FI80600C - Foerfarande foer framstaellning av immunogent protein- eller peptidkomplex. - Google Patents

Description

1 80600

Menetelmä immunogeenisen proteiini- tai peptidikompleksin valmistamiseksi

Esillä oleva keksintä koskee menetelmää immunogee-5 nisen kompleksin, joka sisältää antigeenisiä proteiineja tai peptidejä, joissa on hydrofobisia alueita, jolla kompleksilla on avoin pallomainen rakenne, jonka muodostavat pyöreät alayksiköt tai pallomaisen rakenteen osat, ja jolla kompleksilla yleensä on alempi sedimentaatiovakio kuin 10 vastaavilla miselleillä ja suurempi sedimentaatiovakio kuin proteiinin tai peptidin vastaavalla monomeerisellä muodolla, valmistamiseksi amfipaattisista proteiineista tai peptideistä tai niitä sisältävistä viruksista, bakteereista, mykoplasmoista, parasiiteistä tai eläinsoluista. 15 Glukosidien sekä viruksista, mykoplasmasta, baktee reista, parasiiteistä tai eläinsoluista peräisin olevien proteiinien ja peptidien välinen keksinnön mukaisesti valmistettu immunogeeninen kompleksi on ns. "iskomi". Sitä voidaan käyttää immuunimekanismia stimuloivana aineena 20 sekä rokotteena.

On tunnettua, että tapetuilla viruksilla, esimerkiksi influenssaviruksilla on hyvä antigeenivaikutus. Ne ovat kuitenkin pyrogeenejä myös korkeatasoisen puhdistuksen jälkeen. Eristämällä komponentteja, jotka ovat tärkei-25 tä suojaavan immuniteetin aikaansaamisessa, on vältetty pyrogeenivaikutus, mutta immunogeenisuus ei useinkaan ole riittävän voimakas. Siksi rokotteeseen täytyi sisällyttää immuunivasteen lisäämiseksi sopivaa adjuvanttia, joka sisältää eristettyjä antigeenejä (alayksiköitä). Toisaalta 30 tehokas adjuvantti aiheuttaa siten käytettynä kuin sitä on tähän mennessä käytetty, kielteisiä sivuvaikutuksia. Adjuvanttipitoinen rokote ei ole siksi parempi kuin rokote, joka pohjautuu koko virukseen, kun on kysymys pyrogee-nisista vaikutuksista.

2 80500

Immunogeenisuuden lisäämiseksi on valmistettu de-tergenttipitoisia membraaniproteiineja, jotka on sijoitettu liposomeihin tai kiinnitetty liposomien pintaan (EPC-hakemus 794 008 30.0). Detergenttejä sisältämättömiä memb-5 raaniproteiineja liposomeissa kuvataan US-patenttijulkaisussa 4 148 876. Adjuvantin liittämistä sellaisiin deter-gentittömiin yksikerroksisiin liposomituotteisiin mainitaan US-patenttijulkaisussa 4 196 197 (selvittämättä sen vaikutusta). US-patenttijulkaisussa 4 117 113 kuvataan 10 negatiivisesti varattuja liposomeja sisältäviä virusanti-geenejä. Adjuvantin, mykobakteerien soluseinämien liittäminen liposomeihin, jotka sisältävät influenssahemagglu-tiimia ja neuramidaasia johtaa parempaan immuunivasteeseen. Saadaan myös parempi immuunivaste, kun adjuvantti, 15 kuten tapettu Mycobacterium tuberculosis tai Bortedella pertussis ja saponiineja viedään sellaisiin negatiivisesti varattuihin liposomeihin, jotka sisältävät difteritoksidia (US-patenttijulkaisu 4 053 585). Kaikki edellä mainitut lipidipitoiset membraaniproteiinituotteet ovat kuitenkin 20 epästabiileja pitempään säilytettäessä, jäähdytyskuivauk-sen yhteydessä tai varomattomasti käsiteltäessä esimerkiksi korkeassa lämpötilassa.

Rokotteeksi on myös valmistettu proteiinimisellejä, jotka ovat lipidittömiä ja joissa ei ole detergenttejä. 25 On osoitettu, että Semliki Forest-viruksen (SFV) membraa-niproteiinien misellit stimuloivat kiertävien SFV:n vasta-aineiden muodostumista sekä antavat hiirellä suojaa SFV:n kuolettavaa infektiota vastaan. Toisaalta eivät sellaiset parainfluenssa-3-viruksen membraaniproteiinimisellit ol-30 leet tehokkaita, kun oli kysymys vasta-aineen muodostuksen stimuloimisesta lampaalla tai keuhkokuumeen aiheuttavan PI-3-kannan annoksen vastaisesta suojasta, ellei öljyad-juvanttia oltu sekoitettu misellien kanssa, öljyadjuvantti antaa useimmiten sivuvaikutuksia, jotka ilmenevät paikal-35 listen reaktioiden muodossa injektiokohdassa (EPC-hakemus

II

3 80600 811 022 13.6). Kyseessä olevan keksinnön tarkoituksena on välttää näitä haittoja sekä aikaansaada säilytyksen kestävä proteiini- tai peptidikompleksi, jolla on voimakas im-munogeenisuus ilman sivuvaikutuksia. Tämä saavutetaan muo-5 dostamalla lipiditön kompleksi viruksista, mykoplasmasta, bakteereista, eläinsoluista tai parasiiteistä peräisin olevien proteiinien ja peptidien hydrofobisten alueiden sekä hydrofobisten ryhmien välille, jotka sijaitsevat yhdessä tai useammassa glykosidissa.

10 Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että sekoitetaan vähintään yksi edellä mainituista komponenteista vähintään yhden liuottavan aineen kanssa, jolloin komplekseja muodostuu amfipaattisten antigeenisten proteiinien tai peptidien ja liuottavan aineen välillä, 15 minkä jälkeen amfipaattiset antigeeniset proteiinit tai peptidit erotetaan liuottavasta aineesta, liuottavan aineen läsnäollessa tai erotettuna liuottavasta aineesta, ja ne siirretään suoraan liuokseen, jossa on vähintään yksi triterpeenisaponiini, jossa on hydrofobisia ja hydro-20 fiilisiä alueita pitoisuudessa, joka on vähintään kriittinen misellipitoisuus (CMC).

Uudella kompleksilla on toinen morfologinen rakenne elektronimikroskoopissa kuin vastaavalla proteiinimisel-lillä, joka valmistetaan ilman glykosidilisäystä. Misel-25 leiliä on tiivis keskusydin säteittäin järjestynein haa-rakkein, kun taas keksinnön mukaisesti valmistetuilla komplekseilla on avoin pallomainen rakenne, joka koostuu pyöreistä alayksiköistä tai pallomaisen rakenteen osista. Kompleksilla ja sen osilla on edelleen säännöllisesti 30 alempi sedimentaatiovakio (kts. kuva 2) kuin vastaavilla miselleillä ja korkeampi sedimentaatiovakio kuin proteiinin tai peptidin vastaavilla monomeerimuodoilla.

Kompleksilla, joka on valmistettu glykosidilisäyk-sen kanssa, on parempi immunogeeniaktiivisuus kuin vastaa-35 villa proteiinimiselleillä, jotka on valmistettu ilman 4 80600 glykosidilisäystä, tai proteiinimolekyylin ja liuottavan aineen välisellä (monomeerimuotojen) kompleksilla tai lipidiin sidotuilla proteiinimolekyyleiliä, esim. viroso-meilla; ja se antaa vähemmän sivuvaikutuksia kuin se, että 5 proteiinimisellejä sekoitetaan glykosidien tai uuden ad-juvantin kanssa. Täten voidaan membraaniproteiinien annosta vähentää noin 1/10:aan tai enemmän.

Proteiinit tai peptidit, joissa on hydrofobisia alueita, jotka kompleksisidotaan glykosideissa sijaiseviin 10 hydrofobisiin alueisiin, voivat olla: A) amfipaattisia proteiineja tai peptidejä hydro-fiilisin ja hydrofobisin ryhmin, jotka ovat peräisin tai jotka valmistetaan vaipallisten virusten, mykoplasman, bakteereiden, parasiittien tai eläinsolujen membraanipro- 15 teiineista tai -peptideistä tai sellaisista proteiineista tai peptideistä; B) hydrofiilisiä proteiineja tai peptidejä, jotka tehdään amfipaattisiksi kytkemällä niihin hydrofobisia ryhmiä. Nämä proteiinit tai peptidit voivat olla peräisin 20 viruksista, mykoplasmasta, bakteereista tai parasiiteistä; C) amfipaattisia proteiineja tai peptidejä, jotka on saatu siten, että hydrofiilisten proteiinien saavuttamattomissa olevia hydrofobisia osia on kemiallista tietä 25 tehty luoksepäästäviksi. Nämä proteiinit voivat olla peräisin edellä mainituista mikro-organismeista tai soluista.

a) Kun on kysymys kokonaisista soluista tai viruksista peräisin olevista membraaniproteiineista tai -pep- 30 tideistä, kompleksin valmistus käsittää periaatteessa seu-raavat vaiheet: eläinsolujen tai mikro-organismien tai niiden fragmenttien puhdistus tai eristäminen; sekä hydrofobisten proteiinien liuottaminen sekä liuottajan poistaminen, kun samanaikaisesti haluttu antigeeni saatetaan il 5 80600 kompleksiin immunogeenimuodossa olevan glykosidin välityksellä (immunogeenikompleksi).

Vaipalla varustettu virus, mykoplasma, bakteerit, parasiitit ja eläinsolut konsentroidaan ja puhdistetaan 5 tunnetulla tavalla (kts. The Tools of Biochemistry, T. G. Cooper, John Wiley & Sons (1977) New York; joka sisällytetään viitteenä) esimerkiksi suodatuksen, ultrasuodatuksen tai elektroforeesin ja erilaisten kromatografisten menetelmien avulla, esimerkiksi geelisuodatuksen tai sokeri-10 gradientin kautta suoritetun gradienttisentrifugoinnin tai ontelokuitudialyysin avulla. Kun on kysymys bakteereista, voi olla tarpeellista tai edullista ensin liuottaa tai lyödä soluseinämät rikki (kts. Cota-Robles ja Stein; CRC Handbook of Microbiology, osa II (1973), ss. 833 - 844; 15 joka sisällytetään viitteenä tässä yhteydessä) esimerkiksi ultraääni- tai ranskalaista puristinkäsittelyä käyttäen.

