CN107648600A - 链球菌组合疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及链球菌组合疫苗。具体地,本发明涉及用于保护鱼不受链球菌感染的组合疫苗,链球菌用于制造此类疫苗的用途,用于制备此类组合疫苗和包含此类疫苗的各部分组成的试剂盒的方法。
Description
本申请是申请日为2010年10月8日的中国专利申请201080047156.5“链球菌组合疫苗”的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于保护鱼不受链球菌感染的组合疫苗,链球菌用于制造此类疫苗的用途,用于制备此类组合疫苗的方法和包含此类疫苗的各部分组成的试剂盒(kit-of-parts)。
背景技术
经过过去数十年,全世界范围可见鱼类消耗的大量增加。这是关于冷水鱼例如鲑鱼、比目鱼、大比目鱼和鳕鱼,以及热带鱼例如亚洲海鲈、罗非鱼、遮目鱼、黄尾鱼、琥珀鱼、石斑鱼和军曹鱼的情况。因此,已见养鱼场的数目和大小的增加,以便满足渐增的市场需要。
如由例如畜牧业已知的,紧密生活在一起的大量动物易受各种各样的疾病影响,甚至是几乎不知道或没见过的疾病,或甚至是在大规模商业养殖前未知的疾病。这对于鱼类养殖同样是真实的。
众人皆知的商业上重要的鱼病原体的例子是鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subspecies piscicida)、海洋屈挠杆菌(Tenacibaculum maritimum)、黄杆菌属物种(Flavobacterium sp.)、屈挠杆菌属物种(Flexibacter sp.)、链球菌属物种(Streptococcus sp.)、格氏乳球菌(Lactococcus garviae)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鲶鱼爱德华氏菌(E. ictaluri)、病毒性坏死病毒、虹彩病毒和锦鲤疱疹病毒。
细菌链球菌属的几个物种目前已知在鱼中更具体而言在水产业中饲养的鱼中引起感染。此类链球菌属物种的例子是海豚链球菌(Streptococcus iniae)、难辨链球菌(S. difficile)、无乳链球菌(S. agalactiae)、停乳链球菌(S. dysgalactiae)和海豹链球菌(S. phocae)。
近来在关于难辨链球菌和无乳链球菌的正确命名法的意见中已存在某些变化。Vandamme等人(Int. J. Syst. Bacteriology 47:81-85(1995))已建议难辨链球菌事实上是非溶血性无乳链球菌。
海豚链球菌在罗非鱼、虹鳟、欧洲海鲈和鳊、亚洲海鲈、眼斑拟石首鱼、河豚、牙鲆、黄尾鱼和杂交柳鲈中频繁发现。海豚链球菌感染对水产业的影响每年超过100,000,000美元。
难辨链球菌在罗非鱼、鲷鱼和甚至鳐鱼中频繁发现。
尽管在许多鱼物种中发现,但无乳链球菌目前主要发现感染罗非鱼。
用于对抗鱼中的链球菌感染的疫苗是本领域已知的。
许多链球菌疫苗基于被杀死的全细胞。无乳链球菌疫苗例如在美国专利申请US2005/0208077中描述。海豚链球菌疫苗例如在美国专利US 6,379,677中描述。用于对抗海豚链球菌感染的疫苗也是商购可得的。例子是Norvax Strep Si,针对海豚链球菌感染且由Intervet Int. B.V. 销售的疫苗。Eldar等人(Vaccine 13:867-870(1995))已描述了基于被杀死的全细胞针对难辨链球菌的疫苗。
为了改善在热带鱼中更具体而言在罗非鱼中的链球菌疾病的了解,本发明人已在亚洲和拉丁美洲中的主要罗非鱼生产国家中J进行了广泛流行病学调查。经过过去8年,这些研究已获得从13个国家中约50个场所回收的几乎500个链球菌分离物。使用标准生物化学和细菌学鉴定法已鉴定了分离物,并且随后通过聚类(cluster)分析进行分析(基于差异百分比的未加权对组平均值)。有趣的是,从罗非鱼中回收的几乎500个链球菌分离物中,82%鉴定为无乳链球菌,并且18%鉴定为海豚链球菌。
