FI86801C - Foerfarande foer framstaellning av immunogent komplex och medelst foerfarandet framstaellt diagnostiskt reagens - Google Patents

Description

1 86801

Menetelmä immunogeenisen kompleksin valmistamiseksi ja menetelmällä valmistettu diagnostinen reagenssi

Keksintö koskee menetelämää immunogeenisen kom-5 pieksin valmistamiseksi ja menetelmällä valmistettua diagnostista reagenssia. Valmistetaan immunogeenisen kantaja-aineen immuunikompleksia yhden tai useamman molekyylin kanssa, jonka toivotaan tulevan immunogeeniseksi tai jonka immunogeenisuutta toivotaan lisääntyvän vasta-ainei-10 den muodostumisen aikaansaamiseksi analyysitarkoituksia varten, sairauden tai taudin määrittämiseksi, biologisen kohteen tutkimiseksi tai rokotteen valmistamiseksi.

Rokote on perinteisesti koostunut kokonaisista mikro-organismeista, jotka on tehty vaarattomiksi tai ei-pa-15 togeenisiksi tappamalla ne tai heikentämällä niitä. Esimerkiksi, viruksia on heikennetty viljelemällä niitä vieraassa isännässä tai isäntäsolussa tai niitä on viljelty muissa erityisolosuhteissa.

Rokotteen seuraava kehitys perustuu spesifisiin 20 mikro-organismikomponentteihin, jotka vastaavat immunitee tin stimuloinnista antaen suojan infektiota vastaan. Sellaisille komponenteille voidaan antaa parannettu immunogee-nisuus järjestämällä ne fysikaalisesti määrätyiksi multi-meerimuodoiksi, kuten esimerkiksi proteiinimiselleiksi, li-25 pidirakkuloiksi (liposomit), edellyttäen että läsnä on hydrofobinen alue (Morein et ai., 1978, Effective subunit vaccines against enveloped animal viruses; Nature, 276, 715-718). Vielä parempi immunogeeninen vaikutus on saatu sisällyttämällä hydrofobisia proteiineja ja peptidejä kom-30 pleksiin (EP-hakemus 83850273.0), jolle on annettu nimi is-kom.

Oletetaan, että kolmas ja neljäs rokotesukupolvi käsittää peptidejä ja proteiineja, jotka on valmistettu yh-distelmä-DNA-tekniikoiden avulla tai ne sisältävät synteet-35 tisesti valmistettuja peptidejä tai hiilihydraatteja. Viimeksi mainitut voidaan valmistaa synteettisesti tai ne saa- 2 86801 tetaan valmistaa puhtaassa muodossa, esimerkiksi biologisesta materiaalista, joka on valinnaisesti sidottu peptidi-proteiiniin tai lipidiin. Monia sellaisia tuotteita valmistetaan ja ne ovat rokotteina vielä käyttämättömiä. Tähän 5 mennessä, kaikki yritykset tehdä sellaiset valmisteet riittävän immunogeenisiksi yleisten menetelmien avulla, ovat epäonnistuneet ellei valmisteita ole kytketty kantajaraken-teeseen, kuten esimerkiksi häränseerumialbumiiniin tai KLHriin (Keyhole Limpet Haemosyanine) ja sekoitettu adjuva-10 ntin, esim. öljyadjuvantin kanssa. Sellaisia tuotteita on kuitenkin mahdotonta hyväksyä rokotteina, mm. koska kanta-ja-ainerakennetta ei voida hyväksyä eikä ilmeisten sivuvaikutusten vuoksi. Lisäksi, pääosassa tapauksia tarvittava antigeeniannos on 100 - 1000 kertaa suurempi kuin tarvit-15 tava annos, kun vastaavia antigeenirakenteita käytetään immunisointiin ja niitä on läsnä mikro-organismissa; toisinaan voi tarvittava antigeeniannos olla suurempi kuin edellä mainittu 1000-kertainen annos.

Tavanomaisesti käytettäessä tunnetut adjuvantit 20 ovat tehokkaita ainoastaan, kun niitä käytetään niin suurina annoksina, että ne saavat aikaan sivuvaikutuksia, joita ei voida hyväksyä. Yritettäessä välttää tätä, muranyyli-peptidiksi (MDP) nimitetty adjuvantti on sidottu kovalent-tisesti antigeeniin (peptidi) ja täten saavutetaan adju-25 vanttivaikutus käyttämällä MDP alhaisina annoksina. Arnon, R., Sela, M., Parant, M. ja Chedid, L., 1980, Proc. na. Acad. Se. USA 77, 6769-6772. Tämäntyyppinen konjugaatti on suhteellisen vaikea ja kallis valmistaa ja tähän mennessä on rajoituttu koevaiheeseen.

30 Nyt on havaittu, että proteiinit ja peptidit, eri tyisesti ne, jotka on valmistettu synteettisesti, hiilihydraatit, glykolipidit, ja muut pienet molekyylit, esimerkiksi biotiini sekä erityisesti ne, jotka eivät ole riittävän immunogeenisia, voidaan tehdä immunogeenisiksi kytkemällä 35 ne EP-hakemuksen 83850273.0 mukaiseen immunogeeniseen kan-tajakompleksiin, ns. iskomiin. Keksinnön mukaiselle mene- 3 86801 telmälle on tunnusomaista se, mitä vaatimuksessa 1 esitetään.

Iskom on glykosidin (adjuvantti) ja hydrofobisten, antigeenisten proteiinien tai peptidien välinen kompleksi.

5 Nämä proteiinit tai peptidit ovat sellaisia, että niiden käyttö voidaan hyväksyä rokotteiden valmistuksessa. Adjuvantti (glykosidi) voi toimia iskomissa konsentraatioina, jotka ovat paljon niiden konsentraatioiden alapuolella, joita käytetään tavanomaisesti ja se sekoitetaan antigeenin 10 kanssa. Adjuvantin aiheuttamien sivuvaikutusten ongelma vältetään tällä tavalla.

Kyseessä olevan keksinnön mukaisesti iskom-valmis-te, joka sisältää immunogeenisen peptidin tai immunogeeni-sen oroteiinin ja täten stimuloi immuunivastetta, mm. vas-15 ta-aineen muodostumista sitä vastaan, voidaan nyt kytkeä edellä mainittuihin molekyyleihin. Primaarinen iskom muodostaa kantajarakenteen, johon molekyylit kytketään. Tällä tavalla saadaan vasta-aineet primaarisessa iskomissa sijaitsevaa peptidiä tai proteiinia vastaan sekä siihen kyt-20 kettyjä molekyylejä vastaan.

Primaarisen iskomin sitomista varten peptidiin, jota esim. on tarkoitus käyttää rokotteessa, tulisi edullisesti sisältää kapseliproteiini, joka sinänsä on käyttökelpoinen rokotteena. Useita lisäpeptidejä, jotka vastaavat 25 determinantteja (epitooppeja), jotka ovat peräisin erilaisista mikro-organismeista, voidaan kytkeä primaariseen is-komiin, joka sinänsä on rokote yhtä tai useampaa mikro-organismia tai viruksia vastaan. Tällä tavalla voidaan valmistaa monenarvoisia rokotteita.

30 Uudella kompleksilla on samanlainen morfologinen rakenne elektronimikroskopian perusteella kuin kantajara-kenteella ts. primaarisella iskomilla. Morfologiassa tapahtuva muutos havaitaan kuitenkin, kun primaariseen iskomiin kytketään suuria molekyylejä. Hiiriä immunisoitiin kyseessä 35 olevan keksinnön mukaisella kompleksilla käyttäen noin 1 -10 pg:n suuruisia annoksia, jotka aikaansaivat immuunivas- 4 86801 teen ilman havaittavia sivuvaikutuksia. Saattaa olla tarpeellista suurentaa tai pienentää annosta sekä immunisoida useammin kuin kerran.

Primaariseen iskomiin kytketyt molekyylit saattavat 5 olla peptidejä, proteiineja, hiilihydraatteja tai muita molekyylejä, jotka samoin kuin primaariseen iskomiin sisältyvät peptidit tai proteiinit, on saatu mikroorganismeista (katso alla) tai ne edustavat mikro-organismien antigeenisiä determinantteja. Jos iskomia on saatavissa suuria mää-10 riä, voi olla käytännöllisempää kytkeä valmistettuun iskomiin se peptidi tai se proteiini, jota vastaan halutaan vasta-aineita, pikemmin kuin valmistaa uusi iskom.

Primaarisessa iskomissa kompleksiin sidottujen proteiinien ja peptidien täytyy olla hydrofobisia (vrt. EP-ha-15 kemus 83850273.0). Niiden molekyylien, jotka ovat kytketyt primaariseen iskomiin kyseessä olevan keksinnön mukaisesti, ei tarvitse olla hydrofobisia, mutta niiden tulee olla vain jonkin laatuisia kytkentämolekyylejä, esimerkiksi sellaisia, joita on esitetty tässä yhteydessä myöhemmin.

20 On olemassa mikro-organismien tiettyjä tyyppejä, joita ei voi kasvattaa rokotetta varten suuressa mittakaavassa. Malaria on eräs esimerkki. On syntetisoitu antigeenisiä aminohapposekvenssejä (peptidejä), jotka vastaavat malariaproteiinien antigeenideterminantteja, joita pidetään 25 suojaavan immuniteetin antajina. Näitä peptidejä ei kuiten kaan ole havaittu riittävän immunogeenisiksi. Näiltä peptideiltä usein puuttuu sopiva hydrofobisuus iskomien muodostamiseksi. Vaikka on mahdollista kytkeä peptideihin hydrofobinen molekyyli ja valmistaa iskom siitä, saattaa olla 30 sopivampaa, mm. tekniseltä ja immunogeenisuuden kannalta, kytkeä peptidit primaariseen, jo valmistettuun iskomiin. Täten on myös mahdollista valmistaa yhdistetty rokote sekä malariaa ja, esimerkiksi, poliomyelitistä vastaan (kompleksiin sidottu poliopeptidi primaarisessa iskomissa).

35 Primaariseen iskomiin kytketyt peptidit ovat mieluum min synteettisiä tai mikro-organismeista puhdistettuja ja 5 86801 usein ne ovat analysoituja sen seikan varmistamiseksi, että ne sisältävät antigeenideterminantteja. Determinanttiepi-toopin klassinen koko on 1-4 aminohappoa. Mieluummin ne sisältävät aminohappoja aina 40 saakka, sopivasti 10-25 ami-5 nohappoa. Peptidit, joissa on enemmän kuin 25 aminohappoa, ovat vaikeat syntetisoida ja niillä on taipumuksena taittua kokoon ja kätkeä antigeenideterminantit.

Jos peptidit ovat lyhyitä ja sisältävät vähemmän kuin n. 10 aminohappoa tai jos ne sisältävät hydrofobisia ryhmiä, 10 joilla on taipumus taittua kokoon tai taipua primaarisessa iskomissa sijaitsevia hydrofobisia osia kohti, saattaa olla sopivaa siirtää ne primaarisen iskomin ulkopuolelle pidentämällä niitä ns. välikkeillä, jotka ovat alifaattisia ketjuja, joissa on 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 tai 12 hii-15 liatomia, sopivasti 6, 7, 8 hiiliatomia, joissa on 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 OH-ryhmää, jotka tekevät alifaattisen ketjun hydrofiiliseksi ja ketjun päässä toiminnallinen kvtkentä-ryhmä (kuten esimerkiksi sellainen, joita on lueteltu si-20 vulla 7) kunkin ketjun päässä, esimerkiksi NH2”/ COOH-, SH- tai OH-ryhmän, kuten esimerkiksi glukoosiamiinit tai peptidi, joka käsittää 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 aminohappoa, mieluummin hydrofiilisia aminohappoja, esimerkiksi glysiinin tai pro-25 liinin, kuten esimerkiksi polyglysiini tai polyproliini. Välike kytketään mieluummin ensin primaariseen iskomiin ja sitten peptidiin terminaalisten, toiminnallisten ryhmien avulla, käyttäen siihen yhtä seuraavista kytkentämenetel-mistä.

30 Esimerkkeihin molekyyleistä, jotka voidaan kytkeä kantajamolekyyliin, kuuluu syklisiä ja lineaarisia proteiineja ja peptidejä, jotka on tässä yhteydessä myöhemmin lueteltu iskomin valmistuksen yhteydessä; lineaarisia tai syklisiä, synteettisiä peptidejä tai peptidejä, jotka on 35 valmistettu hybridi-DNA-tekniikan avulla, aminohappo- sekvenssein, esimerkiksi malarialle ominaisin sekvenssein, 6 86801 peptidejä, jotka ovat peräisin poliovirukselta, erityisesti 277-300 peptidit, jotka ovat peräisin hepatiitti-B-viruk-selta, erityisesti peptidit alueissa 32-74, 110-156; ja erityisesti peptidit, jotka sisältävät aminohapposekvens-5 sit 144-145; vesikauhuvirus, erityisesti peptidit alueissa 1- 50, 290-320 ja erityisesti alueessa 100-175; influenssa-viruspeptidit, jotka sisältävät aminohapposekvenssit 140— 146, 187-196 tai peptidit, jotka on valittu alueelta Cys 52-Cys 278 tai 207-220; suu- ja sorkkatautiviruspeptidit 10 141-160, 144-160, 146-154, 144-150, 142-158; T-solujen kas vutekijät (interleukiini II), mieluummin peptidit, joissa on aminohapposekvenssit 79-92, 139-153C, 111-125 ja 18-32C, peptidejä Epstein Barr -viruksesta, erityisesti sekvenssit A: Asp, Vai, Gly, Gly, Lys, Lys, His, Gin, Lev, Asp, Cys, 15 Leu, Leu, B: His, His, Ala, Glu, Asn, Gin, Asn, Pro, Cys,

Leu, Leu, C: Ala, Trp, Pro, Asn, Asn, Thr, Glu, Thr, Asp,

Phe, Lys, Cys, Leu, Leu; antigeenideterminantit HTLV 1-, 2- tai 3-viruksilta; veriryhmätekijöissä esiintyviä peptidejä.

20 Kyseessä olevan keksinnön mukaisesti on myös pri maariseen iskomiin mahdollista kytkeä peptidejä, polypeptide jä ja pitkäketjuisia proteiineja, joita vastaan halutaan aikaansaada vasta-aineita ja erityisesti hormoneja, peptidihormoneja sekä prostaglandiineja, joista seuraa-25 vat voidaan mainita esimerkkeinä: tyrotropiini, adenokor-tikotropiini, luteinisoiva hormoni, gonadotropiinia vapauttava hormoni (LHRH), follikkelia stimuloiva hormoni, pro-laktaani, kasvuhormini, oksitosiini, vasopressiini, para-tyreoideahormoni, kalsitoniini, insuliini, glukagoni. Ha-30 lutaan myös valmistaa vasta-aineita entsyymejä kohtaan, jotka voidaan kytkeä kyseessä olevan keksinnön mukaisesti. Tässä yhteydessä esimerkkeinä voidaan mainita lysotsyymi ja peroksidaasi. Nämä entsyymit saattavat sisältää enemmän kuin 40 aminohappoa.

35 Iskomiin on myös mahdollista kytkeä hiilihydraat teja ja hiilihydraatteja sisältäviä rakenteita, kuten 7 86801 esimerkiksi lipopolysakkarideja, polysakkarideja, jotka ovat peräisin kapselin käsittävistä mikro-organismeista, kuten esimerkiksi E. colilta; ja erityisesti K-antigeenit 1-13, Haemophilus influenza, meningococcus, veriryhmäte-5 kijöiden, gangliosidien, kuten esimerkiksi GM1:n ja gli-omgangliosidien glykoproteiinien oligosakkaridiosa. Käytännön etua saatetaan saada veriryhmäanalyysin suhteen, kun valmistetaan vasta-aineita veriryhmätekijöitä kohtaan. Gliomgangliosidit muodostuvat muutosten avulla, joita ta-10 pahtuu aivokasvaimissa sijaitsevissa gangliosideissa ja näitä gliomgangliosideja vastaan valmistettuja vasta-aineita saatetaan käyttää aivokasvaimien taudinmääritykseen.

Muita esimerkkejä aineista, joita saatetaan kytkeä kantajaan, ovat lipoproteiinit, muut glykoproteiinit ja 15 biotiini.

Nämä molekyylit voidaan kytkeä primaariseen isko-iii i i n toiminnallisten ky Lken täryhmien avulla, joita jo sijaitsee primaarisessa iskomissa tai jotka kytketään primaarisessa iskomissa sijaitseviin molekyyleihin ja toimin-20 nallisiin ryhmiin, esimerkiksi proteiineissa tai peptideissä sijaitsevissa aminohapoissa tai glykosideissa sijaitseviin HO-, CHO- tai HOOC-ryhmiin. Tunnettuja kytken-täreaktioita sovelletaan käytäntöön tässä suhteessa. Sopivimmat kytkentäryhmät tällöin ovat: 25 Toiminnallinen Aktivointireagenssi Toiminnallinen ryh- ryhmä kytkettävän mä primaarisessa molekyylin pinnalla iskomissa -NH2 (Ct tai £) glutaraldehydi -NH2

karbodi-imidit -C02H

30 di-imidoesterit -NH2 di-isosyanaatit -NH2(-OH)

MeO-Cl2-triatsiini -OH, -SH, -NH2 aryylihalogenidit -NH2, -C02H karbodi-imidit -NK2(-OH) 35 -SH MeO-Cl2-triatsiini -OH, -SH, -NH2 alkyylihalogenidit -SH, (-NH2, Kis) 8 86801

Toiminnallinen Aktivointireagenssi Toiminnallinen ryh- ryhmä kytkettävän mä primaarisessa molekyylin pinnalla iskomissa jodietikkahappo + -NH2 5 karbodi-imidi

maleimidit -SH

-OH (Tyr) MeO-Cl2~triatsiini -OH, -SH, -NH2

aryylihalogenidit -NH0, -OH, -SH

aromaatit bis-diatsonium- aromaattiset 10 Tyr:n, His:n yhdisteet Tyr, His, Lys kanssa CHO pH:n säätö yli 8 -NH2 vierusasema per jodaattimuodot -MH2

CHO

15 OH pH:n säätö yli 8 CHO hydratsiini

OH pH:n säätö 9-10:ksi -NIU

NH2 kuten yllä CHO, OH

Useita kvtkentäryhmiä ja -menetelmiä löytyy kuvat-20 tuina julkaisuissa Journal of Immunological Methods, 59 (1983), 129-143, 289-299; Methods in Enzymology, osa 93, sivut 280-333; ja Analytical Biochemistry 116, 402-407 (1981), jotka on liitetty tähän yhteyteenviitteinä.

