JP2002537351A - コーロバクターリポ多糖免疫アジュバント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は免疫原組成物を提供し、またコーロバクター（とりわけコーロバクタークレセントゥス）ＬＰＳまたはその断片もしくは誘導体から選択される部材よりなるアジュバントを使用して抗原を用いる高められた免疫応答を誘導する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】

本出願人は１９９９年２月２２日に出願された合衆国暫定特許出願番号第６０
／１２１，１２０号の利益を主張し、その開示は全体としてここで引用例として
組み込まれている。

【０００２】 本出願はワクチン用の免疫アジュバンドとそのような免疫アジュバンドを含む
ワクチンに有用であるリポ多糖（ＬＰＳ）の分野に関する。

【０００３】

【発明の背景】

数多くの種類の抗原は動物内での抗体の産生を刺激し、続く感染に対し防御を
与える。しかしある種の抗原は穏やかなまたは効果のない免疫応答のみを刺激し
、一方あるものは効果のある免疫応答を刺激できないままである。

【０００４】 相対的に弱い抗原の免疫原性はしばしば抗原をアジュバンドと同時投与するこ
とで高められ、このアジュバンドは単独で投与されるときには免疫性であり、ま
たはそうでないこともあるが、ある一つの抗原が投与される時間と同時にまたは
その時間に近接してアジュバンドが投与されるときにはその抗原に対する粘膜免
疫およびまたは局所免疫の状態を誘導する物質である。不幸なことに、多くの免
疫アジュバンド、例えばフロイント完全アジュバントは有毒であり、従ってヒト
のワクチン接種ではなく動物研究目的に限ってのみ有用である。

【０００５】 望ましいアジュバンドは単独で投与される時には免疫性でなくまたは非常に有
毒ではないが、ワクチンに対する免疫応答の効力を高め焦点を集める。アジュバ
ントはしばしばサイトカインカスケードの産生を誘導し、増殖された免疫応答に
帰着する免疫モジュレーターを含む。免疫モジュレーターの例はある種の水溶性
ポリマー、ムラミルペプチド、グラム陰性菌と誘導体からのリポ多糖（ＬＰＳ）
および陽イオン界面活性剤を含む。

【０００６】 特徴のあるグラム陰性菌の外膜はリン脂質、タンパク質、リポ多糖（ＬＰＳ）
、および存在するならば細胞外多糖より成り、それらすべては相互作用して水環
境に向けて浸透性障壁を形成する。これらの成分の内、最初に細胞外環境に出会
い、またＬＰＳ層が存在するならばいくらかはその付着に適応するに違いないも
のはリポ多糖または細胞外多糖である。

【０００７】 内毒素としても知られているグラム陰性菌からのリポ多糖は有力な免疫モジュ
レーターとして認識されてきた。実際に、グラム陰性菌のリポ多糖内毒素のアジ
ュバンド活性成分はリピドＡと同定された（パウエルおよびニューマン編、ワク
チン設計：サブユニットとアジュバンドのアプローチ、プレナム・プレス（１９
９５年）よりウルリッヒおよびマイヤーによる「アジュバントとしてのモノホス
ホリルリピドＡ」と標題された第２１章、図１を参照のこと）。不幸なことに、
リピドＡは発熱性であり、数多くの望ましくない副作用を引き出す（例えば、「
細菌性内毒素：真核信号伝達を活性化する異常リピド」の標題のジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー，５７４５−５７５３ページ（１９９３年３月）のレーツ
によるミニレビューを参照のこと）。毒性からアジュバンド活性を分離するため
に数多くの努力が払われてきた。前に記載のレーツの論文は大腸菌リピドＡとリ
ピドＡの部分についての構造、並びにアジュバンドとしての用途に関する。リピ
ドＡ内毒素の構造はそれが得られる細菌の型に依存して変化する。

【０００８】 一般にリピドＡは（二糖の１′と４′の位置で）２個のリン酸基と５個または
６個の脂肪酸側鎖を持つグルコサミンの二糖である。弱酸性条件下で、１個のリ
ン酸基は４′−モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）を残して除去することができ
る。この分子はアジュバント活性を保持するがその毒性はリピドＡよりも大幅に
少ない。ＭＰＬはそれが適切に調合されるとヒトに使用することができる。サル
モネラ ミネソタ菌から誘導されるＭＰＬはＲＩＢＩ ＭＰＬアジュバントとし
て知られる商業アジュバントの基礎になる。