Puhdistetut eläinsolut, mikro-organismit tai niiden fragmentit sekoitetaan tämän ionittoman, ionisen tai zwit-ter-ionidetergentin tai sappihappojohdannaisen detergentin 20 kanssa, jota käytetään ylimäärin. Tyypillisiä esimerkkejä sopivista, ionittomista detergenteistä ovat polyglykoli-esterit ja -eetterit, jotka on muodostettu alifaattisten ja aralyylifaattisten happojen ja alkoholien kanssa. Näistä ovat esimerkkejä alkyyli-, polyoksietyleenieetterit, 25 joiden yleinen kaava on CnH2 +1 (OCH2CH)XOH, lyhennettynä

CnΕχ; alkyylipolyoksietyleenieetterit, joissa on fenyyli-rengas alkyyliryhmän ja polyoksietyleeniketjun välillä, lyhennettynä Cn 0 Εχ, esim. Triton X-100 = tert.-C8 0 E, 6 (polyoksietyleenioksidin oktyylifenolieet-30 teri), asyylipolyoksiesterit, asyylipolyoksietyleenisor-bitaaniesterit, lyhennettynä Cn-sorbitaani-Ex , esim. Tween 20 tai Tween 80, β-D-alkyyliglykosidit, esim. β-D-oktyyli-glykosidi. Edellä mainittujen glykosidien rinnalla voidaan käyttää varsinkin saponiinia. Nämä ovat kuitenkin heikkoja 35 detergenttejä, ja niitä tulee käyttää yhdessä muiden de- 6 80600 tergenttien kanssa. Sopivien ionisten detergenttien tyypillisiä esimerkkejä ovat sappihappodetergentit, kuten esimerkiksi deoksikolaatti ja kolaatti. Voidaan käyttää myös konjugoituja detergenttejä, kuten esim. taurodeoksi-5 kolaattia, glykodeoksikolaattia sekä glykokolaattia. Zwit-ter-ionisina detergentteinä voidaan mainita lysolesitiini sekä synteettiset lysofosfidit. Voidaan käyttää myös edellä mainittujen detergenttien seoksia.

Liuottaminen voidaan suorittaa alkoholien, orgaa-10 nisten liuottimien tai pienten amfipaattisten molekyylien, kuten heptaani-1,2,3-triolin, heksaani-1,2,3-triolin, etikkahapon, vesiliukoisten peptidien ja proteiinien tai niiden seosten tai detergenttien kanssa.

Liuotinta käytetään ylimäärin suhteessa lipidin ja 15 hydrofobisten proteiinien määrään. Soluja tai mikro-organismeja sekä liuottavaa ainetta sekoitetaan sopivasti painosuhteessa 1:3 - 1:10.

Solut tai mikro-organismit sekä liuotin sekoitetaan puskuroidussa, mahdollisesti suolapitoisessa liuoksessa. 20 Suolaliuoksen molaarisuus on välillä 0,02 ja 0,5 M, etupäässä välillä 0,05 - 0,25 M, edullisesti 0,1 - 0,2 M. Detergentin tulee vaikuttaa noin 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa.

Keittosuolaa pidetään edullisena suolana, mutta 25 myös muut suolat voivat tulla kysymykseen, etenkin alkali-ja maa-alkali- sekä ammoniumionien sekä voimakkaiden mine-raalihappojen ja orgaanisten happojen, kuten etikkahapon, trikloorietikkahapon, muurahaishapon ja oksaalihapon muodostamat suolat. Puskureiksi soveltuvat kaikki aineet, 30 jotka puskuroituvat pH-alueella 6,5 - 9. Kolaatteja ja deoksikolaatteja käytettäessä pidetään edullisina pH-aluetta 8 - 9 ja ionittomia detergenttejä käytettäessä pH-arvoa 7,4. Käytettäessä orgaanisia happoja proteiinien liuottamiseen, voidaan puskuri jättää pois.

7 80600

Soluja tai mikro-organismeja liuotettaessa muodostetaan seos liuottimesta ja solu- tai mikro-organismifrag-menteista (alla mainitut fragmentit). Fragmenttien joukossa on varattuja, monomeerisiä antigeeniproteiineja, joissa 5 on hydrofobisia alueita liuottimien kanssa muodostetussa kompleksissa. Uusi immunogeenikompleksi valmistetaan siten, että varatut monomeeriset antigeeniproteiinit erotetaan liuottimesta yhden tai usemman glykosidin läsnäollessa tai liitetään suoraan niihin, jolloin glykosideilla 10 tulee olla hydrofobisia ja hydrofiilisiä alueita ja niiden tulee esiintyä konsentraationa, joka on vähintään kriittinen misellien konsentraatio. Muut fragmentit poistetaan ennenkuin kompleksi valmistetaan keksinnön mukaisesti, samalla kun se valmistetaan tai jälkeen päin, mie-15 luummin kuitenkin ennen.

Kompleksi voidaan valmistaa joko siten, että liuottava aine poistetaan esimerkiksi dialyysin, geelisuodatuk-sen tai kromatografoinnin avulla seoksesta, jonka muodostavat liuottava aine, varatut, monomeeriset antigeenipro-20 teiinit, glykosidi sekä mahdollisesti muut fragmentit, tai erottamalla varatut, monomeeriset antigeeniproteiinit mainitusta seoksesta esimerkiksi gradienttisentrifugoinnin, kromatografian tai elektroforeesin avulla. Olennaista keksinnön mukaan on se, että monomeeriset antigeeniproteiinit 25 erotetaan liuottavasta aineesta, siten, että samanaikaisesti on läsnä glykosidi, tai sitten ne erottamisen jälkeen liitetään suoraan glykosidiin, jonka tulee olla mi-sellimuodossa.

Kun monomeeriset antigeeniproteiinit erotetaan 30 liuottavasta aineesta niin, että ne voivat joutua suoraan kosketukseen glykosidin kanssa, muodostuu erikoiskomplek-si. Glykosidin misellimuodon oletetaan muodostavan kompleksin, ja oletetaan, että tämä muodostuu glykosidimisel-lien hydrofobisten alueiden ja membraaniproteiinien hydro-35 fobisten alueiden välisen vetovoiman avulla. Glykosidin 8 80000 määrä kompleksissa vaihtelee riippuen käytetystä glykosi-dista ja kompleksiin sidotuista membraaniproteiineista, ja sitä on noin 0,5 - 50 paino-%, erityisesti 0,5 - 25 paino-%, etupäässä 0,5 - 15 paino-%, usein 0,5 - 10 pai-5 no-%, erityisesti 2-8 paino-%. Jos varatut antigeeniset monomeeriset proteiinit erotetaan liuottavasta aineesta glykosidin poissaollessa, muodostuu sitä vastoin proteii-nimisellejä, jotka ovat sen laatuisia kuin hakemuksen EPC 811 022 13.6 mukaan valmistetaan.

10 On sopivaa poistaa muut fragmentit gradienttisent- rifugoinnin avulla, koska mainittujen komponenttien sedi-mentaatiovakiot pienenevät seuraavassa järjestyksessä: solufragmentti, proteiinikompleksi liuottavan aineen tai glykosidin kanssa, monomeeriset proteiinit sekä liuottava 15 aine. Täten voidaan muut fragmentit poistaa gradientti-sentrifugoinnin avulla seoksesta, jossa on liuotin, mono-meerisiä proteiineja sekä muita fragmentteja, ennen kuin glykosidi lisätään ja liuotin poistetaan esim. dialyysin, geelisuodatuksen tai kromatografian avulla, tai monomeeri-20 set proteiinit erotetaan liuottavasta aineesta esim.

elektroforeesin, kromatografian tai gradienttisentrifu-goinnin avulla. Jälkimmäisessä menetelmässä on myös mahdollista poistaa muut fragmentit saman gradienttisentrifu-goinnin avulla, jona aikana kompleksi muodostuu. On myös 25 mahdollista erottaa muut solukomponentit, sen jälkeen, kun kompleksi muodostetaan edellä esitetyllä tavalla, esim. sentrifugoinnin, affiniteettikromatografian tai geelisuodatuksen avulla.

Glykosidi on triterpeenisaponiini. Saponiineja ku-30 vataan R. Tschesche’n ja Wulfin julkaisussa Chemie und Biologie der Saponine; Fortschritte der Chemie organischer Naturstoffe, julk. W. Herz, H. Grisebach ja G. W. Kirby, nidos 30 (1973). Edullisesti käytetään voimakkaasti polaarisia saponiineja, etupäässä polaarisia triterpeenisapo-35 niineja, esim. saponiiniuutetta, joka on saatu kurillajan

II

9 80600 kuorien aralosidi A:sta, Chikusetsu-saponiini IV:stä, Ca-lendula-glykosidi C:stä, Chikusetsu-saponiini V:stä, Achyranthes-saponiini B:stä, Calendula-glykosidi A:sta, Aralosidi B:stä, Aralosidi C:stä, Putranjia-saponiini 5 HI:sta, Bersama-saponosidista, Putranjia-saponiini IV:stä, Trichosid A:sta, Trichosid B:stä, Saponasid A:sta, Trichosid C:stä, Gyposidista, Nutanosidista, Dianthosid C:stä, Saponasid D:stä, etupäässä aeskiini, joka on saatu Aesculus hippocastanum'ista [T. Patt ja W. Winkler: Der 10 therapeutisch wirksamme Prinzip der Rosskastanie (Aesculus hippocastanum), Arzneimittelforsch. 10 (4), (1969), ss. 273 - 275], tai sapoalbiini, joka on saatu Gypsophilla struthium'ista [R, Vochten, R. Joos ja R. Ruyssen: Physicochemical properties of sapoalbin and their relation to 15 the foam stability, J. Pharm. Belg. 42, (1968), ss. 213 - 226], etenkin saponiiniuute, joka on saatu Quillaja saponaria Molina'sta, ensisijaisesti DQ-uute, joka valmistetaan K. Dalsgaard'in mukaan [Saponin Adjuvants, Bull. Off. Int. Epiz 77 (7 - 9), (1972), ss. 1289 - 1295], sekä 20 Quil A, jota valmistetaan K. Dalsgaard'in mukaan [Saponin Adjuvants III, Archie filr die Gesamte Virusforschung 44, (1974), ss. 243 - 254]. Voidaan myös käyttää glykosidien seoksia. Käytettyjen glykosidien määrän tulee olla vähintään 1-3 kertaa niiden kriittinen misellinmuodostamis-25 konsentraatio (VMC), etupäässä vähintään 5, etenkin vähintään 7-12 kertaa tämä määrä. Oletetaan, että glykosidi voidaan siinä tapauksessa sitoa membraaniproteiinien mono-meerimuotoihin ja sulkea niiden sisään. Edullisesti käytetään Quil A:ta, jonka kriittinen misellinmuodostamiskon-30 sentraatio on 0,03 paino-%. Quil A:n määrän tulee olla vähintään 0,02 paino-%, varsinkin 0,05 - 0,5 paino-%, etupäässä 0,2 paino-%. Edellä esitettyjä glykosideja koskevat julkaisut sisällytetään viitteinä.

ίο 80 600

Varattujen, monomeeristen antigeeniproteiinien erottaminen liuottavasta aineesta on suoritettu sentrifu-goinnin, dialyysin, elektroforeesin sekä erilaisten kromatografisten menetelmien avulla.