海豚链球菌是在热带和亚热带地区中的许多海洋和淡水培养的鱼物种中引起疾病和死亡率的重要鱼病原体。在多种鱼物种包括罗非鱼中对抗海豚链球菌感染的疫苗是可获得的,并且存在关于这种生物在多种鱼物种中的致病机理的大量文献。
对于鱼致病性无乳链球菌可获得少得多的信息。
无乳链球菌是所谓的B组链球菌(GBS)。它是人和动物的重要病原体。尽管与人和牛宿主中的疾病通常更相关,但鱼致病性无乳链球菌早至1966年已得到证明,当时非溶血性B组链球菌鉴定为金体美洲鳊鱼(美洲鳊鱼(Notemigonus crysoleucas))中的2种动物流行病的原因。
今天,随着水产业的加强,无乳链球菌已知是海产和淡水培养物种且特别是罗非鱼中的死亡率和发病率的重要原因。如通过本发明人发现的,罗非鱼无乳链球菌分离物的详细分析表明在多种生物化学和表型特征中不同的2个独特簇的存在。这些独特簇称为生物型,并且在这个基础上,可以在‘经典’无乳链球菌(下文称为无乳链球菌生物型1)和一般地非β溶血性无乳链球菌(下文称为无乳链球菌生物型2)之间做出区分。这后一种菌株先前鉴定为难辨链球菌(S. difficile/S. difficilis),但随后已重新分类为无乳链球菌的非-β-溶血性变体。
在养殖的罗非鱼中的无乳链球菌感染目前已知导致显著发病率、死亡率和经济损失。无乳链球菌的感染导致多种内脏器官特别是脑的败血病和建群(colonization),导致临床症状。无乳链球菌感染的临床体征包括异常游泳、‘C’形体位和食欲不振。无乳链球菌在温带和热带地区各处流行,并且本发明人已从在欧洲、中美洲和拉丁美洲和亚洲各处的患病罗非鱼中回收到它。
2个无乳链球菌生物型引起细微不同的疾病综合征,其中生物型1感染从幼年到成年的生产周期各处的鱼,而生物学2占优势地在较大的鱼中引起疾病。
在迄今为止本发明人的流行病学调查中,对于来自13个国家的几乎500个链球菌分离物,罗非鱼的所有链球菌分离物中的大多数是无乳链球菌生物型2。本发明人已在来自主要罗非鱼生产国家的大多数的患病鱼中鉴定了无乳链球菌生物型2,所述国家包括印度尼西亚、中国、越南、菲律宾、厄瓜多尔、洪都拉斯、墨西哥和巴西。
从鱼中分离的生物型1菌株的分析揭示存在2个血清型:血清型Ia菌株和血清型III菌株(Suanyuk,N.等人,Aquaculture 284:35-40(2008))。
然而,2个菌株共有使得其成为生物型1菌株的相同生物化学特征,并且它们都是溶血性的。
最重要的是,2个菌株含有编码表面结合的α-C蛋白质的基因(bca)。对于这种蛋白质,在1991年已广泛显示它诱导针对无乳链球菌的保护性免疫(Michel,J.L.等人,Inf. &Immun. 59:2023-2028(1991))。
甚至产生了针对B组链球菌中的特异性保护性α-C蛋白质表位的单克隆抗体,其能够杀死B组链球菌(Madoff,L.C.等人,Inf. & Immun. 59:204-210(1991))。
α-C蛋白质通常在无乳链球菌血清型Ia菌株中发现,但在人无乳链球菌血清型III菌株的表面上不常见。然而,结果是它通常存在于迄今为止分离的所有鱼病原性无乳链球菌血清型III菌株的表面上。
因此,可以确实地得出结论基于例如Mullet分离物Ia血清型的血清型的现有全细胞疫苗,能够诱导针对已知的无乳链球菌血清型Ia菌株和近期以来发现的无乳链球菌血清型III菌株的保护性免疫应答。
发明内容
目前令人惊讶地发现,尽管其具有相关的(joined)生物型、具有相关的β-溶血性特征和具有相关的表面结合的α-C蛋白质,但基于已知Mullet(Ia)菌株的全细胞疫苗的确仅提供针对近期以来发现的无乳链球菌血清型III菌株的部分保护,并且反之亦然。
这个出乎意料的发现迄今为止仍是被忽视的。
同样出乎意料的后果是目前疫苗不足以有效避免或治疗鱼中的无乳链球菌感染。
本发明的目的之一是通过提供用于保护鱼不受无乳链球菌感染的组合疫苗,提供针对这个问题的解决方案,所述组合疫苗具有它包含免疫原性量的2个无乳链球菌生物型1菌株的特征:一个属于血清型Ia并且一个属于血清型III。
