PT98383A - Processo para a preparacao de uma proteina de classe ii da membrana exterior de neisseria meningitidis tendo propriedades de veiculo e de intensificacao imunologicas - Google Patents

Description

ANTECEDENTES DO INVENTO 0 uooiplsxD de proteiiirf da membrana BKteriur íOMPC) de Neisseria roenirig ir. ia is é utilizada coroo um veiculo imunológico em vacinas para utilização em humanos» 0 DliPC consiste em lipossonsas contendo uma variedade de proteínas assim como lípidos merobrano-sos, incluindo 1ipopolissacáridos CLPS ou sndoloxina>» 0 OMPC tem a propriedade de aumento imune, e quando tun antigénio é quimicamente acoplado a ele, resulta numa resposta da anticorpo aumentada ao antigénio» 0 OMPC é currentemente utilizado em vacinas para recém-nascidas humanos contra agentes infec— ciosos tais coma Haemophilus influenzae, e torna os recém-nascidos capazes de montar uma IgS e uma resposta de memória imune ao fosfato de polirrihosíi— rihitoi íPRP) de H« inf 1 uerizae, quando o PRP está covalentemente ligada ao OMPC» * 0 OMPC é uma mistura de uma variedade de proteínas e lípides, e não foi conhecido qual D componente ou componentes do OMPC que conferem o efeito benéfico de intensificação imune aos antigénios acoplados» Contudo, alguns dos aspectos potencialmente negativas de utilização da OMPC em vacinas humanas incluem reacçSes relacionadas com LPS»

Além disso, os conjugados de QllPC-antigénio sSo bastante heterogéneos visto que o antigénio se pode tornar conjugado a qualquer uma das porções de proteína que constituem o OMPC, e a ca.f çoe proteiMd tocai por dose cie uma vsciLna muXtivaiente serxa bastante alta.

QBJECTIVQS DQ INVENTO É um objectivo do presente invento propi

I imunointsnsificadora (Mlκ) derivada directamente a partir da membrana exterior de Neisseria meninqitidis.. livre de outros componentes de membrana anterior de Hsissarãa meningitidis. έ um outro objectivo do presente invento proporcionar MIP recombinante substancia1mente pura da membrana anterior de Msisssria meningi-ti d.is,, produzida numa célula hospedeira recombinante, completa-ϊΓιογ* Le livre de tooas as outras proteínas de Ímsisserxa meninqi— tidis, Um objectivo adicional do presente invento é o de proporcionar uma proteína de imunoveicuio eficaz para a intensificação de uma resposta imune aos antigénios, compreendendo quer MIP purificada directamente a partir da membrana exterior de Neisser ia meningitidis; quer MIP rsícombiriante de iveisseria meninqi— tidis produzida numa célula hospedeira recombinante.. Um outro objectivo do presente invento é o de proporcionar uma proteína que possua actividade mitogénica imune, compreendendo quer MIP purificada directamente a partir da membrana exterior de Neis-seria meningitidis * quer MIP combinante de Neisseria meninqitidis produzida numa célula hospedeira recombinante. Um objectivo adicional do presente invento é o de proporcionar composições de vacina, contendo quer a MIP' recombinante, quer a MIP purificada directamente a partir da membrana exterior de Neisseria meningi-tidis„ Estes e outros objectivos tornar-se-ão aparentes a partir da descrição seguinte. m.

SUMARIO DO INVENTO O presente invento óiz respeito à principal proteína iiisunointensificadora, de Classe II íMIP) da membrana exterior de Neisseria meninqitidis, na forma substancial mente pura, livre de outras proteínas d-e membrana exterior de Meisse-ria mení.nqi tidi.s contaminant.es e LPB» A MIP do presente invento, quer purificada directamente a partir da membrana exterior de células de Neisse r ia meninaitidis„ quer derivada a partir de uma célula hospedeira recofflbinante produtora -de MIP rscasbinan te de Meisser ia meningitidis,, possui actividade de veículo imunológico e activi-dade mitogénica. A MIP do presente invento, quando acoplada a um antigénio, é capas de imunointensif icaç-Mo visto que a resposta dc anticorpo ao antigénio acoplado έ aumentada ou o antigénio é transformado num antigénio T—dependente que assegura a produção de imunog1ohuIinas da classe IgG» Os antigénios que podem ser acoplados à. MIP do presente invento incluem proteínas virais, proteínas bacterianas e polissacáridos, péptidos sintácticos, outros antigénios imunogénicos, e antigénios nlo imunogénicos ou fracos»

I

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 - As respostas dos de transferfncia adoptivos, que rscefo ladas separadamsnte com PRP--DT e HIP, medidas por ELISA em amostras de sang dos após imunização cora PRP-OMPC. anticorpos de recipientes eram células Qs Paço inocu— ou OHPC , ου. lAA—OMPC, foram ue tiradas nos dias indica-

Fxqura Δ ~ Ensaio de proaiferaç

act.1 vidade mitogénica *·?; de 'THtimidins no DMA células a albumina de da HIP, in vítro» 0 d δ X 1.C X ã f foi medido . soro de bovina (BSA ;□ de j. ir’ífcif—itos qara a aumento de incorporação ; seguir à εκposição das ? PRP—OHPC5 OHPC, ou HIP.

Figura 3 - Os conjugadas PRP-MIP foram testados è iísunogenicidade em ratinhos assim corao era macacos Rhesus recém-nascidos» As respostas dos anticorpos foram medidas ELISA e RIAo quanto par

DESCRIcao DETALHADA DO INVENTO

induzem C 1 *3SSH? ti v» Γ \ Λ* Wm)

Sabe—se que certas substâncias uma resposta imune que consiste IgM e nenhuma memória, podem ser totalmente imunogénicos que induz

que por elas próprias somente em anticorpos de transformados em anti— era anticorpos IgS s IgM assim como memória, génica que pode indu. ção de imurtog 1 obu 1 in " e f ε i to d e ve í c. u I o ” , por acoplamento químico a uma porção anti-zir o auxílio dos 1infócitos-T para a produ-a. Este fenómeno imunológico é denominado por enquanto que a porção não imunogénica ou 4 fraca, e a substância fortemente antigénica são denominados “hapteno" e "veículo", respectivamente. A injseção do hapteno-veículo ou complexo poiissacári-do-veiculo num animai resultará na formação de anticorpos por iinfócitos-Eí, alguns dos quais serão específicos para, a ligar- '—3o ao hapteno, e outros Q! j.s serão específicos para, e ligar— -ão ao veí c u1o» Um aspecto adicional do efeito de veicula é a que a pó s uma expôs dção subsequente ao complexo ha p t en o- ve í - culo, sucederá uma resposta de anticorpo vigorosa ao hapteno. Isto é denominado uma memória ou resposta arsamnéstica. ver funç Ses siiteu iadas tos—T au xili ares”, A auxilia r a ajudar, de odutores de a n t. i c o r p os- 0 efeito de veículo parece envolver por certos linfócitos—T, chamados "linfócitos molécula de veículo estimula a linfócito-T ai: certa forma, a formação de linfécitos—B produtore de : 1 asse IqS anti-hapteno e d e uma respusta de memôna··