5 Edellä esitetyllä tavalla valmistetut seokset, joissa on pirstottuja soluja vastaavia mikro-organismeja sekä liuottavaa ainetta, gradienttisentrifugoidaan ja kerrostetaan esimerkiksi liuottavan aineen sisältävän sokeri-tai suolaliuoksen päälle, jonka alla on glykosidin sisäl-10 tävä gradientti, kuten sokerigradientti tai glyseroligra-dientti tai meritseamidi tai raskassuola, esim. CsCl (ts. suhteellisen inerttejä aineita, joilla on sopiva tiheys ja viskositeetti vaikuttaakseen gradienttimateriaalina) esim. jäljempänä sokerigradientille annettuina konsentraa-15 tioina.

Gradientti-järjestelmää sentrifugoidaan vähintään 100 000 g. Sokerina voivat olla monosakkaridit tai disak-karidit, kuten laktoosi, maltoosi tai sakkaroosi, mutta myös triooseja, tetrooseja sekä glyseriiniä käytetään. 20 Etupäässä käytetään sakkaroosia. Gradientin sokerikon-sentraation sopiva alkukonsentraatio on vähintään 5, etupäässä 15-25 paino-% (ylinnä gradientissa) ja loppukon-sentraatio on vähintään 20, etupässä 45- 60 paino-% (gradientissa alimpana). Gradientti voi koostua esimerkiksi 25 ylemmästä kerroksesta, jonka sokeripitoisuus on 5 - 25 paino-% ja alemmasta kerroksesta, jonka sokeripitoisuus on 20 - 60 paino-%. Kuitenkin gradientissa voi olla myös useampia kerroksia, jolloin erillisten kerrosten kon-sentraatioerot laskevat vastaavassa asteessa. Sokerigra-30 dientti sisältää glykosidin tai glykosidien seoksen. Glykosidin määrän tulee olla vähintään 1-3, etupäässä vähintään 7-12 kertaa CMC, Quil A:lie vähintään 0,02, etenkin vähintään 0,05 - 0,5, etupäässä vähintään 0,2 pai-no-%. Tässä glykosidipitoisessa gradientissa eroteli li 80 600 taan liuottava aine, ja kompleksi tämän ja proteiinin välillä muuttuu proteiini-glykosidi-kompleksiksi.

Sokerigradientin yläpuolella on liuoskerros, joka koostuu sokerista tai raskassuolasta ja sisältää liuotta-5 vaa ainetta tai sen seosta. Lipidit jäävät tähän kerrokseen. Liuottavan aineen konsentraatio tässä kerroksessa on pienempi tai sama kuin päälle asetetussa mikro-organismien tai solujen sekä liuottavan aineen seoksessa, ja se on sopivasti välillä 0,12 ja 3 paino-%, etupäässä 0,75 10 - 1,5 paino-%, jolloin 1 paino-% pidetään parempana. So keri- ja suolakonsentraatio voi olla sama tai se voi olla pienempi kuin alemman glykosidipitoisen gradientin ylemmän kerroksen konsentraatio.

Sen jälkeen kun on sentrifugoitu vähintään 15 100 000 g vähintään 16 tunnin ajan, etupäässä 20 tunnin ajan 20°C:ssa, kootaan proteiinipitoiset jakeet ja dialy-soidaan ne puskuria vastaan; (0,5 - 0,001 M), etupäässä 0,005 M Tris-HCl, 0,01 M NaCl (pH 7,4) tai 0,2 M anunonium-asetaattipuskuria (pH 7,0) vastaan, ja ne väkevöidään esi-20 merkiksi niin kuin T. G. Cooper kuvaa teoksessa The Tools of Biochemistry (kust. John Wiley & Sons, New York, 1974; liitetään tähän viitteenä), esimerkiksi lyofilisoimalla, tyhjödialyysin avulla tai ultrasuodatuksen avulla. Sentri-fugoinnin aikana kaikki ainekset sedimentoituvat, jolloin 25 liuottava aine pääsee irti proteiinin kanssa muodostamastaan kompleksista ja monomeeriset proteiinit siirretään glykosidille, jonka kanssa ne muodostavat kompleksin. Tätä seuraavan dialyysin avulla poistetaan sokeri. Kompleksi voidaan mahdollisesti edelleen puhdistaa esim. vapaan gly-30 kosidin suhteen gradienttisentrifugoinnin avulla, esim. sokerigradientilla, joka sisältää 25 - 60 paino-% sokeria, etupäässä 10 - 40 paino-% sakkaroosia.

12 80 600

Edellä kuvatulla tavalla suoritetun mikro-organismien tai solujen puhdistamisen jälkeen ja sen jälkeen, kun solut on sekoitettu liuottavan aineen kanssa edellä annetussa painosuhteessa, solujen ja liuottavan aineen seok-5 seen edellä mainitussa puskurissa voidaan vaihtoehtoisesti suoraan lisätä 1-3, etupäässä vähintään 7-12 kertaa CMC:n suuruinen määrä, Quil A:n kohdalla 0,05 - 2 paino-% glykosidia, etupäässä 0,2 paino-% glykosidia, ja dialysoi-da puskuria vastaan, jona on 0,5 - 0,001 M, etupäässä 10 0,005 M Tris-Hcl, 0,01 M NaCl (pH 7,4) tai etupässä 0,2 M

ammoniumasetaattipuskuria (pH 7,0). Liuottava aine poistetaan tällöin glykosidin läsnäollessa. Tämän jälkeen valmistettu membraabiproteiinikompleksi eristetään sedimen-taatiogradienttisentrifugoinnin avulla, kuten kuvataan 15 sivun 10 viimeisessä kappaleessa, kuitenkin ilman glykosi-dilisäystä ja poistetaan muut fragmentit sekä vapaa glyko-sidi.

Solujen tai mikro-organismien sekä liuottavan aineen seos puskurissa voidaan myös gradienttisentrifugoida 20 ja esim. kerrostaa edellä mainittuun puskuriin valmistetun 5-60 paino-%:isen sokerigradientin, etupäässä 10 - 20 paino-%:isen sakkaroosigradientin päälle, sekä sentrifu-goida ainakin 150 000 g vähintään 20 minuutin ajan, etupäässä 30 minuutin ajan 250 000 g:llä. Tällöin jäljelle 25 jääneet fragmentit eroavat liuottavan aineen ja proteiinin muodostamasta kompleksista.

Huippufraktioksi nimitetty, pinnalla sijaitseva proteiinipitoinen neste poistetaan ja lisätään glykosidia määrältään vähintään 1-3, etupäässä vähintään 7-12 30 kertaa CMC, Quil A:n kohdalla 0,05 - 0,5 paino-%, etupäässä 0,2 paino-%, ja dialysoidaan 0,5 - 0,001 M puskuria vastaan, varsinkin 0,005 Tris-HCl, 0,01 M NaCl (pH 7,4) tai etupäässä 0,2 M ammoniumasetaattia vastaan. Tällöin liuottava aine poistetaan glykosidin läsnäollessa. Lisä-35 puhdistus voidaan suorittaa sedimentaatiogradienttisentri- il 13 80 600 fugoinnin avulla (kts. sivu 10, 2. kappale). Lisäpuhdistus voi tapahtua sentrifugolmalla sokerlgradlentln läpi, joka sisältää 5-60 paino-% sokeria, etupäässä 19 - 40 pai-no-% sokeria.

5 Vaihtoehtoisesti voidaan seos, jossa on fragmentoi- tuja mikro-organismeja tai soluja sekä liuottavaa ainetta tai proteiinipitoista sentrifugaattia (muut fragmentit ja vapaa liuottava aine ovat poissa), joka saadaan, kun tätä seosta gradienttisentrifugoidaan puskuriin valmistetun 5 10 - 60 paino-%:isen, etupäässä 10 - 20 paino-%risen sokeri- gradientin läpi, erottaa elektroforeettisesti liuottavasta aineesta ja viedä liuokseen, joka sisältää vähintään 1 - 3, etupäässä vähintään 7-12 kertaa CMC, Quil A:n kohdalla 0,05 - 0,5 paino-% glykosidia, edullisesti 0,2 pai-15 no-% glykosidia. Tällöin erotetaan varatut, monomeeriset antigeeniproteiinit liuottavasta aineesta. Elektroforeesin avulla suoritettavan erottamisen yhteydessä on sopivaa, ettei liuottava aine-puskuriliuos sisällä ylimääräistä suolalisäystä, joka voi häiritä elektroforeesia ja 20 tuottaa liian korkean lämpötilan.

Voidaan esimerkiksi käyttää vyöhyke-eletroforeesia kantaja-aineen kanssa tai ilman kantaja-ainetta sekä iso-takoforeesia kantaja-aineen kanssa tai ilman sitä. Kantaja-aineina voidaan käyttää tavallisia aineita, kuten esi-25 merkiksi polyakryyliamidia, agaria, piihappogeeliä, tärkkelystä, selluloosaa, polyvinyylikloridia, ioninvaihtajaa tai seliittiä. Kompleksin eristäminen ja konsentrointi suoritetaan sivulla 11, riveillä 20 - 23 kuvatulla tavalla. Katso gradienttisentrifugoinnin avulla suoritettavaa 30 lisäpuhdistusta sivulta 11, riveiltä 28 - 32.

Jos lähtöaineessa on hydrofobisia membraaniproteii-neja, joilla on erilaiset varaukset tai painot, niin nämä voidaan elektroforeesi- tai sentrifugointimenetelmin erottaa toisistaan ja valmistaa niiden erillisiä komplekseja.

14 80600 Tämän menetelmän avulla voidaan täten erottaa ja rikastaa erilaatuisia membraaniproteiineja.

Liuotetut proteiinit voidaan mahdollisesti solu-fragmenteista suoritetun puhdistamisen jälkeen erottaa 5 liuottavasta aineesta kromatografisilla menetelmillä, esimerkiksi geelisuodatuksella, jolloin antigeeniset rakenteet adsorboidaan liukenemattomaan tukiaineeseen (matriisiin), joka voi olla esimerkiksi selluloosaa, agaroosia, dekstraania, akryyliamidia ja lasia. Kytketään erilaisia 10 ligandeja matriisirakenteeseen, joka saa tällöin erilaisia ominaisuuksia, joita käytetään eristettäessä hyväksi. Tavallisesti antigeeninen rakenne adsorboituu samanaikaisesti, kun käytetty liuottava aine kulkee matriisin läpi adsorboitumatta siihen. Tämän jälkeen tapahtuu antigeenin 15 irtoaminen. Ennen irtoamisvaihetta tai sen aikana voi tapahtua liuottavan aineen, suolan ja puskuroivan aineen vaihtoa, jolloin liuottava aine voidaan korvata glykosi-dilla ja kompleksi valmistetaan.