【０００９】 柄のあるグラム陰性菌であるコーロバクタークレセントゥスは非定型ＬＰＳ分
子を含む（「コーロバクタークレセントゥスの膜リポ多糖」との表題の論文であ
るレーブンスクロフト他、ジャーナル・オブ・バイテリオロジー、７５９５−７
６０５ページ（１９９２年１２月）を参照のこと）。ここでは、このような細菌
から誘導されるＬＰＳは粗面型のものとして記載されており、それはコア糖質に
付着する不均一酸素抗原を含まなかった。リピドＡ等価領域とコアオリゴ糖領域
は他のすべてのＬＰＳ分子とは全く異なることが発見された。もっと最近の分析
は、コーロバクターが粗面と滑面のＬＰＳ両方を有し、滑面ＬＰＳは（この糖質
の約４０個の複製を持つ）ペロサミンのホモポリマー抗原の追加で粗面ＬＰＳと
等価になる。しかしコーロバクターＬＰＳの免疫調節性質については何も知られ
ていない。

【００１０】 グラム陰性菌からのＬＰＳまたはその部分が免疫アジュバントとして使用され
てきているけれども、ＬＰＳがアジュバント性能を持つだけでなくアジュバント
で使用するのに不適のＬＰＳにするかもしれない毒性水準を持たないということ
でＬＰＳがアジュバントとしての使用に適しているかどうかを予言することはで
きない。加えて、毒性の少ないアジュバントの必要性が絶えず存在し続ける。こ
の点に関して、とりわけアジュバント性能を持つけれども、更に弱毒（または陰
性）毒性プロファイルを持つ天然発生ＬＰＳ分子であるかを同定する必要がある
。

【００１１】

【発明の概要】

本発明はアジュバント特性を持つコーロバクターＬＰＳまたはその断片より成
る新規なアジュバント組成物または免疫感作組成物に関する。例えは、断片はア
ジュバント特性を持つＬＰＳリピドＡ、ＬＰＳリピドＡ断片、またはその誘導体
である。望ましくはこのようなアジュバントはコーロバクタークレセントゥスよ
り得られるものである。

【００１２】 更なる見地において、本発明は他のグラム陰性ＬＰＳよりも毒性の少ないアジ
ュバント特性を持つコーロバクターＬＰＳまたはその断片を提供する。望ましく
は、そのようなアジュバントは、他のグラム陰性ＬＰＳ分子よりも毒性が少なく
てまたコーロバクタークレセントゥスから誘導されるアジュバント特性を持つＬ
ＰＳまたはリピドＡ、リピドＡ断片あるいはその誘導体である。リピドＡ誘導体
の代表的な例として言及されるのは、コーロバクタークレセントゥスのＬＰＳの
リピドＡ断片のモノホスホリル化誘導体である。このような誘導体は、他の細菌
のＬＰＳからのリピドＡ断片に関して従来技術で公知の手順によりリピドＡ断片
をモノホスホリル化することにより調製できる。

【００１３】 も一つの見地において、本発明は前の実施例に記載されるアジュバント組成物
が抗原の投与と同時にまたはそれと近接して経口で、筋肉内であるいは非経口で
投与される時に、宿主に免疫性応答、とりわけ防御応答を誘導する方法を提供す
る。一つの見地において、アジュバントは投与に先立ち抗原と混合される。

【００１４】 本発明の更なる目的は、細菌感染を処置しまたはそれを防御するためのワクチ
ンを提供することであり、これは本発明の前記目的で設定される本発明に基づく
アジュバントを利用し、また抗原として細菌性ペリプラズムシャペロンタンパク
質と細菌性付着因子タンパク質との複合体を利用する。望ましくは、抗原性付着
因子タンパク質はピリ線毛付着因子タンパク質である。一つの見地において、抗
原性ペリプラズムシャペロンタンパク質およびピリ付着因子タンパク質は大腸菌
からのものであり、例えばＰａｐＤ／ＰａｐＧおよびＦｉｍＣ／ＦｉｍＨの複合
体から選択される部材である。

