JPH10512758A - 界面活性剤に基づく抽出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 所望する発酵生成物の回収方法を開示しており、その方法においては、塩と界面活性剤との混合物を用いて二層系を形成し、第１層は所望する生成物を含有する界面活性剤に富んだ層であり、第２層は塩に富んだ層になるようにする。本回収方法は、親水性生成物を含む発酵培養基全体または生成発酵培養基に対して特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 界面活性剤に基づく酵素抽出法 発明の属する技術分野 本発明は、適切な界面活性剤を用いることにより、精製発酵培養基（ブロス） または発酵培養基（ブロス）全体から発酵精製物を回収または抽出することに関 する。特に、本発明は、親水性の発酵生成物を界面活性剤に基づいて抽出するこ とに関する。 発明の背景 多くの生物学的生成物−例えば、酵素類のようなタンパク質など−は、好まし い条件下で適切な栄養培地において、ある種の微生物（酵母、バクテリア、真菌 ）を培養することにより産生されることはよく知られている。微生物を培養また は発酵して所望する生成物を産生させた後、発酵培養基から生成物を回収する必 要がある。この回収の方法は、特に大量の工業規模で実施する場合には問題であ る。大量の培養基を生じること、培養基の粘性、培養基内に存在する細胞および 細胞性の破片、所望する生成物の溶解性などにより問題が生じる。これらの問題 は、当業者の間ではよく認識されている。 生物学的／発酵生成物を回収する多くの方法が開発されている。例えば、欧州 特許第0 214 531 B1号には、ポリエチレングリコールなどの高分子と塩との混合 物を添加した発酵培養基全体から細胞外酵素を回収する方法について記載してい る。同様に、米国特許第4,144,130号は、高分子−塩混合物系または複数の高分 子系を用いて、無傷細胞および細胞断片から酵素を回収方法について記載してい る。これらの方法および当該分野で知られている他の多く方法は、有用生成物の 大量回収という点において、工業的には満足できるものではない。その主な理由 は、連続系において経済的に生成物を回収するためには、効率的なリサイクル操 作を開発してそのような方法において使用する高価な高分子（抽出剤）を再生す ることを必要とするからである。欧州特許第0 574 050 A1号には、疎水性の発酵 生成物の回収および精製方法が開示されている。しかしながら、この方法は疎水 性の 発酵生成物に対してのみ有効であり、本発明で採用しているようなＨＬＢが高い 界面活性剤を使用してはいない。それ故、発酵培養基から生成物（および特に親 水性の生成物）を回収するための、より経済的な大量回収方法が必要とされてい る。 本発明者らは、より良い方法を開発し、本明細書に記載しているが、それは、 界面活性剤に基づく抽出方法である。本方法は、洗剤組成物において用いられる 酵素（「洗剤系酵素（detergent-type enzymes）」）などの発酵生成物の回収に 特に有効であるが、これは、洗剤組成物が既に大量の界面活性剤を含んでいるか らである。さらに、界面活性剤に基づく抽出方法は、従来、抽出によって界面活 性剤中に回収されることのなかった親水性の生成物に対して特に有用である。従 って、例えば、洗剤系酵素を加えることを予定している最終的な洗剤組成物と相 溶性の界面活性剤を用いることにより、発酵培養基（精製培養基または培養基全 体）から酵素を抽出することにより、比較的親水性のアルカリプロテアーゼなど の洗剤系酵素を回収することができる。本回収方法は、酵素の回収率が非常に高 いだけでなく、製品を製造する全体のコストを引き下げることができる。なぜな らば、酵素回収工程において使用する界面活性剤のコストは、洗剤の最終製品を 製造する調合装置に添加する界面活性剤の必要量を減らすことにより相殺される からである。 発明の概要 本発明に従えば、精製発酵培養基または発酵培養基全体からも所望する発酵生 成物を抽出する方法が提供され、本発明のの方法は以下の工程を含む。 ａ）所望する発酵生成物を含む精製発酵培養基または発酵培養基全体を、ひと つもしくはそれ以上の塩および親水性−疎水性バランスが少なくとも約12である 適切な界面活性剤と接触させ、 ｂ）所望する生成物および界面活性剤を含む第１層（界面活性剤に富んだ層） と、塩を含む第２層（塩に富んだ層）との２つの層に発酵培養基を分離し、 ｃ）界面活性剤に富んだ第１層を回収し、 ｄ）場合によっては所望する生成物を界面活性剤と分離する。 本発明の好ましい実施態様においては、所望する発酵生成物とは（本明細書中 に記載しているような）親水性酵素であり、より好ましい所望する発酵生成物と は、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼもしくはセルラーゼ構成組成、また はエンドグリコシダーゼなどの親水性洗剤系酵素である。これらの酵素は一般的 な洗浄洗剤組成物に広く添加されており、製品の洗浄活性を増強する。そのよう な洗浄洗剤はまた、一般的に多量の陰イオン性、陽イオン性、または非イオン性 の界面活性剤（洗浄剤）を含んでいるため、本回収方法において使用する界面活 性剤は最終的な洗剤製品と相溶性または最終的な洗剤製品内で有用なものである ことが好ましい。 本発明の別の実施態様においては、上述した方法において、ＨＬＢが約15以上 の界面活性剤を用いることにより、如何なる発酵生成物（親水性または疎水性） に対しても適用することが可能な方法を提供する。 