Ioninvaihtokromatografiässä kytketään varattuja 20 ligandimolekyylejä, kuten dietyyliaminoetyyliä (DEAE) matriisiin ja käytetään kationinvaihtajana. Karboksimetyyli (CM)- tai fosfaattiryhmiä (P) kytketään matriisiin ja käytetään anioninvaihtajana. Käyttämällä antigeenisten rakenteiden ja liuottavan aineen nettovarausten eroa hyväksi, 25 saadaan aikaan näiden molekyylien erottuminen. Tavallisesti liuottava aine on varaukseton ja proteiini on varattu. Eluointi tapahtuu suolagradientin avulla, esim. K- tai NaClrlla tai sopivalla puskurilla, esimerkiksi fosfaatti-puskurilla suoritetun pH:n säädön avulla, liuottavan ai-30 neen läsnäollessa (kts. konsentraatio ja esimerkki edellä esitetyn liuottamisen yhteydessä). Eluoinnin yhteydessä voidaan proteiinit puhdistaa, vaihtaa liuottava aine tai muodostaa kompleksi, jos eluointiaineeseen lisätään glyko-sidi liuottavan aineen sijasta. Suolat poistetaan jälkeen-35 päin dialyysin tai geelisuodatuksen avulla.

il is 80 600

Geelisuodatuksessa käytetään hyväksi sitä seikkaa, että liuottava aine on kooltaan pienempi kuin antigeeni-rakenteet ja että se tulee ulos myöhemmissä jakeissa, kompleksin muodostuessa antigeenipitoisten rakenteiden 5 koko kasvaa, ja vyöhykkeet, jotka sisältävät liuottavaa ainetta, kasvavat.

Vasta-aineet voidaan immunoaffiniteettikromatogra-fian avulla sitoa irreversiibelisti edellä mainittuun matriisiin, minkä jälkeen vasta-aineiden ainutlaatuista spe-10 sifisyyttä ja affiniteettia käytetään hyväksi halutun antigeenirakenteen puhdistamiseen. Liuottavalla aineella ei ole affiniteettia vasta-aineisiin nähden. Eluointi tapahtuu lievän denaturoinnin avulla, esimerkiksi laskemalla pH noin arvoon 4, sekä liuottavan aineen tai glykosidin 15 läsnäollessa.

Lektiini-kromatografian yhteydessä käytetään hyväksi lektiinejä, erästä proteiinien ryhmää, joka voi reagoida reversiibelisti spesifisten sokeriryhmien kanssa, mikä tekee niille mahdolliseksi sitoa ne esimerkiksi glykopro-20 teiineihin. Lektiini kytketään ligandina esimerkiksi

Sepharose'en (Pharmacia, Uppsala) tai ostetaan sopivaan matriisiin valmiiksikytkettynä, kaupallisena tuotteena. Detergenteillä (liuottavilla aineilla) ei ole affiniteettia kytkettyyn lektiiniin. Adsorboidut antigeenirakenteet 25 irrotetaan tavallisesti lisäämällä metyloituja sokereja, esimerkiksi metyylimannoksidia, metyyliglukosidia sekä N-asetyyliglukosamidia, joka on liuotettu puskuroituun suolaliuokseen liuottavan aineen tai glykosidin läsnäollessa.

Kovalenttisessa kromatografiassa sidotaan antigee-30 nirakenne tioliryhmän avulla kovalenttisella sidoksella matriisiin. Aktigeenissa sijatseva tioliryhmä sidotaan selektiivisesti aktivoituun tioryhmään, joka on kytketty sopivaan matriisiin tiodiosulfidi-vaihdon avulla. Tämä sidos on reversiibeli ja sen jälkeen kun liuottava aine 35 pestään pois, voidaan tioliryhmän sitovat antigeeniraken- 16 80 600 teet eluolda pelkistämällä disulfidisidos merkaptoetano-lilla tai ditiotreitolilla liuottavan aineen tai glykosi-din läsnäollessa.

Hydrofobinen kromatografia: Tässä tekniikassa käy-5 tetään hyväksi vuorovaikutusta oktyyli- tai fenyylityyp-pisen, liikkumattoman, hydrofobisen ligandin sekä antigeenisten rakenneosien hydrofobisten pintojen välillä. Tämä tekniikka voi vaihtoehtoisesti olla menetelmä liuottavan aineen sitomiseksi seoksesta ligandiin samanaikaisesti 10 kuin adsorboitumattomat antigeeniset rakenteet voidaan saada takaisin esimerkin 4 (dialyysimenetelmä) mukaisesti suoritettavaan jatkotyöskentelyä varten. Muissa olosuhteissa voidaan antigeeninen rakenne sitoa ligandiin, ja liuottavalla aineella ei ole affiniteettia ligandiin, min-15 kä takia jatketaan dialyysimenetelmän mukaan. Sitominen suoritetaan suurta ioninvahvuutta esim. ammoniumsulfaattia käyttäen ja eluoidaan alhaisella ionivahvuudella, esim. vedellä tai etyleeniglykolilla.

Kun kompleksi sisältää bakteereiden membraaniprote-20 iineja, on edullista lyödä soluseinämät ensin rikki ennenkuin solumateriaalia käsitellään edellä esitetyn menetelmän mukaisesti. Esimerkkejä bakteereista, joista voidaan valmistaa hydrofobisia proteiineja, on esimerkiksi Escherichia, Staphylococci, Haemaphilus, esim. H. influenzae, 25 Bordetella, esim. B. pertussis, Vibrio, esim. V. cholerae, Salmonella, esim. S. typhi ja S. paratyphi, etupäässä Colin, esim. pili K 88, tarttumistekijä sekä Salmonellan huokosproteiini tai B. pertussiksen sekä Neisseria menin-gitidiksen ulommat membraaniproteiinit.

30 Esimerkkejä käyttökelpoisista viruksista, joilla on vaippa, ovat Orthomyxoviridae, kuten influenssa A, B ja C, Paramyxoviridae, etupäässä tuhkarokkovirus, sikotautivirus, parainfluenssa 1, 2, 3 ja 4 virus, penikkatautivirus ja karjaruttovirus, Rhabdoviridae, erityisesti 35 vesikauhuvirus, Retroviridae, etupäässä kissan leukemia- il 17 80 600 virus sekä härän leukemiavirus, Herpesviridae, etupässä Pseudorabies, Coronaviridae, Togaviridae, kuten EEE, WEE ja VEE (Eastern, Western ja Venezuela equine encephalitis), keltakuumevirus, erityisesti härän virusripuli-virus 5 sekä eurooppalainen sikaruttovirus Arenaviridae Poxviri-dae, Bunyaviridae, Iridioviridae, erityisesti afrikkalainen sikaruttovirus, sekä luokittelemattomien virusten joukosta ihmisen hepatiitti B-virus ja Marburg/Ebola-virus.

Esimerkkejä parasiiteistä, joita voidaan käyttää 10 keksinnön mukaisesti, ovat Protozoa, kuten Toxoplasma, esim. Toxoplasma gondii, Plasmodium, esim. Plasmodium vi-vax, malariae ja falciparium, Teileria parvum ja ovale sekä Filaroidae, etupäässä Parafilaria ja Ochoocerca, En-tamöba histolytica, erilaiset anaplasmat, Schistosoma, 15 kuten Schistosoma haematobium, mansoni ja japonicum sekä Trypanosoma, esim. Trypanosoma gambiensi, T. brumseo eli congolesi.

b) On myös mahdollista lähteä hydrofobisista ei-membraaniproteiineista tai ei-hydrofobisista proteiineista 20 tai peptideistä. Ei-hydrofobisia proteiineja tai peptidejä voidaan muuttaa hydrofobisiksi liittämällä niihin hydrofobisia ryhmiä. Mainitut proteiinit voivat olla peräisin viruksista, joilla on vaippa tai jotka ovat ilman vaippaa, bakteereista, mykoplasmasta tai parasiiteistä. Esimerkkejä 25 viruksista, joilla ei ole vaippaa eikä hydrofobisia proteiineja, on Picornaviridae (jolla katsotaan olevan myös hydrofobisia proteiineja), esim. suu- ja sorkkatautivirus, poliovirus, Adenoviridae, Parvoviridae, esim. kissarutto-virus sekä sian parvovirus, Reoviridae, esim. Rota-virus. 30 Esimerkkejä mykoplasmasta ovat M. Pneumoniae, Mycoides, bovis, suis, hyorinos, orale, salivarium, hominis ja ter-mentans.

Nämä proteiinit ja peptidit puhdistetaan kuten kuvataan kohdassa a); puhdistus ja eristys.

35 ie 80 600

Hydrofobiset ryhmät, joita voidaan liittää ei-hyd-rofobisiin proteiineihin, ovat suoria, haaroittuneita, tyydyttyneitä tai tyydyttämättömiä alifaattisia ketjuja, joissa on 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 tai 8 hiiliatomia, edulli-5 simmin 6, 7 tai 8 hiiliatomia; pieniä peptidejä, joissa on 1, 2, 3, 4 tai 5 aminohappoa, edullisesti 2, 3 tai 4 aminohappoa, jotka ovat Trp, Ile, Phe, Pro, Tyr, Leu ja Var, edullisesti Tyr; kolesterolijohdannainen, kuten ko-liinihappo tai ursodesoksikoliinihappo.

10 Näiden hydrofobisten ryhmien tulee olla sidottuja ryhmään, joka voidaan kytkeä ei-hydrofobiseen proteiiniin, kuten karboksyyli-, amino-, disulfidi-, hydroksyyli-, sul-furyyli- ja karbonyyliryhmiin, kuten aldehydiryhmiin.

Hydrofobisiksi kytkentäryhmiksi valitaan etupäässä 15 metaanin, etaanin, propaanin, butaanin, pentaanin, heksaa-nin, heptaanin tai oktaanin karboksyyli-, aldehydi-, amino-, hydroksyyli- ja disulfidijohdannaisia sekä peptidejä, jotka sisältävät Cys:n, Aspin, Glu:n, Lys:n etupäässä ok-tanaalin ja Tyr-Tyr-Tyr-Cys:n, -Aspin tai -Gluin. Hydrofo-20 biset ryhmät, joissa on kytkettävissä oleva ryhmä, täytyy liuottaa veteen esim. edellä mainittujen liuottavien aineiden ja detergenttien tai suolahapon, etikkahapon, jää-etikkahapon, lipeän tai ammoniakin avulla riippuen aineesta, joka tulee liuottaa. Tämän jälkeen pH säädetään neut-25 raalille alueelle aineen saostumatta, jolloin otetaan huomioon, ettei saada pH-arvoa, joka denaturoi proteiinin, johon hydrofobinen ryhmä tulee kytkeä.

Hydrofobisia molekyylejä liitetään ei-hydrofobiseen proteiiniin moolisuhteessa 10il - 0,1:1, etupäässä 1:1.