Kyseessä olevan keksinnön mukainen uusi kompleksi 25 valmistetaan muodostamalla ensin kantaja, primaarinen is-kom (FI-patentti 80600) ja kytkemällä siihen sitten niitä molekyylejä, jotka on tehtävä immunogeenisiksi tai joiden immunogeenisuutta on voimistettava.

j-. Iskomin valmistaminen (primaarinen iskom) 30 Immunogeeninen kompleksi antigeenisten proteiinien tai peptidien, joilla on hydrofobisia alueita, ja glykosi-din välillä, valmistetaan sekoittamalla proteiineja tai peptidejä, joilla on hydrofobisia alueita yhden tai useamman liuottavan aineen kanssa, jolloin kompleksi muodostuu va-35 rattujen, monomeeristen antigeeniproteiinien tai peptidien sekä liuottavan aineen välille, jonka jälkeen 9 86801 monomeeriset antigeeniproteiinit tai peptidit erotetaan liuottavasta aineesta glykosidiliuoksen läsnä ollessa, joka sisältää yhden tai useampia glykosideja, joilla on hydrofobisia ja hydrofiilisia alueita, konsentraationa, joka 5 on vähintään yhtä suuri kuin kriittinen, misellin konsen-traatio taj vaihtoehtoisesti erotetaan liuottavasta aineesta ja siirretään suoraan edellä mainittuun glykosidi-liuokseen, jolloin kompleksi muodostuu proteiinien tai peptidien ja glykosidin välille, tämä kompleksi eristetään ja 10 puhdistetaan.

Hydrofobisia alueita käsittävät proteiinit tai peptidit, jotka kytketään glykosidien hydrofobisiin alueisiin, saattavat olla A) amfifaattisia proteiineja tai peptidejä, joilla 15 on hydrofiilisia ja hydrofobisia ryhmiä, jotka ovat peräisin seuraavista lähteistä tai ovat kapselin käsittävien virusten, bakteereiden, mykoplasmain, parasiittien tai eläinsolujcn membraaniproteiineja tai membraanipeptidejä tai ovat sellaisia proteiineja tai peptidejä, hybridi-DNA- 20 tekniikalla valmistettuina tai synteettisesti valmistettuja molekyylejä, B) hydrofiilisia proteiineja tai peptidejä, jotka on tehty amfifaattisiksi kytkemällä niihin hydrofobisia ryhmiä. Nämä proteiinit tai peptidit saattavat olla peräi- 25 sin viruksista, bakteereista, mykoplasmoista, parasiiteistä, eläinsoluista tai ne saattavat olla syntetisoituja tai saatu hybridi-DNA-tekniikalla, C) amfifaattisia proteiineja tai peptidejä, jotka on saatu hydrofiilisten proteiinien luoksepääsemättömillä 30 hydrofobisilla osilla tekemällä ne luoksepäästäviksi kemiallisin keinoin. Nämä proteiinit saattavat olla peräisin yllä mainituista mikro-organismeista tai soluista tai ne on saatu yhdistelmä-DNA-tekniikalla tai ne on syntetisoitu.

a) Kokonaisista soluista tai viruksista peräisin 35 olevien membraanipeptidien tai membraaniproteiinien valmistus periaatteessa käsittää kolme vaihetta: eläinsolujen 10 86801 tai mikro-organismien tai niiden fragmenttien puhdistamisen ja eristämisen; hydrofobisten proteiinien liuottamisen ja liuottavan aineen poistamisen, samalla kun haluttu antigeeni siirretään kompleksiin immunogeenisessä muodossa 5 olevan glykosidin avulla (immuunikompleksi).

Puhdistus ja eristys

Kapselin käsittävät virukset, mykoplasmat, bakteerit, parasiitit ja eläinsolut konsentroidaan ja puhdistetaan tunnetulla tavalla (viitteitä katso, "The Tools 10 of Biochemistry", T.G. Cooper, John Wiley & Sons (1977)

New York, joka on tässä yhteydessä liitetty viitteenä), esimerkiksi sentrifugoimalla, ultrasentrifugoinnin avulla, elektroforeesilla ja erilaisin kromatografisin menetelmin, kuten esimerkiksi geelisuodatuksen, hydrofobisen vuorovai-15 kutuksen, affiniteettikromatografiän avulla tai sokeri-gradientin läpi suoritetun sentrifugoinnin tai perkollin läpi suoritetun gradienttisentrifugoinnin avulla tai onte-lokuidun avulla suoritetulla dialyysillä. Bakteereiden suhteen voi olla tarpeellista tai edullisempaa ensin liuot-20 taa ja pilkkoa solunseinämät (viitteitä katso, Cota-Robles ja Stein, CRC Handbook of Microbiology, osa II (1973) s.

. 833-844, joka on tähän yhteyteen liitetty viitteenä) esim.

ultraäänellä tai ranskalaisella puristimella (French press) suoritetun käsittelyn avulla.

25 Liuottaminen

Puhdistetut eläinsolut tai mikro-organismit tai niiden osat sekoitetaan sitten ionisen, ei-ionisen tai kahtaisionisen detergentin kanssa, jota käytetään ylimääriä. Sopivien, ionittomien detergenttien tyypillisiä esimerkkejä 30 ovat polyglykoliesterit ja polyglykolieetterit alifaattisten tai aryvlialifaattisten happojen ja alkoholien kanssa. Esimerkkejä näistä ovat alkyylipolyoksietyleenieetterit, joiden yleinen kaava on CnH2n+^ (OCH2CH2) X0H' -Lyhennettynä CfiEx; aikyy-lifenyylipolyoksietyleenieetterit, jotka sisältävät fenyvliren-35 kaan alkyyliryhmän ja polyoksietyleeniketjun, lyhennettyinä 11 86801 C φΕ , välissä, esim. Triton X-100 = tert-CQ0E (poly-n x o y, o etyleenioksidin oktyylifenolieetteri), asyylipolyoksiety-leeniesterit; asyy1ipolyoksietyleenisorbitaaniesterit, lyhennettyinä Cn-sorbitaani-Ex, esim. Tween 20, Tween 80, 5 /J-D-alkyyliglukosidit, esim. /3^D-oktyyliglukosidi . Voidaan käyttää myös alla mainittuja glykosideja, erityisesti saponiinia. Nämä ovat kuitenkin heikkoja detergenttejä ja niitä tulisi käyttää yhdessä muiden detergenttien kanssa. Tyypillisiä esimerkkejä sopivista gallushappodetergenteis-10 tä ovat esimerkiksi desoksikolaatti ja kolaatti. Voidaan käyttää vieläpä konjugoituja detergenttejä, kuten esimerkiksi taurodeoksikolaattia, glykodeoksikolaattia ja gly-kolaattia. Mahdollisia amfoteerisia detergenttejä ovat ly-solesitiini sekä synteettiset lysofosfolipidit. Voidaan 15 käyttää vieläpä yllä mainittujen detergenttien seoksia.

Liuottaminen voidaan myös suorittaa alkoholien, orgaanisten liuottimien tai pienten amfifaattisten molekyylien, kuten esimerkiksi heptaani- 1,2,3-triolin, heksaa-ni-1,2,3-triolin, etikkahapon tai niiden seosten tai 20 detergenttien avulla.

Liuottavaa ainetta käytetään ylimäärin lipidin ja hydrofobisten proteiinien määrään verrattuna. Sopivat solut ja mikro-organismit sekä detergentti sekoitetaan painosuhteessa 1:3 - 1:10.

25 Solut tai mikro-organismit sekä liuottava aine se koitetaan puskuroidussa, mahdollisesti keittosuolaliuoksessa. Keittosuolaliuoksen molaarisuus on 0,02 - 0,5 M, mieluummin 0,05 - 0,25 M. 0,1 - 0,2 M on edullinen. Deter-gentin pitäisi vaikuttaa noin tunnin ajan huoneen lämpöti-30 lassa.

Natriumkloridi on edullinen suolana, mutta muutkin suolat voidaan ottaa huomioon, erityisesti suolat alkali-ionien, maa-alkali-ionien ja ammoniumionien sekä voimakkaiden happojen ja orgaanisten happojen, kuten esimerkiksi 35 etikkahapon, trikloorietikkahapon, muurahaishapon ja oksaalihapon kanssa. Puskureiksi soveltuvat kaikki aineet, 12 86801 jotka puskuroivat pH:n välille 6,5 - 9. Kolaatteja ja desok-sikolaatteja käytettäessä pH 8-9 on edullinen ja kun käytetään ionittomia detergenttejä, on pH 7,4 edullinen. Orgaanisia happoja käytettäessä proteiinien liuottamiseen, puskuri voi-5 daan jättää pois.

Immunogeenikompleksien valmistus

Kun solut ja mikro-organismit on liuotettu, muodostuu liuottavan aineen ja solu- tai mikro-organismifragmenttien seos (tässä yhteydessä myöhemmin nimitetty fragmenteiksi).

10 Fragmenttien joukossa on varattuja, monomeerisia antigeeni-proteiineja, hydrofobisin aluein, kompleksina liuottavan aineen kanssa. Immunogeenikompleksi (primaarinen iskom) valmistetaan erottamalla varatut raonoraeeriset antigeeniprote-iinit liuottavasta aineesta yhden tai useamman glykosidin 15 läsnä ollessa tai suoraan niille siirrettyinä, jolloin gly-kosideilla täytyy olla hydrofobisia tai hydrofiilisiä alueita ja niitä täytyy olla vähintään kriittisenä miselli-konsentraationa. Fragmenttien jäännös poistetaan, ennen kuin kompleksi valmistetaan, samalla kun se valmistetaan 20 tai jälkeenpäin, mieluummin ennen.

Kantajakompleksi voidaan valmistaa joko poistamalla liuottava aine, esim. dialyysin, geelisuodatuksen tai kro-matografian avulla liuottavan aineen, varattujen monomee-risten antigeeniproteiinien, glykosidin ja mahdollisesti 25 muiden fragmenttien seoksesta tai erottamalla varatut, mo-nomeeriset antigeeniproteiinit mainitusta seoksesta, esim. gradienttisentrifugoinnin, kromatografiän tai elektroforeesin avulla. Olennaisena piirteenä on, että monomeeriset antigeeniproteiinit erotetaan liuottavasta aineesta glykosi-30 dien samanaikaisesti ollessa läsnä tai erottamisen jälkeen ne siirretään suoraan glykosidille, jonka misellimuodon tulee olla läsnä. Kun monomeeriset antigeeniproteiinit erotetaan liuottavasta aineesta, niin että ne voivat olla suorassa kosketuksessa glykosidin kanssa, muodostuu erityinen kom-35 pieksi. Oletetaan, että glykosidin misellimuoto on perustana 13 86801 kompleksin muodostumiselle ja tämä muodostuu glykosidi-misel-lien pinnalla sijaitsevien hydrofobisten alueiden ja membraa-niproteiinien pinnalla sijaitsevien hydrofobisten alueiden välisen vetovoiman avulla. Glykosidin määrä kompleksissa vaihte-5 lee riippuen käytetystä glykosidista ja kompleksiin sidotuista membraaniproteiineista ja se on 0,5 - 50 paino-%, erityisesti 0,5 - 25 paino-%, mieluummin 0,5 - 15, usein 0,5 - 10 ja erityisesti 2-8 paino-%. Jos varatut, monomeeriset antigeenipro-teiinit erotetaan liuottavasta aineesta glykosidin poissa ol-10 lessa, muodostuu kuitenkin proteiinimisellejä, jotka ovat sentyyppisiä kuin on valmistettu EP-hakemuksen 81102213.6:n mukaan.

On sopivaa poistaa muut fragmentit gradienttisentri-fugoinnin avulla, koska kyseessä olevien komponenttien se-dimentaatiovakiot pienenevät seuraavassa järjestyksessä: 15 solufragmentti, proteiinikompleksi liuottavan aineen tai glykosidin kanssa, monomeeriset proteiinit ja liuottava aine. Täten muut fragmentit voidaan poistaa gradienttisentri-fugoinnin avulla seoksesta, jossa on liuottava aine, mono-meerisiä proteiineja sekä muita fragmentteja, ennen kuin 20 glykosidi lisätään ja liuottava aine poistetaan, esim. dialyysin, geelisuodatuksen, kromatografiän avulla tai mo nomeeriset proteiinit poistetaan liuottavasta aineesta, . ; esim. elektroforeesin, kromatografiän tai gradienttisentri- fugoinnin avulla. Viimeksi mainitussa menetelmässä on myös 25 mahdollista poistaa muut fragmentit saman gradienttisentri-fugoinnin avulla, juuri kun kompleksi muodostuu. On myös mahdollista erottaa muut solukomponentit, sen jälkeen kun kompleksi on muodostunut yllä mainitulla tavalla, esim. sentrifugoinnin, affiniteettikromatografiän tai geelisuo-30 datuksen avulla.

Glykosidi voi olla mikä tahansa glykosidi vain hyd-rofiilisin ja hydrofobisin aluein. Mieluummin käytetään saponiineja, joita kuvataan julkaisussa R. Tcshesche ja Wulf, Chemie and Biologie der Saponine in Fortschritte der 35 chemie Organischer Naturstoffe, julkaisijat W. Herz, 14 86801 H. Grisebach, G.W. Kirby, osa 30 (1973), erityisesti voimakkaasti polaarisia saponiineja, ensisijaisesti polaarisia triterpeenisaponiineja, kuten esimerkiksi polaarisia, happamia bisdesmosideja, esim. saponiiniuutetta, joka on 5 saatu Quillajabark Aralosidi A:sta, Chikosetsusaponen IVrstä, Calendula-glykosidi C:stä, Chikusetsusaponin V:stä, Achy-ranthes-Saponin B:stä, Calendula-glykosidi A:sta, Araloside B:stä, Araloside C:stä, Putranjia-Saponin III:sta, Bersama-saponosidista, Putranjia-Saponin IV:stä, Trichoside A:sta, 10 Trichoside B:stä, Saponaside A:sta, Trichoside C:stä,

Gypsosidesta, Nutanosidesta, Dianthoside C:stä, Saponaside D:stä, mieluummin Aesculus hippocastanumista peräisin olevasta aescineste (T. Patt ja W. Winkler: Das therapeutisch wirksame Prinzip der Rosskastanie (Aesculus hippocastanum), 15 Arzneimittelforschung 10 (4), 273-275 (1960) tai sapoal-biinia Gypsofila struthiumista (R. Vochten, P. Joos ja R. Ruyssen: Physico-chemical properties of sapoalbin and their relation to the foam stability, J. Pharm. Belg. 42, 213-226 (1968), erityisesti saponiiniuutetta Quillaja sapo-20 näriä Molinasta, ensisijaisesti DQ-uutetta, joka valmistetaan K. Dalsgaardin mukaisesti: Saponin Adjuvants, Bull.

Off. Ont. Epiz. 77 (7-8), 1289-1295 (1972) ja Quil A, joka valmistetaan K. Dalsgaardin mukaan: Saponin Adjuvants III, Archiv fur die Gesamte Virusforschung 44, 243-254 (1974).

25 Käytetään myös glykosidien seoksia. Lisätyn glykosidin määrän tulee olla vähintään 1-3 kertaa niiden kriittisen mi-sellin muodostumiskonsentraatio (CMC), mieluummin vähintään 5, erityisesti vähintään 7-12 kertaa tämä määrä. Oletetaan, että tässä tapauksessa glykosidi voi olla sidottu 30 tai tarttunut membraaniproteiinien monomeerimuotoihin. Mieluummin käytetään Quil A:a, jolla kriittinen misellien muodostumiskonsentraatio on 0,03 paino-%. Quil A:n määrä tulisi silloin olla vähintään 0,02 paino-%, erityisesti 0,05 - 0,5 paino-%, mieluummin 0,2 paino-%. Glykosideja 35 koskevat, yllä esitetyt julkaisut on sisällytetty tähän yhteyteen viitteinä.

is 868 01

Varattujen monomeeristen antigeeniproteiinien erottaminen liuottavasta aineesta voidaan tehdä sentrifugoi-den, dialyysi-elektroforeesin ja erilaisten kromatografisten menetelmien avulla.

5 Sentrifugointimenetelmä

Fragmentoitujen solujen tai mikro-organismien ja liuottavan aineen seokselle, joka on valmistettu yllä esitetyllä tavalla, suoritetaan gradienttisentrifugointi ja se kerrostetaan esim. sokeri- tai suolaliuoksen pinnalle, 10 joka sisältää liuottavan aineen ja jossa on gradientti, joka sisältää glykosidin, kuten esimerkiksi sokerigradientti tai glyseroligradientti tai metritsiamidi tai raskasmetalli, esim. CsCl (se on, suhteellisen inertit aineet, joilla on sopiva tiheys, viskositeetti, jotta ne toimivat gra-15 dienttimateriaalina), esimerkiksi sokerigradientille alla annetuin konsentraatioin.