さらに有利なことには、本発明の方法は一段階抽出法であり、該方法によれば 、塩および界面活性剤を添加した後、発酵培養基は界面活性剤に富んだ相と塩に 富んだ相とのニ相に分離する。所望する生成物は本質的に界面活性剤に富んだ相 に存在している。 図面の簡単な説明 図１は、塩濃度の高い条件下で疎水性相互作用クロマトグラフ（ＨＩＣ）用カ ラムにおけるさまざまな酵素サンプルの保持時間（分）を測定し、重ね書きした ものを示す。 発明の詳細な説明 本明細書で使用している「洗剤系酵素」とは、衣料用洗剤、住宅用クリーナー 、皮膚清浄洗剤、食器洗い洗剤などの洗浄剤において有用な任意の酵素をさす。 従って、洗剤系酵素に含まれるものとしては、プロテアーゼ類、セルラーゼ類、 アミラーゼ類、エンドグリコシダーゼ類、リパーゼ類、ペルオキシダーゼ類、ラ ッカーゼ類、カタラーゼ類などが挙げられるが、これらに限定されるわけではな い。 本明細書で使用している「親水性」とは、実施例１において記載しているよう な条件下において、ＨＩＣカラムにおいて所望する生成物の保持時間を測定した 場合の該生成物の相対親水性を意味している。本発明の目的のためには、塩濃度 の高い条件下でＨＩＣカラムを用いて測定した場合に、保持時間が約14分以下で ある生成物を親水性とみなす。一般的には、ＨＩＣは、タンパク質（酵素）の相 対的親水性／疎水性を調べる方法であり、このとき、酵素は構造的には変性せず 、酵素の露出した表面のみがカラムおよび移動相と相互作用する。この方法は、 非電荷のＨＩＣカラム、一般的にはフェニルまたはアルキルリガンド上に酵素を 塩析すること、および塩濃度を下げ、カラムとの相互作用を減少させて酵素を溶 出することを含む。従って、溶媒と酵素との相互作用が弱い限りは、酵素は樹脂 に結合している。故に、塩濃度が低下してゆく環境において、酵素が疎水性のマ トリックスに長く結合しているほど、その酵素の表面は親水性が低い。逆に、タ ンパク質がカラムから迅速に放出するほど、そのタンパク質の親水性は高い。 本明細書で使用している「親水性−疎水性バランス」あるいはＨＬＢとは、所 与の界面活性剤の全体的な親水性の定量的な尺度である。界面活性剤のＨＬＢが 高い程、該界面活性剤の全体的な親水性は高くなる。この語句は当業者には容易 に理解でき、また、例えば以下のようにして計算できる。 非イオン性多価アルコール脂肪酸のＨＬＢは以下のようにして求められる： ＨＬＢ＝20（１−Ｓ／Ａ） ここで、 Ｓ＝エステルのけん化価＝１ｇの脂肪を中和するのに必要なＫＯＨのmg数 Ａ＝酸の酸価＝１ｇの酸を中和するのに必要なＫＯＨのmg数 または、 ＨＬＢ＝（Ｅ＋Ｐ）／Ｓ ここで、 Ｅ＝オキシエチレン含量の重量パーセント Ｐ＝多価アルコール含量の重量パーセント これはその他の親水性基および疎水性基にも応用することができ、このときは、 ＨＬＢ＝７＋（親水性基数＋疎水性基数）の総和 ここで、 これらおよび関連する法則を用いて求められたＨＬＢ値は、マクカチェオンズ第 １巻、乳化剤および界面活性剤、北アメリカ版、1993年刊（McCutcheon's，Vol. 1，Emulsifiers and Detergents，North American Edition，1993）に掲載され ている。 本発明は、界面活性剤に基づく抽出系を提供し、本発明の抽出系によれば、Ｈ ＬＢが約12以上、好ましくは約15もしくはそれ以上の界面活性剤を使用すること により、高収率（約50％以上、好ましくは約80％以上）で親水性タンパク質（酵 素）を抽出することができる。本発見とは対照的に、膜に結合したタンパク質の 抽出には中程度のＨＬＢを有する界面活性剤（トライトンＸ−100（Triton X-10 0））が有用であるという知見（ボーデール（Bordier），Ｃ，Journal of Biol. Chem.，Vol.256，No.4，pp.1604-1607(1981)）に基づいて、当業者のあいだでは 中程度の界面活性剤を使用してタンパク質を抽出しようとしてきた。さらに、（ 本発明のようなＨＬＢの高い界面活性剤に比べて）ＨＬＢが低いまたは中程度の 界面活性剤を使用した発見も報告されているが、これは、ＨＬＢが低いまたは中 程度の界面活性剤を用いた曇点抽出に関連したものであり、ここでは、偶然の分 離により、高温において分離層を生じている（クラ（Kula）ら，Biotechn．Appl ．Biochem.（1992）16(3): 228-235）。本明細書で使用しているように、ＨＬＢ が低いとは、ＨＬＢが８以下であることを意味しており、ＨＬＢが中程度とは、 ＨＬＢが８〜12の間であることを意味しており、ＨＬＢが高いとは、ＨＬＢが12 以上、好ましくは15以上であることを意味している。 また、本発明とは対照的に、この分野の研究は主としてリパーゼなどの疎水性 タンパク質の抽出に主眼がおかれてきた（例えば、欧州特許第0 574,050 A1号お よびクラ（Kula）ら、J．Biotechnol.（1993）29(2-3): 263-275を参照）。逆に 、本発明は親水性タンパク質（ＨＩＣカラムを使用した場合の保持時間が約14分 以下のタンパク質）の抽出に有効な方法を教示しており、それに加えて、用いる 界面活性剤のＨＬＢが約15以上の場合には、如何なるタンパク質（保持時間に関 係なく）に対しても有効な一般的な抽出方法を提供する。 本発明の回収方法においては、酵素などの細胞内生成物もしくは細胞外生成物 のいずれか、またはそれらの混合物、さらに、原料微生物由来の細胞および／ま たは「細胞性断片」と総称される細胞の破片を含む発酵培養基全体を、さらに処 理を施すことなく使用することが可能である。