30 Hydrofobisia ryhmiä, joissa kytkentäryhmä on kar- boksyyliryhmä, voidaan kytkeä proteiineihin vesiliukoisten karbodi-imidien tai kokoonpantujen anhydridien välityksellä. Ensimmäisessä tapauksessa aktivoidaan karboksyyliryhmä pH-arvossa 5 karbodi-imidillä ja sekoitetaan proteiinin 35 kanssa, joka on liuotettu puskuriin, jonka pH on 8 ja jon- l( 19 80600 ka fosfaattipitoisuus on korkea. Viimeksi mainitussa tapauksessa pannaan karboksiyhdiste isobutyylikloroformaatin kanssa trietyyliamiinin läsnäollessa dioksaaniin tai asetoni triiliin ja syntyvä anhydridi lisätään proteiiniin pH-5 arvossa 8 - 9. On myös mahdollista hydratsiinin avulla muuttaa karboksyyliryhmä hydratsidiksi, joka aldehydien ja ketonien kanssa, jotka sijaitsevat proteiinin perjodaa-tilla hapetetuissa sokeriyksiköissä, antaa hydratsonisi-doksia.

10 Aminoryhmät voidaan salpietarihappamuuden avulla alhaisessa lämpötilassa muuttaa diatsoniumsuoloiksi, jotka antavat atsosidoksia Tyr:n, His:n ja Lys:n kanssa.

Hydroksyyliryhmät voidaan muuttaa meripihka-anhyd-ridien avulla hemisukkinaattijohdannaisiksi, jotka voidaan 15 kytkeä karboksyyliryhminä.

Aldehydiryhmät voidaan proteiinin aminoryhmien avulla muuttaa Sohiff in emäkseksi.

Monia kytkentäryhmiä ja -menetelmiä kuvataan julkaisuissa Journal of Immunological Methods, 59 (1983), 20 sivut 129 - 143 ja 289 - 299; Methods in Enzymology, osa 93, sivut 280 - 333, ja Analytical Biochemistry 116, (1981), sivut 402 - 407; jotka tässä yhteydessä liitetään viitteinä.

Näin valmistetut proteiinit ja peptidit, jotka ovat 25 saaneet hydrofobisia ryhmiä, sidotaan kompleksiksi glyko-sidin kanssa, jota kuvataan kohdassa a), jolloin kuitenkin voidaan jättää pois puhdistusvaihe, jossa poistetaan solu-fragmentit.

c) Voidaan myös lähteä hydrofHiisistä proteiineis-30 ta, joiden sisään on suljettu hydrofobisia ryhmiä, ja päästä käsiksi viime mainittuihin denaturoimalla proteiinit miedosti, esimerkiksi alhaisen pH:n avulla, noin pH-arvossa 2,5, 3-M virtsa-aineella tai korkeassa lämpötilassa 70°C:n yläpuolella. Sellaiset proteiinit voivat olla 35 immunoglobuliineja, kuten IgG, IgM, IgA, IgD ja IgE. Im- 20 80 600 munoglobuliineja voidaan käyttää anti-idiotyyppisinä vasta-aineina. Proteiinit puhdistetaan edelleen kuten proteiinit kohdassa b) ja sidotaan sitten kompleksisiksi glyko-sidiin kuten kuvataan kohdassa a), jolloin puhdistusvaihe 5 solufragmenttien poistamiseksi jätetään pois.

Immunogeenikomplekseja voidaan käyttää spesifiseen immuunijärjestelmän stimulointiin ihmisillä ja eläimillä. Niitä voidaan niin muodoin käyttää rokotteena sairauksia vastaan, jotka ovat bakteereiden, mykoplasman, virusten 10 ja parasiittien aiheuttamia, sekä kun tutkimuksen tavoitteena halutaan valmistaa vasta-aineita erilaisten eläin-solujen membraaniproteiineja vastaan.

Voidaan myös käyttää erilaisista bakteereista tai viruksista peräisin olevien amfipaattisten proteiinien tai 15 peptidien seoksia, kun halutaan valmistaa rokote useita tauteja vastaan.

Keksinnön mukaisesti valmistettuja komplekseja voidaan käyttää ihmis- ja eläinlääketieteellisiin koostumuksiin, jotka sisältävät iskomia mahdollisesti yhdessä ta-20 vanomaisten lisä- ja laimennusaineiden kanssa, edullisesti iskomia puskuriliuoksen muodossa esim. sen TN-liuoksessa (kts. esimerkki 1).

Keksintöä kuvataan lähemmin seuraavilla suoritus-esimerkeillä.

25 Koe 1

Vertailu keksinnön mukaisesti Quil A:n kanssa valmistetun membraaniproteiinikompleksin sekä ilman glykosi-dilisäystä valmistettujen, vastaavien membraaniproteiini-solujen immunogeenisen vaikutuksen välillä.

30 25 hiirtä (BALB C, Bonhollgard, Tanska; paino noin 20 g) jaettiin 5 ryhmään ja ryhmät immunisoitiin 2 kertaa kolmen viikon välein pelkästään puskuriliuoksella (PBS), 0,1 pg:lla tai 5 pg:lla kompleksia, joka oli valmistettu käyttämällä influenssasta saatuja membraaniproteiineja 35 sekä Quil A:ta, 100 piissä PBS esimerkin 1 mukaisesti sekä

II

2i 80 600 käyttämällä 5 pg membraaniproteiinimisellejä, joissa ei ole glykosidia ja jotka on valmistettu EPC-hakemuksen 811 022 13.6 mukaan.

Seerumi kerättiin hiiriltä joka viikko kokeen lop-5 puun saakka. Seerumin immuunivaste mitattiin ELISA-tekniikalla (Voller, Bidwell ja Bartlett 1980, Enzymelinkes Immunosorbent Assay, sivut 359 - 371; Manual of Clinical Immunology, American Society for Microbiology, Washington, USA).

10 Tulos esitetään kuvassa 6. Siitä ilmenee, että Quil A:n kanssa valmistettu antigeenikompleksi antaa paremman immuunivasteen kuin vastaavat proteiinimisellit ilman Quil A:n lisäystä. 0,1 pg Quil A:n kanssa valmistettua proteii-nimembraanikompleksia aikaansaa korkeamman immuunivasteen 15 kuin 5 pg proteiinimisellejä, joihin ei ole lisätty glykosidia.

Koe 2

Quil A:n kanssa keksinnön mukaisesti valmistetun membraaniproteiinikompleksin sekä glykosidin kanssa sekoi-20 tettujen vastaavien membraaniproteiinimisellien immunogee-nisen vaikutuksen sekä sivuvaikutusten vertailu niiden toimiessa adjuvanttilisänä.

Kokeessa käytetään 30 marsua, jotka ovat (Valtion eläinlääketieteellisen laitoksen) SVA:n kasvattamia. Ne 25 on jaettu 5 ryhmään, joissa kussakin on 6 eläintä, ja rokotettu influenssaviruksesta (kanta Soivalla) saaduilla proteiinimisellelllä (P) tai samasta influenssaviruksesta peräisin olevalla membraaniproteiinikompleksilla, joka on valmistettu glykosidi Quil A:n (GP) kanssa taulukon 1 mu-30 kaisesti. Esimerkin 2 mukainen valmistus. 6 marsua oli rokottamattomina kontrolleina. GP-kompleksi on vapautettu vapaasta glykosidista sakkaroosigradienttisentrifugoinnin avulla. Tulokset käyvät ilmi taulukosta 1. P-misellit samoin kuin GP-kompleksi antavat vähimmäisreaktioita ja PG-35 kompleksi antaa selvästi korkeampia vasta-ainevasteita 22 80 600 kuin P-misellit. Seos, jossa on 10 pg vapaata glykosidia sekä P-misellejä, saa aikaan lieviä reaktioita, mutta ei mitään adjuvanttivaikutusta. 100 pg:n lisäys vapaata glykosidia antaa voimakkaita paikallisia reaktioita punoituk-5 sen ja turvotuksen muodossa sekä suuremman vasta-ainevas-teen kuin P-misellirokote ilman vapaata Quil Aita.

Taulukko 1

Immuunivaste influenssavirusta vastaan marsun see-10 rumissa hemagglutinaatioinhibitio (HI)-testillä mitattuna kahden, 4 viikon välein suoritetun rokotuskerran jälkeen. Seerumi on otettu 10 päivän kuluttua toisesta rokotuksesta.

P = 1 pg proteiinimiselliä, joka koostuu influenssavirus-15 peplomeereistä (H ja N) P + 10 = 1 pg proteiinimisellejä + 10 pg vapaata glykosidia P + 100 = 1 pg proteiinimisellejä + 100 pg vapaata glykosidia 20 GP = 1 pg proteiinikompleksia, joka on valmistettu glyko-sidin kanssa, joka sisältää < 0,1 pg glykosidia - ei reaktiota + heikko punoitus ++ kohtalainen punoitus 25 +++ voimakas punoitus ja kuolioita HI-tiitteri (2log/l)

P P + 10 P + 100 GP

M ± SD 6 eläintä 7,9±2,3 7,5±1,5 10,3±3,1 9,7±0,6

Paikallinen reaktio - + +++ 30 [(Rokottamattomilla marsuilla tiitterit olivat 2 (6 eläintä)] . 35 23 80600

Koe 3

Membraaniproteiinikomplekseja, jotka oli valmistettu esimerkin 1 mukaisesti ja edelleen puhdistettu sentri-fugoimalla 10 - 40-%:isen sakkaroosigradientin kautta, 5 tutkittiin immunogeenisen vaikutuksen suhteen. Tässä valmisteessa ei ole osoitettavissa olevia määriä vapaata Quil A:ta (< 0,02 paino-%) mitattuna menetelmällä, joka perustuu Quil A:n soluja hajottavaan aktiivisuuteen. Soluja hajottava aktiivisuus tutkittiin härän punaisilla veriso-10 luilla. Verisolut oli valettu agaroosigeeliin 0,05 %:n konsentraationa. Agaroosigeeli asetettiin elektroforeet-tiseen järjestelmään, jossa Quil A liikkuu anodia kohti ja liuottaa verisolut. Liuenneella vyöhykkeellä on raketin muoto ja glykosidin määrä on verrannollinen raketin pituu-15 teen, ja se tehdään näkyväksi Coomasie Brilliant'ilia suoritetun proteiinivärjäyksen avulla. Tämä menetelmä voi määrittää 0,02 % tai sitä suuremman konsentraation glyko-sidia [Sundqvist et ai., Biochemical and Biophysical research communications, osa 114 (1983), sivut 699 - 704]. 20 Sedimentaatioanalyysissä lisäpuhdistetulla materi aalilla on sama sedimentaatiovakio kuin puhdistamattomalla materiaalilla. Elektronimikroskopian avulla havaitaan partikkeleita, joilla on sama morfologia (kts. kuvat 2 ja 3). Hiiren rokotuksen yhteydessä materiaali oli yhtä aktiivis-25 ta kuin puhdistamaton materiaali vasta-aineiden stimuloinnin yhteydessä. Yhdessä kokeessa 1 pg tai 0,1 pg influens-savirusproteiinikompleksin kompleksia, joka oli valmistettu Quil A-lisäyksen kanssa ja puhdistettu kahden gradient-tisentrifugoinnin avulla edellä kuvatulla tavalla, oli 30 yhtä tehokasta kuin vastaava, edelleen puhdistamaton materiaali. Edellä esitetty tulos osoittaa, että kompleksit ovat stabiileja ja tehokkaita lmmunogeenejä ilman, että niissä on osoitettavia määriä vapaata Quil A:ta.