【００１５】 一つの特定の見地において、本発明は、本発明に基づくアジュバントと、１型
ピリ線毛関連付着因子である抗原から（またはそのマンノース結合断片から）あ
るいはグラム陰性菌の病原種、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などにより起こる
疾病の処置およびまたは予防のためのシャペロンタンパク質とピリ線毛関連付着
因子との複合体である抗原から調剤されるワクチンに関する。例えばそれは、本
発明に基づくアジュバントと、（１）マンノース結合能力（単独またはそのシャ
ペロンＦｉｍＣと複合させたもの）を保持するピリ線毛関連付着因子ＦｉｍＨの
断片、（２）そのペリプラズムシャペロンタンパク質ＰａｐＤと複合されるピリ
線毛関連付着因子ＰａｐＧタンパク質、または（３）全長ピリ線毛関連付着因子
ＦｉｍＨ（単独またはそのシャペロンタンパク質ＦｉｍＣを複合させたもの）の
少なくとも１個から選択される抗原とから調剤されるワクチンで大腸菌により起
きる尿路感染症の処置およびまたは予防に関する。本発明はまた一般に、例えば
診断用試薬およびワクチンとして有用な非ヒト哺乳類種での抗体を高めるために
ヘテロポリマータンパク質複合体と併用して本発明に基づくアジュバントの使用
に関する。

【００１６】 本発明の更なる見地において、本発明に基づくコーロバクタージュバントは疾
病の処置のための治療薬として有用なワクチンを産生するために抗原体と併用し
て使用される。

【００１７】 コーロバクタークレセントゥスは柄のあるグラム陰性菌であり、これまでに全
般的に記載された非定型ＬＰＳ分子を含む。このような細菌からのＬＰＳは粗面
型（Ｒ型ＬＰＳ）であると記載されてきており、ここでそれはコア糖質に付着す
る不均一酸素抗原を含まない。リピドＡ等価領域とコアオリゴ糖領域は他のＬＰ
Ｓ分子で異なっている。コーロバクタークレセントゥスは粗面（Ｒ型）と滑面（
Ｓ型）ＬＰＳの両方を所有し、滑面ＬＰＳは（この糖質の約４０個の複製を持つ
）ペロサミンのホモポリマー抗原の追加により粗面ＬＰＳと等価になる。このよ
うなコーロバクターにより産生されたＬＰＳは３個の２−ケト−３デオキシオク
ツロソネート（ＫＤＯ）分子２個のα−Ｌ−グリセローＤ−マンノヘプトースと
、１個のα−Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノヘプトースを含む内部コア領域と、α−
Ｄ−マンノース、α−Ｄ−ガラクトース、およびα−Ｄ−グルコース（多分ホス
ホルリ化したもの）の外部コア領域と、未決定構造を持つバックボーンに付着す
る３−ＯＨ−ラウリン酸を含むリピドＡ部より成る。

【００１８】 しかし本発明の前には、コーロバクターＬＰＳの免疫調節特性については何も
知られていなかった。

【００１９】 コーロバクタークレセントゥス菌株はここで引用例として組み込まれるレーブ
ンスクロフト他、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、７５９５−７６０５ペ
ージ（１９９２年１２月）に記載の通り成長し、ＬＰＳ分離され精製される。

【００２０】 加えてコーロバクター菌株は標準培養条件下でペプトン−酵母菌抽出物などの
ような既知の培地で成長でき、ＬＰＳは既知の方法で分離される。このような方
法は破壊細胞のヌクレアーゼ消化を含み、次いで溶液での保温によりコーロバク
ター細胞膜がより完全に解離させられる。ＬＰＳのサンプルは周知の手順で精製
することができ、次いで電気泳動あるいはクロマトグラフィーが行われ、または
それを含む。

【００２１】 例えばコーロバクター粗面ＬＰＳは（ここで引用例として組み込まれるクレシ
他、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリーに記載された）修飾ガラ
ノス法により抽出することができ、その純度を決定するために薄層クロマトグラ
フィー（ＴＬＣ）およびまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験される。コーロバク
ターの滑面ＬＰＳはＮａＣＬ／ＥＤＴＡ抽出物およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ調製ゲル
からの溶離液で精製することができ、次いで不純物を除去するために蒸留水に対
しアミコン３０，０００ＭＷカットオフフィルターで広範に洗浄される。コーロ
バクターＬＰＳが約１０，４００ダルトンの分子量を持つことを示すためにＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦ分析が使用できる。ハイブリット形成ＬＰＳのガスクロマトグラ
フィーは試験的にペロサミンとして同定されたジデオキシアミノヘキソースのホ
モポリマーを含む。

【００２２】 ＬＰＳは塩酸０．１Ｎを１００℃、３０分使用してリピドＡと多糖に切断する
ことができ、次いで水溶液ＬＰＳの容積あたりクロロホルム／メタノール（２：
１）の２．５容積で抽出される。リピドＡはクロロホルム／メタノール（または
より低位の）相に分割され、それは次いで乾燥チッソガス流で蒸発乾燥される。
サンプルの組成物はガスクロマトグラフィーその他の標準分析手順で確認するこ
とができる。ＬＰＳサンプルの脱リン（脱ホスホリル化）反応はＨＦを利用して
実行することができ、後でＨＦは除去される。リピド分析とＮＭＲ構築研究は既
知の方法で実行できる。