I

Os linfócitos-T auxiliares estão normalmente envolvidos por j. in f ói-x tos—ií*, de anticorpos espeexfzcos para um certo tipo de antigénios, denominados antigénios “T-dependentes", mas não para outros antigénios denominados antigénios “T-indepen·--dentes”. Uma molécula de veiculo pode converter um hapteno T—independente, fraco ou não imunogénica numa molécula T—dependente fortemente antigénica. Além disso, uma. resposta de memória, seguirse-á a uma exposição subsequente ao complexo hapteno—veículo e consistirá primeiramente de IgG, que é característica de antigénios T—dependentes e não de antigénios T—independentes. A uti1i zadads das moléculas de veículo não está limita-us uui 1 xilação loio antigénios ! independentes mas pode também ser utilizada com antigénios T—dependentes, A resposta de anticorpo a um antigénio T-dependente pode ser intensifiçada por acoplamento da antigénio a um veículo, mesma que o antigénio pose-a, por ele mesmo, induzir uma resposta de anticorpo»

Algumas outras moléculas fim a capacidade da estimular, geral mente, todo o sistema imune. Estas moléculas são denominadas ”fflitogénios" e incluem proteínas ds plantas assim como produtos de bactérias. Os mitogénios fazem proliferar os linfécitos-B e/ou T, e podem intensificar amplamente muitos aspectos da resposta imune incluindo fagocitose aumentada, resistência aumentada à infecção, imunidade a tumor aumentada, s produção de anticorpos aumentada.

Muitos agentes causadores de doenças iníecciosas podem, por eles proprios, induzir anticorpos protectores que podem ligar -e matar, tornando—os inofensivos, ou podem causar a morte ou tornar inofensivo o agente causador de doenças e seus produtos-secundários. A recuperação destas doenças resulta, usualmente, em imunidade de longa duração em virtude dos anticorpos protectores gerados contra os componentes altamente antigénicos do agente i nfecc iqso„

Os anticorpos protectores são parte do mecanismo de

.ural de huma nos e tí? >s no SSnpUB assim Cj é a funçSo princi P defesa na κπο em outros zecxdos e τ iuxoqs il, da maioria, das vacinas, é a de induzir anticorpos protectores contra agentes infeccic-sos e/ou seus produtos secundários, sem causar doença. 0 QHPC de N. meningitiais tem sido utilizado, com sucesso, para induzir respostas de anticorpo em humanos guando o OMPC está quimicamente acoplado a antigènios independentes de células—T, incluindo polissacáridos hacterianos.. 0 OMPC contém várias proteínas de membrana eKterior bacterianas assim como Β lípides bacterianos* Adicionaimente, o GMPC tem uma estrutura lipossómica tri-dimensional« A eficácia do OMPC como um veiculo imunológico pensou— -se depender numa ou mais das proteínas de membrana bacterianas, lipiíáos bactariana, da estrutura lipossómica tri-dimensional, ou. de uma combinação de proteínas, Iipidos, e estrutura lipossómic bacterianas. Os requerentes descobriram que uma das proteínas, HIP, possui o veiculo imunolóqico e oropriedades imunointensi- OMKC, e á efica.z na forma purificada, de membrana de N. meninqitidis e ficadoras de vesículas de livre de outras proteínas 1xpopolxssacáridos, quisn s. .

po i X M IP

Os requerentes também descobrira® que a MIPquando icamente acopladas a um polissacárido bacterlano, funciona bam como o OMPC na indução de resposta de anticorpo ao ssacárido. Os requerentes descobriram adicionalmente que a ê a proteína de Classe 11 da membrana exterior de N. menin- qitidis,, A proteína de Cia e ΣΙ de N» meninq 11idis é uma proteí n a d e po r i n a !“ Mu r a k am i , nity, 37.5 pgs. 2318-233» exterior de todas as bac K», et al. , -(1989), Infeccion And Immu-As porinas encontram-se na membrana tè-rias Bram—negativas»

Embora α presente invento seja exemplificado pela MIP de M» menínoitidis» á prontamente evidente àqueles peritos na arte que qualquer proteína da membrana exterior de qualquer bactéria Bram-negativa, que tenha um veiculo imunológico e sctiv.1 d3ds imunomtsnsificadora, é abrangida pelo presente invento» Exemplos de bactá esteio limitados a espécies Fseu d ορθή as, Haemoohi1us, $ rias Bram-negativas incluem roas nâo -dos géneros Neisseria» Eschericnia Sa 1 roone 11a, Shiqel 1-a k Borde te 11a, *

» A MIP pode ser empregue para pat@nc.iar a resposta de anticorpo a materiais altamente antigénicos, fracamente antigè-nicoSj e n.ãa antigénicos. Os termos ,!antigénioM a “material antigénico" que são utilizados aqui alternadamente incluem um ou mais agentes nlo viáveis, imunogénicos, fracamente imunogénicos, nac imunogénicos, ou dessensihilizanies (antialérgicos) de bactérias, virus, ou outras origens» 0 componente antigénico pode consistir num pó seco, numa fase aquosa tal como uma solução aquosa, ou numa suspensão aquosa e semelhantes, incluindo misturas dos mesmos, contendo um agente ou agentes não viáveis, ifliunoqériicos, fracamente imunogénicos, nao xmunogénicos, ou. d essensi b i1i zantes *

I A fase aquosa pode conveniente-mente ser compreendida pelo material antigénico num liquido parentericamente aceitável» Par exemplo, a fase aquosa pode estar na forma de uma vacina em que o antigênio é dissolvido numa solução salina equilibrada, solução salina fisiológica, solução salina tamponaaa com fosfato, fluidos de cultura de tecidos, ou outros meios em que possa ter crescido um organismo» A fase aquosa pode também conter conser— vantes s/ou substâncias convenciona 1 mente incorporadas em preparações de vacina» As emulsões adjuvantes contendo antigênio conjugado a ΜΣP podem ser preparado empregando técnicas bem conhecxoas na arte» 0 antigênio pode estar na forma de antigénio purificado ou pareiã1sente purificado incluindo, mas não limitado a, antigè— nios derivados de bactérias, virus, células de mamíferos e outras células eucariátas <incluindo parasitas), fungos, rickettsia? ou o antigénio pode ser um. alergécsio incluindo, mas não limitado a, pólens, poeiras, cinzas vulcânicas, ou estratos da mesma? ou o antigênio pode estar na forma de um tóxico ou um veneno incluindo, mas não limitado a, tóxicos ou venenos derivados de répteis ou insectcs venenosas. Q antigénio pode também estar na fornia de um péptido sintético, ou de um fragmento de um polipéptido maior, ou qualquer subporção de uma molécula ou componente derivado de bactéria, célula de mamífero, fungo, vírus, rickettsia, alergénio, tóxico ou veneno. Em todos os casos, os antigénios estarão na forma em que as suas propriedades tóxica e virulenta foram reduzidas ou destruídas s que quando introduzidos num hospedeiro adequado irão ou induzir imunidade activa pela produção nele de anticorpos contra as proteínas específicas, péptidos, microorga·-nismos, extractos, ou produtos de microorganismos utilizados na preparação do antigénio, tóxicos, venenos, ou, no caso de alergé-nios, irSo auxiliar no alivio dos sintomas da alergia devido ao alergènio especí f ico«

Os antigénios podem ser utilizados quer sózinhos quer em combinação, por exemplo, antigénios bacterianos múltiplos, antigénios virais múltiplos, antigénios de micoplasma múltiplos, antigénios da rickettsia múltiplo, toxóides de bactérias ou vírus múltiplos, slergénios múltiplos, proteínas múltiplas, péptidos múltiplos ou podem ser conjugados à MIP combinações de qualquer dos produtos antecedentes.