24 80600

Koe 4 3 erilaista rokotetta, joissa oli Hepatitis Bs (HBs) antigeeni, tutkittiin kukin 4 hiirellä käyttäen 5 pg:n annosta HBs-antigeenia. Nämä 3 rokotetta olivat: is-5 komeja, jotka oli valmistettu esimerkin 14 mukaisesti; 22 nm:n suuruisia, eheitä partikkeleita, jotka vastaavat kaupallisesti saatavissa olevaa rokotetta, sekä kokeellista rokotetta, jossa vastaavat HBs-proteiinit ovat misellin muodossa EPC-hakemuksen 811 022 13.6 mukaan valmistettui-10 na. Vasta-ainevaste on arvioitu ELISA-menetelmällä.

Taulukko 2

Hiiren seerumin vasta-ainevaste HBs-antigeenia kohtaan ELISA:11a mitattuna 15

Iskomit_22 nm:n partikkelit_misellit 1,343 0,603 0,569 1,788 0,598 0,240 1,841 0,888 0,273 20 1,884 0,892 ELISA:n ekstinktioarvot on luettu 495 nm:ssä

Taulukosta 2 käy ilmi, että iskomeilla immunisoidut 25 hiiret johtivat merkittävästi suurempiin vasta-ainetiit-tereihin kuin HBs-rokotteet, jotka sisälsivät eheitä, 22 nm:n suurusia partikkeleita tai misellejä.

Koe 5

Patogeenisellä vesikauhukannalla (CVS) aiheutetun 30 koeinfektion avulla hiirellä suoritetussa rokotuskokeessa on tutkittu esimerkin 4 mukaan valmistetut isomeerit, jotka sisältävät vesikauhuvirusten vaippaproteiineja.

il 25 80600

Hiiret rokotettiin kerran taulukon 3 mukaisella annoksella. Hiirille aikaansaatiin koeinfektio 14 päivää myöhemmin hiirelle patogeenisen CVS-kannan avulla käyttäen annosta, jonka suuruus oli 40 kertaa LDS0.

5

Taulukko 3

Rokotusannos (pg) Elävien/kuolleiden eläinten lukumäärä iO - 4,2 18/19 0,84 15/18 0,17 10/20 0/20 15

Taulukosta käy ilmi, että iskomirokote saa aikaan suojaavan immuniteetin.

Keksinnön mukaisesti valmistettuja uusia antigeeni-komplekseja voidaan varastoida lyofilisoituina valmisteina 20 tai vesisuspensioina. Annostelua varten ne ovat sopivasti jossain liuottimessa, kuten esim. fysiologisessa keitto-suolaliuoksessa. Etupäässä käytetään 0,1 M NaCl-lluosta (pH 7,2-7,6); pH-arvo säädetään 0,05 M Tris-HCl:lla. Muita puskureita voidaan kuitenkin myös käyttää.

25 Uusilla proteiinikomplekseilla on voimakkaampi im- munogeeninen vaikutus (noin 10-kertainen tai usein suurempi) kuin proteiinimiselleillä, joita ei ole valmistettu glykosidin kanssa ja joita ei ole sekoitettu minkään ad-juvantin kanssa. Jos vastaavien proteiinimisellien tulee 30 saada samat immunogeeniset vaikutukset samalla proteiini-annoksella, ne täytyy sekoittaa sellaisen glykosidin tai muun adjuvantin määrän kanssa, etteivät sivuvaikutukset tule liian suuriksi.

26 80 600

Keksinnön mukaisesti valmistettua proteiinikompleksia ei tarvitse sekoittaa minkään adjuvantin kanssa ja sillä tavalla vähennetään sivuvaikutuksia. Uudet kompleksit ovat edelleen stabiileja erotuksena liposomeihin si-5 dottuihin antigeenisiin proteiineihin nähden.

Koe 6 5 mg:aan Mycoplasma gallisepticum liuotettuna 5 ml:aan TN-puskuria (pH 7,4) lisättiin 10 mg MEga-10. Seos inkuboitiin yön yli huoneen lämpötilassa jatkuvasti se-10 koittaen. Tämän jälkeen näytteeseen lisättiin 5 mg Quil A:ta ja seos dialysoitiin vaihtaen nestettä useasti TN-puskuria vastaan (huoneen lämpötilassa 12 tunnin ajan ja sitten +4°C:ssa). Lopetetun dialyysin jälkeen eristetään iskomeja, jotka sisältävät membraaniantigeeneja, ajamalla 15 pohjaan solujätteet ultrasentrifugoinnin jälkeen.

EM-tutkimus osoittaa, että näytteessä on iskomeja.

Immuunivasteen osoittamiseksi M. gallisepticum'ia vastaan käytettiin 2 kananpoikaryhmää. Kumpikin ryhmä käsitti 10 eläintä, jotka kokeen alussa olivat 5 viikon 20 ikäisiä ja joiden keskipaino oli 480 g. Ensimmäinen ryhmä inokuloitiin ihonalaisesti iskomeilla, jotka sisälsivät 20 pg proteiinia, ja toinen ryhmä jätettiin käsittelemättä kontrolliryhmäksi. 14 päivää myöhemmin kaikki kananpoika-set infektoitiin M. gallisepticum'illa oikeaan ilmapussiin 25 0,1 ml:11a 2 x 107 cfu siirrostetta kohti. 6 päivän kulut tua kananpoikaset lopetettiin ja tutkittiin patologisesti ilmapussin vaurioita etsien.

Iskomirokotteella inokuloidussa ryhmässä vauroitu-misindeksi pieneni merkittävästi kontrolliryhmän indeksiin 30 verrattuna.

Yhteenveto: Iskomirokote aikaansai suojaavan immuniteetin kokeellista infektiota vastaan, ja aikaansai merkitseviä HI-tiittereitä M. gallisepticum'ia vastaan.

Il 27 80600

Ryhmä Rokote Vaurioitu- 2xt-testi HI-tiitteri t-testiPC misindeksi 1 iskomi 9 0,001 758 0,01 5 2 kontrolli 27 - 13 -

Esimerkki 1

Parainfluenssa-3-virus U 23, eristetty Uumajassa, 10 Ruotsissa, puhdistetaan sentrifugoimalla 30 paino-%risen sakkaroosin lävitse 100 000 g, tunnin ajan 4°C:ssa. Pohjaan laskeutunut erä liuotetaan noin 10 mg/ml:n konsent-raatioon 0,05 Tris-HCl:ssa (pH 7,4) ja 0,1 M NaCl:ssa (TN). 1 - 5 mg/ml PI-3-virusta, joka on samassa puskurissa 15 (TN), liuotetaan 2 paino-%:iin (loppukonsentraatio) Triton X-100 yhdessä 3H-merkatun viruksen kanssa, jota käytetään noin 105 pulssia/minuutti [A. Luukkonen, C. Gamberg ja E. Renkonen (1979), Virology 76, sivut 55 - 59; joka sisällytetään viitteenä]. Noin 200 μ1:η suuruinen näytetilavuus 20 kerrostettiin 300 μ1:η päälle 15-%:ista sakkaroosia, joka sisälsi 1 % Triton X-100 TN:ssä, sekä 12 ml:n päälle 20-50-paino-%:ista sakkaroosigradienttia TN:ssä, joka sisälsi 0,2 paino-% Quil A:ta. Sentrifugointi suoritettiin 250 000 g:llä 22 tunnin ajan 20°C:ssa. Sentrifugoinnin 25 jälkeen koottiin 500 μ1:η suuruiset jakeet alhaaltapäin ja näytteet (20 - 50 μΐ) mitattiin radioaktiivisuuden suhteen. Radioaktiiviset proteiini jakeet yhdistettiin ja dia-lysoitiin 0,005 M Tris-HCl, 0,01 M NaCl (pH 7,4) vastaan, annosteltiin 10 ml:n suuruisiin pulloihin ja väkevöitiin 30 lyofilisoimalla 18 tunnin ajan Edward'in pakastuskuivaus-laitteessa.

Tämän valmisteen sedimentaatiovakio on 24 S. Kompleksin lisäpuhdistus suoritettiin sentrifugoimalla kompleksi 10 - 40 paino-%:isen sakkaroosigradientin läpi.

28 80 600

Esimerkki 2

Esimerkin 1 mukainen menetelmä toistettiin, mutta käytettiin hevosen influenssavirusta (Soivalla; eristetty Solvallassa, Tukholma, Ruotsi). Koe toistettiin lisäämättä 5 glykosidia (ts. periaatteessa EPD-hakemuksen 811 022 13.6 mukaisesti), ja näin saadut proteiinikompleksit sekä gly-kosidin kanssa valmistettu proteiinikompleksi käytettiin sedimentaatio-gradienttisentrifugointiin, joka suoritettiin 10 - 40 paino-%:isen sokeriliuoksen läpi 280 000 10 gtssä 4 tunnin ajan +4°C;ssa.

Tulos käy ilmi kuvasta 1, joka esittää myös standardina toimineen tyroglobuliinin sedimentaatiovakion (nuolella merkitty, 19 S). Käy ilmi, että proteiinimisel-lien sedimentaatiovakio on 30 S ja glykosidiproteiinimi-15 selleille se on 19 S. (Virusglykoproteiini leimattiin ga-laktosi-oksidaasi-3 H-boorihydridi-menetelmällä.)

Esimerkki 3

Esimerkin 1 mukainen menetelmä toistettiin käyttämällä tuhkarokkovirusta parainfluenssa-3-viruksen tilalla. 20 Saadaan kompleksi, jolla elektronimikroskopian perusteella oli luonteenomainen rakenne, kuten käy ilmi kuvasta 2.