【００２３】 かくして、本発明はコーロバクター、またはその断片もしくは誘導体からのＬ
ＰＳを提供し、これはそれを含むアジュバントまたはワクチン組成物と同じよう
に抗原に対する免疫応答を高める。ＬＰＳは粗面または滑面の形態にある。アジ
ュバントは粗面と滑面の形態の混合物のまたはその単独のものより成り、あるい
はリピドＡ断片またはそのような断片の誘導体の単独またはＬＰＳと組合わせた
ものより成る。

【００２４】 ここで使用されるように、ポリペプチドと関連して使用された「部分」「セグ
メント」および「断片」という用語はアミノ酸残基などの残基の連続配列を引用
し、この配列はより大きな配列のサブセットを形成する。例えばもしあるペプチ
ドが通常のエンドペプチダーゼ、例えばトリプシンまたはキモトリプシンなどの
いずれかで処理された場合には、このような処理から生じるオリゴペプチドは出
発ポリペプチドの部分、セグメントまたは断片を表示するであろう。ポリヌクレ
オチドと関連して使用された場合には、このような用語は通常のエンドヌクレア
ーゼのいずれかで前記ポリヌクレオチドの処理により産生される産生物を引用す
る。

【００２５】 本発明は更に宿主（ヒトまたは非ヒト動物）における免疫応答、とりわけ本発
明に基づくアジュバント組成物が抗原の投与と同時にまたはそれに近接して経口
、筋肉内にまたは非経口で投与される時の防御応答を誘導する方法を提供する。
一つの見地において、アジュバントは投与に先立ち抗原と混合される。選択肢と
して、アジュバント組成物は抗原を投与する時間に近接して投与されるが、投与
に先立ち混合されることはない。

【００２６】 本発明を実施するのに有用な抗原は細胞、細菌、またはウイルス粒子、もしく
はその部分から誘導することができる。ここで定義されるように、抗原はタンパ
ク質、ペプチド、多糖、糖タンパク質、糖脂質、核酸、もしくはこれらの組合わ
せのものであり、それは動物、例えば哺乳類、鳥、または魚に免疫応答を誘出す
る。ここで定義されるように、免疫応答は体液性または細胞仲介であることがで
きる。免疫応答が指向される物質が低い抗原性のものである場合には、それは例
えばいくつかの商業利用可能な試薬キットの一つを持つ標準共有結合技術を用い
てアルブミンなどの担体またはハプテンに接合される。

【００２７】 抗原の例は、インフルエンザタンパク質およびＢ型肝タンパク質などのウイル
スタンパク質、グラム陰性菌細胞壁および表面タンパク質などの細菌タンパク質
とリポ多糖を含む。

【００２８】 アジュバントはまた通常は抗原のアミノ基またはカルボキシル基とアジュバン
トの１個またはそれ以上の側基との間の共有結合により、当業者にとって周知の
方法に従って抗原と共有結合することができる。望ましい実施例でワクチン組成
物のアジュバントと抗原が同時に投与されるけれども、代替実施例では、アジュ
バントと抗原は同じ部位または近い部位に別個に投与される。アジュバントはそ
れが抗原に作用する部位に免疫系の細胞を引き付けるために役立つ。

【００２９】 免疫組成物は問う業者にとって周知の方法でワクチンとして投与することがで
き、それは非経口、経口、または膜内外あるいは粘膜内外投与によるものを含む
免疫応答を誘出することができる。望ましくは、ワクチンは非経口（静脈内、筋
肉内、皮下、腹腔内、等）で、また望ましくは皮下で投与される。粘膜面への送
達のルートとして限定されない例は、鼻腔内（または一般的には鼻関連リンパ組
織）、呼吸系、膣内、および直腸への送達である。ワクチン内では、アジュバン
トは抗原への免疫応答を増加し強化するのに有効な量で加えられる。免疫応答は
防御免疫応答または疾病もしくは疾患の処置に有効な免疫応答であり得る。