Os antigénios de particular importância são derivados de bactérias incluindo, mas não limitadas a B. pertussis, Lesto·- e ictsrghasffigrrhaqias·, S.__earat.vp.hi, A e B, C. áii^Mcise? S..· tsbani, C. botulinum, C. perfrinqens. C„ feseri. e outras bactérias de gangrena gasosa, 5„ anthracis. V. pestis.

EjÍjaalfeBEAda» VH_jçholerae, Weisseriameninqitidis, N· qonorrheae, HââíDOSlliJLMS Treponema,.qa 11idium, e semelhantes? de células de mamíferos incluindo, mas nao limitadas a células de % tumor, células infectadas por vírus, células geneticamente construídas, células crescidas em cultura, estractos de células ou. tecidos, e semelhantes? de virus incluindo, mas não limitados - ii - ii UrfC xc xa.iía· fp P X í'“ S tl,uí rioi=> , V X rus ), vi rus d E~ ence 1” a 1 om í 0 lite , lomie 1 i te H a j apune 3-¾ tf ence f a- viru s de P® s tis pur cina , vi rus aiva, sinome ^8 C ani na 0 fel ina > incl uindo j: ÍíiSS não 1 im itad 03 ao virus iinfotrópico ! humano < tipos múltiplos), virus da imuncdef iciencia humana (tipos e variantes, mui tiples),, poliovirus (tipos múltiplos)5 virus de papiloma humana C tipcs múltiplas), adenovirus (tipos múltiplos), virus parainfluenss (tipos múltiplos), sarampo, parofcidite, virui influensa (tipos vários), tifo equina Ocidental e Oriental, encefalomielite lomialite de primavera-yerSa Russa, da doença de Newcastle, varicela e virus semelhantes, de rickstts. ao iiíu epidémico e endémico ou outros membros do grupo da febre maculosa (meningite cerebrospinal), de vários venenos de aranha e cobra ou de quaisquer dos alergénios conhecidos, incluindo mas não limitados àqueles de erva-de—santiaga ( t.asneira) , pó de casa, estratos de pélens, pólens de erva, e semelhantes» quer tipos parti cu lares, txwíiiplus de iOS inc 1 U0iTi polis tsâcáridos de Stre- ocos) d 03 t X pDS 68, òB, 10A, 11 A,

Os poiissacáridos deste invento podem ser quaisquer polissacáridos bacterianos com grupos ácidos, mas nâo se pretende que estejam limitadas a quaisquer t ISO, Í9A, 19f, 20, 22F, e 23F5 ótrepiococos Brupo B dos tipos Ia, j.b, i I e I i Σ 5 poiissacárido de Haemoshxlus xnf lusnzas serotipo b5 polissacáridos de Meisseria meninqitidis serogrupos A, B, C, χ, ΐ’ 5 W135 e 29E; e poli K29 e Kl® £?» Contudo, dos , são aqueles poli do qrupo consistindo 29E; e poiissacáridos de Escherichia coli Kl, !<12, í<13, poiissacáridos particularmente preferi-jcáridos capsulares seleccionados a partir do grupo consistindo em polissacáridos de H» influensae serotipo b, tais como descrito em

Rusenberg et al„, Biol. Uhem., 236, 2843-2849 (1961) e Zamenhof et ah, J„ Biol= Chem», 203, 695-704 <1953)» U polissacárido de Streptococcus pneumoniae (pneumococos) da tipa óh ou do tipo 6B, tais como descrito em Robbins et al,, Infeccion and Immunity, 26, NS 3 1116-1122 (Dezembro, 1979)5 •c -7* polissacárido de pneumococo do tipo i9F, tal como descrito em C„ J„ Lee et al.t Reviews of Infeccious Diseases, 3, MQ 2,. 323--331 ÍÍ981); e polissacârido de pneumococo tipo 23F, tal como descrito em 0 ,= Larm et _al_« , Adv« Carbohyd Chem and Biochem», 33,, 295-321, ;SS 1 v / és , R, S. Tipson et ai,, ed„, Acstísmi A MIP poda ser purificada a partir do OMPC derivado de culturas de N. meningttidis que crescem da maneira usual como descrito na Patente E„U„A„ número 4459286 e na Patente E„U«A» número 483Θ852» A purificação do OMPC pode ser feita de acordo com o processo descrito na Patente E.= U»AU número 4271147, 4459286, e 4830852« A MIP pode também ser obtida a partir ds DMA, recombi-

So do DMA a MIP pode Mu rakami, K ” ? :i8 J , OU Q ui m :as de sinte se ;pr asso em ÍQ 1imi tadas a fS ou de out ros !ridos do : ^ r* açlo de M IP do DMA que ser obtido a partir de células ds N, meningitidis CMurakami st al«„ (1989), Infeccion And Immunity, 57, pgs«

ti x r DODB de DMA padrão. 0 UMA que codifica is bactérias. :odifica a MIP derivado de N« meningitidis»

A MIP purificada foi preparada a. partir de vesículas de OMPC por lise com dodscilsulíato de sódio \8DS) das vesículas seguida por electroforese em gel de SDS-paliacrilamida ÍPAGE). A MIP foi iluida a partir do gel, dialissda contra um tamplo de pH elevado e concentrada. = Os processos padrão de electroforese em gel de pe>líacrilamitía podem ser utilizados para purificar a MIP

s V-:·adescritus em Molecular ook? 3. et al., <1989)? Cold yorx? e Lurrent Ferococols j.n . M. et al.. editores Wiley

V > de vesículas de OHPC. Tais processo-Cloninqs A Laboratory Manual? Samhn Sprincj Harbor Laboratory Press? New Molecular Bioloqy? (1987) Ausubel F and Sons? New York.