別の方法として、発酵培養基を限 外ろ過などの既知の方法によって精製／浄化し、全てのまたはほとんど全ての細 胞性断片を除去してもよい。発酵培養基全体を用いる場合には、回収工程に先立 って培養基を希釈するほうがよい。そのような希釈は、水を加えることにより行 うが、これは、分離に先立って、所望する生成物が随伴する可能性がある固体全 体の割合を下げ、かつ、培養基の粘度または伝導性を下げるためである。 培養基全体または精製した培養基に塩および界面活性剤を混合し、二層系を形 成する。所望する生成物（酵素など）は界面活性剤に富んだ層に集まり、一方、 細胞性断片、二次酵素、炭水化物などの残りの不要な副生成物は塩に富んだ層に 集まる。この分離により、所望する生成物の効率的、高収率での回収が可能とな る。 本発明において用いられる塩類は、当業者において既知の如何なるものでもよ いが、特に、次のような化合物がよい。陽イオンが一価または二価の金属イオン （ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、アルミニウム、カルシ ウムなど）であり、陰イオンが極性酸素基を有するイオン（スルフェート類、カ ーボネート類、フォスフェート類、アセテート類、ホルメート類、ニトレート類 およびシトレート類などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない）も しくはハロゲン類（塩素類、臭素類、ヨウ素類ならびにそれらの混合物などが挙 げられるが、これらに限定されるわけではない）。好ましい塩類としては次のよ うなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ナトリウムスルフ ェート、ナトリウムフォスフェート、塩化ナトリウム、およびナトリウムホルメ ート。 本発明において用いられる好ましい界面活性剤は、ＨＬＢが少なくとも約12の 任意の非イオン性界面活性剤であり、次のようなものが挙げられるが、これらに 限定されるわけではない：オクチルフェノールポリエーテルアルコール類（トラ イトン（Triton）Ｘ−100、Ｘ−165、Ｘ−305またはＸ−405など、ロム＆ハス（ Rohm & Haas）社から市販）、ノニルフェノールポリエーテルアルコール類（ア ームル（Armul）930（ウィチョ社（Witcho Corp.））、アルカサーフ（Alka Sur f）ＮＰ−15（ローネ・ポウレンク（Rhone Poulenc））、カーソノン（Carsonon ）Ｎ−30（ロンザ社（Lonza，Inc.））、セデパル（Cedepal）ＣＯ−730（ステ パン・カナダ社（Stepan Canada，Inc.））など）、アルコールエトキシレート 類（ネオドール（Neodol）91−６、91−８、23−6.5、25−12、45−13または25 −20など、シェル社（Shell）から市販）。好ましい界面活性剤については、マ クカチェオンズ第１巻、乳化剤および界面活性剤、北アメリカ版、1993年刊（Mc Cutcheon's，Vol.1，Emulsifiers and Detergents，North American Edition，1 993に記載されており、これは、市販されている界面活性剤の標準的なカタログ である。本発明における好ましい界面活性剤は、少なくとも15のＨＬＢを有する 界面活性剤であり、例えば、トライトン（Triton）Ｘ−165、トライトン（Trito n）Ｘ−305またはトライトン（Triton）Ｘ−405などがある。 本発明に従う抽出方法によって回収される所望する発酵生成物が洗剤系酵素で ある場合には、好ましい界面活性剤は、該洗剤系酵素を含有する洗剤組成物と相 溶性の界面活性剤である。そのような洗剤組成物用界面活性剤類は、米国特許第 5,194,639号および第4,507,219号に記載されており、ここで参考として引用して おく。 本発明の回収方法によれば、技術者は、回収すべき所望する発酵生成物の相対 的親水性を（ＨＩＣにおける保持時間を測定することによって）知り、それに応 じて親水性−疎水性バランス（ＨＬＢ）が少なくとも約12である界面活性剤を利 用することができる。好ましくは、所望する生成物の親水性が増す（保持時間が 減少する）場合に収率を上げるには、選択する界面活性剤は、より高いＨＬＢ（ すなわち、約15以上）が要求される。一般的に、ＨＬＢが高い界面活性剤は、ほ とんどのタンパク質に対して抽出効率を挙げるが、抽出の選択性は下がる。 界面活性剤のＨＬＢ値は、そのような製品の市販メーカーから入手可能であり 、例えば、トライトン（Triton）Ｘ−100のＨＬＢは13.5である。ＨＬＢ値が高 いほど界面活性剤の親水性は高い。本発明において用いられる好ましい界面活性 剤は、もちろん回収する生成物の性質にもよるが、ＨＬＢが少なくとも約12、さ らに好ましくは少なくとも約15である。従って、アルカリプロテアーゼなどのよ うな親水性の酵素（ＨＩＣカラムにおける保持時間は14分以下）を高回収率で得 るには、ＨＬＢの高い（すなわち、12.0以上）界面活性剤を選択すべきである。 さらに、より親水性の酵素（ＨＩＣカラムにおける保持時間が４分以下）を高回 収率で得るには、よりＨＬＢの高い（すなわち、15.0以上）界面活性剤を選択す べきである。 加えて、本発明に従えば、より疎水性の高いタンパク質を界面活性剤抽出によ り、高収率で得ることができることも示されている。