本发明的第一个实施方案因此涉及用于保护鱼不受链球菌感染的组合疫苗,其中所述疫苗包含免疫原性量的无乳链球菌生物型1血清型Ia细胞和免疫原性量的无乳链球菌生物型1血清型III细胞和药学可接受的载体。
免疫原性量的无乳链球菌细胞是引起免疫应答所需的量,与未接种疫苗的鱼比较,其至少能够减少疾病的严重度。
药学可接受的载体可以与水或缓冲剂或乳状液或水包油或油包水乳状液一样简单。
尽管无乳链球菌生物型1血清型Ia细胞和无乳链球菌生物型1血清型III细胞对于技术人员是可容易获得的,但无乳链球菌血清型III菌株的例子-无乳链球菌菌株TI 1428(S. agalactiae Strain TI 1428)已在保藏号CNCM I-4232下于2009年10月15日保藏于国家微生物保藏中心(法国),巴斯德研究院,Docteur Roux大街25号,F-75724 巴黎邮编15,法国(Collection Nationale de Cultures de Microorganisms(CNCM),InstitutPasteur,25 Rue du Docteur Roux,F-75724 Paris Cedex 15,France),具有英特维特国际股份有限公司,维姆科沃尔街 35号,5831 AN,博克斯梅尔,荷兰(IntervetInternational B.V.,Wim de Körverstraat 35,5831 AN,Boxmeer,The Netherlands)的名称和地址。
在根据本发明的组合疫苗中,细菌可以以活减毒形式或以灭活形式例如作为菌苗(bacterin)存在。重要的是细菌的免疫原性性质仍存在的事实。这可以通过使用全细菌制剂容易地确保。如上所述,只要细菌的免疫原性性质仍存在,制剂中的细菌是活的、被杀死的或甚至成碎片的(fragmented)(例如通过按压其经过弗氏压碎器)并不是非常重要的。
活减毒的细菌是非常合适的,因为它们确定携带免疫原性特征。并且活减毒的细菌具有超过菌苗的优点,它们可以无需佐剂而容易地被给予。此外,它们自我复制至一定程度,直至它们被免疫系统停止,因此可以给予较低数目的细胞。
另一方面,当这些细菌以菌苗的形式时,免疫原性特征还存在于细菌上。并且菌苗具有超过活减毒的细菌的优点,因为它们是非常安全的。
因此,在这个实施方案的优选形式中,本发明涉及其中无乳链球菌细胞是灭活的组合疫苗。优选地,细胞以菌苗的形式。
菌苗在此处定义为以灭活形式的细菌。用于灭活的方法看起来对于菌苗的活性是不相关的。用于灭活的常规方法例如都是本领域众所周知的热处理,用福尔马林、二乙烯亚胺、硫柳汞等处理是可应用的。使用例如弗氏压碎器(French Press),借助于生理应激的细菌灭活提供了用于制造根据本发明的疫苗的同样合适的原材料(starting material)。
根据本发明的疫苗可以根据熟练从业者众所周知的技术由细菌培养物开始制备。
涉及鱼疫苗及其制造的综述文章例如Sommerset,I.,Krossøy,B.,Biering,E.和Frost,P. in Expert Review of Vaccines 4:89-101(2005);Buchmann,K.,Lindenstrøm,T.和Bresciani,in J. Acta Parasitologica 46:71-81(2001),Vinitnantharat,S.,Gravningen,K.和Greger,E. in Advances in veterinary medicine 41:539-550(1999)和Anderson,D.P. in Developments in Biological Standardization 90:257-265(1997)。
此外,熟练从业者将在下文实施例中找到指导。
根据本发明的疫苗基本上包含有效量的细菌和药学可接受的载体。
施用的细胞量将取决于施用途径、佐剂的存在和施用时刻。