【００３０】 ここで使用される薬理組成物はまた、いずれかの適切な希釈剤または賦形剤を
含む薬理許容担体を含み、それはそれ自身その組成物を受ける個体に有害な抗体
の産生を誘導しないいずれかの薬剤を含み、また過度の毒性無しに投与できるも
のである。薬理許容担体は必ずしもそれに限定されないが、鼻および他の気道送
達あるいは眼科系での送達のためのスプレーを形成するのに有用な担体を含み、
水、食塩水、グリセロールおよびエタノール、その他などの液体を含む。薬理許
容担体、希釈剤、およびその他賦形剤についての十分な議論はレミントン・ファ
ーマシューティカル・サイエンス（マック・パブリケーション・カンパニー，ニ
ュージャージー、最新版）に提示されている。

【００３１】 本発明の手順を実行するに際し、特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件
、その他の引用は限定することを意図するものでなくて、当業者の一人が議論を
提出する特定の関連において興味があり価値があるものと認識するすべての物質
を含むように読み取られるべきであることは当然理解されねばならない。例えば
一つの緩衝系または培養培地を、もしそれが同一ではないにしても、も一つの類
似の成果を達成するものに置換することはしばしば可能である。当業者はこのよ
うなシステムと方法に十分な知識を有しており、過度の実験を行うことなくその
ような置換を行うことが可能であり、ここで開示された方法と手順を用いて彼等
の目的に最適に役立ち得るであろう。

【００３２】 本発明はこれから更に下記の限定されることのない実施例により説明されるで
あろう。これらの実施例の開示を適用するに際して、本発明に基づいて開示され
る方法の他の異なった実施例はそれ自身を従来の関連する技術に習熟した人達に
間違いなく示唆するであろうことを明確に留意しておかねばならない。

【００３３】

【発明を実施するための最良の形態】

実施例１ ウォーカー他、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー，１７６巻、６３１２−
６３２３ページ（１９９４年）で開示された方法を変形することにより、コーロ
バクタークレセントゥスからＬＰＳが分離された。ＬＰＳはＳＤＳ、プロティナ
ーゼＫ、および蒸留水と凍結乾燥に対する広範囲の透析での再引用された連続す
る処理段階を含む（ここで開示された）ＮａＣ１／ＥＤＴＡ抽出により精製され
る。乾燥ＬＰＳは次いで３回クロロホルム（３：１）で抽出され、水に懸濁され
る（また「ＳＬＰＳ」（懸濁ＬＰＳ）と名付けられる）。一部は更にＥＤＴＡ、
０．１Ｍに対しＳＬＰＳ水溶液を作り、その都度水相を維持しながら水溶液ＬＰ
Ｓの容積当りクロロホルム／メタノール（２：１）の２．５容積で２回抽出が行
われて精製される。この調製物は「Ｐ−ＬＰＳ」と名付けられる。

【００３４】 ＮＤ４スイスウエブスターマウスの６個のグループがこの最初の研究で使用さ
れた（グループ当り５匹のマウス）。グループ１はＳ−ＬＰＳアジュバントのみ
（１００μｇ用量）を受け、グループ２はＳ−ＬＰＳ（１００μｇ）＋ＦｍＣＨ
（２０μｇ）を受け、グループ３はＰ−ＬＰＳ（１００μｇ用量）を受け、グル
ープ４はＰ−ＬＰＳ＋ＦｉｍＣＨ（２０μｇ）を受け、グループ５は正の対照（
ＰＢＳ５０μｌでの１：１容積／容積）としてＭＦ５９を受け、またグループ６
はＭＦ５９＋ＦｉｍＣＨ（ＦｉｍＣＨの２０μｇ用量の５０μｌでの１：１容積
／容積）を受けた。マウスは０日に免疫化され１７週に追加免疫された。血液放
出収集は０日（免疫前）に、また免疫後３，７，１１，１５，１９の各週で行わ
れた。各グループからの貯留血清サンプルは（エリザ検定での捕捉抗原としての
ＦｉｍＨ切形「Ｔ３」を使用して）ＦｉｍＨ抗原に対する免疫応答を評価された
。この免疫感作研究＃１の結果はＦｉｍＨに対する相互終点力価（ＥＰＴ）とし
て図１で示される。この研究でもっとも強力な応答はＮａＣ１／ＥＤＴＡ抽出プ
ロトコルにより調製されたＳ−ＬＰＳ調製物に対して見られた。再抽出されたＰ
−ＬＰＳ調製物に対する応答はＭＦ５９アジュバント（正の対照）と比較できる
ものであった。