Esimerkki 4

Rabiesvirus, valmistettu RIV, Bilthoven'issa menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Van Wezel et ai.; Develop. 25 Biol. Standard (1978), 41, sivuilla 159 - 158; konsentroitiin 2 mg/ml:ksi TN:ssä. 1 mg virusta liuotettiin 100 mM kanssa oktyyli-8-D-glykosidia ja sitä inkuboitiin 45 minuutin ajan 20°C:ssa. Näyte kerrostettiin 50 paino-%:isen sokeriliuoksen päälle ja sentrifugoitiin 250 000 g:llä 45 30 minuutin ajan +4°C:ssa. Sentrifugaatti otettiin talteen ja lisättiin Quil A:ta 0,2 paino-%:iin saakka.

Näyte suljettiin selluloosaletkuun ja dialysoitiin +20°C:ssa 0,15 M ammoniumasetaattipuskuria vastaan 1 000 ml;n tilavuudessa, puskuri vaihdettiin 3 kertaa 72 tunnin 35 aikana; jona aikana sekoitettiin jatkuvasti. Dialysoitu

II

29 80 600 aine sisältää rabiesvirus-kompleksia. Osa materiaalista puhdistettiin edelleen sentrifugoimalla 10 - 40 paino-%:isen sokeriliuoksen läpi 280 000 g:llä 4 tunnin ajan +4° C:ssa.

5 Elektronimikroskopiassa saadaan rakenne, joka käy ilmi kuvasta 3.

Esimerkki 5

Esimerkin 4 mukainen menetelmä toistettiin tuhkarokkoviruksen avulla. Saadulla kompleksilla oli sama ra-10 kenne kuin esimerkin 3 mukaan valmistetulla kompleksilla.

Esimerkki 6

Parainfluenssa-3-virus (U 23) puhdistettiin sakka-roosigradienttisentrifugoinnin avulla ja näin saatu puhdistettu virus liuotettiin 10 mg/ml:n konsentraationa 15 0,02 M barbitonipuskuriin (pH 8,0), jossa oli 0,24 M glu koosia (BG), 1-5 mg/ml PI-3-virusta, joka oli BG-pusku-rissa, liuotettiin 2 %:n kanssa Triton X-100 sekä noin 105 3 H pulssia/minuutti leimattua virusta [Luukkonen et. ai., 1977) viitteen mukaisesti] BG-puskurissa. 1 ml:n koetila-20 vuus kerrostettiin l-%:iselle agaroosigeelille, joka sisälsi 0,02 M barbituraattipuskuria (pH 8,0), sekä 0,02 paino-% Quil A:ta. Agaroosigeeli oli suljettuna putkeen, jonka pinta-ala oli 85 mm2 ja korkeus oli 25 mm. Putken ylä- ja alaosa liitettiin kumpikin 0,02 M barbituraatti-25 puskuriin (pH 8,0). Yläastiaan kytkettiin negatiivinen elektrodi. Elektroforeesi suoritettiin 5V/cm:llä 4 tunnin ajan. Näytteet kerättiin geelin anodipuolelle ja mitattiin radioaktiivisuuden suhteen. Näyte dialysoitiin 0,15 M am-moniumasetaattia vastaan (pH 7,0) ja väkevöitiin lyofili-30 soimalla.

Tämän valmisteen sedimentaatiovakio on noin 20 S samalla tavalla mitattuna kuin esimerkissä 2.

Kompleksin lisäpuhdistus suoritettiin sentrifugoimalla kompleksi 10 - 40 paino-%:isen sakkaroosigradientin 35 lävitse.

30 80600

Esimerkki 7

Toxoplasma gondii (saatu Tage Waller'ilta, Valtion eläinlääketieteellinen laitos) puhdistettiin suodattamalla pumpulin läpi ja sentrifugoimalla 30 paino-%:isen sakka-5 roosin kautta 100 000 g:llä 20 minuutin ajan 4°C:ssa. Puhdistettu valmiste liuotettiin 5 mg/ml:n konsentraatioon 0,05 M Tris-HCl:iin (pH 7,4), joka oli 0,1 M NaCl:n suhteen (TN).

1 mg Toxoplasma gondii'ta liuotettiin 5-%:iseen 10 oktyyli^-D-glykosidiin ja 5-%:iseen saponiiniin seuraavan julkaisun mukaisesti: "An investication of the antigenic structure of Toxoplasma gondii". Parasite Immulogy 1981, 3, sivut 235 - 248; yhdessä 3 H:11a merkatun toksoplasman kanssa, noin 105 pulssia/minuutti (Luukkonen et ai., 1977) 15 TN-puskurissa. Noin 200 μ1:η näytetilavuus kerrostettiin 300 μ1:η päälle 15-%:ista sakkaroosia, joka sisälsi 1 % Triton X-100 TN:ssä, sekä 12 ml:n päälle sakkaroosigra-dienttia, jossa oli 20 - 50 paino-% sakkaroosia ja 0,2 paino-% Quil A:ta TN:ssä. Sentrifugointi suoritettiin 20 250 000 g:llä 20°C:ssa noin 18 tunnin ajan. Sentrifugoin- nin jälkeen gradientti jaettiin 500 μ1:η jakeisiin ja 20 - 50 μ1:η suuruiset näytteet mitattiin radioaktiivisuuden suhteen. Voitiin havaita kaksi erilaista radioaktiivista huippua. Eri huippujen jakeet, kunkin huipun erikseen, 25 yhdistettiin, dialysoitiin ja konsentroitiin pakastuskui-vauksen avulla esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Quil A:n kanssa muodostuneella kompleksilla oli alhaisempi sedimen-taatiovakio kuin samasta parasiitistä valmistetuilla pro-teiinimiselleillä.

30 Esimerkki 8 E. coli-bakteereita, joissa oli plasmidi pill K88, ravistettiin mekaanisesti ja saostettiin 3 kertaa iso-elektrisessä pisteessä. Sen jälkeen materiaalia käsiteltiin samalla tavalla kuin on kuvattu esimerkissä 1. Saa-

II

3i 80600 tlin kompleksi, jolla oli luonteenomainen rakenne, kuten esitetään kuvissa 2 ja 3.

Esimerkki 9

Toistettiin esimerkin 8 mukainen menettely salmo-5 nellalla, jossa on huokosproteiinl. Saadaan kompleksi, jolla on tunnusomainen rakenne, joka esitetään kuvissa 2 ja 3.

Esimerkki 10

Kissan munuaisten epiteelisoluja, jotka oli infek-10 toitu kissan leukemiaviruksella, käsiteltiin esimerkin 1 menetelmän mukaisesti. Saatiin kompleksi, jolla oli tunnusomainen rakenne, joka käy ilmi kuvista 2 ja 3.

Esimerkki 11

Munuaisen epiteelisoluja, joita on transformoitu 15 härän leukemiaviruksella, käsiteltiin esimerkin 1 menetelmän mukaisesti. Saatiin kompleksi, jolla oli luonteenomainen rakenne, joka käy ilmi kuvista 2 ja 3.

Esimerkki 12

Parainfluenssa-3-virus U 23 puhdistettiin ja prote-20 iinikompleksi valmistettiin esimerkissä 1 esitetyn menetelmän mukaisesti, sillä erotuksella, että sakkaroosigra-dientti TN:ssä, jossa oli 20 - 50 paino-% sakkaroosia, sisältää muun saponiinin kuin Quil A.

Tutkittiin 2 kaupallisesti saatavaa saponiinia, 25 nimittäin Merck "Weiss", rein 514 0023 sekä Se. Lickardt "S", Schuchart, Mtlnchen. (Saponiinit ovat puhtaita. Valmistaja ei ilmoita tuotteen laatua. Ne eroavat ohutlevy-kromatografiassa Quil A:sta).

Saadaan kompleksi, jonka sedimentaatiovakio on 24 30 S ja joka osoittaa samaa rakennetta kuin esimerkin 3 mukaan valmistettu kompleksi.

Esimerkki 13a

Tuhkarokkovirus (RIV, Bilthoven) liuotettiin esimerkin 3 mukaisesti. Virus-liuotusaineseosta sentrifugoi-35 tiin 2 tuntia 1 000 g:llä. Saatu supernatantti dialysoi- 32 80600 tiin pienen suolapitoisuuden omaavaa fosfaattipuskuria vastaan (10 mM fosfaattia, 50 mM NaCl, pH 7,2) ja siirrettiin DEAE-Sefaros-anioninvaihtajaan, joka oli tasapainotettu 10 mM fosfaattipuskurilla (pH 7,2), jossa oli 50 mM 5 NaCl ja 0,05 % Triton X-100. Absorboimaton materiaali pestiin pois samalla puskurilla. Pylväs tasapainotettiin sen jälkeen 10 mM fosfaattipuskurilla, joka sisälsi 50 mM NaCl ja 0,1 % Quil A:ta. Absorboitu aines eluoitiin samalla puskurilla, joka sisälsi 300 mM NaCl.

10 Eluoitu aines sisälsi kompleksin, jonka luonteen omainen rakenne ilmenee kuvasta 2.

Esimerkki 13 5 mg esimerkin 3 mukaista tuhkarokkovirusta pantiin DEAE-selluloosatyyppiseen anioninvaihtajaan. Ioninvaihtaja 15 säilytettiin 20 ml:n pylväässä, ja se tasapainotettiin 0,01 m fosfaattipuskurilla (pH 7,2), jossa oli 0,5 pai- no-% oktyyli-p-D-glykosidia. Näytemateriaali pantiin io- ninvaihtajaan, ja adsorboitumaton materiaali pestiin pois huuhtomalla 5 pylvään tilavuudella 0,01 M fosfaattipusku- 20 ria (pH 7,2), jossa oli 0,5 paino-% oktyyli-p-D-glykosi- % dia, jonka jälkeen adsorboitunut materiaali eluoitiin lisäämällä pylvääseen suolagradientti, joka oli 0 - 0,5 M NaCl liuotettuna 0,01 M fosfaattiin (pH 7,2), jossa oli 0,5 paino-% oktyyli-p-D-glykosidia. Jakeet, joista iden-25 tifioitiin tuhkarokkomembraaniproteiini, koottiin yhteen ja niihin lisättiin 0,1 paino-% Quil A:ta ja ne dialysoi-tiin 0,05 M ammoniumasetaattia (pH 7,0) vastaan. Saatiin kompleksi, jolla oli luonteenomainen rakenne, kuten käy ilmi kuvista 2 ja 3.

30 Esimerkki 14 22 nm:n suuruisia Hepatiitti B-viruspartikkeleita, jotka oli saatu London School of Tropical Medicine and Hygien'istä (Englanti), liuotettiin uudelleen 1 mg/ml:n konsentraationa TN:iin. 0,3 mg proteiinia, jonka partik-

II

33 80600 kelikoko oli 22 nm, liuotettiin 2 tilavuus-%:11a Triton X-100, 0,5 M NaCl, ja inkuboitiin 16 tunnin ajan +37°C:ssa. Yhä edelleen toistetaan esimerkin 1 mukaista menetelmää.