另外,本领域技术人员在上文提及的参考文献和下文给出的信息特别是实施例中发现足够指导。
一般来说,基于菌苗的根据本发明制造的疫苗一般而言可以通过注射进行施用,其剂量为103 - 1010、优选106 - 1010、更优选108 - 1010个细菌。尽管是免疫学合适的,但由于商业原因,超过1010个细菌的剂量将是较少吸引力的。
对于根据本发明制造和用于经口应用的疫苗中的细菌量,下文的例子将提供充分指导。
适合于在用于根据本发明的疫苗中使用的药学可接受的载体例子是无菌水、盐水、水性缓冲液例如PBS等。此外,根据本发明的疫苗可以包含其他添加剂,例如如下所述的佐剂、稳定剂、抗氧化剂及其他。
在优选呈现中,根据本发明的疫苗特别是包含菌苗的疫苗可以还含有免疫刺激物质,所谓的佐剂。一般而言,佐剂包含以非特异性方式加强宿主的免疫应答的物质。许多不同佐剂是本领域已知的。通常用于鱼和甲壳类动物养殖中的佐剂例子是胞壁酰二肽、脂多糖、几种葡聚糖和聚糖和Carbopol(R)。适合于鱼和甲壳类动物疫苗的佐剂的广泛概述在通过Jan Raa(Reviews in Fisheries Science 4(3):229-288(1996))的综述文件中给出。
疫苗还可以包含所谓的“媒介物”。媒介物是细菌与之附着而无需与之共价结合的化合物。此类媒介物是例如生物微胶囊、微海藻酸盐、脂质体和macrosols,都是本领域已知的。
其中抗原部分包埋到媒介物中的特别形式的此类疫苗是所谓的ISCOM(欧洲专利EP 109.942、EP 180.564、EP 242.380)。
此外,疫苗可以包含一种或多种合适的表面活性化合物或乳化剂例如Span或Tween。
适合于在油包水乳剂中使用的油佐剂是例如矿物油或可代谢油。矿物油是例如Bayol®、Marcol®和Drakeol®。
非矿物油佐剂的例子是例如Montanide-ISA-763-A。
可代谢油是例如植物油例如花生油和大豆油,动物油例如鱼油角鲨烷和角鲨烯,和生育酚及其衍生物。
合适的佐剂是例如w/o乳状液、o/w乳状液和w/o/w双重乳状液。
基于水的纳米颗粒佐剂的例子是例如Montanide-IMS-2212。
通常,将疫苗与稳定剂混合,例如以保护有降解倾向的蛋白质不被降解,增强疫苗的保存期限,或改善冷冻干燥效率。有用的稳定剂是例如SPGA(Bovarnik等人;J.Bacteriology 59:509(1950)),碳水化合物例如山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、右旋糖酐或葡萄糖,蛋白质例如白蛋白或酪蛋白或其降解产物,和缓冲剂例如碱金属磷酸盐。
此外,疫苗可以悬浮于生理学可接受的稀释剂中。
不用说,佐剂化、加入媒介物化合物或稀释剂、乳化或稳定化蛋白质的其他方式也在本发明中体现。
已知当作为油包水乳状液给予时,特别是灭活疫苗例如菌苗显示改善的免疫原性。
因此,在这个实施方案的更优选形式中,本发明涉及其中疫苗是油包水乳状液的组合疫苗。
从药学可接受性的观点来看,越来越不愿意使用矿物油。
因此,在这个实施方案的更加优选形式中,本发明涉及其中油是非矿物油的组合疫苗。
在这个实施方案的最优选形式中,本发明涉及其中油是Montanide ISA 763 A的组合疫苗。
可以应用许多施用方式,其都是本领域已知的。根据本发明的疫苗优选经由注射、浸入、浸渍或经口施用于鱼。
特别地经口应用和例如腹膜内应用是有吸引力的施用方式。
一般来说:如果疫苗可以通过加入佐剂得到改善,那么施用方式将优选是腹膜内途径。从免疫学观点来看,用菌苗的腹膜内疫苗接种是非常有效的疫苗接种途径,特别是因为它允许佐剂的掺入。
施用方案可以依据标准疫苗接种实践进行最佳化。技术人员将了解如何做到这点,或他将在上述文件中找到指导。
待接种疫苗的鱼的年龄并不是关键的,尽管明确的是希望在尽可能早的阶段,即在可能暴露于病原体前,进行针对鱼致病性细菌的疫苗接种。
然而,极小鱼的疫苗接种是困难和耗时的。一般来说,如果需要或希望的话,自5克以上的鱼可以借助于注射进行疫苗接种。
