과물 + 1부분 10% Zwittergent 10%)와 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. RP-HPLC를 전과 같이 수행하였다.

하기 표는 UF 단계 없이 측정되는 HA 함량과 비교하여, UF 처리 전 단계로 SRID 또는 RP-HPLC에 의해 측정되는 HA 함량을 나타낸다:

따라서 UF 전-처리 단계는 RP-HPLC 결과와 SRID 결과의 밀접한 관련성을 야기한다.

예비 실험을 또한 A/H1N1 균주로 수행하였다. 본 방법이 HA1을 성공적으로 정제하고, UF 전처리가 응집물을 제거할 수 있지만, RP-HPLC에 의해 측정되는 항원 내용물은 SRID와 관련성이 없었다. 그러나 관련 항원 표준이 시험될 때, 그것의 함량은 그것의 기준 값과 > 2-배로 다르다. 따라서 항원 표준은 결함이 있는 것으로 보이고, 따라서 이 실험의 결과는 신뢰할 수 없다.

결론적으로, RP-HPLC는, 특히 상당한 양의 변성된 HA를 가지는 1가벌크에서 HA 함량을 전체적으로 과대평가한다. 그러나 처리전 UF 단계 후, 값은 SRID와 매우 밀접하게 일치한다.

본 발명은 단지 예시의 방법으로써 설명되었고, 변형이 본 발명의 범주와 정신 내에서 유지되는 동안 만들어질 수 있다는 것은 이해될 것이다.

참고문헌

[1] Williams (1993) Vet Microbiol 37:253-262.

[2] Fitzgerald & Needy (1986) Dev Biol Stand 64:73-79.

[3] WO2005/090390.

[4] Kapteyn et al . (2006) Vaccine 24:3137-44.

[5] Kapteyn et al . (2009) Vaccine 27:1468-77.

[6] Garcia-Canas et al . (2007) Anal . Chem . 79(8): 3164-72.

[7] Michaelides (2008) Studies by Undergraduate Researchers at Guelph 1(2):7-19.

[8] WO96/37624.

[9] WO98/46262.

[10] WO95/18861.

[11] Bright et al. (2008) PLoS ONE 3:e1501.

[12] Crevar & Ross (2008) Virology Journal 5:131.

[13] Vaccines , (eds. Plotkin & Orenstein). 4th edition, 2004, ISBN: 0-7216-9688-0.

[14] Huckriede et al . (2003) Methods Enzymol 373:74-91.

[15] GenBank sequence GL325176.

[16] WO2008/032219.

[17] WO97/37000.

[18] WO2008/001221.

[19] WO90/14837.

[20] Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203.

[21] Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680.

[22] Vaccine Design : The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995

(ISBN 0-306-44867-X).

[23] Vaccine Adjuvants : Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. O'Hagan.

[24] Allison & Byars (1992) Res Immunol 143:519-25.

[25] Hariharan et al . (1995) Cancer Res 55:3486-9.

[26] US-2007/014805.

[27] WO95/11700.

[28] US patent 6,080,725.

[29] WO2006/113373.

[30] WO2005/097181.

[31] WOO1/22992.

[32] Hehme et al . (2004) Virus Res . 103(1-2): 163-71.

[33] Treanor et al . (1996) J Infect Dis 173:1467-70.

[34] Keitel et al. (1996) Clin Diagn Lab Immunol 3:507-10.

[35] Zangwill et al. (2008) J Infect Dis . 197(4):580-3.

[36] Gennaro (2000) Remington : The Science and Practice of Pharmacy . 20th edition, ISBN: 0683306472.

[37] Banzhoff (2000) Immunology Letters 71:91-96.

[38] Nony et al. (2001) Vaccine 27:3645-51.

[39] Poole & Mussett (1989) J Biol Stand 17:161-71.

[40] Poole et al . (1997) J. Endotoxin Res 4:221-31

[41] Potter & Oxford (1979) Br Med Bull 35: 69-75.

[42] Greenbaum et al . (2004) Vaccine 22:2566-77.

[43] Zurbriggen et al . (2003) Expert Rev Vaccines 2:295-304.

[44] Piascik (2003) J Am Pharm Assoc ( Wash DC ). 43:728-30.

[45] Halperin et al (1979) Am J Public Health 69:1247-50.

[46] Herbert et al . (1979) J Infect Dis 140:234-8.

[47] Mann et al . (2004) Vaccine 22:2425-9.

[48] Chen et al . (2003) Vaccine 21:2830-6.

SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG DORMITZER, Philip RINELLA, Paola WEN, Yingxia WU, Ping PALMER, Gene <120> ASSAYS FOR INFLUENZA VIRUS HEMAGGLUTININS <130> p054582wo <140> PCT/IB2010/001423 <141> 2010-05-28 <150> US61/217,405 <151> 2009-05-29 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 326 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 1 Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val 1 5 10 15 Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu 20 25 30 Leu Gly Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val Ala 35 40 45 Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 Glu Thr Pro Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Ile 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu 100 105 110 Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Thr Pro Asn His Asp Ser 115 120 125 Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser Phe 130 135 140 Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys 145 150 155 160 Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu 165 170 175 Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu Tyr 180 185 190 Gln Asn Ala Asp Thr Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser Lys 195 200 205 Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu 210 215 220 Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys Ile 225 230 235 240 Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe Ala 245 250 255 Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro Val 260 265 270 His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn Thr 275 280 285 Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys Pro 290 295 300 Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn 305 310 315 320 Ile Pro Ser Ile Gln Ser 325 <210> 2 <211> 326 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 2 Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val 1 5 10 15 Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu 20 25 30 Leu Glu Asp Asn His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Lys Gly Ile Ala 35 40 45 Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Ser Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Glu Cys Glu Ser Leu Phe Ser Lys Lys Ser Trp Ser Tyr Ile Ala 65 70 75 80 Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe Ala 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu 100 105 110 Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Lys His Asn Val 115 120 125 Thr Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Ser His Lys Gly Lys Ser Ser Phe 130 135 140 Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys Asn Gly Ser Tyr Pro Asn 145 150 155 160 Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu 165 170 175 Trp Gly Val His His Pro Ser Asn Ile Glu Asp Gln Lys Thr Ile Tyr 180 185 190 Arg Lys Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Asn Arg 195 200 205 Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asn Gln Glu 210 215 220 Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile 225 230 235 240 Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala 245 250 255 Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Ser Met 260 265 270 Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn Ser 275 280 285 Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro 290 295 300 Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn 305 310 315 320 Ile Pro Ser Ile Gln Ser 325

Claims

(i) 샘플의 초미세여과로 여과액을 제공하는 단계; 및 (ii) 여과액의 RP-HPLC로 그 안의 어떤 다른 성분들로부터 임의의 HA를 분리하는 단계를 포함하는, 샘플에서 인플루엔자 바이러스 HA를 정제하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (i)은 300kDa 컷오프를 가지는 초미세여과 막을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (ii)는 500-5000 Å의 기공 크기를 가지는 폴리스티렌디비닐벤젠 입자의 RP-HPLC 지지체를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 단지 하나의 인플루엔자 바이러스 균주로부터 HA를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, HA는 인플루엔자 A 바이러스 HA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, HA는 H1, H3 또는 H5 HA인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, HA는 인플루엔자 B 바이러스 HA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 내 HA는 인플루엔자 비리온으로부터인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 (i) 인플루엔자 바이러스 HA 및 (ii) 인플루엔자 바이러스 항원 PB1, PB2, PA, NP, NA, M1, M2, NS1 및/또는 NS2를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 전체 인플루엔자 비리온을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 분할 인플루엔자 비리온을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 인플루엔자 비리온으로부터 정제된 표면 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, HA는 HA1인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 혈청 성분, (ii) 난 단백질, 및/또는 (iii) 닭 DNA가 없는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 인플루엔자 바이러스 단백질을 제외한 바이러스 단백질을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 세제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 벌크 백신인 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 제1항 내지 제17항의 방법에 의해 백신 또는 그것의 샘플 내의 HA를 정제하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 결과를 사용하여 백신 내 HA 농도를 계산하는 단계를 포함하는, 백신을 분석하는 방법
(a) 제16항 방법에 의해 백신 또는 그것의 샘플 내의 HA를 정제하는 단계; (b) 단계 (a)의 결과를 사용하여 벌크 백신 내 HA 농도를 계산하는 단계를 포함하는 백신을 분석하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 결과를 사용하여 벌크 백신을 희석하여 원하는 HA 농도를 제공하는 단계를 포함하는, 원하는 HA 농도를 가지는 벌크 백신을 제공하는 방법.
제19항에 있어서, 원하는 HA 농도는 1 내지 150μg/ml, 예를 들어 90μg/ml, 45μg/ml, 30 μg/ml, 15 μg/ml, 10 μg/ml, 7.5 μg/ml, 5 μg/ml, 3.8 μg/ml, 3.75 μg/ml, 1.9 μg/ml, 또는 1.5 μg/ml인 것을 특징으로 하는 방법.
제19항 또는 제20항의 방법에 의해 원하는 HA 함량을 가지는 벌크 백신을 제조하는 단계; 및 이어서 희석된 벌크로부터 하나 이상의 단위 용량의 백신을 추출하는 단계를 포함하는, 환자 사용을 위한 백신을 제공하는 방법.
제21항에 있어서, 추출된 단위 용량은 제2 키트 구성요소와 조합하여 키트 구성요소로서 포장되며, 제2 키트 구성요소는 백신 면역증강제인 것을 특징으로 하는 방법.
제19항 또는 제20항의 방법에 의해 원하는 HA 함량을 가지는 벌크 백신을 제조하는 단계; 및 이어서 희석된 벌크 백신을 면역증강제와 혼합하는 단계를 포함하는 벌크 면역증강된 백신을 제공하는 방법.
제23항의 방법에 의해 벌크 면역증강된 백신을 제공하는 단계; 및 이어서 하나 이상의 단위 용량의 백신을 벌크로부터 추출하는 단계를 포함하는, 환자 사용을 위한 면역증강된 백신을 제공하는 방법.