【００３５】 Ｓ−ＬＰＳとＰ−ＬＰＳをマウスで試薬するに先立ち、これら調製物のそれぞ
れは細胞毒性に対する標準試験管内検定を利用して毒性を検定された。ＲＡＷ２
６４．７ネズミマクロファージ（メリーランド、ロックビル、ＡＴＣＣ）は胎仔
ウシ血清１０％で補充されたダルベッコ修飾イーグル培地とペニシリン／ストレ
プトマイシン１％を持つＬ−グルタミン１％で成長した。密集まで成長した後、
ＲＡＷマクロファージは濃度を変えたコーロバクターＬＰＳ（または大腸菌ＬＰ
Ｓ）で一晩（１８時間）刺激され、上澄みはＴＮＦ−α産生のために酵素免疫測
定法（エリザ）で試験された。その結果は図２で示される。

【００３６】 マンノース（尿路上皮細胞に関するＦｉｍＨのレセプター）への細菌結合を予
防するための抗体のＦｉｍＨに対する能力が各ＬＰＳアジュバント調製物により
誘出するＦｉｍＨへの機能抗体の尺度として試験管内で調査された。検定は以下
のように行われた：イムロン−４，９６ウエルエリザ平板がトリマンノースの２
．５μｇ／ｍｌ（１００μｌ／ウエル）で被覆された。平板をＰＢＳ−１％ＢＳ
Ａで遮断した後、１型線毛化大腸菌が前に引用されたマウスの各グループからの
抗ＦｉｍＨ抗体または負の対照抗血清（アジュバントのみ）の存在下であるいは
抗体無しで各ウエル（８×１０⁷ＣＦＵ／ｍｌ）に加えられ、１時間３７℃で保
温され平板に結合された。結合していない細菌は洗浄して除かれ、トリマンノー
スに付着したままの大腸菌はラビット抗大腸菌ＨＲＰ抗血清の１：４００の希釈
液で検出され、次いでＴＭＢ基質が追加された。１９週の放出収集血液（追加免
疫後）の結果は下記の表１で示される。データは正の対照（抗体無し）のものと
比較したトリマンノースへの結合の阻害パーセントで提示される。

【００３７】 表１．トリマンノース（ＦｉｍＨリガンドのレセプター）への１型線毛大腸菌 の試験管内結合およびコーロバクターＬＰＳアジュバント（ＳＬ９７） またはＭＦ５９で高められた抗ＦｉｍＨ抗血清による阻害

【００３８】

【表１】

【００３９】 実施例２ コーロバクタークレセントゥス細胞はＲＬＰＳを回収するために、修飾ガラノ
ス法（クレシ他、ジャーナル・オブ・バイオロジー・アンド・ケミストリー，２
５８巻、１２９４７−１２９５１ページ（１９８３年））を受ける。ＳＬＰＳは
ＳＤＳ，プロティナーゼＫ、および蒸留水に対する広範囲の透析での処理の続く
段階を含むウォーカー他、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１７６巻：６
３１２−６３２３ページ（１９９４年）で開示されたＮａＣ１／ＥＤＴＡ抽出法
によりコーロバクタークレセントゥスから精製される。この実験のために、ＳＬ
ＰＳは更に準備ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製され、ゲルからのＳＬＰＳ帯の電気
溶離、および不純物除去のため蒸留水でエミコン３０，０００ＭＷカットオフフ
ィルターでの溶離ＳＬＰＳの広範囲の洗浄が続けられた。冷却エタノール９５％
内でのＭｇＣｌ₂、７．５％でのＰＬＰＳの処理から生じる沈殿物として実施例
１のＰＬＰＳから回収された不純物は試験的に「糖脂質」（糖リピド）と標識さ
れたがいくらかのＳＬＰＳを含んでいることが発見された。

【００４０】 実施例１で分離されたコーロバクタークレセントゥスのＬＰＳは粗面ＬＰＳ（
ＲＬＰＳ）を回収するためにグラノス抽出法（ユーロピアン・ジャーナル・オブ
・バイオケミストリー、９巻：２４５−２４９ページ）を受ける。残存部分は実
施例１と同じようにＮａＣｌ／ＥＤＴＡ抽出を受け、次いで滑面ＬＰＳ（ＳＬＰ
Ｓ）を回収するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥ準備ゲルから電気溶離される。ゲルから
回収される不純物は暫定的に、「糖脂質」と標識されるが、これもいくらかの滑
面ＬＰＳを含んでいる。

【００４１】 ＰＬＰＳは実施例１からの物質である。

【００４２】 免疫感作のためのプロトコル マウス菌株：ＮＤ４スイスウエブスター グループ当たりマウス：５匹 グループ数：１２グループ 免疫感作スケジュール：０日に免疫性を与え、終点力価と機能的阻害力価を 決めるために３週毎に血液放出収集する。９週で追加免疫性が与えられる。