对于经口施用,疫苗优选与用于经口应用的合适载体混合,所述载体即纤维素、食物或可代谢的物质例如α-纤维素或植物或动物起源的不同油。同样,有吸引力的方式是疫苗施用至高浓度活饲料生物,随后将活饲料生物喂给靶动物例如鱼。用于根据本发明的疫苗的经口递送的特别优选的食物载体是能够包装疫苗的活饲料生物。
合适的活饲料生物包括浮游生物样非选择性滤食动物(filter feeder),优选轮虫的成员、卤虫(Artemia)等。高度优选的是海虾卤虫属物种。
如下根据实施例,无乳链球菌生物型1和无乳链球菌生物型2之间的交叉保护水平很低,或是不存在的。
因此,根据本发明另一种优选形式的组合疫苗另外包含免疫原性量的无乳链球菌生物型2细胞、免疫原性量的无乳链球菌生物型2细胞的抗原或编码此类抗原的遗传材料。
此外,根据本发明的疫苗将获益于免疫原性量的海豚链球菌细胞、免疫原性量的海豚链球菌的抗原或编码此类抗原的遗传材料的另外存在。
因此,根据本发明的再次另一种优选形式的组合疫苗另外包含免疫原性量的海豚链球菌细胞、免疫原性量的海豚链球菌的抗原或编码此类抗原的遗传材料。
明确的是,根据本发明的疫苗还将获益于用于制造疫苗的另一种免疫原性量的另一种鱼致病性微生物或鱼致病性病毒、此类微生物或病毒的抗原或编码此类抗原的遗传材料的存在。
因此,第一个实施方案的另一种优选形式涉及根据本发明的组合疫苗,其中所述疫苗另外包含免疫原性量的另一种鱼致病性微生物或鱼致病性病毒、此类微生物或病毒的抗原或编码此类抗原的遗传材料。
优选地,所述其他微生物或病毒选自下述鱼病原体:鳗弧菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、海洋屈挠杆菌、黄杆菌属物种、屈挠杆菌属物种、格氏乳球菌、迟钝爱德华氏菌、鲶鱼爱德华氏菌、停乳链球菌、病毒性出血败血症病毒、病毒性坏死病毒、虹彩病毒、鲤鱼跳跃病毒血症和锦鲤疱疹病毒。
因此,以更优选的形式,其他微生物或病毒选自下述鱼病原体:鳗弧菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、海洋屈挠杆菌、黄杆菌属物种、屈挠杆菌属物种、格氏乳球菌、迟钝爱德华氏菌、鲶鱼爱德华氏菌、停乳链球菌、病毒性出血败血症病毒、病毒性坏死病毒、虹彩病毒、鲤鱼跳跃病毒血症和锦鲤疱疹病毒。
本发明的另一个实施方案涉及免疫原性量的无乳链球菌生物型1血清型Ia细胞和免疫原性量的无乳链球菌生物型1血清型III细胞用于制造用于保护鱼不受链球菌感染的疫苗的用途。
本发明的另外一个实施方案涉及用于制备根据本发明的组合疫苗的方法,其中那种方法包含混合免疫原性量的无乳链球菌生物型1血清型Ia细胞和免疫原性量的无乳链球菌生物型1血清型III细胞和药学可接受的载体的步骤。
本发明的再次另一个实施方案涉及各部分组成的试剂盒,其具有它包含至少2个小瓶的特征,其中这些小瓶一起包含免疫原性量的无乳链球菌生物型1血清型Ia细胞和免疫原性量的无乳链球菌生物型1血清型III细胞和药学可接受的载体。此类各部分组成的试剂盒例如还包括包含至少2个小瓶的各部分组成的试剂盒,其中一个小瓶包含免疫原性量的无乳链球菌生物型1血清型Ia细胞和免疫原性量的无乳链球菌生物型1血清型III细胞,并且另一个小瓶包含生物型2细胞和药学可接受的载体。
附图说明
图1:经过攻击后6周观察期的疫苗接种后生长(n=15,除在第3周时:n=45和第6周:n=50)。
图2:在疫苗接种后第3周时,在用Sa1-X(TI1428)执行的攻击后,在接种疫苗组(Vacc Sa1(X)、Vacc Sa1(Y))和对照组(Ctr)中证实的累积百分比(%)(n=15),包括在攻击后观察期结束时的阳性再分离鱼(pos)。
图3:在疫苗接种后第3周时,在用Sa1-Y(TI1422)执行的攻击后,在接种疫苗组(Vacc Sa1(X)、Vacc Sa1(Y))和对照组(Ctr)中证实的累积百分比(%)(n=15),包括在攻击后观察期结束时的阳性再分离鱼(pos)。