Os proces SOS p -3,d Γ •xlO d e i lui ção de pro iteinas a p- artir de ge 1 C3 0 SD S-pal í.ac ri Iam ida s ão de SC Γ .1 tos em Hunkapiiler? M. W «? e Lu. j an ? E. , (1986) , Pu r X *fi. C-â ti on of Microgr Quantities f? -f Pr oteins- by Po 1 y sc. r ylami de úie 1 rv i _ i... £!. X fcSU v.5* ophores is? em Method 3 ΟΪ Protein Ϊ lic rocharsc teria ati on ( edi tor 3, Shi vel y> Humanna F*res· 3 Cl ifton í 4. J o ? e Cur ren t Pr o > to co ils in Molecul ar Biology (1 DP7 \ Cj / 1 ij t L sube1? F. M= , et S2-s 7 edi to s w ile »y and S ons í? New York X ta maneira está prontemente adequada derivados de bactérias? virus? i a ? a1e rgén ios, tóxicos QU venenos ? ρο 1 issac-ár idos ? ou qual que· r outro A MIP preparada des para conjugação a antigénios células de mamífero? ricketts fungos? péptidos? proteínas? antigénio

I A ΗΊΡ recombinante pode ser preparado por expressão do DNA de N. meninaitidis genómico que codifica a MIP em bactérias? por exemplo, E» coli ou em levedura? por exemplo? S, cerevisiae. Para se obter o DNA genómico que codifica a MIP? o DNA genémico é extractado a partir de N- meninqitidis e preparado para clonagem por quer fragmentação aleatória de DNA de elevado peso molécular seguido pela técnica de Maníatis? T«? et a1,, (1978), Cell? 15? pq* 687? quer por clivagem com uma endonuclease de restrição pela processo de Smithies? et al., (1978)? Science? 2J?2? pq. 1248= 0 DNA genómico é então incorporado num vector de clonagem apropriado? por exemplo? fago lambda lver Bambrook? J« et al,, <1989)? Molecular Cloning? A Laboratory Manual? Cold Spring Harbor Press? New Yorkl. Alternativamente? -a técnica de reacção 14 em cadeia de pol 1 me rase CPUR) CPerkin Elmer) pode ser utilizada para Siiíp 11fxcar as sequencxas de- uMA espec^-Ticas no DNh gsnom.i.cQ CRouX j et al., (1989) Biatechoiqu.ess 8S pq* 483=, 0 tratamento PCFi requer um oliçionu.cleótido de DMA que possa hibridar com as sequências de DMA especificas na DMA genámico» A sequtncis de DMA dos oliqonucleótidos de DMA que podem hibridar com DMA de MIP no DMA gene-mico de N„ meninqitidis pode ser determinada a partir da sequência de aminoácido as MIP ou por referência â sequência de DMA determinada para a principal proteína de membi-ana ds Classe II de SM« meninqitidis LMurakami,, K.* et ãh„ CI9S9)? Infeccion and Immursity, 57, pgs„ 23183» A MIP recombinants pode ssr separado de outras proteínas celulares por utilização de uma coluna, de afinidade feita com anticorpos monoclonais ou policlonais específicos para a MIP. Estas colunas de afinidade são feitas por adição dos anticorpos a Affigel-l® (Biorad), um suporte de gel que á pré-activado com estéres de N-hidroxissuccininsida ds modo que os anticorpos formem ligações covalentes com a suporte de pérolas de gel de agarose»

I

Os anticorpos slo então acoplados ao gel via ligações amida com o braço espaçador» Os ésteres activados restantes slo então destruídos com etanolamina HC1 1 M CpH 8). A coluna é lavada com água seguido por glicina HC1 Θ?23 M CpH 2,= è> para remover qualquer anticorpo não conjugado ou proteína estranha» A coluna é então equilibrada em solução salina tampo-nada com fosfato CpH η i os sobrenadantes da cultura de células au. estractos de células contendo MIP são passados lentamente através da coluna» A coluna é então lavada com solução salina tamponada com fosfato aí-a que a densid-soe ορtxca iA) csis. ρ-ara a cie fundo» então a proteína é eluída com glícína-HCi θ523 M CpH 2sè>. A proteína é então dialisada contra solução salina tamponada com fosfato» 15

15 I

Os conjugadas do presente invento podem ser quaisquer conjugados polissacárido-MIP estáveis ou quaisquer outros conjugados antigénio-MIP, incluindo antigénios de péptidos sintéticos. Os péptidos sintéticos podem possuir um ou mais determinantes antigénicos de qualquer antigénio incluindo determinantes anticênicos de bactérias, ricksttsia, virus {incluindo o virus da imunodeficiencia humana), células de mamífero ou outras células eucariotas incluindo parasitas, toxinas ou tóxicos5 ou alergéni-ds. Os conjugados antigénio-MIP sSo acoplados através de espaça-dores bigenéricos contendo um grupo tioéter e uma amina primária, que formam ligações covalentes hidroliticamente lábeis com o polissacárido e a ΙΊΙΡ» Contudo , conjugados preferidos de acordo com este invento, são aqueles que podem ser representados pelas fórmulas, .Ps—A—Ξ—tí—8—Pro ou Ps—a' — S—E‘ — Er — Pro, em que Ps representa um polissacárido ou. qualquer outro antigénio; Pro representa a proteína bacteriana Mips e A-E-S-B e A'—S™E'-B'' constituem espaçadores bigenéricos que contem ligações tioéter covalentes hidroliticamente estáveis, s que formam ligações covalsntes (tais como ligações amida ou éster hidroliticamente lábeis) com as niacroíBolécuIaSj Pro e Ps. No espaçador, A-E-S-B, S é enxofre; E é o produto de transformação ds um grupo tiofílico que foi feito reagir com um grupo tioi. e é representado por

JP

em que H é H ou CHT, e p é 1 a ·3ρ A é

WH "! -dlíOi,) YtCH„) -NH-, j£. m .z. n em que W á ou WH !, ΙΠ -¾ δ 4s Π S -S tí írf Y ê uH.~ s U 5 b 5 r*!R ‘ - CHCQ^H, onde £u R' é H ou alquilaC, ou C._t? tal que se Y for CH en tao quer ff! quer n não podem ser iguais a zero5 e se Y for S? en tão sn é maior do que i e n è maior do que 15 e m ou i B é -CCri-J CHÍCH„) D- ^ Pi 2 q 2 em que q é Θ a 25 zé Ni-U, NHCR' ? COOH, ou H, onde R* e p são tiolg e é representado por 0 em que R é como defenido seima. 0 H 0 0 >’· 1 is u como dsfenidos aciir.âj e D é C n NFr" 5 ou w ΙΪ espaçador Λ ' u ri "* S—E' —B' ç. S é emeofrep A' é -CNHCCH.-, > HDY' I n 1 é 1 & 4, 0 fl1 · é CH.-j, ou Lj.,. . «IC-UH i. L-H-, .5 , onde Y' é NH_. ·*- p 4*15 ρ e R" são c oiBD d ef en i dos acima. e Ε' ώ o m~aáu. mação de UtíTí Cj ru pO CXLí 1 ,ϊ. X .1. co que foi teito Γ Sí H·. Q X Γ c ε B' é --C-, ou t." è

N—, 0

Adiciorfâlmente» dos sspaçadorss B' è —ÍCH^) C—, em que ρ 18

bigenáricos, fi-E-S-B e fi' -S-E' —B' os componentes E---3-8 H ' 3—E ' são determináveis e quantifiçáveis, refisctindo ssta identificação a covaleneia da ligação do conjugado ligando o lado do tioéter da enxofre que te-m origem no polissacárido covalentemente modificado com o lado do espaçador que tem origem na proteína f unc i onalisad a.