かくして、与えられたタン パク質が比較的疎水性（すなわち、保持時間が約14分以上）であっても、ＨＬＢ が少なくとも約15以上である界面活性剤を使用することにより、該タンパク質を 高収率（50％以上、好ましくは80％以上）で抽出することが可能である。 およそ室温から40℃の温度において、発酵培養基（全体または精製したもの） に塩類および界面活性剤を添加する。通常は塩を先に添加するが、これは、塩の 溶解に際して発酵培養基を加温および／または撹拌する必要があるからである。 しかしながら、塩の添加前に界面活性剤を添加することもできる。回収すべき発 酵精製物の性質に応じて、幅広いｐＨ範囲において（ｐＨ２〜10）塩および界面 活性剤を添加することができる。塩および界面活性剤の添加は、撹拌をしてもし なくても行うことができる。 塩および界面活性剤の添加後、通常は、発酵培養基は二層を形成するように分 離するが、第三の層（中間層）を形成することもある。もし第三層が存在する場 合には、上層あるいは界面活性剤に富んだ層の一部として処理する。通常は、界 面活性剤に富んだ層が上層となり、所望する生成物を含んでいる。二層分離は沈 降、すなわち、混合物を撹拌することなくそのままにしておくにより形成または 生じるが、別の方法として、当業者に既知の方法によって混合物を遠心分離する こともできる。界面活性剤に富んだ層は、塩に富んだ層を実質的に含まないこと が好ましい。実質的に含まないとは、塩に富んだ層またはその他の所望しない副 生成物（細胞性断片、二次酵素、炭水化物など）が、ほとんどまたは全く、界面 活性剤に富んだ層内に随伴していないことを意味している。同様に、実質的に全 ての所望する生成物は界面活性剤に富んだ層内に随伴していることが好ましい。 これらの因子は、回収工程において容積比および分離係数を測定することにより 、モニターすることが可能である。容積比は、上（界面活性剤）層の容積を下（ 塩）層の容積で割ることによって計算する。この容積比は小さい（0.1〜0.5）こ とが好ましいが、これは、材料が濃縮されていることを示しているからである。 分離係数（Ｋ）は、上（界面活性剤）層の酵素濃度と下（塩）層の酵素濃度との 比として計算される。分離係数は大きい（５以上）方が好ましいが、これは、通 常は、生成物が界面活性剤に富んだ層に選択的に濃縮されることが望ましいため である。 次に、例えば遠心分離などのような当業者において既知の方法によって、界面 活性剤に富んだ層（塩に富んだ層を実質的に含まない）を収集または回収する。 このようにすることにより、所望する生成物は界面活性剤に富んだ層内に回収さ れる。この界面活性剤／所望する生成物層は、そのまま所望する製品の調製に用 いることができる。例えば、界面活性剤が所与の洗剤組成物と相溶性である場合 には、界面活性剤−アルカリプロテアーゼ層をそのまま界面活性剤組成物に用い ることができる。一方、所望する生成物を界面活性剤と組み合わせて使用しない 場合（例えば、所望する生成物が組換えレンニン／キモシンである場合など）に は、既知の方法、すなわち沈澱、限外ろ過、逆抽出、クロマトグラフィーまたは 蒸発など軒値の方法によって該生成物を界面活性剤から分離し、実質的に界面活 性剤を含まない生成物を得ることができる。 本発明の方法による発酵生成物の抽出は、粘度の高い材料を得るために行うこ ともでき、そのような材料は、洗剤粉末などのように、直接塊状集積（アグロメ レーション）させて固体製品を得る場合に適している。 本発明における所望する生成物として好ましいのは、洗剤系酵素である。本明 細書で用いている洗剤系酵素とは、洗剤を基本とする洗浄用製品に使用する任意 の酵素をさす。これらには以下のようなものがあるが、これに限定されるわけで はない。プロテアーゼ類、セルラーゼ類（もしくはそれらの組み合わせ）、アミ ラーゼ類、リパーゼ類、エンドグリコシダーゼ類、ラッカーゼ類、ペルオキシダ ーゼ類、カタラーゼ類など、またはこれらの酵素の任意の組み合わせ。特に有用 な酵素としては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではな ル社（Genencor International，Inc.）から市販）およびサヴィナーゼ（Savina se^TM）（ノヴォ・インダストリーズ（Novo Industries）社から市販）など、タ ンパク質工学によって得られた酵素、例えば、プロテアーゼ899（Protease 899 ）（ジェネンコア・インターナショナル社（Genencor International，Inc.）か ら市販）、デュラザイム（Durazym^TM）（195番および222番が変異しているプロ テアーゼ、ノヴォ・ノルディスクＡ／Ｓ（Novo Nordisk）社から市販）、マクサ ペム（Maxapem^TM）（222番が変異しているプロテアーゼ、ギストブロケーズ（Gi stbr （ジェネンコア・インターナショナル社（Genencor International，Inc.）から 市販）など、もしくは米国特許出願第08/194,664号および第08/289,3521号（参 考としてここで引用しておく）に記載されているようなタンパク質工学によって 得られたアミラーゼ類；セルラーゼもしくはセルラーゼ組成物、例えば、デニメ ックス（Denimex^TM）（ノヴォ・ノルディスクＡ／Ｓ（Novo Nordisk）社から市 販）など、または米国特許出願第07/707,647号および米国特許第5,120,463号（ ここで開示内容を参考として引用しておく）に記載されているトリコデルマ（Tr ichoderma）様セルラーゼ類もしくはセルラーゼ組成物；リパーゼ類、例えば、 ルマファ tional，Inc.）