图4:在疫苗接种后第3周时,在用Sa2(Y)(TI 016)执行的攻击后,在接种疫苗组(Vacc)和对照组(Ctr)中证实的累积百分比(%)(n=15),包括在攻击后观察期结束时的阳性再分离鱼(pos)。
图5:在疫苗接种后第6周时,在用Sa1-X(TI1428)执行的攻击后,在接种疫苗组(Vacc)和对照组(Ctr)中证实的累积百分比(%)(n=15),包括在攻击后观察期结束时的阳性再分离鱼(pos)。
图6:在疫苗接种后第6周时,在用Sa1-Y(TI1422)执行的攻击后,在接种疫苗组(Vacc)和对照组(Ctr)中证实的累积百分比(%)(n=15),包括在攻击后观察期结束时的阳性再分离鱼(pos)。
图7:在疫苗接种后第6周时,在用Sa2(Y)(TI 016)攻击后,在接种疫苗组(Vacc)和对照组(Ctr)中证实的累积百分比(%)(n=15),包括阳性再分离鱼(pos)。
具体实施方式
实施例1
疫苗接种
疫苗:
疫苗-1:TI1428无乳链球菌生物型1,血清型III,也称为Sa1(X)
药物形式:油包水:30%水相和70%Montanide ISA 763油
抗原浓度:以1.36E+8细胞/ml的无乳链球菌1(X)
疫苗-2:TI1422无乳链球菌生物型1,血清型Ia,也称为Sa1(Y)
药物形式:油包水:30%水相和70%Montanide ISA 763油
抗原浓度:以1.36E+8细胞/ml的无乳链球菌1(Y)
标准疫苗稀释缓冲液(SVDB)
表1给出使用的攻击菌株的描述。
表1:用于攻击的攻击菌株
菌株编码 | 无乳链球菌菌株 | 用多克隆兔抗TI1425的凝集反应* | 用多克隆兔抗TI513的凝集反应* | 血清型命名 | 生物化学分析 | PCR |
TI1428 | 无乳链球菌生物型1 | + | - | III | 无乳链球菌 | 无乳链球菌 |
TI1422 | 无乳链球菌生物型1 | - | + | 1a | 无乳链球菌 | 无乳链球菌 |
TI016 | 无乳链球菌生物型2 | - | + | 1b | 难辨链球菌 | 无乳链球菌 |
*标准化的载玻片凝集反应,TI1425针对生物型1血清型III产生,TI513针对生物型2产生。
动物
物种:罗非鱼(口孵鱼属物种(Oreochromis sp))
在到达时的平均重量:<0.5g
在实验开始时的平均重量23g。
管理
水
▪ 盐度:在疫苗接种后约6 ppt,在攻击后淡水
▪ 温度:在疫苗接种后约27℃±2℃,在攻击后32℃±2℃
▪ 槽:在疫苗接种后500L,在攻击后250L。
饲料
在疫苗接种后,鱼以2-4 %体重/天进行饲养。每周调整每个处理组的补料速率。在攻击后,如果接受饲料,那么鱼以1%-3%其体重/天进行饲养。
在任何处理例如转移至槽、称重前,使鱼饥饿至少12小时,并且在注射前,使鱼饥饿至少48小时。
槽
湿室(wet lab)设施中的所有槽(tank)具有唯一编号编码,并且这种编码在实验自始至终和所有记录表格上使用。在疫苗接种后,将鱼置于500L槽中。借助于垂直置于槽中间的网,将槽分成两半。槽的两半通过槽编号和字母(A和B)鉴定。这个编号对于槽是固定的。将受攻击的鱼饲养在通过2个垂直放置的2个网分开的250L槽中,所述网将槽分成3个区室。每个区室通过槽编号和字母A、B或C鉴定。这个编号对于槽是固定的。
动物分配至处理组
相似大小的总共285条鱼用于这个实验。将鱼以95条鱼为一组分为3组,2个接种疫苗组和1个对照组。
疫苗接种
通过IP注射执行疫苗接种。将鱼用AQUI-S麻醉直至镇静,并且大约在胸鳍的末端处以及胸鳍的尖端之间处用0.05 ml进行IP注射。在注射后立即将鱼转移至它们分配的槽并且进行恢复。对照鱼使用相同程序用相似体积的SVDB进行注射。表2描述使用的组以及在疫苗接种后的槽分配。
表2:处理时间表和在疫苗接种后的槽分配
攻击接种物的制备
TI 1422和TI 1428菌株从在TSA上的<-50℃冷冻的甘油原种复苏,并且随后在26-32℃孵育约24小时。