I

Então os conjugados, Ps-A-E—8-B—Pro9 de acordo com este invento podem conter espaçadorss cujos componentes incluem derivados de, inter alias dióxido de carbono, :l ,4—butanodiamina, e S-cartaaximetil-N-acefcil-homacisteínas dióxido de carbono, í,5—pentanodi&mina, e S—carboximetil—M—acetil—hcmocisteína; dióxido de carbono, 3-oxa--í ,5-pentanodlamina, e S—carboximetil” --N-acetil“homocisteinaj dióxido de carbono, 1,4--butanodiamina, e S-carboxiroetil-N-acetilcisteínafi dióxido de carbono, i ,3-propano·--diamina, e S—carboximetil-N-benzoil—homocisteinas dióKido de carbono, 3-asa-í ,5-pentanodiamina, e S-carboximetil-N-acetilcis-teina§ e dióxido de carbono, i,2—etanodlamina, glicina, e S-(suc-c.in-2-il J-N-acetil-homocisteina. Os conjugados, Ps-ft' -S-E' -•~B'~Pro, de acordo com este invento, podem conter espaçadores cujos componentes incluem derivados de, intsr alias dióxido de carbono e S-carhoximeiiXcisteaminaf dióxido de carbono e S— Ca--carboxietil jeisteamina-, dióxido de carbono e S-carboximetil-—homocisteaminaρ dióxido de carbono, S— Csuccin-2-.il Icisteamína, e glicina, e dióxido de carbono s 3—carboximetilcisteína.

No processo do presente invento, o polissacáritío está modificada covalentemente por Ca) solubilização num solvente orgânico não hidroxílico, depois (b> activaçSo com um reagente bifuncional, Cc) reacção deste polissacárido activado com um bis-nucleófilo, e finalmente, se necessário, ainda Cd) funcio-naiização deste polissacáritío modificado por quer reacçSo, íi) com um reagente gerador de sítios electrofílicos (por exemplo, 1 -ν tiolfílico) quer, (ii) com um reagente gerador de grupos tiol» A proteína á, reciprocam ente. quer feita reagir (!) com um reagente gerador de grupos tiol ru í."vr \4 w.w: (ii) com uí a reagente gerador de sítios tiolfílicos, depois o polissacàrido modificado covalen-temente s a proteína funcionalizada são feitas reagir conjunta-mente para formar o conjugada covalentements ligado, estável, e ã mistura final é purificada, para remover polissacáridos e proteínas que nSo reagiram» 0 processo deste invento inclui também a selecçSo de um nucleófilo ou bis-nucleófilo que reagirá com o polissacàrido activado para formar um polissacàrido modificado covalentemente com sítios electrofilicos pendentes ou. grupos tiol pendentes, prevenindo assim a necessidade de adicionalmente funcionalisar o polissacàrido bis-nucleófilo modificado antes de reagir o polis-sacárido covalentemente modificado com a proteína covalentemente modificada» A funeiona1icação da proteína para qualquer uma das formas de porções pode também ser realizada em mais do que um passo d is auordo com a ssãscçcÍo de reagentes nestes passos»

No primeiro passo com vista a modificar covalentemente c< polissacàrido, o polissacàrido sólido tem -de ser solubilieado» f

Uma vez que os grupos hidroKilo alcoólicos nucleofiÍleos de um polissacàrido não podem competir quimicamente para reagentes electrofí1icos com os hidróKilos da água numa solução aquosa, o polissacàrido devia ser dissolvido em solventes não aquoso (não hidroxílicos)= Os solventes adequados incluem di— meti1formamida, dimetiIsulfókíqo, dimetilacetemida, formamida„ N,, M-d i me ti 1 i m.i. da col idinona» e outros solventes apróticos, similarmente polares, preferivelmente dimeti1formamida»

Adicionalmente, à utilização destes solventes*, a convenção dos polissacáridos (por exemplo, os polissacáridos capsularas de H, ,1.nfIuenz-ss tipo b, que são polímeros de fosfato de ribose-ríbitol), que t@m hidrogénios ácidos, tais como mono- e diésteres de ácido fosfórico, numa forma de sal apropriada, faz com que os polissacáridos se tornem prontamente soláveis nos solventes acima» Os hidrogénios acídicos nestas macromoláculas podem, ser substituídos por catiSes hidrofóbicos, grandes, tais — a Os-íaiTsonxo, 1 âssbiciciQL2>z>2J— > catt -· Π*-)amónio, e o tri- ou particularmente tri- ou tetra-alquil(C, X ϋ tetra-alquilamónio resultante ou sais similares de polissacáridos fosforilados prontamente dissolvidos nos solventes acima a cerca de i7°-5®':'C, enquanto agitados durante desde um minuto a uma hora» O polissacérido de H» influenzae» serotipo B, parcial-mente hidrolisado foi convertido no sal de tetrabutilamómio, depois dissolvido em dimetilsulfóxido (Egan st al»» a» ftmer»

J

Chem» Soe. 1Θ4, 2898 C J.982)), mas este produto já não é anti-génico, e por conseguinte é inútil para a preparação de vacinas» Em contraste, os Requerentes realizaram a solubilização de um polissacérido não hidrolizado, intacto, por passagem do polis-sacárido através de uma resina de permuta catiónica ácida forte, na forma de tetra-alquilamónio, ou por neutralização cuidadosa do polissacérido com hidróxido de tetra-alquilaménio, preferivelmente pelo procedimento anterior, e por conseguinte conservaram a viabilidade do polissacérido para utilização na vacina i mu.n oq èn i c a * de

Os passos subsequentes são então dirigidos para superar a outra limitação significativa., fisico-química para fazer ligações covalentes a polissacáridos, sendo aquela a falta

> grupos funcionais nos polissacâridos, outros que nos grupos hid rοκi 1 o que são sufieien t emen te rsac tivos com rsagentes uti 1 i— zados normal ou praticamente para a funcionalizaçSo de unidades com as quais é desejada a lio-ação» A activação do polissacârido para formar um polissacârido activado, reacçSo com bis-nucleéfi-~ los para formar um polissacârido nucleófilo funcionalizado, e funcionalização com reagentes geradores de quer sítios eIsctrotil icos quer grupos tiol, são todas dirigidos para modificar covalentemente o polissacârido e desenvolver grupos funcionais no polissacârido em preparação paira conjugação.

No passa seguinte, o polissacârido solubil.izado é activaoo por reacçlo com um reagente bifuncional a cerca de Θ°“50°C5 enquanto agitada durante dez minutos a uma hora, com a razão de peso crucial de agente de activante para polissacârido no intervala de Ís5 a '1; 12 , No passado, esta ac ti. vagão foi realizada por reacção do polissacârido com brometo de cianogénio* Contudo, os derivados activados com brometo de cianogénio. que t.@m uma "proclividatíe” para diois vizinhos, mostraram estabilidade transitória durante diàlise contra um tampão de fosfato. Por conseguinte, embora a activação com brometo de cianogénio seja ainda possível de acordo com o presente invento, este reagente é fracamente utilizado na activação de polissacáridos e não é preferido. Por outra, as reagentes bifuncionais preferidos para activação de polissacárido incluem derivados do ácido carbónico, 0 u RJ~--C—R"~, em que R"" e R“ podem ser independentemente azolilo, tal como imidazolilo? haletoss ou ésteres de fanilo, tais como D-nitrofenilo, ou poli-halofenilo. 0 carbonildiimidazol, um reagente particularmente preferiao, reagirá com os grupos hidroKiio para formar imidazoiiluretsnos dc polissacárido, e os c ioroformatos de srilc; incluindo,, por exemplo, aloroformato da nitrofenilo, produzirão carbonatos misturados do polissacárido» Em cada caso, o polis-· sacárido activado resultante á muito suscaptivei a reagentes nucleofílicos, tais coma aminas, e é par conseguinte transformado nas ureianas rsspsctivas.