【００４３】 免疫感作のルート：皮下 用量：各ＬＰＳアジュバント２５μｇ，ＦｉｍＣＨ２０μｇ ＭＦ５９の通常量（１°および追加（ブースト））

【００４４】

【表２】

【００４５】 結果 すべての精製画分（Ｒ−ＬＰＳ，Ｓ−ＬＰＳおよび「糖脂質画分」）で強いア
ジュバント作用が見られた（図３参照）。いくつかの粗面ＬＰＳがＳ−ＬＰＳと
糖脂質の両方に存在することに注目されたい。

【００４６】 これらの研究に対して、固定用量としてＦｉｍＣＨ２０μｇが試験抗原として
使用された。しかしこれは必ずしも最適用量ではない。加えて、図１−３は単に
滑面、粗面、および滑面＋粗面コーロバクターＬＰＳ調製物の潜在的アジュバン
ト特性を示すに過ぎない。更にこれらの研究は、異系交配されたＮＤ４スイスウ
エブスター菌株と同じくＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（ＬＰＳ非応答動物）およびＣ３
Ｈ／ＯｕＪマウス（ＬＰＳ応答動物）で行われた。（アジュバントなしで単独食
塩加リン酸緩衝液内で）試験抗原としてのＦｉｍＣＨに対して、ＦｉｍＣＨは他
のアジュバント（例えばＭＦ５９など）で誘導される力価に比較できる（Ｔ３エ
リザ検定を使用する）ＦｉｍＨタンパク質に対する終点力価（ＥＰＴ）を約０．
２５μｇ乃至約１．０μｇの間のＦｉｍＣＨ用量に下げるように誘導することを
追加の研究が示した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪとＣ３Ｈ／ＯｕＪマウス菌株両方でＦｉｍ
ＣＨ、０．２５μｇと１．０μｇの両方を持つコーロバクターＬＰＳアジュバン
ト（Ｒ−ＬＰＳ、Ｓ−ＬＰＳ、およびＲ−ＬＰＳ＋Ｓ−ＬＰＳ）の追加実験が行
われた。０．２５μについての結果はＣ３Ｈ／ＨｅＪとＣ３Ｈ／ＯｕＪマウス菌
株それぞれに対して図４と図５で示される。

【００４７】 精製受容体または受容体相同体であるヒト組織への試験管内結合はピリ線毛関
連付着因子を含む数多くの細菌付着因子の菌力における役割を解明するのによく
使用される。同じように、細胞または特異的受容体への細胞の付着を遮断するこ
のような抗体の能力についての検定は抗体の付着因子への機能性を評価すること
ができる。

【００４８】 膀胱上皮細胞への細菌結合を遮断する抗ＦｉｍＨ付着因子抗体の能力はもとも
とリケッチア細胞付着を評価するために発展されたフローサイトメトリー法を使
用して試験管内で調べられた（リーおよびウォーカー、感染性免疫、６０巻：２
０３０−２０３５ページ（１９９２年））。この検定は以下の通り適用された。
１型ピリ線毛膀胱炎分離物ＮＵ１４（ハルトグレン他、感染性免疫、５４巻：６
１３−６２０ページ（１９８６年）はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩ
ＴＣ）で直接標識され、免疫前血清または高度免疫血清（マウスまたは霊長類血
清）の存在下で細胞当り２５０細菌の比率で０．５×１０⁶Ｊ８２膀胱細胞で保
温され、３０分、３７℃で細菌と混合された。多数回洗浄の後、サンプルはこれ
までに公開された方法（ランガーマン他、サイエンス、２７６巻：６０７−６１
１ページ（１９９７年））に基づきファクスター・プラス（ベクトン・ディキン
ソン）内でフローサイトメトリーにより検定された。Ｊ８２膀胱細胞に結合した
ＦＩＴＣ標識細菌の指示薬として平均チャンネル蛍光が使用された。阻害パーセ
ントは各動物から取られた免疫前サンプルと比較して決定された。すべての血清
サンプルは分析の前にＰＢＳで（１：５０乃至１：８００の範囲内で）２倍に希
釈された。

【００４９】 ＦｉｍＣ＋コーロバクターＬＰＳ調製物で免疫化されたＣ３Ｈ／ＨｅＪとＣ３
Ｈ／ＯｕＪマウス菌株両方からの採血清の結果は図６と図７で示される。

【００５０】 この結果は、他のアジュバントと比較される終点力価とＦｉｍＨに対する機能
的阻害力価に関してコーロバクターＬＰＳが有用なアジュバント特性を持つこと
を明らかに示している。観察された応答はマウス内でのＬＰＳ応答性と相関する
ように見える（Ｃ３Ｈ／ＯｕＪマウス菌株は特異的にＬＰＳアジュバントを受け
る時にはＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスよりも高い終点力価とより良好な機能活性を持つ
）。