Gradientti-järjestelmää sentrifugoidaan ainakin 100 000 g:llä (riippuu ajasta ja gradientista, käytännön olosuhteiden mukaisesti). Sokerina voidaan käyttää mono-20 sakkarideja, kuten esimerkiksi glukoosia, laktoosia, mal-toosia, disakkarideja, kuten esimerkiksi sakkaroosia, mutta myös triooseja, tetrooseja ja glyseriiniä. Mieluummin käytetään sakkaroosia. Sakkaroosikonsentraatio gardientis-sa on sopivasti ainakin 5, mieluummin 15-25 paino-% alku-25 konsentraationa (gradientissa ylimpänä) ja lopullinen kon-sentraatio on ainakin 20, mieluummin 45-60 paino-% (gradientissa alimpana). Gradientti voi esimerkiksi koostua ylemmästä kerroksesta, jossa on 5-25 paino-% sokeria ja alemmasta kerroksesta, jossa sokeripitoisuus on 20-60 pai-30 no-%. Gradientissa voi kuitenkin olla myös useita kerrok sia, jolloin yksityisten kerrosten konsentraatioerot vähenevät vastaavasti. Sokerigradientti sisältää glykosidin tai glykosidien seoksen. Glykosidin tulisi olla 1-3, erityisesti vähintään 5, mieluummin vähintään 7-12 kertaa 35 CMC Quil A:n suhteen, ainakin 0,02, erityisesti ainakin 0,05-0,5, mieluummin vähintään 0,2 paino-%. Tässä 1β 86801 1 6 glykosidia sisältävässä gradientissa erotetaan liuottava aine ja liuottavan aineen ja proteiinin välinen kompleksi muutetaan proteiini-glykosidi-kompleksiksi.

Sokerigradientin huipulla on sokeri- tai raskassuola-5 liuoksen muodostama kerros, joka sisältää liuottavan aineen tai niiden seoksen; lipidit jäävät tähän kerrokseen. Liuottavan aineen konsentraatio tässä kerroksessa on vähemmän tai sama kuin käytetyssä mikro-organismien tai solujen ja liuottavan aineen seoksessa ja se on sopivasti 0,25 - 3 paino-%, 10 mieluummin 0,75 - 1,5 paino-%, 1 paino-%:n ollessa edullisen. Sokeri- tai suolakonsentraatio voi olla sama tai vähemmän kuin konsentraatio alemman glykosidin sisältävän gradientin ylemmässä kerroksessa, mieluummin 5-25 paino-%, erityisesti 15 paino-% sokeria.

15 Sen jälkeen kun on sentrifugoitu ainakin 100 000 g:llä vähintään 16 tunnin ajan, mieluummin 20 tuntia, 20°C:ssa, proteiinia sisältävät jakeet kootaan ja dialysoidaan puskuria vastaan (0,5 - 0,001 M), mieluummin 0,005 M Tris-HCl, 0,001 M NaCl, pH 7,4 tai 0,02 M ammoniumasetaattipuskuris- 20 sa, pH 7,0 ja ne väkevöidään, esim. kuten T.G. Cooper kuvaa julkaisussa The Tools of Biochemistry, julkaisija John Wiley & Sons (New York 1974), joka on tähän yhteyteen sisällytetty liitteenä, esimerkiksi lyofilisoinnin, tyhjössä suoritettavan dialyysin tai ultrasuodatuksen avulla.

25 Sentrifugoinnin aikana kaikki aineosat laskeutuvat, jolloin liuottava aine irtoaa proteiinin ja liuottavan aineen muodostamasta kompleksista ja monomeeriset proteiinit siirretään glykosidille ja ne muodostavat kompleksin sen kanssa.

Tätä seuraavassa dialyysissä poistetaan sokeri.

30 Kompleksia voidaan puhdistaa edelleen, esimerkiksi glykosidittomaksi, gradienttisentrifugoinnin avulla, esim. käyttämällä sokerigradienttia, joka sisältää 26-60 paino-% sokeria, mieluummin 10-40 paino-% sakkaroosia.

Dialyysimenetelmä 35 Solujen tai mikro-organismien yllä kuvatulla tavalla suoritetun puhdistamisen jälkeen ja sen jälkeen, kun ne on 17 86 801 sekoitettu liuottavan aineen kanssa yllä kuvatussa paino-suhteessa, solujen ja liuottavan aineen seos, joka on yllä kuvatussa puskurissa, voidaan vaihtoehtoisesti suoraan sekoittaa Quil A:n suhteen ainakin 1-3, mieluummin 7-12 ker-5 täisen määrän kanssa 0,05 - 2 paino-%:ista glykosidia, mieluummin 0,2 paino-%:ista glykosidia, ja dialysoidaan puskuria vastaan, kuten esimerkiksi 0,5 - 0,001 M, mieluummin 0,005 M Tris-HCl, 0,01 M NaCl, pH 7,4; erityisesti 0,2 M ammoniumasetaattipuskuria, pH 7,0 vastaan. Tämä erottaa 10 liuottavan aineen glykosidin läsnä ollessa. Valmistettu membraaniproteiinikompleksi voidaan sitten eristää sedimen-taatiogradienttisentrifugoinnin avulla, kuten esimerkiksi on kuvattu sivulla 14, toisessa kappaleessa, glykosidi-lisäaine kuitenkin jätetään pois eikä sentrifugointiin si-15 säily muita fragmentteja eikä vapaata glykosidia.

Solujen ja mikro-organismien sekä liuottavan aineen seokselle, joka on puskurissa, suoritetaan myös gradient-tisentrifugointi ja esimerkiksi se kerrostetaan 5-60 painolliseen sokerigradienttiin, joka on yllä mainitussa pus-20 kurissa, mieluummin 10-12 paino-%:iseen sakkaroosigradient-tiin ja sentrifugoidaan ainakin 150 000 g, vähintään 20 minuutin ajan, mieluummin 30 minuuttia 250 000 g:llä. Tällöin erotetaan muut fragmentit liuottavan aineen ja proteiinin välisestä kompleksista.

25 Proteiinia sisältävä ylempi liuos, nimeltään huippu- jae, uutetaan ja glykosidia lisätään määrältään ainakin 1-3, mieluummin 7-12 kertainen CMC, Quil A:n suhteen, 0,05 - 0,5 paino-%:na, mieluummin 0,2 paino-%:na ja se dialysoidaan 0,5 - 0,001 M puskuria, erityisesti 0,005 M Tris-30 HCl, 0,001 MHCl, pH 7,4; mieluummin 0,2 M ammoniumasetaat-tia vastaan. Liuottava aine poistetaan glykosidin läsnä ollessa. Lisäpuhdistus voidaan suorittaa sedimentaatiogra-dienttisentrifugoinnin avulla (katso sivulta 15, ensimmäinen kappale). Lisäpuhdistus voidaan suorittaa sentrifuoimal-35 la sokerigradientin läpi, joka sisältää 5-60 paino-% sokeria, mieluummin 20-50 tai 10-40 paino-% sokeria.

86801 18

Elektroforeesimenetelmä

Vaihtoehtoisesti, fragmentoitujen mikro-organismien tai solujen ja liuottavan aineen tai proteiineja sisältävän huippuliuoksen (muut fragmentit ja vapaa liuottava aine on 5 poistettu), joka saadaan, kun tätä seosta gradienttisentri-fugoidaan esim. 5-60-paino-%:isella, mieluummin 20-50 painollisella tai 10-40 paino-%:isella sokerigradientilla puskurissa, erotetaan elektroforeesin avulla liuottavasta aineesta ja siirretään liuokseen, joka sisältää ainakin 10 1-3, mieluummin ainakin 7-12 kertaa CMC:n Quil A:n suhteen, 0,05 - 0,5 paino-% glykosideja, mieluummin 0,2 paino-% gly-kosidia. Varatut, monomeeriset antigeeniproteiinit erotetaan tällöin liuottavasta aineesta. Elektroforeesilla suoritettavaa erottamista varten on sopivaa, että liuottava 15 aine-puskuriliuos ei sisällä ylimääräisesti lisättyä suolaa, joka voi häiritä elektroforeesia ja saada aikaan erittäin korkean lämpötilan. On mahdollista käyttää esim. vyöhyke-elektroforeesia kantaja-aineen kanssa tai ilman sitä. Tavalliset aineet, joita voidaan käyttää kantaja-aineina, 20 ovat esimerkiksi polyakryyliamidi, agar, piihappogeeli, tärkkelys, selluloosa, polyvinyylikloridi, ioninvaihtaja, seliitti. Kompleksien eristäminen ja konsentrointi suoritetaan sivulla 16, riveillä 20-22 kuvatulla tavalla. Lisä-puhdistus suoritetaan gradienttisentrifugoinnin avulla (ks. 25 sivu 16, rivit 30-33).

Jos lähtömateriaalissa on läsnä hydrofobisia membraa-niproteiineja, joilla on erilaiset varaukset tai paino, ne on mahdollista erottaa toisistaan elektroforeesi- tai sen-trifugointimenetelmien avulla ja valmistaa niistä erillisiä 30 komplekseja. Näitä olosuhteita käyttäen on mahdollista erottaa ja rikastaa erilaisten membraaniproteiinien muodostamia komplekseja.

Kromatografiset menetelmät

Liuotetut proteiinit voidaan valinnaisesti, sen jäl-35 keen kun ne on puhdistettu solufragmenttien suhteen, erottaa liuottavasta aineesta kromatografisin menetelmin, 19 86801 esimerkiksi geelisuodatuksen, hydrofobisen kromatografiän tai affiniteettikromatografiän avulla, esim. ioninvaihto-kromatografiällä, siten että antigeenirakenne on adsorboitu liukenemattomaan substraattiin (matriisi), joka saattaa 5 koostua selluloosasta, agaroosista, dekstraanista, akryyli-amidista ja lasista. Erilaisia ligandeja kytketään matriisi-rakenteeseen, joka tällöin saa spesifisiä ominaisuuksia, joita käytetään hyväksi erottamisen aikana. Antigeenirakenne adsorboidaan tavallisesti samaan aikaan kuin käytetty 10 liuottava aine läpäisee matriisin adsorboitumattomana. Sitten seuraa antigeenin deadsorptio. Ennen deadsorptiovaihet-ta tai sen aikana voi tapahtua liuottavan aineen, suolan ja puskurointiaineen vaihto siten, että liuottava aine syrjäytyy glykosidilla ja kompleksi muodostuu.

15 Ioninvaihtokromatografiässä varattuja ligandimole- kyylejä, kuten esimerkiksi dietyyliaminoetyyliä (DEAE) kytketään matriisiin ja käytetään kationinvaihtajana. Karbok-syylimetyyli- (CM) tai fosfaattiryhmiä (P) kytketään matriisiin ja käytetään anioninvaihtajina. Nämä molekyylit 20 erotetaan käyttämällä hyväksi eroja kokonaisvarauksessa antigeenirakenteiden ja liuottavan aineen välillä. Yleensä liuottava aine on varaukseton ja proteiini on varattu.

I Eluointi suoritetaan suolagradientin avulla, kuten esimer kiksi K- tai NaCl-gradientin avulla tai sopivalla puskuril-25 la, esimerkiksi fosfaattipuskurilla liuottavan aineen läsnä ollessa (mitä konsentraatioon ja esimerkkeihin tulee, katso kappale liuottaminen yllä) suoritettavan pH:n säädön avulla. Eluutiossa proteiini voidaan puhdistaa, liuottava aine vaihdetaan tai kompleksi muodostuu, jos glykosidi lisätään 30 eluenttiin liuottavan aineen sijasta. Tämän jälkeen suolat poistetaan, esimerkiksi dialyysin tai geelisuodatuksen avulla.

Geelisuodatuksessa käytetään liuottavaa ainetta, joka on molekyylipainoltaan pienempi kuin antigeeniraken-35 teet ja joka tulee ulos seuraavissa jakeissa. Kompleksin muodostuessa antigeeniä sisältävien rakenteiden koko 86801 20 suurenee ja ne virtaavat pois detergenttiä sisältävästä vyöhykkeestä.

Inununoaffiniteettikromatografiän avulla vasta-aineet voidaan sitoa irreversiibelisti yllä mainittuun matriisiin, 5 jonka jälkeen vasta-aineiden ainutlaatuista spesifisyyttä ja affiniteettia käytetään hyväksi halutun antigeenirakenteen puhdistamiseksi. Liuottavalla aineella ei ole affiniteettia vasta-aineita kohtaan. Eluointi suoritetaan lievästi denaturoiden, esimerkiksi laskemalla pH noin 2,5 teen ja 10 liuottavan aineen tai glykosidin läsnä ollessa.

Lektiinikromatografiässä käytetään lektiinejä, proteiinien ryhmää, joka pystyy reagoimaan reversiibelisti spesifisten sokeriryhmien kanssa, mikä tekee mahdolliseksi sitoa niihin esimerkiksi glykoproteiineja. Lektiini kytke-15 tään ligandina, esimerkiksi Sepharoseen (Pharmacia, Uppsala) tai se on kaupallisesti ostettuna, valmiiksi kytketty sopivaan matriisiin. Detergenteillä (liuottavilla aineilla) ei ole affiniteettia liikkumattomaksi tehtyyn lektiiniin. Adsorboitu antigeenirakenne deadsorboidaan tavallisesti li-20 säämällä pienimolekyylipainoista sokeria, mahdollisesti me-tyloituna, jolla sokerilla on affiniteettia kyseessä olevaa lektiiniä kohtaan, lisäämällä esimerkiksi mannoosia, metyylimannosidia, glukoosia, metyyliglykosidia ja N-ase-tyyliglukosamiinia, puskuroituun suolaliuokseen liuotettu-25 na, liuottavan aineen tai glykosidin läsnä ollessa.

Kovalenttisessa kromatografiässä, antigeenirakenne, jossa on tioliryhmä sidottuna kovalenttisella sidoksella, sidotaan matriisiin. Antigeenissä sijaitseva tioliryhmä sidotaan selektiivisesti aktivoituun tioliryhmään, joka on 30 kytketty sopivaan matriisiin tiodisulfidivaihdon avulla.

Tämä sidos on reversiibeli ja pesemällä suoritetun liuottavan aineen poistamisen jälkeen tiolia kantava antigeeni-rakenne voidaan eluoida pelkistämällä disulfidisidos mer-kaptoetanolilla tai ditiotreitolilla, liuottavan aineen 35 tai glykosidin läsnä ollessa.

21 86801

Hydrofobinen kromatografia Tämä tekniikka käyttää hyväksi liikkumattomaksi tehtyä, hydrofobista ligandia, joka on tyypiltään alifaattinen tai aromaattinen, esimerkiksi oktyyli tai fenyyli sekä pro-5 teiinin tai muun antigeenirakenteen hydrofobisten pintojen välistä vuorovaikutusta. Adsorbointi tapahtuu korkeassa ionivahvuudessa, esimerkiksi ammoniumsulfaatilla ja eluoin-ti suoritetaan alhaisessa ionivahvuudessa, vedellä tai ety-leeniglykolilla.

10 Kun kompleksit sisältävät bakteeriperäisiä membraa- niproteiineja, on ensin edullista rikkoa solunseinämät, ennen kuin solumateriaalia käsitellään yllä esitetyn menetelmän mukaisesti. Esimerkkejä bakteereista, joista hydrofobisia proteiineja voidaan valmistaa, ovat esimerkiksi 15 Escherichia, Staphylococci, Haemaophilus, esim. H. influenzae, Bordetella, esim. B. pertussis, Vibrio, esim.

V. cholerae, Salmonella, esim. S. typhi, S. paratyphi, mieluummin colin tarttumistekijä, esimerkiksi pili K 83:n ja huokosproteiini, esimerkiksi Salmonellalla tai ulko-20 membraaniproteiinit, jotka on saatu B. pertussikselta ja Neisseria meningitidikselta.

Esimerkkejä käyttökelpoisista viruksista, joilla on kapseli, ovat Orthomyxoviridae, kuten esimerkiksi influenssa A, B, C, Paramyxoviridae, erityisesti tuhkarokkovirus, 25 sikotautivirus, parainfluenssa 1, 2, 3 ja 4 virukset, penikkatautivirus sekä karjaruttovirus, Rhabdoviridae, erityisesti vesikauhuvirus, Retroviridae, erityisesti kissan leukemiavirus ja härän leukemiavirus, ihmisen T-solujen lymfotrofinen virus HTLV 1, 2 ja 3, Herpesviridae, erityi-30 sesti Pseodorabies, Herpes simplex I ja II, Cytomegalovirus, Cotronaviridae, Togaviridae, kuten esimerkiksi EEE, WEE, VEE (itäinen, läntinen ja venetsuelalainen hevosen aivotulehdus), keltakuumevirus, erityisesti härän ripuli-virus ja eurooppalainen sikaruttovirus Arenaviridae, 35 Poxviridae, Bunyaviridae, erityisesti Huntan-virus, Irido-viridae, erityisesti afrikkalainen sikaruttovirus ja 22 86801 luokittelemattomien virusten joukosta ihmisen hepatiitti B-virus sekä Marburg-Ebola-virus.