から市販）またはリポラーゼ（Lipolase^TM）（ノヴォ・ノルディ スクＡ／Ｓ（Novo Nordisk）社から市販）など；あるいは米国特許第5,238,843 号および第5,258,304号に記載されているようなエンドグリコシダーゼ類。 上述したように、本発明のひとつの長所は、所望する発酵生成物（好ましくは 酵素）を界面活性剤に富んだ層に回収して、この界面活性剤に富んだ層を、所与 の界面活性剤を含む最終製品にそのまま酵素源として用いることができるように した点である。所望する発酵生成物が洗剤系酵素である場合には、該酵素を既知 の洗剤または洗浄剤組成物に混合することができる。洗剤または洗浄剤組成物に は次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。産業用ま たは一般向けの任意の洗浄剤、例えば、衣料用洗剤、住宅用クリーナー、衣類用 前処理剤、食器洗い洗剤、皮膚清浄洗剤など。これらの製品は、例えば液体また は粉末である。当業者であれば、洗浄剤組成物として用いる場合の各種の組成物 を熟知しているであろう。酵素を含有する組成においては、既知の化合物の多く が界面活性剤としての使用に適している。そのような洗浄剤の例としては米国特 許第4,404,128号および第4,261,868号に記載されており、ここで参考として引用 しておく。 所望する生成物を界面活性剤に富んだ層に分離した後、所望する生成物を界面 活性剤からさらに分離したいこともある。例えば、本方法を用いて診断用または 研究試薬として有用な酵素（例えば、米国特許第5,238,843号に記載されているP NGaseFなどのエンドグリコシダーゼなど）を回収する場合には、界面活性剤から PNGaseFをさらに回収し、当業者に既知の方法によって酵素を生成することが望 ましい。 以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を限定する ものではない。 実施例 実施例１：回収すべき生成物の相対的親水性の測定 本発明に従って回収しようとする生成物の親水性が未知の場合には、適切な界 面活性剤を選択するために、親水性を測定する必要がある。 以下の実施例の場合には、回収すべき各々の酵素の親水性を疎水性相互作用ク ロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて測定した。保持時間（疎水性の尺度）を計 算するために本実施例において用いた特別な方法の詳細については、以下の結果 の項に示している。 材料および方法 ＰＤ−100カラム（ファルマシア・バイオテク（Pharmacia Biotech）社製）な らびに酢酸ナトリウム 20mMおよび塩化カルシウム ５mMからなるｐＨ5.2の緩 衝液を用い、試験すべき酵素を少なくとも25mg含有する限外ろ過酵素濃縮液を、 平衡化したＰＤ−10カラムに供した（カラムあたりの添加量は2.5mlまでとした ）。酵素サンプルは、3.5mlの酢酸緩衝液と共にＰＤ−10カラムから溶出し、こ れを等量に二つ（各1.75ml）に分け、それらを新たに平衡化した２本のＰＤ−10 カラムに供し（1.75ml／カラム）、前回と同様に溶出した。この過程により、共 通のマトリックスに溶解した７mlの脱塩酵素が得られた。この７mlの酵素液に硫 酸アンモニウムを加え、サンプル内の硫酸アンモニウム濃度を約1.5Ｍにした（ 硫酸アンモニウムは、４Ｍ溶液から液体として、または室温で混合しながら固体 結晶としてのいずれの状態でも脱塩サンプル中に加えることができる）。酵素サ ンプル中に硫酸アンモニウムを加えている間に、酵素は沈澱し始め、溶液は懸濁 してくる。懸濁してきた場合には硫酸アンモニウムを加えるのを止め、サンプル を酢酸緩衝液で希釈して懸濁を除去する。 次に、酵素サンプルを５mg量を得るのに十分な量（適切な酵素アッセイにより 決定する）のＨＩＣカラムに供した。サンプルの分析には、濃度勾配を展開し、 かつ、分配できると共に、サンプルをカラムに注入することができることが必要 である。それ故、BioCAD 60（パーセプティブ・バイオシステムズ（PerSeptove Biosystems）社製）を使用したが、ファルマシア・バイオテク（Pharmacia Biot ech）社のＦＰＬＣを使用することもできる。疎水性が不明の酵素を処理する場 合には、低置換フェニルカラム（保持マトリックスにフェニル配位子が結合して いる）を使用した。本実施例においては、ポロス（POROS） PH/Mカラム（4.6×1 00mm、粒子サイズ20ミクロン）（パーセプティブ・バイオシステムズ（PerSepto ve Biosystems）社製）を使用したが、同様のカラムは他のメーカーからも入手 可能であり、例えば、フェニルスペロース（Phenyl Superose）HR5/5（ファルマ シア・バイオテク（Pharmacia Biotech）社）などがある。カラムからの溶出は 、酵素の存在を確認するために、適切な検出器を用い、280nmにおいてモニター した（この検出器は記録計に接続しておき、カラム溶出液内の吸光度の増加／減 少の様子 を記録する）。 サンプルを注入した時点からフラクションを集め始め、継続することにより、 酵素の存在が溶出時点から視覚化され、フラクションを適切なアッセイに供する ことによって確認できる。使用した流出緩衝液は、50mMのリン酸ナトリウムに1. 5Ｍの硫酸アンモニウムに溶かしてｐＨ7.0としたものであり、溶出緩衝液は超純 水である。