【図面の簡単な説明】

【図１】 グラフにプロットされた表の値を持つＮＤ４ウエブスターマウス
（グループ当り５匹のマウス）の（表の側面部で同定された）６個のグループに
ついての免疫感作研究の結果を示す図。貯留血清はＦｉｍＨ抗原に対する応答を
示すために使用された。もっとも強力な応答はＳ−ＬＰＳ調製物に対するもので
あった。ＥＰＴ＝終点力価（ＦｉｍＨに対するもの）

【図２】 標準試験管内検定を用いるＴＮＦ（腫瘍壊死因子）の誘導につい
ての毒性データを示す図。ＴＮＦ−α産出高はエリザでモニターされた。

【図３】 実施例２で設定されたプロトコルに基づき実施された免疫感作の
結果を示す図。強いアジュバント作用がすべての精製画分で見られた。

【図４】 ＦｉｍＣＨを抗原として０．２５μｇ使用し、アジュバントＩＭ
の５０μｇを０日と１５週の追加免疫で使用したＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの免疫感
作の結果を示す図。もっとも大きな結果はＭＦ５９で１６週で観察された。

【図５】 ＦｉｍＣＨ（０．２５μｇ）を使用し、５０μｇのアジュバント
ＩＭを０日と１５週追加免疫で使用したＣ３Ｈ／ＯｕＪマウスでのコーロバクタ
ーＬＰＳのアジュバント特性を示す図。これより高い作用はＲ（粗面）ＬＰＳで
２０週で見られた。

【図６】 Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスでコーロバクターＬＰＳ対ＭＦ５９アジュ
バントの（１６週で追加免疫した）２０週血清収集の結果を示す図

【図７】 Ｃ３Ｈ／ＯｕＪマウスでコーロバクターＬＰＳ対ＭＦ５９アジュ
バントの（１６週で追加免疫した）２０週血清収集の結果を示す図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ランガーマン，ソロモン アメリカ合衆国，21215 メリーランド， ボルチモア，クロス カントリー ブール バード 6606 (72)発明者 ケーニッグ，スコット アメリカ合衆国，20852 メリーランド， ロックビル，ラルストン ロード 10901 (72)発明者 スミット，ジョン カナダ，ヴィー７エイ ４アール８ ブリ ティッシュ コロンビア，リッチモンド， シーキャスル ドライブ 9960 (72)発明者 クレシ，ナイロファー アメリカ合衆国，53719 ウィスコンシン， マディソン，レイモンド ロード 8251 Ｆターム(参考） 4C085 AA03 BA07 BA21 BA31 BB21 CC07 CC21 EE03 EE06 FF14 GG01 GG08

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 動物に免疫応答を誘導する一つの組成物であって、抗原と、
   コーロバクターリポ多糖、コーロバクターリポ多糖の断片、リポ多糖の誘導体、
   リポ多糖の断片の誘導体より成るグループから選択される少なくとも１個の部材
   より成ることを特徴とする組成物。
2. 【請求項２】 請求項１記載の組成物であって、ここでコーロバクターがコ
   ーロバクタークレセントゥスであることを特徴とする組成物。
3. 【請求項３】 請求項１記載の組成物であって、ここで前記部材がコーロバ
   クタークレセントゥスのリポ多糖のリピドＡ断片であることを特徴とする組成物
   。
4. 【請求項４】 請求項１記載の組成物であって、ここでリポ多糖が粗面コー
   ロバクタークレッセントゥスであることを特徴とする組成物。
5. 【請求項５】 請求項１記載の組成物であって、ここでリポ多糖が滑面コー
   ロバクタークレッセントゥスであることを特徴とする組成物。
6. 【請求項６】 請求項１記載の組成物であって、ここで部材がモノホスホリ
   ルリピドＡ断片であることを特徴とする組成物。
7. 【請求項７】 抗原に高められた免疫応答を導入する一つの方法であって、
   動物に抗原とアジュバントを投与することより成り、前記アジュバンドはコーロ
   バクターリポ多糖、コーロバクターリポ多糖の断片、コーロバクターリポ多糖の
   断片の誘導体、およびリポ多糖の誘導体より成るグループから選択される少なく
   とも１個の部材より成ることを特徴とする方法。