Esimerkkejä parasiiteistä, joita voidaan käyttää esitetyissä komplekseissa, ovat Protozoa, kuten esimer-5 kiksi Toxoplasma, esimerkiksi Toxoplasma gondii,

Plasmodium, esimerkiksi Plasmodium vivax, malariae, falci-parium, Teileria parvum, ovale ja Filaroidae, mieluummin Parafilaria ja Onchocerca, Entamoeba histolytica, erityyppiset anaplasmat, Schistosoma, kuten esimerkiksi Schistosoma 10 hematobium, mansoni, japonicum ja Trypanosoma, esimerkiksi Trypanosoma gambiense, brusei tai congolesi.

b) On myös mahdollista aloittaa hydrofobisista proteiineista, jotka eivät ole membraaniperäisiä tai ei-hydro-fobisista proteiineista tai peptideistä. Ei-hydrofobiset pro-15 teiinit tai peptidit voidaan tehdä hydrofobisiksi kytkemällä niihin hydrofobisia ryhmiä. Ei-hydrofobiset ryhmät saattavat olla peräisin viruksilta, joissa on kotelo tai jotka ovat ilman koteloa, bakteereilta, mykoplasmoilta ja parasiiteiltä. Kapselittomien virusten esimerkkejä, joissa on 20 ei-hydrofobisia proteiineja, ovat Picornaviridae (joilla oletetaan myös olevan hydrofobisia proteiineja) esimerkiksi suu- ja sorkkatautivirus, poliovirus, Adenoviridae, Parvo-viridae, esimerkiksi kissan ruttovirus ja sian parvovirus, Reoviridae, esimerkiksi Rotavirus. Esimerkkejä mykoplasmois-25 ta ovat M. pneumoniae, mycoides, bovis, suis, hyorinos, orale, salivarium, hominis ja fermentans.

Nämä proteiinit voidaan saada puhdistettuina, kuten kuvataan kohdassa a) puhdistus ja eristys.

Hydrofobiset ryhmät, jotka voidaan kytkeä ei-hydro-30 fobisiin proteiineihin, ovat suoria, haarautuneita, tyydyttyneitä tai tyydyttymättömiä alifaattisia ketjuja, joissa on mieluummin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 tai 30 hiiliatomia tai hydrofobisia aminohappoja tai pepti-35 dejä tai muita hydrofobisia rakenteita, kuten esimerkiksi steroideja. Hydrofobisen rakenteen pituus sovitetaan 23 86801 proteiinin koon ja luonteen mukaisesti. Esimerkkinä voidaan mainita, että peptidi, jossa on 10-15 aminohappoa (suu- ja sorkkatautivirus) saadaan sopivasti esiin siten, että siinä on kaksi tyrosiinia amino- tai karboksi-päätteisessä päässä.

5 Proteiini, jonka molekyylipaino on 70 000 daltonia, tarvitsee noin 20 hydrofobista aminohappoa. Koe tehdään empiirisesti. Täten käytetään erityisesti peptidejä, joissa on 1-20 aminohappoa, mieluummin 1, 2, 3, 4, 5 aminohappoa, jotka on erityisesti valittu Trp:n, Ile:n, Phe:n, Pro:n, 10 Tyrin, Leu:n, Värin, erityisesti Tyrin joukosta; kolesteroli johdannaisia , kuten esimerkiksi koliinihappoa, ursode-soksikoliinihappoa.

Nämä hydrofobiset ryhmät täytyy kytkeä toiminnalliseen ryhmään, joka voi olla kytketty ei-hydrofobiseen pro-15 teiiniin. Toiminnallinen ryhmä voi olla valittu sivuilla 7-8 mainittujen ryhmien joukosta, kuten esimerkiksi karbok-syyli-, amino-, disulfidi-, hydroksyyli-, sulfhydryyli- ja karbonyyliryhmän, esimerkiksi aldehydiryhmien joukosta.

Hydrofobisissa rakenteissa sijaitsevat kytkentäryh-20 mät valitaan mieluummin karboksyyli-, aldehydi-, amino-, hydroksyyli- tai sulfhydryyliryhmien joukosta ja peptidien - - joukosta, jotka sisältävät Cysin, Aspin, Gluin, Lysin. Hyd rofobiset ryhmät ryhmän kanssa, joka voidaan kytkeä, täytyy liuottaa veteen esimerkiksi liuottavien aineiden ja yl-25 lä mainittujen detergenttien tai suolahapon, etikkahapon, emäksisen liuoksen, ammoniakin kanssa, riippuen liuotettavasta aineesta. pH säädetään sitten neutraaliin suuntaan ainetta saostamatta; tällöin on varmistuttava siitä, että ei saada pH-arvoa, joka denaturoi proteiinin, johon hydro-30 fobinen ryhmä on kytkettävä.

Hydrofobinen molekyyli lisätään ei-hydrofobiseen proteiiniin moolisuhteissa 10:1 - 0,1 i1, mieluummin 1:1.

Hydrofobiset ryhmät karboksyyliryhmän kanssa kyt-kentämolekyylinä, voidaan kytkeä proteiiniin vesiliukois-35 ten karbodi-imidien tai seosanhydridien avulla. Ensimmäisessä tapauksessa karboksyyliryhmä aktivoidaan pH 5issä 24 8 6 8 01 karbodi-imidillä ja sekoitetaan proteiinin kanssa, joka on liuotettu puskuriin, jonka pH on 8 ja jolla on korkea fosfaattisisältö. Viimeksi mainitussa tapauksessa karbodi-yhdiste reagoi isobutyyliklooriformaatin kanssa trietyyli-5 amiinin läsnä ollessa dioksaanissa tai asetonitriilissä, ja syntyvä anhydridi lisätään proteiiniin pH 8-9:ssä. On myös mahdollista muuttaa karboksyyliryhmä hydratsiinin avulla hydratsidiksi, joka yhdessä aldehydien ja ketonien kanssa proteiinissa sijaitsevissa, perjodaatilla hapete-10 tuissa sokeriyksiköissä antaa hydratsonisidoksia.

Aminoryhmät voidaan typpihapon kanssa, alhaisessa lämpötilassa, muuttaa diatsoniumsuoloiksi, jotka Tyr:n,

His:n ja Lys:n kanssa muodostavat atsosidoksia.

Hydroksyyliryhmät voidaan sukkiinihappohydridin 15 avulla muuttaa hemisukkinaattijohdannaisiksi, jotka voidaan kytkeä, kuten karboksyyliryhmät.

Aldehydiryhmät voivat reagoida proteiinissa sijaitsevien aminoryhmien kanssa muodostaen Schiffin emäksen.

Näin valmistetut proteiinit ja peptidit, jotka ovat 20 vastaanottaneet hydrofobisia ryhmiä, sidotaan sitten kompleksiksi glykosidin kanssa, kuten on kuvattu kohdassa a), mutta tässä vaiheessa solufragmenttien poistamiseen käytetyt puhdistusvaiheet on jätetty pois.

c) on myös mahdollista aloittaa hydrofiilisista pro-25 telineistä, jotka sulkevat sisäänsä hydrofobisia ryhmiä, ja tehdä ne jälkeenpäin luoksepäästäviksi denaturoimalla proteiinit, se on alhaisessa pH:ssa, noin 2,5, 3M urealla tai korkeassa lämpötilassa, 70°C:n yläpuolella. Sellaiset proteiinit saattavat olla immunoglobuliineja, kuten esimer-30 kiksi IgG, IgA, IgD ja IgE ja tiettyjä virusproteiineja, kuten esimerkiksi poliovirusproteiini. Immunoglobuliineja voidaan käyttää anti-idiotyyppisinä vasta-aineina. Proteiinit saadaan puhdistettuina, kuten proteiinit, joita on kuvattu kohdassa b) ja sitten glykosidiin kompleksiin sidottuina, 35 kuten on kuvattu kohdassa a), tällöin puhdistusvaiheet solufragmenttien poistamiseksi jätetään pois.

25 8 6 8 01

Kun aloitetaan puhdistetuista tai synteettisistä proteiineista tai peptideistä b):n tai c):n mukaisesti, niillä on taipumus aggregoitua misellien muodossa iskomeja valmistettaessa. Sen tähden yhden tai useamman lipidin, 5 erityisesti kolesterolin, lisäys lisää primaarisen kompleksin muodostusta. Lipidit lisätään proteiiniin ja peptidiin, samalla kun liuottavat aineet lisätään. Määrä ei ole ratkaiseva. Lipidin molaarisen suhteen peptidiin tulisi olla vähintään 1:1. Tällöin voidaan käyttää jotain yllä maini-10 tuista neljästä menetelmästä. Kun käytetään radioaktiivisia lipidejä, mitään radioaktiivisuutta ei voida havaita primaarisessa, immuunikompleksissa.

Hydrofiiliset peptidit/polypeptidit voivat olla ko-valenttiscsti sidotut rasvahappoihin, jotka sisältyvät li-15 posomeihin, jotka koostuvat esimerkiksi kolesterolista, fosfatidyylikoliinista ja rasvahapoista, suhteessa 1:7:2. Peptidi/polypeptidi uutetaan liposomeista detergenttien avulla ja erotetaan lipidiylimäärästä sentrifugoimalla sakkaroosigradientissa (10-30 % sakkaroosia), joka sisäl-20 tää detergentin.

Iskomit voidaan valmistaa yllä esitetyllä tavalla, mieluummin sentrifugointi- tai dialyysimenetelmän avulla. Sentrifugointimenetelmää käytettäessä voidaan käyttää Triton X-100 liposomikompleksin liuottamiseen. Dialyysi-25 menetelmää käytettäessä pitäisi olla mahdollista dialysoi-da detergentti pois (esimerkiksi oktyyliglykosidi).

Primaarista immuunikompleksia voidaan käyttää spesifiseen immunostimulaatioon ihmisillä ja eläimillä. Niitä voidaan täten käyttää rokotteina sairauksia vastaan, joita 30 bakteerit, virukset, mykoplasmat ja parasiitit aiheuttavat ja vasta-aineiden valmistamiseen erilaisista eläinsoluista saatuja membraaniproteiineja vastaan, tutkimustarkoituksia varten.

Voidaan myös lisätä erilaisista bakteereista ja vi-35 ruksista saatujen, amfifaattisten proteiinien seoksia, rokotteiden saamiseksi useita tarpeita varten. Seosta 26 8 6 8 01 voidaan käyttää myös kyseessä olevan menetelmän mukaisena kantajana.

II. Kyseessä olevan keksinnön mukaisen kompleksin valmistaminen 5 Molekyyli, jota vastaan vasta-aine on muodostetta va, kytketään kantajamolekyyliin lyofilisoidun, primaarisen iskomin avulla tai niiden liuosten avulla, jotka on saatu iskomia valmistettaessa sentrifugoinnin, dialyysin, elektroforeettisen menetelmän tai edellä mainittujen kro-10 matografisten menetelmien avulla tai niiden liuosten avulla, jotka jäävät jäljelle sakkaroosiliuoksen läpi sentri-fugoimalla suoritetun lisäpuhdistuksen jälkeen.

Kun valmistus suoritetaan sentrifugointimenetelmän mukaisesti, saadaan primaarinen iskom gradienttipuskuri-15 seoksessa (ks. sentrifugointimenetelmä), esimerkiksi soke-ri-puskuri-seoksessa. Sokeri poistetaan dialysoimalla tai geelisuodatuksen avulla, esimerkiksi Sephadex®G 50:llä, puskuria vastaan, jota myöhemmin käytetään, kun primaarinen iskom on kytkettävä molekyyliin, joka on tehtävä an-20 tigeeniseksi. Vaihtoehtoisesti käytetään haihtuvaa puskuria, kuten esimerkiksi ammoniumasetaattia, joka poistuu, kun seosta tämän jälkeen jäädytyskuivataan.

Dialysointia käytettäessä voidaan dialysointi suorittaa edellä mainittuja puskureita vastaan tai lisädialyy-25 si tai geelisuodatus voidaan suorittaa puskurin vaihtamiseksi .

Kromatografisia tai elektroforeettisia menetelmiä käytettäessä saadaan primaarinen iskom puskuriliuoksissa tai kun liuoksia puhdistetaan edelleen, valinnaisesti gra-30 dientissa, esimerkiksi sokeri-puskuri-liuoksissa. Näitä liuoksia voidaan myös käsitellä edellä esitetyllä tavalla, vaihtamalla puskuria tai jäädytyskuivattamalla. Primaariseen iskomiin kytkettävän molekyylin liukoisuus ratkaisee pH:n, jossa kytkentä voidaan suorittaa sekä sen lisäksi 35 myös, mitä kytkentämenetelmiä voidaan käyttää.

27 86801

Usein tiedetään/ mitkä ryhmät molekyylissä ovat asiaankuuluvia antigeenideterminantteja. Kytkentäreagens-sin ei tule reagoida näiden determinanttien kanssa, mutta ne tulee valita siten, että muut toiminnalliset ryhmät rea-5 goivat kytkentätapahtuman aikana. Normaalisti käytetään terminaalisia aminoryhmiä ja karboksyyliryhmiä luonnon peptidien ja proteiinien ollessa kysymyksessä. Voidaan antaa käyttöön synteettisiä peptidejä, joissa on esimerkiksi tyrosiini- tai sukkinyyliryhmiä ja ne voidaan kytkeä pri-10 maarisiin aminoryhmiin diatsoniumyhdisteiden kautta tai vastaavasti säätämällä pH noin kahdeksaksi. Seuraavat kyt-kentämenetelmät ovat edullisia.

Toiminnalliset ryhmät käsittävät kysteiiniryhmiä, jotka kytketään toisiinsa maleiini-imidobentsoyyli-N-hydr-15 oksi-sukkinimidiesterin kanssa tapahtuvan reaktion avulla, sulfohydryyliryhmiä, jotka kytketään aminoryhmiin diatso-toinnin avulla, aminoryhmiä, jotka kytketään toisiin aminoryhmiin 4-hydroksi-3-nitro-metyyli-bentsimidaatti-hydro-kloridin kanssa, karboksyyliryhmiä, jotka kytketään amino-20 ryhmiin vesiliukoisten karbodi-imidien kautta tai seosan-hydridejä, aminoryhmiä, jotka on muutettu diatsoniumsuo-loiksi ja sidottu atsosidoksien välityksellä Tyr:iin, His:iin ja Lys:iin, hydroksyyliryhmiä, jotka on muutettu sukkiinihappoanhydridin avulla hemisukkinaattijohdannai-25 siksi ja kytketty karboksyyliryhmiin, aldehydiryhmiä, jotka ovat reagoineet aminoryhmien kanssa muodostaen Schiffin emäksiksi, syntetisoiduissa peptideissä sijaitsevia sukki-nyyliryhmiä, jotka kytketään primaarisiin amiineihin säätämällä pH < 5, hydroksyyliryhmiä, jotka ovat reagoineet suk-30 kiinihappoanhydridin kanssa hemisukkinaattijohdannaisten muodostamiseksi, jotka on kytketty karboksyyliryhmiin, vieressä sijaitsevia OH-ryhmiä, jotka on muutettu CHO-ryhmik-si, esimerkiksi perjodaatin avulla ja on kytketty aminoryhmiin säätämällä pH > 8, aminoryhmiä, jotka on kytketty 35 glutaraldehydin kanssa amino- ja sulfhydryyliryhmiksi- di-imidoestereiden kanssa aminoryhmiksi, di-isosyanaattien 28 86801 kanssa amino- tai hydroksyyliryhmiksi, amino-, hydroksyyli-tai sulfhydryyliryhmiä, joita on vastavuoroisesti kytketty kaksi ja kaksi metoksi-dikloridi-triatsiinin kanssa, amino-ja hydroksyyliryhmiä, joita on kytketty amino-, hydroksyy-5 li- tai sulfhydryyliryhmiin aryylihalogenidien kanssa, sulfhydryyliryhmiä, joita on kytketty sulfhydryyli- tai aminoryhmiin alkyylihalogenidien kanssa, aminoryhmiin jodi-etikkahapon ja karbodi-imidin kanssa tai sulfhydryyliryhmiin maleimidien kanssa, aldehydi-, karboksyyli- ja amidi-10 ryhmiä, jotka kytketään hydratsiinien kanssa primaarisiksi amiineiksi säätämällä pH 9-10:ksi.

Aminoryhmä voidaan kytkeä toiseen aminoryhmään diat-sotoimalla seuraavalla tavalla.

Proteiinit ja peptidit reagoivat kukin sinänsä noin 15 20 mM:n kanssa 4-hydroksi-3-nitro-metyyli-bentsimidaatin hydrokloridia (MHNB) noin 0,1 M boraattipuskurissa (pH 9,0), huoneen lämpötilassa. Proteiinin modifikaation astetta MHNB:llä voidaan säädellä reaktioajan avulla. 30 minuutin kuluttua reaktioliuos dialysoidaan 0,1 M boraattipur-20 kuria vastaan yli yön, pH 8,0:ssa. Sitten nitroryhmiä pelkistetään noin 1 mg:lla/ml natriumditionaattia, 1-2 minuutin ajan, huoneen lämpötilassa. Reagoivat aineet poistetaan Sephadex'flG-25 pylväässä, käyttäen 0,1 M boraattipuskuria, pH 8,0 tai dialysoimalla 0,1 M boraattipuskuria, pH 8,0, 25 vastaan, 2-6 tunnin ajan, +4°C:ssa, yli yön. Aminoryhmät diatsotoidaan 0°C:ssa 0,1 M NaNC^illa, pH 4:ssä, yhden (1) minuutin ajan, jonka jälkeen pH säädetään nopeasti 8,5:ksi. Muu proteiini tai peptidi, mieluummin iskom, lisätään sitten, mieluummin boraattipuskuriin, pH 8,5, liuotettuna, huo-30 neen lämpötilassa. Nitriitti poistetaan dialysoimalla 0,1 M boraattipuskuria, pH 8,0, vastaan.