5 Saadun kompleksin sedimentaatiovakio oli 20 S.

Saadulla kompleksilla oli elektronimikroskooppisessa tutkimuksessa rakenne, joka käy ilmi kuvasta 4. Tämä rakenne poikkeaa kuvassa 2 esitetystä rakenteesta siinä suhteessa, että se koostuu tämän rakenteen osista.

10 Esimerkki 15 3 mg härän ripulivirusta (diarrövirus, BDV) TN:ssä liuotettiin lisäämällä Triton X-100 1 tilavuus-%:iin saakka. Seosta sekoitettiin 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Näin liuotettu virus pantiin lektiinipylvääseen, joka 15 koostui lektiini Lentilistä, joka oli kytketty Sepharose 4B:hen (Pharmacia, Uppsala). Pylväs tasapainotettiin TN:llä ja sen jälkeen kun virusmateriaali oli viety pylvääseen, se pestiin 5 pylvään tilavuudella TN, joka sisältää 0,1 tilavuus-% Triton X-100, sekä sen jälkeen 10 pyl-20 vään tilavuudella TN. Viruksen vaippaproteiinit vapautetaan adsorptiosta siten, että kolonniin viedään eluointi-puskuria, joka koostuu 0,2 M metyyli-a-D-mannosidista ja 0,5 paino-%:sta oktyyli-p-D-glykosidia TN:aan liuotettuna. Jakeet, jotka sisältävät viruksen vaippaproteiineja, koo-25 taan ja niihin lisätään Quil Asta 0,1 paino-%:iin saakka. Seosta dialysoidaan 0,05 M ammoniumasetaattia (pH 7,0) vastaan -t-4°C:ssa 3 vuorokauden ajan vaihtaen 1 litran suuruista puskurin määrää 3 kertaa.

Lopputuote lyofilisoidaan ja elektronimikroskopian 30 avulla nähdään (kompleksi) rakenteita, joita kompleksin osat muodostavat kuvana 4. Tämän valmisteen sedimentaatiovakio on 20 S.

34 8 0 6 0 0

Esimerkki 16

Puhdistettu, tapettu poliovirus, valmistettu RIV, Bilthoven'issa menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Van We-zel et ai. [Develop. Biol. Standard (1978), 41, sivut 159 5 - 168], liuotettiin sopivaan puskuriin, esim. TN, joka sisälsi liuottavan aineen, esim. 2 % SDS (natriumdodekyy-lisulfaatti), inkuboimalla 37°C:ssa 2 tunnin ajan. Virus-kapsidiproteiinit erotettiin elektroforeettisesti prepara-tiivisessa 10-%:isessa polyakryyliamidigeelissä, joka si-10 sälsi 0,1 % SDS. Proteiinien sijainti geelissä selvitettiin, minkä jälkeen geelistä leikattiin sopivia vyöhykkeitä, ja proteiinit eluoitiin elektroforeettisesti. VP3, jonka molekyylipaino on noin 26 kilodaltöniä, on eräs kap-sidiproteiini. VP3-pitoiseen liuokseen lisättiin Triton 15 X-100 2 %:n loppukonsentraatioksi. Seos käytettiin prote iinikompleksin (iskomin) valmistamiseen esimerkin 1 mukaisella sentrifugointimenetelmällä.

Elektronimikroskooppisessa tutkimuksessa ilmeni valmisteen luonteenomainen rakenne, joka käy ilmi kuvasta 20 3.

Esimerkki 17

Puhdistettu, tapettu poliovirus, valmistettiin RIV Bilthoven'issa, liuotettiin 67 tilavuus-%:iseen etikkahap-poon, joka sisälsi 0,1 M MgCl2. Tämän jälkeen virusmate-25 riaalia ultrasentrifugoitiin 1 tunnin ajan 100 000 g:llä, ja supernatantti, joka sisälsi yksinomaan virusproteiine-ja otettiin talteen ja dialysoitiin siten, että läsnä oli 0,1 paino-% Quil A:ta, 0,01 M Tris, 0,14 M NaCl (pH 7,4) vastaan.

30 Saadulla kompleksilla oli sama rakenne kuin esimer- kin 3 mukaan valmistetulla kompleksilla.

11 • » s5 80600

Esimerkki 18

Neisseria meningitidiksen ulompia membraaniproteii-neja saatiin jäähdytyskuivattuina National Institute of Health'ista (Hollanti) ja ne liuotettiin TN:ään, joka si-5 sälsi 2 paino-% oktyyli-p-D-glykosidia ja 0,1 paino-% Quil A:ta, ja sitä käsiteltiin samalla tavalla kuin esimerkissä 4. Saatiin kompleksi, Jonka sedimentaatiovakio oli 20 S mitattuna samalla tavalla kuin esimerkissä 2.

Esimerkki 19 10 Hydrofobisia aminohappoja sisältävä peptidi.

Suu- ja sorkkatautipeptidi 144 - 159 0 Kaufbenren.

Käytettiin VP1, joka oli syntetisoitu 0, 1, 2, 3 tai vastaavasti 4 tyrosiinin avulla, yhdistämällä ne toisesta päästään (kaupallisesti saatu). Peptidi liuotetaan 15 vähimmäismäärään 67 tilavuus-%:ista etikkahappoa, neutraloidaan 25-%:isella ammoniakilla ja sekoitetaan 0,5 M am-moniumasetaattiin tislatun veden kanssa (detergenttiä 2 %:n lopulliseen konsentraatioon saakka). Lisätään 0,1 % glykosidia ja seosta dialysoidaan 0,05 M ammoniumasetaat-20 tia (pH 7,0) vastaan (dialyysiletku Spectra Por 6 MWCO 1 000).

Hiiriä rokotettiin kaksi kertaa 50 pg:lla 2 viikon välein.

25 Peptidi/tyrosiinien ELISA-arvo (vasta-aineita) lukumäärä toinen näyte 0 0,005 1 0,217 30 2 0,311 3 0,347 4 0,346

36 8 O 6 O O

Kompleksin muodostuminen voidaan osoittaa elektronimikroskoopin avulla (kts. kuva 5), jossa nähdään pallomainen, elektronitiheä partikkeli, jonka pituus on 20 - 40 nm ja leveys on 10 nm. Nähtävissä on myös poikkeavia koko- 5 ja.

Kuvassa 5a näkyy elektronimikroskooppikuva peptidistä, joka on kytketty kolmeen tyrosiiniin ja kuvassa 5b on elektronimikroskooppikuva peptidistä, joka on kytketty neljään tyrosiiniin.

10 Esimerkki 20

Hiiren IgG, joka on puhdistettu tunnetuin menetelmin [M. Van der Branden, J. L. de Coen, L. Kanarek ja Ruyshaert; Molecular Immunology 18, (1981), sivut 621 -637] tai se on rikastettu ammoniumsulfaattiliuoksen avulla 15 [J. E. Conradie, M. Govender ja L. Visser; Journal of Im munological Methods, osa 59 (1983), sivut 289 - 299; julkaisut sisällytetään viitteinä]; ja dialysoidaan kylmä-huoneessa yön yli 1 litraa vastaan 0,15 M fosfaattisit-raattia (PC), joka on puskuroitu pH-arvoon 2. Tämän jäl-20 keen lisätään 2 % detergenttiä (esim. oktyyli-p-D-glykosi-dia). Jos käytetään detergenttiä, jolla on alhainen kriittinen misellaarinen konsentraatio (CMC), täytyy detergen-tin vaihdon tapahtua ennen kuin dialyysi alkaa. Seos dialysoidaan PC:tä vastaan pH-arvossa 7. Tunnin kuluttia li-25 sätään Quil A:ta, kunnes saadaan 0,05 5:n loppukonsentraa-tio, ja dialyysiä jatketaan PC:tä vastaan ja pH-arvossa 7 yhden vuorokauden ajan kylmähuoneessa.

Kompleksin muodostuminen osoitetaan sentrifugoimal-la 5 - 30-%:isen sakkaroosigradientin kautta 3,3 tunnin 30 ajan 40 000 kierroksella minuutissa Beckman SW-60 roottorissa. Kompleksi havaitaan gradientilla ELISA-tekniikan avulla.

Claims (5)

37 80600

1. Menetelmä immunogeenisen kompleksin, joka sisältää antigeenisiä proteiineja tai peptidejä, joissa on hyd-5 rofobisia alueita, jolla kompleksilla on avoin pallomainen rakenne, jonka muodostavat pyöreät alayksiköt tai pallomaisen rakenteen osat, ja jolla kompleksilla yleensä on alempi sedimentaatiovakio kuin vastaavilla miselleillä ja suurempi sedimentaatiovakio kuin proteiinin tai peptidin 10 vastaavalla monomeerisellä muodolla, valmistamiseksi am-fipaattisista proteiineista tai peptideistä tai niitä sisältävistä viruksista, mykoplasmoista, parasiiteistä tai eläinsoluista, tunnettu siitä, että sekoitetaan vähintään yksi edellä mainituista komponenteista vähintään 15 yhden liuottavan aineen kanssa, jolloin komplekseja muodostuu amfipaattisten antigeenisten proteiinien tai peptidien ja liuottavan aineen välillä, minkä jälkeen amfi-paattiset antigeeniset proteiinit tai peptidit erotetaan liuottavasta aineesta, liuottavan aineen läsnäollessa tai 20 erotettuna liuottavasta aineesta, ja ne siirretään suoraan liuokseen, jossa on vähintään yksi triterpeenisaponiini, jossa on hydrofobisia ja hydrofiilisiä alueita pitoisuudessa, joka on vähintään kriittinen misellipitoisuus (CMC).

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään triterpeenisaponii-neja, jotka on valittu ryhmästä, johon kuuluu Quillaja saponaria Molina.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että käytetään peptidejä, jotka on valittu ryhmästä, joka käsittää amfipaattiset peptidit ja ei-hydrofobiset peptidit, jolloin ei-hydrofobiset peptidit on tehty hydrofobisiksi liittämällä hydrofobisia ryhmiä, tai amfipaattiset peptidit, jotka sisältävät saa- 38 80 600 vuttamattornissa olevia hydrofobisia ryhmiä, jotka on tehty tavoitettaviksi miedon denaturoinnin avulla.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään membraaniproteiine- 5 ja, jotka on valittu ryhmästä, johon kuuluu Orthomyxoviri-dae, Paramyxoviridae, Retroviridae, Rhabdoviridae, Togavi-ridae, Herpesviridae, hepatiitti-B-virus, toksoplasman membraaniproteiinit ja Picornaviridae.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä immuno-10 geenisen kompleksin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että käytetään liuosta, joka sisältää liuottavaa ainetta ja sokeria, jolloin sokerin konsentraatio ei ole suurempi kuin konsentraatio triterpeenisaponiinipitoisen sokerigradientin ylemmässä osassa, ja liuottavan aineen 15 konsentraatio pidetään 0,25 - 3 paino-%:ina. 20 25 30 35 tl 39 80 600