对于TI 1422,将生长物收集在TSB中,直至达到OD660 0.134 - 0.147。使用0.9%无菌NaCl,执行10倍稀释直至10-6。将0.4%这种制剂接种至更大体积的TSB。将培养基(broth)在32℃孵育16-17小时。当OD660达到0.879 - 0.904时,通过将培养物在0.9%无菌NaCl中稀释200倍,将培养物用于制备攻击悬液。对于第3周和第6周攻击,在用于攻击的所得到的悬液中的CFU分别测定为1.0E+7 CFU/ml和1.3E+7。
对于TI 1428,将生长物收集在SGM中,直至达到OD660nm 0.162 - 0.170。将制剂以1%v/v接种到100ml SGM内,并且随后在32℃孵育。在约16小时孵育后,培养物的OD660nm是1.339 - 1.362。通过将其在0.9%无菌NaCl中稀释100倍,将培养物用于制备攻击悬液。对于第3周和第6周攻击,在用于攻击的所得到的悬液中的CFU分别测定为9.0E+7 CFU/ml和7.4E+7。
对于TI016(无乳链球菌生物型2(也称为Sa2)),从≤ -50℃冰箱获得1ml攻击种子小瓶,解冻并且将其内容物接种到100ml SGM内。将培养物置于在32℃的定轨振荡器上,其中振荡速度设为150 RPM。在21小时-22小时孵育后,培养物具有OD660 0.181 - 0.177。通过将其在0.9%无菌NaCl中稀释1000倍,将培养物用于制备攻击悬液。对于第3周和第6周攻击,在用于攻击的所得到的悬液中的CFU分别测定为9.9E+5 CFU/ml和4.2E+5。
通过在TSA上100 μl等分试样的10倍稀释的细菌悬液的标准涂布铺平板,并且随后在32℃孵育24-48小时,测定在所有攻击培养物中的集落形成单位数目。
攻击
在第3周和第6周时,在攻击前,使鱼饥饿至少48小时,以确保胃肠道的完全排空,并且从而阻止由于注射对于内脏的损伤。使用AQUI-S将它们麻醉,并且通过IP注射执行攻击。对于每个攻击时间点,15条鱼用0.1ml上述攻击悬液进行IP注射。在注射后立即将鱼转移回至它们分配的槽(半槽)并且进行恢复(关于分布参见表3)。
表3:对于第3周和第6周攻击,实验组、鱼数目/组和在攻击后分配的槽
X:仅与Sa1抗血清的凝集反应,Y:仅与Sa2抗血清的凝集反应。
结果评估
通过计算相对保护百分比(RPP)值,评估疫苗保护鱼不受多种攻击菌株的能力。RPP值根据下式进行计算:
*受感染的鱼包括从其中可以分离出攻击生物的在观察期过程中收集的死鱼,以及从其中可以分离出攻击生物的在研究结束时收集的鱼。
水参数和在疫苗接种后的死亡率
在疫苗接种后第8天时,发现来自接种疫苗的Sa1(Y),(TI 1422)组的1条鱼死亡。将鱼解剖(cannibalised)。从铺板的(plated)内脏器官中未观察到生长。死因无法得到证实。在疫苗接种后的实验期过程中未观察到异常行为。
疫苗接种后的生长
经过6周观察期在接种疫苗和对照组中的生长在图1中给出。
死亡率在接种疫苗和对照组中是相似的。
功效
在攻击后的死亡率
对于Sa1-X、Sa1-Y和Sa2攻击,在用多种攻击菌株的第3周攻击后获得的死亡率分别在图2、3和4中举例说明。
在第3周攻击后,在对照组中的死亡率如预期的(在Sa1-X、Sa1-Y和Sa2攻击后,分别为87%、93%和80%的累积死亡率%)。
在用Sa2菌株攻击后,死亡率在2个疫苗组中很高(67%和87%)。在用Sa1-X攻击后,当与血清学异源的Sa1-Y疫苗接种组(60死亡率%)比较时,死亡率水平在血清学同源的Sa1-X疫苗接种组中更低(27%)。
在用Sa1-Y攻击后,做出相同观察:当与血清学异源的Sa1-X疫苗接种组(40死亡率%)比较时,死亡率水平在血清学同源的Sa1-Y疫苗接种组(6.7%)中更低。关于累积证实死亡率%的概述,参见表4。
表4:在第3周攻击后,累积证实死亡率%的概述(n=15)。
对于Sa1-X、Sa1-Y和Sa2攻击,用多种攻击菌株在第6周攻击后获得的死亡率分别在图5、6和7中举例说明。关于累积证实死亡率%的概述,参见表4。