Tätä menetelmää käytetään mieluummin, kun primaariseen iskomiin kytkettävä molekyyli sisältää Tyr:n tai His:n, jota ei tarvitse kytkeä MHNB:en. Molekyyli voidaan kytkeä 35 suoraan MHNB:n muuntamaan iskomiin ja jokainen reagoimaton molekyyli voidaan saada takaisin. MHNB voidaan valmistaa 29 86801 julkaisun Journal of Applied Biochemistry 1, 301-310 (1979), mukaisesti.

Syntetisoidut peptidit voidaan antaa käyttöön terminaalisen N-hydroksi-sukkinimidipeptidin kanssa synteesin 5 aikana ja kytkeä iskomissa sijaitseviin primaarisiin amino-ryhmiin.

Sukkinyloitu peptidi liuotetaan alhaisessa pH:ssa, pH < 5, mieluummin etikkahapossa. Sitten lisätään primaarinen iskom, mieluummin fosfaattipuskuriin liuotettuna ja 10 pH säädettynä noin 8,0:ksi.

Yhdessä peptidissä sijaitseva tyrosiini voidaan kytkeä toisessa peptidissä sijaitsevaan tyrosiiniin bis-diatsobentsidiinin kanssa tapahtuvan reaktion avulla.

Peptideissä sijaitsevat sulfhydryyliryhmät voidaan 15 kytkeä toisiinsa maleinimido-bentsoyyli-N-hydroksi-sukkin-imidiestereiden kanssa tapahtuvan reaktion avulla.

Aminoryhmät voidaan muuttaa typpihapon kanssa alhaisessa lämpötilassa diatsoniumsuoloiksi, jotka antavat atsosidoksia Tyr:n, His:n ja Lys:n kanssa.

20 Lipideissä, hiilihydraateissa, peptideissä sijait seva karboksyyliryhmä voidaan kytkeä peptideissä sijaitsevaan aminoryhmään vesiliukoisten karbodi-imidien tai seos-anhydridien avulla. Ensiksi mainitussa tapauksessa karboksyyliryhmä aktivoidaan pH 5:ssä karbadi-imidissä, voimak-25 kaassa fosfaattipuskurissa, joka on noin 10-15 mM ja sekoitetaan primaarista iskomia sisältävän proteiinin kanssa, liuotettuna puskuriin, pH 8,0; jolla on korkea fosfaatti-sisältö (0,4 - 0,5, mieluummin 0,2 M). Viimeksi mainitussa tapauksessa karboksiyhdiste reagoi isobutyyliklooriformaa-30 tin kanssa trietyyliamiinin läsnä ollessa dioksaanissa tai asetonitriilissä ja syntyvä anhydridi lisätään iskomiin, joka sisältää aminoryhmän, pH 8-9:ssä. Karboksyyliryhmä voidaan myös muuttaa hydratsiinilla hydratsidiksi, joka aldehydeissä ja ketoneissa, perjodaatilla hapetetuissa so-35 keriyksiköissä, ollessaan läsnä proteiinissa, tuottaa hydratsonisidoksia.

30 86801

Hydroksyyliryhmät, esimerkiksi hiilihydraateissa, voidaan muuttaa meripihkahappoanhydridin avulla hemisukki-naattijohdannaisiksi, jotka kytketään karboksyyliryhmiin, jotka ovat esimerkiksi peptideissä. Läheiset OH-ryhmät voi-5 daan muuttaa CHO-ryhmäksi esimerkiksi perjodaatilla, jolloin tämä CHO-ryhmä reagoi tämän jälkeen primaarisen amiinin kanssa Schiffin emäkseksi, kun pH säädetään yli 8,0:ksi.

Kytkettävää molekyyliä käytetään primaarisessa is-komissa proteiinin suhteen moolisuhteessa 50:1 - 0,1:1, 10 mieluummin 15:1 - 1:1. Saattaa olla sopivaa konjugaatin immunogeenisuuden optimoimiseksi kutakin kytketyn molekyylin primaarisen iskomin konjugaatin suhteen tutkia tämä siten, että iskomin sisältämään kuhunkin proteiiniin kytketään eri lukumäärä molekyylejä. Käytetystä kytkentämene-15 telmästä riippuen tätä voidaan säädellä vaihtelemalla kytkettyjen molekyylien konsentraatiota, aktivoivan reagens-sin (aktivoi, muuttaa toiminnallista ryhmää) konsentraatiota, aktivointiaikaa sekä kytkentäaikaa.

Puhtaasti käytännöllisistä syistä, primaariseen is-20 komiin kytkettävää molekyyliä käytetään määrältään niin paljon, että se vastaa 1 mg proteiinin yhtä mg kohtaan, mieluummin 250-500 ^ug proteiinin mg kohti primaarisessa iskomissa. Primaarisen iskomin proteiinisisältö määritetään esimerkiksi Bradford-menetelmällä (m.M. Bradford, 25 Analyt. Biochem. 72 (1976)).

Kun kytkentä lopetetaan, havaitaan tutkimalla elektronimikroskoopissa, että isomeerit ovat pilkkoutuneet mi-selleiksi, nämä misellit voidaan kytkeä yhteen detergentin avulla, esimerkiksi vastaavasti MEGA 9:llä ja 10:llä, 30 (N-(D-gluko-2,3,4,5,6-pentahydroksiheksyyli)-N-metyyli- nonamidilla ja -metyylidekanamidilla, jotka on valmistettu julkaisun Biochem. J. (1982) 207, 363-366, mukaisesti tai /S-oktyyliglukosidin tai jonkin muun detergentin avulla, esimerkiksi niiden avulla, jotka on mainittu sivuilla 9-11, 35 seoksena glykosidin, esimerkiksi Quil A:n kanssa. Reagens-siylimäärä ja läsnäoleva detergentti ja glykosidi poistetaan 3i 86801 sitten dialysoimalla tai suorittamalla geelisuodatus sopivan puskurin avulla, esimerkiksi PBS:llä tai haihtuvalla puskurilla, kuten esimerkiksi ammoniumasetaattipuskurilla, joka lähtee, kun lopullinen tuote jäädytyskuivataan, jol-5 loin tämä tuotteen jäädytyskuivaus on valinnainen vaihe.

Uusi antigeenikompleksi voidaan varastoida jäädy-tyskuivatussa muodossa tai vesisuspensiona. Esitetään myös ihmisille ja eläimille tarkoitettujen lääkkeiden koostumuksia, jotka sisältävät aktiivista ainetta yhden tai useampia 10 keksinnön mukaisesti valmistettuja komplekseja, valinnaisesti tavanomaisten lisä- tai jatkoaineiden muodossa, mieluummin iskomin puskuriliuoksen muodossa, esimerkiksi TN-liuoksessa (vrt. esimerkki 1) tai fysiologisessa keittosuolaliuoksessa, esim. 0,1 M NaClrssä, pH 7,2-7,6. pH voidaan 15 säätää 0,05 M Tris-HCl:llä.

Komplekseja käytettiin ihmisten ja eläinten immunisointiin, määrän vastatessa noin 0,1 pg - 1 mg kompleksia yksilöä kohti, kerran tai kaksi kertaa (kaksi viikkoa im-munisointikertojen välillä).

20 Kyseessä olevaa keksintöä kuvataan seuraavassa yk sityiskohtaisemmin joukolla esimerkkejä, joista esimerkit 1-27 koskevat kantajakompleksin valmistusta ja esimerkit 28-36 koskevat keksinnön mukaista menetelmää kantajakompleksin liittämiseksi antigeeniseen molekyyliin.

25 Esimerkki 1

Parainfluenssa-3-virus U23 eristettiin Uumajassa, se puhdistettiin sentrifugoimalla 30 paino-%:isen sakkaroosin kanssa, 100 000 g:ssä, yhden tunnin ajan 4 °C:ssa. Pohjakerros liuotettiin noin 10 mg/ml:n konsentraatioksi 0,05 30 M Tris-HCl:ssä, pH 7,4 ja 0,1 M NaCl:ssä (TN). 1-5 mg/ml

Pl3-virusta, joka oli samassa puskurissa (TN), liuotettiin 1 paino-%:n avulla (lopullinen konsentraatio) Triton X- 3 100:a, yhdessä H-merkatun viruksen kanssa, jota käytettiin 5 noin 10 cpm (A. Luukkonen, C. Gamberg, E. Renkonen (1979) 35 Virology 76 s. 55-59, joka sisällytetään tähän yhteyteen viitteenä), TN-puskurissa. Noin 200 pl:n näytetilavuus ker- 32 86801 rostettiin 300 μ1:η pinnalle 15 %:ista sakkaroosia, joka sisälsi 1 % Triton X-100 TNS:ssä ja 12 ml:lie sakkaroosi-gradienttia TN:ssä, jossa oli sakkaroosia 20-50 paino-% sekä 0,2 paino-% Quil A:a. Sentrifugointi suoritettiin 250 5 000 g:llä noin 22 tunnin ajan 20 °C:ssa. Sentrifugoinnin jälkeen koottiin 500 pl:n suuruiset jakeet alhaalta käsin ja näytteet (20-50 μΐ) mitattiin radioaktiivisuuden suhteen. Radioaktiiviset proteiinijakeet yhdistettiin ja dialy-soitiin 0,005 M Tris-HCl:llä, joka oli 0,01 M NaCl:n suh-10 teen, pH 7,4, ne annosteltiin 10 ml:n vetoisiin pulloihin ja väkevöitiin lyofilisoimalla niitä 18 tunnin ajan Edward-sin jäädytys-kuivaus-laitteessa.

Tämän valmisteen sedimentaatiokerroin on 24 S. Kompleksin lisäpuhdistus suoritettiin sentrifugoi-den kom-15 pleksia 10-40 paino-%:isen sakkaroosigradientin avulla.

Esimerkki 2

Esimerkin 1 mukainen menetelmä toistettiin käyttämällä hevosen influenssavirusta (Soivalla, eristetty Solvallasta, Tukholmasta). Koe suoritettiin ilman glykosi-20 dilisäystä (esimerkiksi, periaatteessa EP-hakemuksen 81102213.6:n mukaisesti) ja näin saaduille proteiinimisel-leille ja glykosidin kanssa muodostuneelle proteiinikompleksille suoritettiin gradienttisedimentaatio sentrifugoi-malla 10-40 paino-%:isessa sokeriliuoksessa 280 000 g:llä, 25 neljän tunnin ajan 4 °C:ssa. Tulokset on annettu kuviossa 1, jossa esitetään myös standardina toimineen tyroglobulii-nin sedimentaatiokerroin (19 S nuolen kohdalla). Se ilmaisee, että proteiinimisellien sedimentaatiokerroin on 30 S [·] ja glykosidi-proteiini-kompleksin sedimentaatiokerroin 30 on 19 S [o]· (Virusglukoproteiini merkattiin galaktoosiok- 3 sidaasi- H-boorihydridimenetelmän avulla.)

Esimerkki 3

Esimerkin 1 mukainen menetelmä toistettiin tuhkarokkoviruksen avulla parainfluenssa-3-viruksen sijasta.

35 Saatiin kompleksi, jolla elektronimikroskopiassa oli tunnusomainen rakenne, joka esitetään kuviossa 2.

33 86801

Esimerkki 4

Vesikauhuvirusta, jota tuotettiin Bilthovenissa (Hollanti) menetelmän mukaisesti, jota Van Wezel et ai. ovat kuvanneet julkaisussa Davelop. Biol. Standard (1978), 5 41, 159-168, väkevöitiin konsentraatioon 2 mg/ml TNrssä.

1 mg virusta liuotettiin 100 mM:n avulla oktyyli-/3-D-glu-kosidia ja inkuboitiin 45 minuutin ajan 20°C:ssa. Näyte kerrostettiin 50 paino-%risen sokeriliuoksen päälle ja sitä sentrifugoitiin 250 000 g:llä 45 minuutin ajan 4°C:ssa.

10 Ylempää liuosta uutettiin ja Quil A lisättiin 0,2 paino-%:iin saakka.

Näyte suljettiin selluloosaletkuun ja sitä dialy-soitiin 20°C:ssa 0,15 M ammoniumasetaattipuskurissa 1 000 ml:n tilavuudessa, joka vaihdettiin kolme kertaa 72 15 tunnin mittaisen, jatkuvan sekoituksen aikana. Dialysoitu materiaali sisältää vesikauhuviruskompleksin. Osa materiaalista puhdistettiin edelleen sentrifugoimalla 10-40 paino-%:isen sokeriliuoksen kautta 280 000 g:llä neljän tunnin ajan 4°C:ssa. Elektronimikroskopia paljasti rakenteen, jo-20 ka on esitetty kuviossa 3.

Esimerkki 5

Esimerkin 4 mukainen menetelmä toistettiin käyttämällä tuhkarokkovirusta. Saadulla kompleksilla oli samanlainen rakenne kuin esimerkin 3 mukaisesti valmistetulla 25 kompleksilla.

Esimerkki 6

Parainfluenssa-3-virus (U-23) puhdistettiin sakka-roosigradienttisentrifugoinnin avulla ja täten puhdistettu virus liuotettiin konsentraatioksi 10 mg/ml 0,02 M veronaa-30 lipuskuriin, pH 8,0, 0,24 M glukoosin suhteen (BG). 1-5 mg/ ml PI-3-virusta BG-puskurissa tehtiin liukeneviksi 2 %

Triton X 100:11a yhdessä virusten kanssa, jotka oli mer-kattu noin 10 H-iskulla/min (Luukkonen et ai., 1977, viitteen mukaisesti), BG-puskurissa. Näyte, jonka tilavuus oli 35 1 ml, kerrostettiin 1-%:isen agaroosigeelin pinnalle, joka sisälsi 0,02 M veronaalipuskuria, pH 8,0 sekä 0,02 paino-% 34 86801

Quil A:a. Agaroosigeeli suljettiin putkeen, jonka pinta-ala 2 oli 85 mm ja korkeus oli 25 mm. Putken yläosa sekä alaosa yhdistettiin elektroforeesipuskuriin, jona oli 0,02 M ve-ronaalipuskuri, pH 8,0. Yläastia yhdistettiin negatiiviseen 5 elektrodiin ja ala-astia positiiviseen elektrodiin. Elektroforeesi suoritettiin jännitteellä 5 V/cm neljän tunnin ajan. Näyte koottiin geelin anodipuolella ja mitattiin sen radioaktiivisuus. Näyte dialysoitiin 0,15 M ammoniumasetaatti-puskurissa pH 7,0 ja se konsentroitiin lyofilisoimalla.

10 Tämän valmisteen sedimentaatiokerroin on noin 20 S

samalla tavalla mitattuna kuin esimerkissä 2.

Kompleksin jatkopuhdistus suoritettiin sentrifugoi-malla kompleksia 10-40 paino-%risen sakkaroosigradientin läpi.

1 5 Esimerkki 7

Mahanestettä, joka oli saatu hiireltä, joka oli in-fektoitu Toxoplasma gondiilla, suodatettiin harsokankaan ja puuvillan läpi 10 ml:n vetoisessa ruiskussa, sentrifu-goitiin nopeudella 1 000 kierrosta/min 20 minuutin ajan ja 20 solusaostuma liuotettiin PBS:iin ja pestiin kahdesti (1 000 kierrosta minuutissa 20 minuutin ajan). Saostuma, noin 1-10 mg proteiinia, uutettiin (kolme kertaa tunnissa huoneen lämpötilassa) 1 ml :11a 5-%:ista MEGA:a.

Kolme päällä sijaitsevaa liuosta yhdistettiin ja 25 niitä sentrifugoitiin 10 minuutin ajan nopeudella 1 000 kierrosta minuutissa ja 0,1 % Quil A:a lisättiin päällä sijaitsevaan nesteeseen. Sitten seosta dialysoitiin 0,05 % M ammoniumasetaattia vastaan 48 tunnin ajan.

Esimerkki 8 30 E. coli -bakteeria, jossa oli plasmidi pili K 88, ravisteltiin mekaanisesti ja se saostettiin kolme kertaa isoelektrisessä pisteessä. Sitten materiaalin annettiin reagoida samalla tavalla kuin esimerkissä 1. Saatiin komplekseja, joilla oli luonteenomainen rakenne, joka on esi-35 tetty kuvioissa 2 ja 3.

35 86801

Esimerkki 9

Esimerkin 8 mukainen menetelmä toistettiin Salmonellaa käyttäen, jolla on huokosproteiini. Saatiin komplekseja, joilla on luonteenomaiset rakenteet, jotka on esitetty 5 kuvioissa 2 ja 3.

Esimerkki 10

Munuaisten epiteelisoluja kissasta, joka oli infek-toitu kissan leukemiaviruksella, käsiteltiin esimerkin 1 mukaisella menetelmällä. Saatiin komplekseja, joilla oli 10 luonteenomainen rakenne, joka on esitetty kuvioissa 2 ja 3.

Esimerkki 11

Munuaisten epiteelisoluja, joita oli transformoitu härän leukemiaviruksella, käsiteltiin esimerkissä 1 esitetyn menetelmän mukaisesti. Saatiin komplekseja, joilla on 15 kuvioissa 2 ja 3 esitetty luonteenomainen rakenne.

Esimerkki 12

Puhdistettiin parainfluenssa-3-virus U-23 ja proteiinikompleksi valmistettiin esimerkin 1 menetelmän mukaisesti, mutta erotuksena oli se, että 20-50 paino-%:inen sakka-20 roosigradientti TN:ssä sisälsi muuta saponiinia kuin Quil A. Tutkittiin kaksi kaupallista saponiinia, Merck "Weiss", rein 51400023 sekä Se, Lickhardt "S" Schuchardt, Munchen. (Saponiineja, jotka ovat puhtaassa muodossa. Valmistaja ei halunnut ilmaista tuotteen tyyppiä. Ohutkerros-25 kromatografiässä ne eroavat Quil A:sta.) Syntyvän kompleksin sedimentaatiokerroin on 24 S ja se ilmaisee samaa rakennetta kuin on kompleksilla, joka on valmistettu esimerkin 3 mukaisesti.