Na fase seguinte, o palissacárido activado é feito reagir com um reagente nucleofílico, tal como uma antina, parti

H

H >, hA<ch0> ,y«ch0> -Ah, cularmante diaminas, por exempla, ΗΝίυΗ,,Ι^ΥίΟΗ,,Ι^-ΝΗ, em que m e 034, n é ® a 3, eYá CHos 0, S, NR', CHCO^B, onde R' é H ou um il xC. alquilC. ou C„* de modo que se Y for CI-w. então m e n não podem ser iguais a zero, e se Y for 0 ou S, então m è maior do que í, e n é maior do que í, num grande excesso total de amina Cisto é, por exemplo, um excesso molar de 5Θ a 10® vezes de amina versus agente activante utilizado), A reaeçao ê mantida num banho de gslo durante 15 minutos a uma hora depois mantida durante 15 minutos a uma hora a cerca de 17° a 4®°C.

Um polissacárido activado, quando feito reagir com uma diamina, por exemplo, í,4-butanodiamina, resultará num polissacárido em forma de uratana com aatinas pendentes, que pode então ser funcionalizado adicionaImante por acilaç-So» Os carbonatas misturados reagirão também prontamente com diaminas para resultar sm grupos amina pendentes, AIternativamenta, o polissacárido activado pode ser feito reagir com um nucleófilo, tal coma uma mono-haloaoetamida de um diaminoalcano, por exemplo, 4—bromoacetamidobutilamina Cver, W. 8, Lawson et_al., Hoppe SeylerJs Z, Physiol Chem.. 549, 251 C i9AS)>, para gerar um polissacárido modificado

í_ uva 1 sn temes i te c om sátios eiectrofíliccs pendentes. Ou, α polis-sacárido activado pode ser feito reagir com um aminotiol, tal como cisteamina íaminoetanotiol) ou cisteina, exemplos de derivados que são bem conhecidos na arte de sintese de péptidos, para produzir um polissacárido com grupos tiol pendentes. Em ambos os casos, não é necessária a funcionalisacão adicional antes do acoplamento do polissacárido modificado covalentemente à proteína “veículo" bacteriana modificada. 0 último passo na preparação uo polissacárido, a íuncionalização adicional, se necessária, do polissacárido, pode tomar a forma de quer reacçâo do polissacárido nucleófilo funcio-nalísado com um reagente para gerar sítios eiectrofilicos íisto é, tiofílico), quer com um reagente para gerar grupos tiol.

Os reagentes adequados para utilização na produção de sítios eiectrofílicos, incluem por exemplo, aqueles para acilação UK: ΪΪ | í

a a-haloacstilo ou «-halopropionilo, derivados tais como XCdHM (em que R ê H ou fc-H_5 X ê Cl, Br ou lp e X' é nitrcfenoxilo, * dinitrofenoxilo, pentaelorofenoxilo, pentafluorofenoxilo, haleto, Π— (N—hidro>;issucciniusi.di 1 o) ou. acido), particularmente, ácido cio r o a cético ou ácido a—bromopropiónico, com a rescçao a decorrer a um pH de S a íl (mantido neste intervalo pela adição de base, se necessário) e a uma temperatura de cerca de 0o a 35°C, durante jUí minutos a uma hora. Um polissacárido amino derivado pode ser s.cilado com aminoáeidos· de maleimido activados (ver, 0. Kel ler et âJL« ? Hei v. Chim. Ac ta., 58, 531 (1975)) para produzir grupos maleimido. οII—C(CH2) ν I rο ο

Sm que pé i a 3; com um agente 2 bromoacetato de p—nitrofenilos ou ácida carbojíí 1 ico, por exemplo» ha 1 oacetiiante,, tal como com um derivada a—haloceton do 0 ho2c

(Ber. , 67, 12©4, (1934)) de modo a produzir polissacáririos apropriadaments funcionalizados suseepiiveis para subetituiçSa l-in v_ ± U .t ue reagentes adsqusoos para utxIxzauSQ na ρrodução ds grupos tiol incluem, por exemplo, reagentes adiantes, tio1actonas, por exemp1o, tais como

(ch2)P, „4 . , em que K e aiquilu

a C r\*i ti L,Hs- ou O ·-! • . ..·j.,, s μ ti i a -5 h ítí 1·:.·

NHCOR Ú C0 -0-,.SSCH- (UH._.) ÔH-CGX', em que m é O a 4S Ru é alqui IC, a C ou C, , e X' é cama definida a. cima , seguida por tratamento com wf CH^jCH^OHj ou NHCOR"

1 S UNic^-S-CH,.,(Ci-L·) CHCOX*, em que m, R'- e X' s«fo como definidos a. ·„.< a. o Os imediatamente acima» depois tratamento com ditiotrsitol» Tais reacçSes sSq realizadas numa atmosfera de asatc, a cerca de ©° a 35 °C e a um pH de 8 a 11 (com base adicionada, quando necessário, para manter o pH dentro deste intervalo), durante uma a vinte e quatro horas» Por exemplo, um polissacárido amino derivado pode ser feito reagir corn

NHCOCHg rt r? v— "c j-~.· t

Unf μθ1 ISSaCârido

Funcionalizado»

Par estes passos, são produzidos. então polissacáridos modificados covalentemente das formas, Ps—A—ES- ou Ps--A'“SH~? em "jUe t.S é -CCHX ou o

O

II K —C(CH2)pN !

V o A funcionalizaçlío separada da. proteína a ser acoplada ao ρο 1 i ssacé.r ido, envolve a rescçSo da proteína com um ou ma is reagentes para gerar um grupes tiol. ou a reacçSo da proteína com um ou mais reagentes para gerar um centro elecirofilico (isto ê, t.I.OT:!. 1 ÍCO) „

Na preparação para a conjugação com um polissacárido electrofílico funcionalizado, a proteína é feita reagir num ou dois passos com u.m ou mais reagentes para gerar grupos tiol, tai· como aqueles reagentes acilantes utilizados para gerar grupos tiol em polissacáridos5 como discutido nas páginas 15—17 acima. As proteínas tioladas podem ser também preparadas por proteínas carboKi act ivadas amin antes, tais como aque1as mostrai Atassi et a 1., Biochem et Biophys. Acta, 67Θ* - 3ΘΘ, <1 aminotiois. para criar a. proteina ti o1ada. Uma conere com preferida deste passo do processo envolve a acilação directa dos grupos amino pendentes (isto è, grupos lisilo) da proteína comi N-acetil-homocisteínatíolactona a cerca de ©* a 35°C e pH 8- 11, durante cinco minutos a duas horas, utilizando pesos equivalente·; de reaqentss»