使用したカラムに適合する流速（ポロス（POROS）PH/Mの場合、10ml ／分）に従い、20cv（カラム容積）の流出緩衝液をカラムに通し、続いて、適切 な量の調製サンプル（５mgの酵素が得られる量）を添加した。次に流速を初速の 75％に下げ、カラム（酵素サンプルを含んでいる）を25cvの流出緩衝液で洗浄し た。 カラムからの酵素の溶出は、同じ流速（初期速度の75％）で、流出緩衝液から 100％超純水までの勾配をかけながら行った。溶出中、カラムに供した酵素サン プルの伝導度を測定し、流出緩衝液の伝導度と比較し、ピーク溶出時間を記録し た。溶出液の伝導度が高いほど、また、溶出が早いほど、酵素は疎水性が低い。 数回の実験を行い、比較して、データが条件に見合ったものであることを確認し た。 酵素サンプル：各酵素をＵＦ濃縮したものを用いた。試験した酵素は以下に挙 げるものである： プロテアーゼ（Protease）１−米国特許RE 34,606号に記載されているような 、枯草菌（Bacillus subtilis）内で発現するバチルス・アミロリケファシエン ス（Bacillus amyloliquefaciens）由来の変性アルカリプロテアーゼ。この酵素 は、プロテアーゼ899（Protease 899）としてジェネンコア・インターナショナ ル社（Genencor International，Inc.）から購入可能である。 プロテアーゼ（Protease）２−米国特許第5,185,258号に記載されているよう な、枯草菌（Bacillus subtilis）内で発現するバチルス・レントゥス（Bacillu s lentus）由来の変性アルカリプロテアーゼ。 ピュラフェクト（Purafect）−バチルス・レントゥス（Bacillus lentus）由 来のプロテアーゼであり、ジェネンコア・インターナショナル社（Genencor Int ernational，Inc.）から購入可能。 ＡＡ20−バチルス・リケニフォルミス（Bacillus Iicheniformis）由来のα− アミラーゼ酵素であり、スペザイムＡＡ20（SPEZYME AA20）としてジェネンコア ・インターナショナル社（Genencor International，Inc.）から購入可能。 ndocina）由来のクチナーゼであり、米国特許第5,352,594号に記載されており、 また、ジェネンコア・インターナショナル社（Genencor International，Inc.） から購入可能。 ァルマシア・バイオテク（Pharmacia Biotech）社製）脱塩カラムを用いて脱塩 し、４Ｍの硫酸アンモニウムを用いて1.5硫酸アンモニウム濃度とし、適切な酵 素アッセイを用いて酵素濃度を測定した。 各酵素サンプルについて３回の実験を行って得られたデータを集め、平均を求 めた。３回の実験の結果を表１および図１に示す。既に記載しているように、高 伝導度（高塩濃度）において溶出する酵素は、低い伝導度（低塩濃度）において 溶出する酵素に比べて、カラムの疎水性マトリックスとの結合が弱い。本実施例 においては、早く溶出する酵素は、遅く溶出する酵素よりも疎水性が低いことが わかる。従って、親水性に関して比較を行うと、親水性が低い方から高い方へ順 に並べると次のようになる：ルマファスト（Lumafast）＜ＡＡ20＜プロテアーゼ （Protease）２＜ピュラフェクト（Purafect）＜プロテアーゼ（Protease）１。 実施例２ 枯草菌（Bacillus subtilis）内で発現したプロテアーゼ（Protease）２（米 国特許第5,185,258号に記載されているようなサブチリジン）の発酵培養を行っ た。細胞片の凝集および回転減圧ドラムフィルター（ＲＶＤＦ）を用いたろ過に よって発酵培養基を精製した。 ろ液100mlをギ酸を用いてｐＨ７に調整した。15ｇの硫酸ナトリウムおよび10 ｇの塩化ナトリウムを該ろ液に加えた。この材料を25℃まで加温し、約１時間撹 拌してすべての塩を溶解した。親水性−疎水性バランス（ＨＬＢ）が13.5である トライトン（Triton）Ｘ−100（非イオン性のオクチルフェノールポリエーテル アルコール、ロム＆ハス（Rohm & Haas）社から市販）の10mlを加え、約15分撹 拌した。約3000ｇで約15分間遠心分離（ＩＥＣ セントラ−βセントリフュージ （IEC Cetra-beta Centrifuge）を使用）することにより、該混合物は２層（上 層は界面活性剤に富んでおり、下層は塩に富んでいる）に分離し、これらの層に ついてサブチリジン（ズブチリシン）活性を調べた。 容量比（上層の体積／下層の体積）を計算すると0.2であった。分離係数（上 層の酵素濃度／下層の酵素濃度の比）を計算すると442であった。濃度率（上層 の酵素濃度と当初の酵素濃度との間の割合）を計算すると4.7であった。抽出収 率（上層において回収された酵素の総量と当初の酵素量との比率）を計算すると 93％であった。 実施例３ 上の実施例２に記載した抽出方法と同様の方法で、ネオドール（Neodol）91− ６（エトキシレート非イオン性界面活性剤であり、ＨＬＢは12.5、シェル社（Sh ell）から市販）を用いてプロテアーゼ（Protease）２を抽出したところ、以下 のような結果が得られた： 容量比 0.22 分離係数 57 濃縮率 4.66 上層収率 100 上のデータから、本発明の方法は、ＨＬＢが12以上の種々の界面活性剤を用い て、アルカリプロテアーゼを効率的に回収することができることが明かである。 