Esimerkki 13 30 5 mg tuhkarokkovirusta liuotettiin esimerkin 3 mu kaisesti ja pantiin anioninvaihtajaan, joka oli DEAE-sellu-loosatyyppiä. Ioninvaihtaja oli pylväässä, jonka tilavuus oli 20 ml ja se tasapainotettiin 0,01 M fosfaattipuskurilla pH 7,2, jossa oli 0,5 paino-% oktyyli-/3-D-glukosidia. Näy-35 temateriaali pantiin ioninvaihtajaan ja adsorboituina ton materiaali pestiin pois, sen jälkeen kun pylvään läpi oli 36 86801 laskettu viiden pylvään tilavuutta 0,01 M fosfaattipuskuria, pH 7,2, jossa oli 0,5 paino-% oktyyli-/3~D-glukosidia ja sitten adsorboitu materiaali eluoitiin lisäämällä pylvääseen suolagradientti, jossa oli 0 - 0,5 M NaCl liuotet-5 tuna 0,01 M fosfaattiin, pH 7,2, joka oli 0,5 paino-%:inen oktyyli-/3-D-glukosidin suhteen. Identifioitiin jakeet, joissa oli tuhkarokkoviruksen membraaniproteiinit, ne yhdistettiin ja Quil A lisättiin 0,1 paino-%:iin ja suoritettiin dialysointi 0,05 M ammoniumasetaattia vastaan, pH 10 7,0. Muodostui kompleksi, jolla oli luonteenomainen raken ne, joka on esitetty kuvioissa 2 ja 3.

Esimerkki 13a

Tuhkarokkoviruksia (RIV-Bilthoven) liuotettiin esimerkin 3 mukaisesti. Virus-detergentti-seosta sentrifugoi-15 tiin kahden tunnin ajan nopeudella 100 000 x g. Syntyvä ylempi liuos dialysoitiin fosfaattipuskuria vastaan, jolla oli alhainen suolasisältö (10 mM fosfaattia - 50 mM NaCl -pH 7,2) ja se pantiin DEAE-Sepharose-anioninvaihtajaan, joka tasapainotettiin puskurissa, jossa oli 10 mM fosfaattia 20 pH 7,2 - 50 mM NaCl - 0,05 % TX-100. Adsorboitumaton materiaali pestiin pois samalla puskurilla. Sitten pylväs tasapainotettiin puskurilla, joka sisälsi 10 mM fosfaattia - 50 mM NaCl - 0,1 % Quil A:a. Adsorboitunut materiaali eluoitiin samalla puskurilla, joka sisälsi 300 mM 25 NaCl. Eluoitu materiaali sisälsi komplekseja, joilla oli luonteenomainen rakenne, joka on esitetty kuviossa 2.

Esimerkki 14 22 nM hepatiitti B virus -partikkeleita, jotka oli saatu London School of Tropical Medicine and Hygiene:stä 30 (Englanti), lietettiin TN:ään konsentraationa 1 mg/ml.

0,3 mg proteiinia, jossa oli 22 nM partikkeleita liuotettiin 2 tilavuus-%:isella Triton X-100, joka oli 0,5 M NaCl:n suhteen ja sitä inkuboitiin 16 tunnin ajan 37°C:ssa. Sitten esimerkin 1 mukainen menetelmä toistettiin. Syntyvän komp-35 leksin sedimentaatiovakio oli 20 S. Elektronimikroskopian perusteella kompleksilla oli rakenne, joka on esitetty 3’ 86801 kuviossa 4. Tämä rakenne eroaa rakenteesta, joka on esitetty kuviossa 2 siinä suhteessa, että se käsittää tämän rakenteen osia.

Esimerkki 15 5 3 mg härän ripulivirusta (BDV) TN:ssä hajotettiin lisäämällä Triton X-100 1 tilavuus-%:iin saakka. Seosta ravisteltiin kahden tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Liuotettu virus pantiin lektiinipylvääseen, joka käsitti Lentil-lektiiniä, joka oli kiinnitetty Sepharose 4 B:en (Pharmacia, 10 Uppsala). Pylväs tasapainotettiin TN:llä ja sen jälkeen kun virusmateriaali oli pantu pylvääseen, sitä pestiin viiden pylvään tilavuudella TN, joka sisälsi 0,1 tilavuus-%

Triton X-100 ja sen jälkeen 10 pylvään tilavuudella TN. Viruksen kapseliproteiinit deadsorboitiin eluointipuskuril-15 la, joka käsitti 0,2 M metyyli-Ct-D-mannosidia, 0,5 paino-% oktyyli-/3-D-glukosidia, joka oli liuotettu TN:ssä, lisäämällä se pylvääseen. Jakeet, jotka sisälsivät viruksen kap-seliproteiineja, koottiin ja niihin lisättiin 0,1 paino-% Quil A:a. Seosta dialysoitiin 0,05 M ammoniumasetaatilla 20 pH 7,0 4°C:ssa kolmen päivän ajan vaihtaen kolme kertaa 1 litran suuruinen puskuritilavuus.

Lopullinen tuote lyofilisoitiin ja elektronimikroskopia paljasti (kompleksi) rakenteita, jotka ovat kompleksin osia, jotka on esitetty kuviossa 4. Tämän valmisteen 25 sedimentaatiovakio on 20 S.

Esimerkki 16

Puhdistetut, tapetut poliovirukset, jotka oli valmistettu RIV-Bilthovenissa Van Wezel et al.:n kuvaaman menetelmän mukaisesti (Develop. Biol. Standard (1978) 41, 30 159-168), liuotettiin sopivaan puskuriin, kuten esimerkik si TN:iin, joka sisälsi liuottavan aineen, esimerkiksi 2 % natriumdodesyylisulfaattia, inkuboimalla 37°C:ssa kahden tunnin ajan. Viruksen kapseliproteiinit erotettiin elektroforeesin avulla sopivassa 10-%:isessa polyakryyli- 35 amidigeelissä, joka sisälsi 0,1 % dodesyylisulfaattia. Proteiinien asemien identifioinnin jälkeen geelissä, 38 86801 siitä leikattiin sopivat suikaleet ja proteiinit eluoitiin elektroforeesin avulla. VP-3, jonka molekyylipaino on noin 26 K Daltonia, on yksi kapseliproteiineista. Triton X-100 sekoitettiin VP:3 sisältävän liuoksen kanssa siten, että 5 lopulliseksi konsentraatioksi tuli 2 %. Tätä seosta käytettiin sitten proteiinikompleksin (iskom) valmistamiseen, esimerkissä 1 esitetyn sentrifugointimenetelmän mukaisesti.

Elektronimikroskopia ilmaisi valmisteen luonteenomaisen rakenteen, joka on esitetty kuviossa 3.

10 Esimerkki 17

Formaliinilla tapetut, puhdistetut poliovirukset (valmistettu RIV-Bilthovenissa) liuotettiin 67 tilavuus-%:iseen etikkahappoon, joka sisälsi 0,1 M MgC^. Sitten virusmateriaalia ultrasentrifugoitiin yhden tunnin ajan 15 100 000 g:llä ja yksinomaan virusproteiineja sisältävä supernatantti otettiin talteen ja dialysoitiin siten, että läsnä oli 0,1 paino-% Quil A puskuria vastaan, jossa oli 0,01 M Trisiä, 0,14 M NaCl, pH 7,4. Syntyvällä kompleksilla oli samanlainen rakenne kuin esimerkin 3 mukaan val-20 mistetulla kompleksilla.

Esimerkki 18

Neisseria meningitidiksen ulkomembraaniproteiinit otettiin vastaan jäädytyskuivattuina National Institute of Healthilta (Alankomaat) ja ne liuotettiin TN:ssä, joka si-25 sälsi 2 paino-% oktyyli-/J-D-glukosidia sekä 0,1 paino-%

Quil A ja niitä käsiteltiin samalla tavalla kuin esimerkissä 4. Syntyvän kompleksin sedimentaatiovakio on 20 S samalla tavalla mitattuna kuin esimerkissä 2.

Esimerkki 19 30 Hydrofobisia aminohappoja sisältävä peptidi. Suu- ja sorkkatautipeptidi 144-169, O. Kaufbehren. Käytettiin VP 1:tä, joka oli syntetisoitu 0, 1, 2, 3 ja 4 tyrosiinin kanssa toiseen päähän kytkettynä (kuten kaupallisesti saatu) . Peptidi liuotettiin erittäin pieneen määrään 65 tila-35 vuus-V, :ista et ikkahappoa , neutraloitiin 25-%: isolla ammoniakilla ja seos laimennettiin ammoniumasetaatin suhteen 39 8 6 8 01 0,5 M:ksi käyttäen tislattua vettä (detergentin lopullinen konsentraatio 2 %). Lisättiin 0,1 % glykosidia ja seosta dialysoitiin 0,05 M ammoniumasetaattia vastaan, pH 7. (Dia-lyysiletku Spectra Por 6 MWCO 1,000.) 5 Muodostuneen kompleksin voidaan osoittaa elektroni mikroskopiassa (ks. kuvio 5) ilmaisevan pyöreän, elektro-nitiheän partikkelin, jonka pituus on 20-40 nm ja leveys on 10 nm. Nähtiin myös muita kokoja.

Kuvio 5a esittää kolmeen tyrosiiniin kytketyn pepti-10 din elektronimikroskooppikuvaa (EM) ja kuvio 5B esittää neljään tyrosiiniin kytketyn peptidin EM-kuvaa.

Esimerkki 20

Hiireltä saatu IgG puhdistettiin tunnettujen menetelmien mukaisesti (M. Van den Branden, J.L. de Coen, L.

15 Kanarek ja Royschaert (1981) sekä Molecular Immunology 18, s. 621-631 (1981)) tai sitä rikastettiin ammoniumsulfaatti- saostuksen avulla (J.E. Conradie, M. Govender, L. Visser, Journal of Immunological Methods, osa 59, s. 289-299 (1983); lainaukset sisällytetty viitteinä) ja dialysoitiin yli yön 20 yhtä litraa vastaan 0,15 M fosfaatti(PC)-puskuria, pH 2,5, jäähdytetyssä huoneessa. Sitten lisättiin 2 % detergenttiä (esim. oktyyli-/3~D-glukosidia) . Jos käytetään detergenttiä, jolla on hyvin alhainen, kriittinen misellikonsentraatio (MCM), detergentti täytyy vaihtaa ennen dialyysin alkua.

25 Seosta dialysoitiin PC, pH 7, vastaan. Tuntia myöhemmin Quil A lisättiin 0,05 %:n lopulliseksi konsentraatioksi, ja dialyysiä jatkettiin PC, pH 7, vastaan 24 tunnin ajan jäähdytetyssä huoneessa.

Kompleksin muodostuminen osoitettiin sentrifugoimal-30 la 5-30 %:n sakkaroosigradienttia vastaan 3,3 tunnin ajan nopeudella 40 000 kierrosta minuutissa Beckman SW-60 roottorissa. Kompleksit havaittiin gradientissa ELISA-teknii-kan avulla.

Esimerkki 21 35 Iskomien valmistus linnun keuhkoputkentulehduksen aiheuttavasta viruksesta (Coronaviridae-suku). 5 mg 4o 86801 linnun puhdistetun keuhkoputkentulehdusviruksen sakkaroosi-gradienttia, joka oli 0,5 ml:ssa TN-puskuria (0,05 M Tris ja 0,1 M NaCl), liuotettiin lisäämällä oktyloglukosidi-de-tergenttiä 2 %:iin saakka ja inkuboitiin yhden tunnin ajan 5 37°C:ssa ja kaksi tuntia huoneen lämpötilassa. Seos kerrostettiin sakkaroosigradientin pinnalle, joka käsitti 3 ml 30-%:ista sakkaroosia TN:ssä, putken pohjalla ja tämän yläpuolella 1,5 ml 10-%:ista sakkaroosia, 1 % oktyloglukosidia ja 0,1 % Quil A sisältävässä TNrssä. Sentrifugoitiin TST 10 54 Contron roottorissa kahden tunnin ajan nopeudella 50 000 kierrosta minuutissa ja 20°C:ssa.

Gradientin huipulta koottiin 2 ml ja dialysoitiin 6°C:n lämpötilassa 1 litraa vastaan 0,05 M ammoniumasetaat-tia, joka korvattiin joka kolmas tunti kolmen päivän pitui-15 sen jakson aikana. Dialyysin jälkeen valmistetta sentrifugoitiin 10 ml:n kautta 10-%:ista sakkaroosia, joka oli TNrssä kuuden tunnin ajan nopeudella 40 000 kierrosta minuutissa TST Contron roottorissa 20°C:ssa. Saostuma lietet-tiin 1 ml jaan TN-puskuria.

20 Elektronimikroskopia ilmaisi tyypillisen iskomien morfologian (ks. kuvio 2).

Esimerkki 22

Iskomien valmistus kissan leukemiaviruksesta (Retro-viridae-suku). FeLVm valmistamiseksi joko FL74 tai F422 25 lymfoblastisolulinjaa viljeltiin suspensiossa Wolff et ai.:n mukaan. Elatusaine koottiin päivän välein ja solun pirstaleet poistettiin sentrifugoimalla alhaisella nopeudella. Konsentroitiin ultrasuodatuksen avulla käyttämällä Millipore®-suodatinjärjestelmää (sulkee pois mp 100 000) 30 ja virus puhdistettiin edelleen ultrasentrifugoimalla kaksi kertaa 30-%risen (paino/paino) sakkaroosikerroksen kautta. Syntyvä saostuma liuotettiin TN-puskurilla (0,05 M Tris ja o,1 M NaCl, pH 7,4), joka sisälsi 2 % Triton X-100 ja 0,02 % ditiobis-n-nitropyridiiniä. Iskomit valmistettiin 35 edellä kuvatulla tavalla sentrifugointimenetelmää käyttäen. Lyhyesti sanottuna 200 ^ul liuotettua virusta pantiin 41 86801 200 ^ul:n kerroksen päälle 8-%:ista sakkaroosia, 1 %:n Triton X-100 sisältävässä TN:ssä kerrostettuna 5 ml:lie 10-40-%:ista sakkaroosigradienttia, joka sisälsi 0,2 %

Quil Δ. Sentrifugointi suoritettiin SW50 roottorissa no-5 peudella 150 000 g neljän tunnin ajan 20°C:ssa. Gradientti koottiin 500 ^ul:n jakeina ja gp 70/85 sisältävät jakeet identifioitiin 10-%:isella SDS-polyakryyliamidigeelielek-troforeesilla (SDS-PAGE). Gp 70/85:n läsnäolosta varmistuttiin edelleen pistetäpläjärjestelmän avulla. Fraktiois-10 ta pantiin 5 ^ul:n jakeet nitroselluloosasuodattimelle, upotettiin 30 minuutiksi TN-puskuriin, joka sisälsi 5 % albumiinia ja joka pestiin TN-puskurilla. Sitten sijoitettiin monoklonaalisella anti-gp-70/85-vasta-aineella merkattua piparjuuriperoksidaasia ja sitoutuminen havainnollis-15 tettiin TN-puskurissa suoritetun pesun jälkeen. Iskomien läsnä olosta varmistuttiin negatiivisella kontrastielektro-nimikroskoopilla aiemmin kuvatulla tavalla. Kokonaispro-teiinisisältö mitattiin Lowryn mukaan ja gp 70/85 määritettiin selaamalla polyakryyliamidigeeli. Valmisteet lyo-20 filisoitiin varastointia varten.

Kissoilla suoritetuissa immunisaatiokokeissa isko-mit aikaansaivat neutraloivia vasta-aineita ja suojan he-rätekokeen aiheuttamaa infektiota vastaan.

Esimerkki 23 25 Iskomien valmistus Plasmodium falciparumista (Protozoa). 1 mg Plasmodia falciparumia (Trophozoites, Schizonts ja Merozoites) lietettiin 500 ^ulraan TN-pusku-ria, joka sisälsi 1 % MEGA:a. Solut ja soluntähteet sentri-fugoitiin alhaisella nopeudella 3 000 kierrosta minuutissa 30 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Suspensiota inkuboi- tiin yhden tunnin ajan 30°C:ssa ja kahden tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen suspensio kerrostettiin epäjatkuvan sakkaroosigradientin huipulle, joka käsitti 3 ml 30-%:ista sakkaroosia TN-puskurissa putken pohjalla.

35 Tämän yläpuolella oli 1,5 ml 10-%:ista sakkaroosia ja 1 % MEGA:a TN-puskurissa ja 0,1 % Quil A. Gradienttia sentri- 42 86801 fugoitiin kolmen tunnin ajan nopeudella 50 000 kierrosta minuutissa 2ö°C:ssa TST 55 Contron -roottorissa. Gradientin huipulla sijaitseva 3 ml:n liuoserä koottiin ja dialysoi-tiin yhtä litraa vastaan 0,1 M ammoniumasetaattia, joka 5 korvattiin kolme kertaa kolmen päivän mittaisen dialyysin aikana. Tämän jälkeen tuote koottiin ja kerrostettiin 10-%:isen sakkaroosin päälle 13 ml:n vetoisessa sentrifu-giputkessa ja sitä sentrifugoitiin kuuden tunnin ajan 20°C:ssa nopeudella 40 000 kierrosta minuutissa TST 41 10 Contron -roottorissa. Saostuma liuotettiin 500 ^ul:aan TN-puskuria. Elektronimikroskooppi ilmaisi partikkelin, jolla oli iskomien tyypillinen morfologia.