在第6周攻击后,在对照组中的死亡率如预期的(在Sa1-X、Sa1-Y和Sa2攻击后,分别为86.7%、60%和66.7%的累积死亡率%)。
在第3周时进行的观察在第6周攻击后得到证实:在用Sa2菌株攻击后,死亡率在2个疫苗组中很高(66.7%和73.3%)。在用Sa1-X攻击后,当与血清学异源的Sa1-Y疫苗接种组(26.7死亡率%)比较时,死亡率水平在血清学同源的Sa1-X疫苗接种组中更低(6.7%)。
在用Sa1-Y攻击后,得到相同观察:当与血清学异源的Sa1-X疫苗接种组(53.3死亡率%)比较时,死亡率水平在血清学同源的Sa1-Y疫苗接种组中更低(6.7%)。关于累积证实死亡率%的概述,参见表5。
关于每日死亡率和再分离的细节在附录3中给出。
表5:在第6周攻击后,累积证实死亡率%的概述(n=15)。
RPP值
计算RPP值且在表6中表示。
表6:在疫苗接种后第3和6周时,在无乳链球菌攻击后的RPP值。
当在第3周用Sa2攻击菌株执行攻击时,与疫苗无关,保护很弱至不存在(对于Sa1(X)疫苗,RPP 16.7%,对于Sa1(Y)疫苗,RPP -8.3%)。这个观察在第6周攻击后得到证实,其中对于任一疫苗不可见保护(RPP 0%(Sa1-X疫苗)和-10%Sa1(Y)疫苗)。
当执行同源Sa1-X疫苗接种/Sa1-X攻击时,获得良好保护(在第3和6周时,RPP分别为 69.2%和92.3%)。然而,当执行异源Sa1-X疫苗接种/Sa1-Y攻击时,保护很低(在第3和6周时,RPP分别为 57.1%和11.1%)。
当执行同源Sa1-Y疫苗接种/Sa1-Y攻击时,得到相同观察。当Sa1-Y疫苗接种的鱼用Sa1-Y攻击菌株攻击时,观察到良好保护(在第3和6周时,RPP分别为 92.9%和88.9%)。然而,当Sa1-Y疫苗接种的鱼用Sa1-X菌株攻击时,与同源攻击比较时,保护更低(在第3和6周时,RPP分别为30.8%和69.2%)。
结论
总之,可以说在生物化学不同的无乳链球菌菌株之间未获得保护:无乳链球菌生物型1疫苗不针对由无乳链球菌生物型2的感染交叉保护。然而,无乳链球菌生物型1疫苗提供针对无乳链球菌生物型1攻击的保护。尽管如此,当无乳链球菌生物型1疫苗用血清学异源的攻击菌株攻击(X-Y和Y-X)时,可见保护降低。对于血清学同源的攻击(X-X和Y-Y),可以提供极佳保护。因此,包含无乳链球菌生物型1血清型Ia细胞和无乳链球菌生物型1血清型III细胞的组合疫苗提供针对2种无乳链球菌生物型1血清型的极佳保护。
使用的缩写
IP 腹膜内
Ppt 千分之一
RPP 相对存活百分比
TSA 胰蛋白胨大豆琼脂
TSB 胰蛋白胨大豆肉汤
SGM 链球菌生长培养基
Claims (8)
1.用于保护鱼不受链球菌感染的组合疫苗,其特征在于所述疫苗包含103 - 1010的无乳链球菌生物型1血清型Ia细胞和103 - 1010的无乳链球菌生物型1血清型III细胞,以及药学可接受的载体。
2.根据权利要求1的组合疫苗,其特征在于所述无乳链球菌细胞是灭活的。
3.根据权利要求1或2的组合疫苗,其特征在于所述疫苗是油包水乳状液。
4.根据权利要求3的组合疫苗,其特征在于所述油是非矿物油。
5.根据权利要求4的组合疫苗,其特征在于所述非矿物油是Montanide ISA 763。
6.无乳链球菌生物型1血清型Ia细胞和无乳链球菌生物型1血清型III细胞用于制造根据权利要求1-5的任一项的用于保护鱼不受链球菌感染的疫苗的用途。
7.用于制备根据权利要求1-5的组合疫苗的方法,其特征在于所述方法包含混合103 -1010的无乳链球菌生物型1血清型Ia细胞和103 - 1010的难辨链球菌生物型1血清型III细胞以及药学可接受的载体的步骤。
8.各部分组成的试剂盒,所述试剂盒的特征在于它包含至少2个小瓶,所述小瓶一起包含103 - 1010的无乳链球菌生物型1血清型Ia细胞和103 - 1010的无乳链球菌生物型1血清型III细胞,以及药学可接受的载体。
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