実施例４ 本実施例においては、プロテアーゼ（Protease）１（プロテアーゼ（Protease ）899としてジェネンコア・インターナショナル社（Genencor International，I nc.）から市販）を含むろ過培養基を用いて、界面活性材に基づく抽出を行った 。 ｐＨ7.33のろ液10mlに17ｇの硫酸ナトリウムと10ｇの塩化ナトリウムとを加え た。約35℃で約１時間、これらの材料を混合した。この材料を15mlの遠心管にお のおの９mlずつ移した。 これらの遠心管に、ＨＬＢの異なる３種類の非イオン性界面活性剤を１mlずつ 加えた。各遠心管を混合し、遠心分離機に入れて２層に分離し、これらの層につ いてサブチリジン活性を調べた。結果は以下に示すとおりである： 上に示すデータから、界面活性剤のＨＬＢが高くなると、プロテアーゼ（Prot ease）１のような非常に親水性の酵素（保持時間＝2.75分）の回収（％収量）が 良くなることがわかる。実施例３のプロテアーゼ（Protease）２（これはプロテ アーゼ（Protease）１よりも疎水性であり、保持時間＝12.89分）と比較すると 、プロテアーゼ（Protease）１はＨＬＢが15以下の界面活性剤では十分に抽出さ れない。つまり、ＨＩＣカラムにおける保持時間を測定して得られる所望する生 成物の親水性と対応する界面活性剤のＨＬＢに基づいて、適切な界面活性剤を選 択することにより、本抽出法を最大限に活用することができる。 実施例５ プロテアーゼ（Protease）２を含む発酵培養基全体を界面活性剤に基づく系を 用いて抽出した。 1400mlの培養基全体を700mlの蒸留水に加え、撹拌した。ギ酸を用いてこの材 料をｐＨ７に調整した。315ｇの硫酸ナトリウム（15％）および210ｇの塩化ナト リウムを加え、塩が溶解しやすくなるように該材料を35℃に加温しながら１時間 撹拌した。非イオン性界面活性剤であるネオドール（Neodol）91−６（ＨＬＢは 12.5）を添加し、最終濃度を7.5％とした。 調製した混合物をウエストファリア連続抽出機（Westfalia Continuous Extra ctor）（TA-05-00-105）を用いて抽出した。流速は180ml／分とした。上層およ び下層を集めて分析した。得られた結果は以下のようであった： 容量比 0.20 分離係数 154 濃縮率 7.8 上層収率 100 上記の結果からも、本抽出方法は、非常に効率的に、500倍以上のスケールア ップが可能であることがわかる。本実施例はまた、培養基全体から直接的に酵素 を回収、濃縮するための一段階操作の可能性を示唆している。 実施例６ 本実施例においては、最初に希釈材料として50％蒸留水を用いて、培養基全体 に含まれているプロテアーゼ（ピュラフェクト（Purafect）、ジェネンコア・イ ンターナショナル社（Genencor International，Inc.）から市販）を抽出した。 ｐＨ８（ＮａＯＨで８に調整）の材料100mlに10ｇの硫酸ナトリウムおよび10ｇ のギ酸ナトリウムを加え、約35℃で約１時間撹拌した。 該材料を撹拌した後、15mlの試験管に移したが、ここには、最終量５mlに対し て375μｌ（最終量に対して7.5％）のネオドール（Neodol）91−６（ＨＬＢは12 .5）を含んでいた。卓上遠心分離機を用い、3500rpmで15分間、試験管を回転し た。二層が得られ、上層に所望するプロテアーゼが含まれている。各パラメータ ーの計算を行い、得られた結果は以下のようであった： 容量比 0.12 分離係数 36 濃縮率 14 上層収率 100 実施例７ 本実施例においては、プソイドモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina ） （Genencor International，Inc.）から市販）を含む細胞不含培養基を、おのお の15％（重量／容量）の硫酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムを用いて処理し、 35℃で約１時間撹拌した。次に、400μｌの３種の異なるトライトン（Triton） ：Ｘ−100、Ｘ−305およびＸ−405を含み、最終量を４mlとして、塩を含む材料 を15mlの試験管に移した。この試験管を3500rpmで15分間回転し、層の量を測り 、リパーゼ活性を測定した。これらのデータを用いて、上層の収率を求めた。以 下のような結果が得られた： 実施例１と比較してより疎水性の高い（保持時間は16分）本酵素については、 ＨＬＢが13.5程度の界面活性剤を使用しても高収率が得られることがわかる。し かも、界面活性剤のＨＬＢが上昇すると、回収率も増加した。 実施例８ ５〜10％のネオドール（Neodol）界面活性剤（ＨＬＢは12.5）を用いて抽出を 行った以外は実施例３に記載した方法に従って、アルカリプロテアーゼの界面活 性剤による抽出物の調製を行った。この場合の抽出物は、ペースト状であり、自 由流動性の液体ではない。液体の抽出物を所望する場合には、10％の界面活性剤 を用いる。 次に、陽イオン性界面活性剤（直鎖アルキルベンゼンスルフォネート、アルキ ルスルフェート、アルキルエトキシスルフェート）および非イオン性界面活性剤 （アルキルエトキシレートアルコール類）を含む基本洗浄剤ペースト混合物と共 に、４％ｗ／ｗ濃度のプロテアーゼを含む抽出物ペーストを高剪断アグロメレー ター（ロッジ（Lodige）社製またはシューギ（Shugi）社製など）に導入した。 一般的には、１重量％となるように抽出物を基本洗浄剤混合物に加えるが、0.1 ％〜10％の範囲で加えることができる。 