Esimerkki 24

Iskomien valmistus Bordetella pertussiksen ulkomem-15 braaniproteiineista. 10 g lyofilisoitua Bordetella pertus-sista lietettiin 340 mlraan tislattua vettä. Bakteerit rikottiin ranskalaisessa puristimessa. Tämän jälkeen suspensiota kuumennettiin 66°C:seen ja lisättiin yhtä suuri tilavuus fenoli-vesi-liuosta (90 % fenolia ja 10 % tislattua 20 vettä) 66°C:n lämpötilassa. Seos pantiin ravistelijaan 20 minuutiksi ja sitten se jäähdytettiin 5°C:seen ja sitä sentrifugoitiin 20 minuutin ajan nopeudella 3 000 kierrosta minuutissa. Vesijae koottiin ja MEGA lisättiin 2 %:n konsentraatioon saakka ja SDS lisättiin 0,1 %:n konsentraa-25 tioon asti. Tämän jälkeen valmistetta sentrifugoitiin 20 minuutin ajan kierrosnopeudella 3 000 kierrosta minuutissa ja supernatantti koottiin. Seos konsentroitiin ultrasuoda-tuksen avulla käyttämällä Millipore®-suodatinjärjestelmää (sulkee pois mp 100 000) ja proteiinikonsentraatio, joka 30 oli mitattu Lowryn avulla (1), säädettiin 20 mg:ksi prote-iinia/ml. Tämän jälkeen Quil A lisättiin 0,2 %:n konsentraatioon saakka ja suspensio dialysoitiin 6°C:ssa yhtä litraa vastaan 0,15 M ammoniumasetaattia, joka uusittiin kolme kertaa kolmen päivän pituisen jakson aikana. Elektro-35 nimikroskopia ilmaisi partikkeleita, joilla oli iskomien tyypillinen morfologia.

43 86801

Esimerkki 25 10 mg HINI-PR8-virusta liuotettiin 100 ^ulrlla 20-%:ista N-dekanyyli-N-metyyli-glukamiinia ja inkuboitiin tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Liuotetut membraanipro-5 teiinit erotettiin ydinosasta sentrifugoimalla 20-%:isen sakkaroosin läpi, joka sisälsi detergenttiä konsentraatio-na, joka ylitti kriittisen misellikonsentraation. Membraa-niproteiinit koottiin ja lisättiin Quil A:a siten, että sen lopulliseksi konsentraatioksi tuli 0,1 % ja dialysoitiin 10 0,9-%:ista NaCl vastaan ensimmäiset 4-6 tuntia huoneen läm pötilassa, sitten 4°C:ssa.

Esimerkki 26 300 ,ug gp 340:ää, Epstein Barr viruksen (herpesvirus) kapseliproteiinia, joka on 200 ^,ul:ssä PBS, lisä-15 tään putkeen, jossa on 70 ^,ug kolesterolia kuivattu seinämälle. Lisätään Triton X-100 ja seosta pidetään huoneen lämpötilassa kahden tunnin ajan. Seos, joka on 300 ^ul:n tilavuudessa, kerrostetaan gradientin huipulle, joka huipusta lähtien pohjaa kohti sisältää 200 yUl 15-%:ista sak-20 karoosia ja 1 % TX-100 sekä ~12 ml 20-%:ista sakkaroosia PBS:ssä, jossa on 0,1 % Quil A. Sentrifugointi suoritettiin nopeudella 40 000 kierrosta minuutissa Beckman SW 40 -roottorissa 16 tunnin ajan ja 20°C:ssa. Gradientti koottiin pohjasta käsin 500 ^ulrn suuruisina erinä. Gp 340, deter-25 gentin kanssa sekoitettuna sekä kolesteroli voidaan järjestää uudelleen iskomeiksi dialyysimenetelmän avulla. Tuossa tapauksessa Quil A lisättiin ennen dialyysiä siten, että lopulliseksi konsentraatioksi tuli 0,1 %. Sitten on edullista käyttää detergenttiä, joka voidaan helposti dia-30 lysoida pois, esimerkiksi oktyyliglykosidia, jota käytettiin tässä tapauksessa.

Sitten seosta dialysoitiin 48 tunnin ajan 4-6°C:ssa PBS vastaan (on käytetty myös TN-puskuria). Iskomien muodostuminen tarkistettiin elektronimikroskopiassa. Erilai-35 sin menetelmin, esimerkiksi valitulla menetelmällä 44 86801 puhdistettujen, esim. erilaisten virusten kapseliproteii-nien käytön antama etu on ilmeinen.

Esimerkki 27

Hydrofobisista peptideistä valmistetut iskomit. Val-5 mistettiin iskomeja peptideistä, joilla on hydrofobinen häntä, esim. Tyr^-FMD Tyr^-FMD

palmitiinihappo-FMD

myristiinihappo-FMD

10 Liuotetaan 1 mg peptidiä 100 ^ulissa 20-%:ista ok- tyyliglukosidia, N-dekanyyli-N-metyyli-glukamiinia tai jotain dialysoivaa detergenttiä, lisätään ekvimolaarinen määrä (i 20 %) kolesterolia 50 ^ulissa detergenttipuskuriliuosta, 15 lisätään puskuria ja Quil A siten, että lopulliseksi konsentraatioksi tulee 1 mg/ml peptidiä ja 0,1 % Quil A, dialysoidaan (dialyysipussi, estää läpäisyn molekyy-lipainon 1 000 kohdalla) perusteellisesti PBS tai jotain muuta sopivaa puskuria vastaan, ensimmäiset 24 tuntia huo-20 neen lämpötilassa.

Esimerkki 28

Aminohappojen 139-153 sekvenssi, joka edustaa osaa T-solujen kasvutekijästä, interleukiini II:sta, syntetisoitiin siten, että aminopäätteenä oli kaksi tyrosiinia.

25 Peptidit kytkettiin iskomissa sijaitseviin glyko- proteiineihin diatsotoinnin avulla.

Iskomit käsittivät glykoproteiineja, jotka ovat peräisin influenssaviruksesta, kanta N2/PR-8 ja joita valmistettiin sentrifugoimalla esimerkeissä 1 ja 2 esitetyn 30 menetelmän mukaisesti.

1 mg iskomvalmistetta (laskettu iskomin sisältävän proteiinimäärän perusteella) liuotettiin 0,1 M boraatti-puskuriin, pH 9,5 (1 mg/ml). Aktivointi suoritettiin lisäämällä 5 mg (5 mg/ml.mg) kiinteää MHNB:ä (metyyli-4-35 hydroksi-3-nitrobents-imidaattia). Seosta ravisteltiin, kunnes kaikki MHNB oli liuennut, jonka jälkeen liuosta 45 86801 inkuboitiin kahden tunnin ajan huoneen lämpötilassa (viite Muller, Pleiderer, Hoppe-Seyler1 s Z. Physiol. Chem., osa 359, s. 407-411 (1978), Muller, Pleiderer, Journal of Applied Biochem, osa 1, s. 301-310 (1979)). Sitten seosta 5 dialysoitiin yön yli 0,1 M boraattia, pH 8,0, vastaan 4°C:ssa, pelkistettiin ditioniitilla (1 mg ditioniittia/ml) 1-2 minuutin ajan huoneen lämpötilassa, dialysoitiin 0,1 M boraattia, pH 8,0, vastaan 2-6 tunnin ajan 4°C:ssa ja dialysoitiin 0,1 M boraattia, pH 4,0, vastaan yli yön 4°C:ssa.

10 Sitten seos diatsotoitiin lisäämällä NaNC>2 (6,9 mg/ ml) kantaliuoksesta (100 mg/ml tislatussa vedessä), inkuboitiin yhden minuutin ajan jäähauteella, jonka jälkeen pH säädettiin nopeasti 8,5:ksi (booraksi ja NaOH). 1 mg peptidiä liuotettuna 50-100 ^ul:aan 0,1 M boraattia, pH 8,5, li-15 sättiin sitten liuokseen ja sekoitettiin sen kanssa perusteellisesti, jonka jälkeen lämpötila kohotettiin huoneen lämpötilaan ja liuosta inkuboitiin kahden tunnin ajan.

Sitten seosta dialysoitiin 0,1 M boraattia, pH 8, vastaan yli yön 4°C:ssa. Dialyysiletkun läpäisyraja = 20 1 000. Lisättiin sitten 1 % MEGA (tai 2 % /3-oktyyliglukosi- dia) +0,1 % Quil A, jonka jälkeen seosta inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen seosta dialysoitiin PBS:ssä (tavanomainen dialyysiletku) 2-4 tunnin ajan huoneen lämpötilassa sekä sitten 4°C:ssa yön yli.

25 Elektronimikroskopia varmisti, että iskomkomplekseja oli läsnä.

Viisi hiirtä immunisoitiin kukin noin 10 ^ug:lla peptidiä, joka oli iskomkompleksin muodossa, joka oli valmistettu Mullerin kuvaaman menetelmän mukaisesti, Miiller, 30 j., Pfleiderer, G.A., (1979), Journal of Applied Biochem I, s. 301-310. Hiirten immunisoinnin jälkeen vasta-ainevaste seerumissa arvioitiin ELISA-tekniikalla, jossa käytettiin alkalista fosfataasientsyymiä. Tausta, esimerkiksi luettavuus absorbanssina 405:ssä oli 0,01 % tai alhaisempi see-35 ruminäytteillä, jotka olivat peräisin hiiriltä, joita ei oltu immunisoitu. Immunisoiduista hiiristä otettu seerumi 46 86801 sisälsi vasta-aineita, jotka voitiin osoittaa laimennuksilla aina 1:100:aan saakka tai vielä suuremmilla laimennuksilla sekä lukemien avulla, jotka olivat 10 kertaa suurempia kuin tausta tai vielä tätä suurempia. Mitään vasta-aine-5 vastetta ei havaittu, kun immunisoitiin ainoastaan peptidien avulla.

Esimerkki 29 20 aminohapon sekvenssi (141-160, jotka on saatu VIP FMD virukselta, suu- ja sorkkatauti) syntetisoitiin 10 kolmena varianttina: 1. 15 aminohappoa ilman muita lisäyksiä; 2. 15 aminohappoa sekä kaksi (2) lisäaminohappoa aminopäässä; 3. 15 aminohappoa sekä yksi (1) N-hydroksi-sukkin-15 imidiesteri.

Peptidit kytkettiin iskomiin, joka valmistettiin esimerkin 1 mukaisesti influenssaviruksen, kannan H2N2/ PR-8, glukoproteiineista kolmella kytkentämenetelmällä.

Muunnos 1 kytkettiin iskomeihin niiden COOH-päättei-20 den välityksellä käyttämällä karbodi-imidi-menetelmää (vertaa karbodi-imidikytkentä).

250 ^ug peptidiä liuotettiin 250 ^uljaan 25 mM fosfaattipuskuria, pH 5.

2,5 mg EDC (1-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)-25 karbodi-imidi, Sigma) liuotettiin 250 ^ul:aan tislattua vettä ja sekoitettiin peptidin kanssa. Sitten seosta inku-boitiin kahden minuutin ajan huoneen lämpötilassa.

1 mg iskomia (laskettu proteiinina) liuotettuna 500 ^ulraan 0,4 M fosfaattipuskuria, pH 8, lisättiin seok-30 seen ja sen annettiin reagoida yön yli huoneen lämpötilassa. Sitten seosta dialysoitiin yli yön PBS vastaan 4°C:ssa.

Kytkennän saanto oli 27 %, joka vastaa arviolta noin viittä (5) FMDV-peptidiä primaarisen iskomin kussakin proteiinissa.

35 Muunnos 2 kytkettiin iskomeihin tyrosiiniensa väli tyksellä diatsotoinnin avulla, vrt. esimerkki 28. 55 % 47 86801 peptidistä kytkettiin primaariseen iskomiin, joka vastaa noin 13 peptidiä primaarisen iskomin proteiinimolekyyliä kohti.

Muunnos 3, N-hydroksi-sukkinimidi-peptidin kytkentä 5 iskomeihin. 1 mg influenssaviruksen iskomvalmistetta (H2N2/Pr-8), valmistettu sentrifugointimenetelmällä (vrt. diatsokytkentä), dialysoitiin 0,05 M fosfaattipuskuria vastaan, pH 5.

1 mg sukkinyylipeptidiä liuotettiin 25 yultssa väke-10 vöityä etikkahappoa, jonka jälkeen peptidi + iskomvalmiste sekoitettiin ja ne titrattiin 2-3 minuutin kuluessa 0,2 M Na2HPO^:llä pH 8:ksi. Sitten seosta inkuboitiin neljän tunnin ajan huoneen lämpötilassa.

Lisättiin 1 % MEGA (tai 2 % /^-oktyyliglukosidia) se-15 kä 0,1 % Quil A ja seosta inkuboitiin 30-60 minuutin ajan huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen seosta dialysoitiin PBS vastaan 2-4 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja sitten yön yli 4°C:ssa.

Esimerkki 30 20 Biotiini-iskom-kompleksi. Iskom muodostettiin gluko- proteiineista, jotka oli saatu influenssavirukselta, joka oli serotyyppiä A, alatyyppiä AEq2 BEq2, kantaa Soivalla/ 79. Iskom valmistettiin esimerkkien 1 ja 2 mukaisesti.

1 mg (laskettu proteiinina) Solvalla-iskomia liuo-25 tettiin 1 mitään 0,1 M NaHCO^, pH 8, ja siihen lisättiin 100 ^ul (0,2 mg kantaliuoksesta, joka sisälsi 2 mg/ml DMSOtssa) N-hydroksi-sukkinimidobiotiinia (Sigma), jonka jälkeen syntyvää liuosta inkuboitiin neljän tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja sitä dialysoitiin yli yön PBS vas-30 taan 4°C:ssa. Elektronimikroskopia ilmaisi iskomkompleksien läsnäolon.

Kolme hiirtä (Balb/c) immunisoitiin, kukin kaksi kertaa, 50 ^ulilla konjugaattia (laskettu konjugaatin kokonaispainona) , 14 päivän välein. Kolmen päivän kuluttua 35 ensimmäisen immunisoinnin jälkeen kaikilla hiirillä havaittiin vasta-ainetiitteri, joka oli - 1/100 000, ELISA- 48 86801 tekniikalla mitattuna. ELISA-levyjen kammiot päällystettiin biotinyloidulla BSArlla (härän seerumin albumiini). BSA käytettiin biotiinin esille asettamiseksi analyysin aikana. Mikään vasta-aineista, jotka oli otettu immunisoiduista 5 hiiristä, eivät reagoineet yksinomaan BSArlla päällystettyjen levyjen kanssa. Eläimien ei havaittu kärsivän mistään sivuvaikutuksista.

Esimerkki 31

Peroksidaasin kytkeminen PR8-primaariseen iskomiin 10 Nakane Kawaoin (1974), mukaisesti. Peroksidaasilla merkattu vasta-aine. Uusi konjugointimenetelmä I Histochem. Cytochem. 22, 1084.

1 mg HPR (peroksidaasia) liuotettiin 200 ^lraan 0,3 M NaHC03, pH 8,1, ja lisättiin 20 yul 1-%:ista FDNBra 15 (fluorodinitrobentseeniä) ja inkuboitiin yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa, primaaristen aminoryhmien suojaamiseksi. Sitten lisättiin 200 ^ul 0,08 M NalO^ ja inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa, viereisten 0H-ryhmien muuttamiseksi CHO-ryhmiksi. 200 ^ul 0,18 M etylee-20 niglykolia lisättiin ja inkuboitiin yhden (1) tunnin ajan huoneen lämpötilassa reagoimattoman NalO^rn poistamiseksi.

Aktivoitua peroksidaasia ja 1 mg (laskettu proteiinina) influenssaviruskannan H2N2 PR-8 iskomia (valmistettu . esimerkin 1 mukaisesti) dialysoitiin yli yön 0,01 M

25 NaHCO^, pH 9,5, vastaan (kukin sinänsä).

PR-8 +HRP-liuokset sekoitettiin ja niitä inkuboitiin ainakin neljän tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Konju-gaatti erotettiin kytkeytymättömästä HRPrstä gradientti-sentrifugoinnin avulla 10-40-%:isella sakkaroosilla, jolloin 30 HRP-aktiivisuus seurasi iskomia. Elektronimikroskopia paljasti iskomkompleksien läsnäolon.

Molekyylien kytkentää yllä esitetyissä esimerkeissä kontrolloitiin gradienttisentrifugoinnin avulla. Iskomiin kytketyt, radioaktiivisesti merkatut peptidit seuraavat 35 iskomkompleksia ja laskeutuvat S-vakion arvolla noin 19 S, so. samalla arvolla kuin iskomkompleksin itsensä S-arvo on.

<9 86801

Esimerkki 32

Iskomien valmistus malariapeptidin, oktapeptidin (Glu-Glu-Asu-Val-Glu-His-Asp-Ala) avulla. Primaarinen is-kom valmistettiin esimerkissä 25 kuvatulla tavalla dialyy-5 simenetelmällä influenssaviruskannan PR 8 kapseliproteii-nien kanssa.

1 ml PR 8 iskomia PBS:ssä (0,98 mg/ml) sekoitettiin 1,56 mg:n kanssa malariapeptidiä;

Lisättiin 10 yUl 25-%:ista glutaraldehydiä siten, 10 että lopullinen konsentraatio oli 0,25 %;

Inkuboitiin 24 tunnin ajan huoneen lämpötilassa samalla hitaasti sekoittaen;

Valmistetta dialysoitiin 24 tunnin ajan 4°C:ssa PBS vastaan.