Quando E'B' é Λ π I N(CH2)PC, as condições e o processo de preparação da proteína funcionali-sada são coma discutidos acima para a preparação do polissacárida complemento por reacçlo com ácidos de maleimido activados. ' Na preparação para a. conjugação com um polissacárida bacteriano modificado covalentemente com grupos tiol pendentes, a protama ú aciiada com um reagente gerando um centro eiectrof±~ 0 !l 1ico, incluindo tais agentes acilantes, por exemplo, XCH^C-X' e CH_ 0 XCN - CX' a’ , em que X e a‘ sâo como oeTimaos acima; e \ o ''cot N CCH2),C-X' s

2tí coma em que a' é coma definido -acima» As proteínas adequadas com centros electrofílicos também incluem, por exemplo, aquelas preparadas por acilaças dos grupos lisilamino pendentes com um reagente,, tal como ácidos de maleimido activados, por exemplo. o o

I

ou por reacção da proteína carboxi-activada com derivados mono-· .-haloacetilo de diaminas» Em ambas as reacçSes de preparação, a temperatura é de €>° a. 35°C durante cinco minutos a uma hora. ε o pH é de 8 a 11« A formação do con juqadí então, meramente, uma questão de fazer reagir qualquer um dos polissacáridos modificados covalentemente tendo centros electrofílicos pendentes com a proteína, bacteriana HIP tendo grupos tiol pendentes a um pH de 7 a 9, em razões de pesos equivalentes aproximados, numa atmosfera de azoto, durante seis a vinte e quatro horas a cerca de 170 a 4Θ °C, para dar um conjugado cova lente» Exemplos de tais reacçSes incluem?.

OH 0 NHCOCH.

Ps—CNCH-CH^CH^jCH-.NHCCH^Br + HSCH^CH^ÒHCO-Pro OH 0 NHCOCH-, U | I! I -i P sC^CH0CH0CH0CH„NHCC'H _SCH„CH„ ÈHCOP r o, ·£» «Λ» ·£- j^L «£

em que um polissacárido activado que fax feito reagir com 4-broffio·· acetamidohutiismina é feito reagir com uma proteína que foi feita reagir com N-acstil-homocisteínatialactana, para formar um conjugada, oq OH 111

PsCNY" —NCCH2N

HSCH2CH2NHCCH2CH2CPro 0 O O 11 11 PsCNHT NHCCH2- N

.CH2CH2NHCCH2CH2CPro

0 II

0 II (onde Y'* é um rad icai a 1 qui 1 ) ;i em jC. O amino deri vado que ; foi feita reagir com activados é fei to reag x r com uma protsíi n pagado. tox amxnaaa com um aminatxoisara formar um

Similarmentej qualquer um dos polissscáritíos modificados o ova len temente· com grupos tiol pendentes pode ser feito reagir com a. proteína faacteriana MIP tendo centros electrofílicos pendentes para dar um conjugado cavalente» Um exemplo de uma tal reacção és ο ο Ο Η

PsCNHCH„CH„BH + ProCCH„CH„C-NÍCH„>,NHCOCH„Br 2 A 2 2 2 4 2

OH

OH 0

FsCftCH^CH^SCH^Cft iCH2)4NHCCH2CH2CPro, sm qus um polissacárido activado que foi feito reagir com um aminotiol é feito reagir com uma proteína carboni—activada que foi feita reagir com derivados mono—haioacetilo de uma diamina, para formar um conjugado.

Como actividade electrofílica de um excesso de grupos haloacatilo necessita ser eliminada, a resxçSa do conjugado com um tiol de baixo peso molecular, tal canso n-aceiilcistesmina, realizará esta finalidade. A utilização deste reagente, n-acetil-cisteamina, também permite a contagem de confirmação das porções de haloacetilo utilizadas (ver Secção D), porque a S-carboxime-tilcisteamina que é formada pode ser, unicamente, detectsda pelo processo de Spackman, Hoore e Stein.

Estes conjugados são então centrifugatíos a cerca de 100 &00 x g utilizando um rotor de ângulo fixo durante cerca de duas horas a cerca de Io a Ξθ*€·;, ou são submetidos a um qualquer de uma variedade de outros procedimentos ds purificação, incluindo a penetração sm gel, cromatografia de exclusão iónica, centrifugação ds gradiente, ou outra cromatografia de adsorção diferencial, para remover proteínas e polissacáridos ligados não covalentem-ente, utilizando o ensaio de covaltncia para o espaçador bigené-rico (ver abaixo) como um processa de seguimento da actividade biológica desejada. A separação adicional dos reagentes pode ser realizada por cromatografia de exclusão da tamanha numa coluna, ou no caso 31 / de proteínas não solúveis muito grandes, a separação pode ser realizada por ultracentrifugação, A análise do conjugado para confirmar a covalência, e consequentemente a estabilidade do conjugado, é realizada por hidroli.se do conjugada ípreferivelmente cora HC1 6 N a 1 iΘ°C durante 2Φ horas), depois analise quantitativa para o aminoácido do espaçador hidroliticamente estável c e aminoâcidos constituintes da proteína, m Lutarmwiy aminoàcidos da proteína pode ser removida, se necessário, por comparação com o aminoácido apropriado padrão para a proteína envolvida, reflectindo o valor de aminoácido restante a covalln-cia do conjugado, ou o aminoácido do espagador pode ser consebido para aparecer fora do aminoácido padrão da proteína na análise. 0 ensaio de covaIeneia ê também útil para monitorizar os procedimentos de purificação para marcar a intensificação de concentração dos componentes biologicamente activos. Nos exemplos

OH NHCOGH- acima, a hidrólise de PsCNCH^CH^CH^CH„NHCCH^SCH„CH,,CHCOPro resulta na libertação de S-carboxiinetil-homocisteína, NH,_ HO.-jCuH.-SCH.-jwH.-jCHL-O.-Hs a hidrólise de ο Ο PsCNHT NHCCH2 Ν

H,CH2NHCCH2CH2CPro Ο Μ resulta na libertação do ácido aminodicarboxilico, HO,-jCCH.?CHSCH7CH.~,MH.-,r, s a hidrólise de riu .-fw

uH OH U i i-sCteH„CH_SCH?C['\fCCH...J)^MHCCH^CH^CPro resuIta na libertaçlo de S-carboximetiicisteamine, H^NCH.JjB^SCH^CD-H por c 1 ivagem da molécula Ps-A-E-S-B-Pro nas ligações peptídicas e noutras- liga-çSes hidroliticamente instáveis» Os processes cromatográficos, tais como aqueles de Spackman, Moore, e Btein, podem entio ser aplicados convenientemente e determinada a razão de constituinte de aminoácido» A produção óptima de anticorpos IgB requer a colaboração dos linfócitos T e B com especificidade para o antigénio de interesse» Os linfócitos T são incapazes de reconhecer os polis-sacâridos mas podem proporcionar auxilio para as respostas do anticorpo IgB anti-polissacárido se o polissacárido estiver covalentemente ligado a uma proteína que a célula T έ capaz de reconhecer» u u li