刃を高速で0.25〜10分間操作してアグロメレーションした後、酵素を含有する 界面活性剤アグロメレートは流動性の顆粒状洗浄剤粉末として取り出される。 このアグロメレートは、酵素を顆粒から分離する必要性がなく、また、顆粒化 した酵素混合物が取り扱い易いことにおいて、コスト的および工程的に有利であ る。そのような酵素顆粒化技術は、当業者において既知である。界面活性剤ペー スト処理用の市販のアグロメレーターを用いることにより、酵素−界面活性剤ペ ースト（または液体）を容易に取り扱うことができる。さらに、アグロメレート した洗浄剤中の酵素濃度は、市販の酵素顆粒のそれの10分の１〜200分の１であ るため、感受性の高い酵素ダストに接触する危険性（取り扱う材料の酵素濃度に 比例する）が減少する。

【手続補正書】 【提出日】１９９７年９月１９日 【補正内容】 (1) 発明の名称を「界面活性剤に基づく抽出法」に補正する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ベッカー，ナザニエル ティー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94080 サウス サンフランシスコ キン ボール ウェイ 180 ジェネンコア イ ンターナショナル インコーポレーテッド 内 (72)発明者 ガンショー，グラント シー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94080 サウス サンフランシスコ キン ボール ウェイ 180 ジェネンコア イ ンターナショナル インコーポレーテッド 内 (72)発明者 グレイカー，トーマス ピー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94080 サウス サンフランシスコ キン ボール ウェイ 180 ジェネンコア イ ンターナショナル インコーポレーテッド 内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．所望する親水性発酵生成物を回収する方法であって、 a) 所望する発酵生成物を含む精製発酵培養基または発酵培養基全体を、一種 もしくはそれ以上の塩類および疎水性−親水性バランスが少なくとも約12である 適切な界面活性剤と接触させ、 b) 該発酵培養基を、界面活性剤に富んだ第１層および塩に富んだ第２層の２ つの層に分離し、 c) 所望する精製物を含む界面活性剤に富んだ層を回収し、さらに、 d) 場合によっては、所望する精製物から界面活性剤を分離する ことを含むことを特徴とする方法。 ２．所望する親水性発酵生成物が、塩濃度の高い条件下で疎水性相互作用クロマ トグラフィー（ＨＩＣ）カラムを用いて測定した保持時間が14分以下である生成 物から構成されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 ３．塩が、陽イオンは、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、 アルミニウムおよびカルシウムからなる群から選択され、かつ、陰イオンは、ス ルフェート、カーボネート、塩素、臭素、ヨウ素、フォスフェート、アセテート 、ホルメート、ニトレートおよびシトレートからなる群から選択されることを特 徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 ４．塩が、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびギ酸ナ トリウムまたはそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求 の範囲第３項記載の方法。 ５．界面活性剤の疎水性−親水性バランスが少なくとも約15であることを特徴と する請求の範囲第１項記載の方法。 ６．界面活性剤が非イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求の範囲第１ 項記載の方法。 ７．所望する親水性発酵培養生成物が酵素であることを特徴とする請求の範囲第 １項記載の方法。 ８．所望する発酵培養生成物が親水性洗剤系酵素であることを特徴とする請求の 範囲第７項記載の方法。 ９．発酵培養基全体を用い、該発酵培養基全体を一種もしくはそれ以上の塩類お よび適切な界面活性剤と接触させる前に、所望の生成物を含む発酵培養基全体を 水で希釈する工程を含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 10．界面活性剤抽出した洗剤系酵素を用いて洗浄剤粉末を製造する方法であって 、 a) 請求の範囲第１項記載の方法を用いて、ペースト状または液状の酵素を抽 出し、さらに、 b) 該抽出物を好ましい洗浄剤ペースト混合物と共にアグロメレートする ことを含むことを特徴とする方法。 11．所望する発酵生成物を回収する方法であって、 a) 所望する発酵生成物を含む精製発酵培養基または発酵培養基全体を、一種 もしくはそれ以上の塩類および疎水性−親水性バランスが少なくとも約15である 適切な非イオン性界面活性剤と接触させ、 b) 該発酵培養基を、界面活性剤に富んだ第１層および塩に富んだ第２層との ２つの層に分離させ、 c) 所望する精製物を含む界面活性剤に富んだ層を回収し、さらに、 d) 場合によっては、所望する精製物から界面活性剤を分離する ことを含むことを特徴とする方法。