15 Kokonaisproteiinipitoisuus määritettiin 1,02 mg:ksi/ ml Bradfordin mukaisella menetelmällä (Analyt. Biochem. 1976, s. 248-254).

Noin 25 % peptidistä laskettiin sitoutuvan PR 8 is-komiin. Tyypillisiä iskomeja nähtiin elektronimikroskopian 20 avulla.

Viisi hiirtä rokotettiin 50 yugrlla konjugaattia ihonalaisesti. Kahden viikon kuluttua koottiin verta seerumin valmistusta varten. Samanaikaisesti annettiin toinen 50 ^ug:n suuruinen annos konjugaattia. Lisäviikon jälkeen 25 hiiristä vuodatettiin verta ja valmistettiin seerumia.

Seerumin vasta-ainevaste tutkittiin ELISA-kokeessa käyttämällä hiiristä koottua, yhdistettyä seerumia.

ELISA suoritettiin muovisilla laatoilla (Nunc 96 F 2 - 69620 PS SH).

30 Päällystys suoritettiin härän seerumin albumiiniin (BSA) konjugoidulla peptidillä - (yksi mg BSA ja 1 mg peptidiä, käyttämällä glutaraldehydiä yllä kuvatulla tavalla sekä 0,25 %:n lopullisena konsentraationa). Seosta dialysoitiin yllä kuvatulla tavalla. Käytettiin yksi ^ug konju-35 gaattia (BSA-peptidiä) ml:aa kohti päällystykseen käytetyssä puskurissa, esimerkiksi 0,05 M karbonaattipuskurissa, 50 8 6 8 01 pH 9,6 ja kuhunkin alustan kammioon lisättiin 100 ,ul. In-

O

kuboitiin 4 C:ssa yli yön.

0,05 % Tween 80 sisältävällä fosfaattipuskurilla suoritetun kahden pesun jälkeen lisättiin koeseerumia eri 5 laimennuksina. Inkuboitiin yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Yllä kuvatulla tavalla suoritettujen pesujen jälkeen lisättiin kaniinin anti-hiiri-seerumia (Dakopatts, Kööpenhamina), joka oli merkattu piparjuuriperoksidaasil-la. Inkuboitiin yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Tä-10 män jälkeen lisättiin trimetyylibentsidiinisubstraattia. Reaktio pysäytettiin 10 minuutin kuluttua ja luenta suoritettiin 405 nm:ssä.

Tulokset:

Kahden viikon kuluttua ensimmäisestä rokotuksesta 15 yhdistetyn seerumin laimennustiitteri oli 1:300. Viikon kuluttua toisesta rokotuksesta tiitteri kohosi 1:700:aan.

Millään hiiristä ei ilmennyt immunisoinnista johtuvia sivuvaikutuksia. Peptideillä suoritettavaan tavanomaiseen immunisointitapaan sisältyy peptidin kytkeminen pro-20 teiiniin, esimerkiksi BSA:an tai KLHriin. Sitten tämä kon-jugaatti sekoitetaan tai emulgoidaan öljyadjuvantin kanssa, esimerkiksi Freundin epätäydellisen tai Freundin täydellisen adjuvantin kanssa, joka antaa useita sivuvaikutuksia paikallisten tai systeemisten reaktioiden muodossa. Näitä 25 adjuvanttityyppejä ei hyväksytä eläimillä yhtä hyvin kuin ihmisillä käytettäviin rokotteisiin.

Esimerkki 33

Luteinisoivaa hormonia vapauttavan hormonin (LHRH) dekapeptidin (Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly) val-30 mistus. Primaarinen iskom valmistettiin esimerkissä 25 kuvatulla tavalla dialyysimenetelmän avulla käyttämällä inf-luenssaviruskannan PR 8 kapseliproteiineja.

Ryhmässä A (ks. taulukko 1) kytkentä tehtiin 1 ml:11a PR 8 iskomia PBS:ssa (1 mg/ml) sekä 1 mg:llä peptidiä yksi-35 vaiheisessa menetelmässä, kuten esimerkissä 32.

51 86801

Ryhmässä B, C, D ja E (ks. taulukko 2) kytkentä tehtiin kaksivaiheisena menetelmänä 1 mg:aan PR 8 iskomia, joka oli 1 ml:ssa PBS, lisättiin 1,25-%:ista glutaraldehydiä f^Otssa siten, että lopulliseksi konsentraatioksi tuli 5 0,25 % ja seosta dialysoitiin yli yön huoneen lämpötilassa 0,9-%:ista NaCl vastaan. Lisättiin 1 mg peptidiä, joka oli 100 ^ulissa 0,9-%:ista NaCl. Sekoittamisen jälkeen lisättiin 50 ^ul 1 M karbonaattipuskuria, pH 9,5 ja seosta in-kuboitiin 4°C:ssa 24 tunnin ajan. Tämän jälkeen seosta dia-10 lysoitiin PBS:a vastaan 24 tunnin ajan.

Proteiinisisältö määritettiin Bradfordin menetelmällä ja laimennettiin 1 mg:ksi/ml.

Noin 25 % peptidistä laskettiin sitoutuvan PR 8 iskomiin. Elektronimikroskopiassa oli nähtävissä tyypilli-15 nen iskomrakenne.

Hiiriä immunisoitiin kaksi kertaa ihonalaisesti neljän viikon välein annoksilla, jotka ovat 0,1 - 3 ^ug annosta kohti, kuten on esitetty taulukossa 1. Verinäytteet koottiin immunisointiajankohtana sekä neljä viikkoa toisen 20 immunisoinnin jälkeen.

Immuunivaste mitattiin ELISA11a, kuten esimerkissä 32 on kuvattu käyttämällä BSA:n konjugoitua peptidiä koe-antigeenina.

Tiitteri ilmaistaan hiiren seerumin laimennuksena, 25 joka antaa positiivisen lukeman 405 nm:ssä.

Tulokset on annettu taulukossa 1. Kaikki hiiret reagoivat seerumin vasta-ainetiitterein. Yhden immunisoinnin jälkeen kolme viidestä hiirestä, jotka oli immunisoitu 1 yUg:lla peptidiä tai sitä suuremmalla määrällä, ke-30 hitti havaittavan vasta-ainemäärän LHRH:a kohtaan.

52 86801

Taulukko 1 ELISA-tiitterilaimennus

Peptidi Ryhmäannos 1. immunisointi 2. immunisointi LHRH B 0,1 Ug <100 157 112 149 5 <100 200 <100 190 <100 126 LHRH C 0.3 ug <100 292 5 yhdistetyn 162 seerumin keski- 112 arvo 100 10 ________________ i LHRH 0 1,0 ug 112 283 103 209 <100 274

128 24C

<100 419 LKRH E 3.0 ug 134 274 <100 >600 <100 >600 LHRH A 1,0 ug 248 >600 100 522 <100 600 20 ----

Taulukko 2 ELISA-tiitterilaimennus

Peptidi Ryhmäannos 1. immunisointi 2. immunisoint,.

FMD A 1 ,0 ug <100 <100 25 <ioo <100 <100 <100 <100 100 <100 196 PM) B 3,0 ug 0 400 0,26 226 ^ Q 0,10 163

Kahden immunisoinnin jälkeen kaikki hiiret reagoivat lisääntynein vasta-ainetiitterein. Hiiret, jotka oli immunisoitu 0,1 ^,ug:lla, olivat myös reagoineet hyvin 35 vasta-ainevastein.

53 86801

Mitään sivuvaikutuksia/ esim. paikallista reaktiota tai systeemisiä reaktioita, ei havaittu yhden eikä kahden immunisoinnin jälkeen.

Esimerkki 34 5 Iskomien valmistus suu- ja sorkkatauti- (FMD) pepti din avulla (16 aminohappoa: Leu-Arg-Gly-Asp-Leu-Gly-Val-Leu-Ala-Glu-Lys-Val-Ala-Arg-Tyr-Leu). Primaarinen iskom valmistettiin influenssaviruskantojen PR 8 kapseliproteiinien kanssa, kuten on kuvattu esimerkissä 25.

10 Kytkentä suoritettiin kaksivaiheisena menetelmänä glutaraldehydin kanssa, kuten on kuvattu esimerkissä 33 käyttämällä 1 mg PR 8 iskomeja sekä 1 mg peptidiä.

Proteiinisisältö kytkennän jälkeen määritettiin Branfordin menetelmällä sekä laimennettiin 1 mg:ksi/ml.

15 Noin 25 % peptidiä laskettiin sitoutuneen PR 8 isko- meihin.

Elektronimikroskopiassa havaittiin iskomien tyypillinen morfologia.

Hiiret immunisoitiin kahdesti ihonalaisesti neljän 20 viikon välein, kuten on esitetty taulukossa 2 yhdellä tai kolmella ,ug:lla PR 8 iskomiin konjugoitua peptidiä.

Hiirien vasta-ainevaste mitattiin hiiren seerumilla ELISAa käyttäen, kuten on kuvattu esimerkissä 32 sekä 33 käyttämällä BSAran konjugoitua peptidikonjugaattia koeanti-25 geeninä. Tiitteri ilmaistaan hiiren seerumin laimennuksena, joka antaa positiivisen lukeman 405 nm:ssä.

Tulokset on esitetty taulukossa 2. Hiiret eivät reagoineet havaittavan seerumin vasta-aineen kanssa yhden immunisoinnin jälkeen, kun vasta-ainevaste mitattiin seeru-30 missä kaksi tai neljä viikkoa immunisoinnin jälkeen. Neljän viikon kuluttua toisen immunisoinnin jälkeen seerumi, joka oli saatu immunisoiduista hiiristä, tutkittiin ja kaikki hiiret olivat reagoineet seerumivasta-aineen kanssa peptidiä kohtaan.

35 Mikään hiiristä ei osoittanut immunisoinnista joh tuvia sivuvaikutuksia paikallisina eikä systeemisinä reaktioina .

54 86801

Esimerkki 35

Gp 120;llä rikastettujen HTLV-III-iskomien valmistus. Retrovirus-suvun puhdistetut virukset yleensä menettävät kapseliproteiinin uloimman osan. Uloin osa on ratkaiseva 5 suojaavan immuniteetin induktiossa. Tämä ulkoinen osa voidaan saada takaisin kudosviljelmänesteestä, joka on saatu virusviljelmistä ja nesteestä, joka on saatu viruksen puhdistuksen aikana esimerkiksi supernatantista viruksen ultra-sentrifugoinnin aikana.

10 10 mg HTLV-III-virusta, joka on 1 ml:ssa PBS, liuo tetaan 1 %:n kanssa N-dekanyyli-N-metyyli-glukamiinia. Seosta inkuboidaan yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa.

Liuotetut membraaniproteiinit erotetaan nukleiinihaposta ja kiinnittyneistä proteiineista sentrifugoimalla 15 sakkaroosin, esim. 20-%:isen läpi, joka sisältää saman de-tergentin, esim. 0,5 % ja 0,1 % Quil A PBS:ssa:

Sakkaroosin, detergentin ja Quil A:n jakeet, jotka sisältävät membraaniproteiinit, dialysoidaan 0,05 M ammo-niumasetaattia vastaan (puskuri ei ole kriittinen) ensim-20 mäisten kuuden tunnin aikana huoneen lämpötilassa ja sen jälkeen 4°C:ssa.

0,3 mg gp 120:ää, joka on 1 ml:ssa affiniteettikro-matografiällä papulektiinin kanssa tai Sepharoseen kiinnitetyllä anti-gp-120:11a rikastettua kudosviljelmänestettä, 25 inkuboidaan glutaraldehydin kanssa lopullisen konsentraa-tion ollessa 0,25 % yli yön huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen sitä dialysoidaan 0,9-%:ista NaCl vastaan.

Lisättiin 2 ml:n tilavuudessa HTLV-III-iskomeja, jotka olivat 2 ml:n tilavuudessa sekä 150 ^ul 1 M karbo-30 naattipuskuria, pH 9,5. Valmistetta inkuboitiin 24 tunnin ajan 4°C:ssa ja tämän jälkeen sitä dialysoitiin PBS vastaan 24 tunnin ajan 4°C:ssa.

Iskomien tyypillinen muodostuminen nähtiin elektronimikroskoopissa .

55 86801

Esimerkki 36

Kolme sekvenssiä DNA-hybridituotetta, joka oli saatu FeLV gp 70:stä, konjugoitiin stearyyliamiiniin, joka oli sisällytetty liposomeihin kaksivaiheisella glutaraldehydi-5 menetelmällä (ks. esimerkki 33). 10 mg (10 mg/ml) liposo-meja, jotka olivat PBSrssä, pH 7, aktivoitiin glutaralde-hydilla, jonka lopullinen konsentraatio oli 1,25 %, huoneen lämpötilassa yli yön. Glutaraldehydin ylimäärä poistettiin dialyysin tai geelisuodatuksen avulla.

10 3 mg aktivoituja liposomeja sekoitettiin 1 mg:n kanssa kutakin FeLV gp 70 polypeptidiä, tilavuus säädettiin 1 ml:ksi ja pH nostettiin 9,6:ksi lisäämällä 100 μΐ 1 M NaCOg. Seosta inkuboitiin yön yli ja se puhdistettiin sitoutumattoman polypeptidin suhteen geelisuodatuksen avulla 15 (esim. S-300).

Polypeptidi-rasvahappo uutettiin 2-%:isella N-deka-noyyli-N-metyyliglukamiinilla (MEGA-10) ja erotettiin li-pidiylimäärästä sentrifugoimalla sakkaroosigradientilla (5-30 % sakkaroosia), joka sisälsi 0,3 % MEGA-10.

20 Polypeptidi koottiin, Quil A lisättiin 0,1 %:n lo pulliseksi konsentraatioksi ja seos dialysoitiin perusteellisesti PBS vastaan, ensimmäiset 4-6 tuntia huoneen lämpötilassa, sitten 4 °C:ssa.

Claims (4)

86801 56

1. Menetelmä immunogeenisen kompleksin valmistamiseksi, joka sisältää antigeenisiä proteiineja tai pepti- 5 dejä, joissa on hydrofobisia alueita, ja triterpeenisapo-niineja, jolla kompleksilla on avoin pallomainen rakenne, joka koostuu rengasmaisista alayksiköistä tai pallomaisen rakenteen osista, ja jolla kompleksilla yleensä on alempi sedimentaatiokerroin kuin vastaavilla miselleillä 10 ja korkeampi sedimentaatiokerroin kuin vastaavalla mono-meerimuodolla, jolloin valmistetaan kantajakompleksi sekoittamalla vähintään yksi antigeeninen proteiini tai yksi antigeeninen peptidi, joka on valittu amfapaattisten proteiinien tai peptidien joukosta tai viruksia, baktee-15 reita, mykoplasmoja, parasiitteja tai eläinsoluja, jotka sisältävät amfipaattisia proteiineja tai peptidejä vähintään yhden liuottavan aineen kanssa, jolloin muodostuu komplekseja amfipaattisten antigeenisten proteiinien tai peptidien ja liuottavan aineen välillä, minkä jälkeen am-20 fipaattiset antigeeniset proteiinit tai peptidit erotetaan liuottavasta aineesta, liuottavan aineen läsnäollessa tai erikseen siitä, ja siirretään suoraan liuokseen, joka sisältää vähintään yhtä triterpeenisaponiinia, jolla on hydrofobisia ja hydrofiilisia alueita, konsentraation 25 ollessa vähintään kriittinen misellienmuodostuskonsen- traatio (CMC), tunnettu siitä, että kantajakompleksi liitetään toiseen antigeeniseen molekyyliin, joka on valittu peptidien, proteiinien, hiilihydraattien, gly-koproteiinien tai pienten molekyylien, kuten biotiinin 30 joukosta sidottujen molekyylien toiminnallisten kytkentä- ryhmien ja kantajakompleksiin toiminnalisten ryhmien välisellä kytkennällä tunnetuin menetelmin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kantajakompleksiin kytketyt 35 molekyylit valitaan peptidien joukosta, joissa on 1-40, 57 86801 erityisesti 10-25 aminohappoa, jolloin, kun aminohappojen lukumäärä on pienempi kuin 10, peptidit saattavat olla kytketyt alifaattisiin ketjuihin, joissa on 2-12 hiili-atomia ja 6-26 OH-ryhmää tai peptideihin, joissa 1-20 5 aminohappoa, edullisesti hydrofiilisiä aminohappoja toiminnallisten ryhmien välityksellä erityisesti sellaisten, joilla on aminohapposekvenssejä, jotka ovat tyypillisiä malarialle, ja suu- ja sorkkatautivirukselle, erityisesti suu-ja sorkkatautiviruspeptideille 141-160, 144-160, 146-10 154, 144-150, 142-158, T-solujen kasvutekijöille, edulli sesti peptideille, joissa on aminohapposekvenssit 79-92, 139-153C, 111-125 ja 18-32C, HTLV 1, 2 tai 3 viruksen an-tigeenideterminanteille, hormonien, kuten luteinisoivaa hormonia vapauttavan hormonin, ja entsyymien, kuten pe-15 roksidaasin joukosta.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että noin 1 mg, edullisesti 250-500 pg kytkettävää molekyyliä saatetaan reagoimaan noin 1 mg:n kanssa (mitattu proteiinisisältönä) kantajakomplek- 20 siä, toiminnallisten ryhmien välisessä kytkennässä.

4. Diagnostinen reagenssi, tunnettu siitä, että se käsittää ainakin yhden immunogeenisen kompleksin, joka on valmistettu jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaisesti. 58 8 6 8 01