Em ratinhos esta requisito existe para respostas de anticorpo, secundárias·, assim como primárias, e e especifico de ve í c u 1 o ·, i s to é, uma resposea s anticorpo secundária ocorre sómente se as células T auxiliares tiverem sido. previamente, sensibilizadas com proteína veículo utilizada para a imunização secundária. Por conseguinte, a capacidade de um ratinha para produzir uma resposta de anticorpo secundária a um conjugado de PRP~proteína ê dependente da presença de linfócitos Ϊ inoculados com especificidade para a proteína veículo. A demonstração da capacidade da MIP para proporcionar um veículo que inocula respostas de anticorpo anti-PRP foi feita em ratinhos adoptivamente inoculados com PRP ligado covalente-mente a um veículo hsterélogo, ΐοκά-ide de difteria CBT>. Foi utilizada transferência adoptiva de modo a determinar se a administração de linfócitos inoculados com MIP sèzinha era suficiente para gerar actividade de célula T auxiliar eficaz para a formação de anticorpo anti-PRP em resposta a PRP-OMPC. As respostas de anticorpo anti-PRP secundárias comparáveis foram induzidas por PRP-OMPC quando os linfócitos inoculados com MIP ou OMPC foram transferidos, indicando assim o reconhecimento de

r-fàl.ilaci T

uias i de resíduos de OMPU

HiS puf ysíO

MIP

Os conjugados PRP-MIP foram testados quanto â imunoge-nicidade em ratinhos assim como em macacos Rhssus recém-nascidos. A resposta imune em ambos os modelos- animais partilha, com humanos recém-nascidos, uma deficiência na sua capacidade para gerar respostas de anticorpo contra antigénios T-independentes cais como polissacarxdos haccerianos. Estes animais são normal-mente utilizados como modelos para determinação da resposta imune de humanos recém-nascidos a vários antigénios.

Uma ou rnais das vacinas conjugadas dêste inventa podem ser utilizadas em espécies de mamíferos quer para protacção activa quer passiva profilacticamenis ou terapeuticausente contra agentes infbcciosos incluindo bactérias» rickettsia, parasitas, e 34 -

vírus, ou contra toxinas ou tóxicos, alergénios, e células de mamíferos ou outras células eucariótas» A protecção activa pode ser realizada por ínjecçSo de urna quantidade eficaz capaz de produzir quantidades mensuráveis de anticorpos {por exemplo, 2 a 5Θ pg> de um antigénio (por exemplo PRP) na forma de ΜΙΡ-conjogado de cada. um dos conjugados a ser administrado por dose, A utilização de um adjuvante (por exemplo, alumén) pretende também estar no âmbito deste invento. A protecção passiva pode ser realizada por injecção do antissoro total obtido a partir de animais previamente doseados com o Hlp-conjugado ou conjugados, ou a globulina ou outras fracções contendo anticorpo dos referidos antissoros, com ou sem um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como uma solução salina estéril. Tal globulina é obtida a partir do antissoro total por cromatografia, fraccionamento em álcool ou sal ou electroforese. A protecção passiva pode ser realizada por procedimentos de anticorpo monoclonal padrão ou por imunização de hospedeiros mamíferos adequados.

Numa concretização preferida deste invento, o conjugado é utilizado para vacinação imunogénica activa de humanos, espe-c:ialments recém—nascidos e crianças, indivíduos imunocomprometi— dos (tais como pessoas asplénicas a pacientes pés-quimioterapia) e dos idosos, rara estabilidade adicional, estes conjugados podem também ser liofilizados na presença de lactose (por exemplo, a 2Θ μς>/ml. de PRP/4 mg/mL de lactose) antes da utilização.

Um nível de dosagem preferido é uma quantidade de cada um dos ΜΙΡ-conjugados, ou seu derivado a ser administrada, _orresporidendo a entre aproximadamente 2 a 20 μα de PRP na forma 0=e ΗϊΡ-conjugado para conjugados de polissacárido de H. influen-.-jg? serotipo B numa única» administração. Se necessário, podem tamb-ém ser administradas uma ou duas doses adicionais do MlP-con-jugsdo? ou seu derivado, do polissacárido de H, influenzae

correspondendo entre aproximadamente 2 conjugado. sara tipo 33 numa quantidade a 2Θ μα de PRP na forma de 0 invento é definida adicionalmente por referência aos exemplos seguintes, que se pretende que sejam ilustrativos e não 1imi tativos. EXEMPLO 1

Preparação do OHPC de Meisseria meninqitidís Bíl serotipo 2 A. Fermentação 1. Meisseria meninqitidis grupo Bil

Um tubo contendo a cultura iiofilizada de Nsisseria rneningítídis (obtida a partir de Br» M. Artenstein, Uislter Reed Army Institute of Research íWRAXR), Washington, D.C.) foi aberto e foi adicionado Eugonbroth ÍBBL). A cultura foi riscada em declives de àqar Mueller Hinton s incubada a 37°C com C0_ a 5% durante 3ò horas, tempo no qual α crescimento foi colhido em meio de leite desnatado a 1 &a (Difco), e as alico-tas foram conqeladas a -7Ô°C. A identidade do organismo foi confirmada por aglutinação com antissoro especifico fornecido por WRAIR, e soro padrão t o rn ecido por Difco.

Um frasco da cultura da segunda passagem- foi descongelado e riscado para 1Θ placas de ágar Columbia Sheep Blood <CBAB-BBL). As placas foram incubados a 37°C com C0._, a 5% durante 18 horas após o qu.e o crescimento foi colhido em 1ΘΘ mL de meio de leite desnatada a 10%, as dades de β,5 mL e congeladas licotas foram retiradas em quanti--70°Ce Q organismo foi identifica do positivamente por aglutinação com antissoro específico, fermentação em açúcar e coloração Sram.

Um frasco da cultura desta passagem foi descongelado, diluído com Hueller-Hinton Broth e riscado em 4© placas de ágar de Mueller—Hinton» As placas foram incubados a 37°C com C0o a 6% durante 18 horas após o que o crescimento foi colhido em 17 mL de meio de leite desnatado a 10%, foram retiradas alicotas em quantidades de ©,3 mL e congeladas a --7Θ°C» O organismo foi identificado positivamante em coloração Bram, aglutinação com antissoro específico e teste de oxids.se» 2. Fermentação e recolha da pasta de células a» Desenvolvimento do Inóculo- 0 inóculo cresceu num frasco congelado de Neisseria meninoiti;-jis do Brupo B, B-íl do acima (passagem 4). Foram inoculados dez declives de ágar Mueller—Hinton foram inoculados, e seis foram colhidos aproximadamen-te 18 horas mais tarde, e utilizados como inóculo para 3 frascos de 25© mL de meio dialisado de levedura de Botschilch a pH 0,35. A DO foi ajustado a 0,18 e incubado até a D.O.,,. est-ar entre 1 e 1,8, 1 mL Desta cultura, foi uti 1 izado para inocular cada um 5 2L, Os frascos Erlenmeyer (cada contendo i Litro de meio? ver abaixo) e incubados a 37*C num agitador a 20€í rpm. A D.O. foi monitorizado a intervalos de uma hora a seguir à inoculação. Resultaram 4 litros de caldo de cultura, numa D.O, . de 1,28. OO0

Fermentador de Sementes de 7© Litros- Foram utilizados aprouimadamente 4 litros de cultura de sementes para inocular um fermentador de 7© Litros estéril contendo cerca de 40 litros d© de produção completo (ver abaixo) » A: fermentação de 70-1itros incluíram 37CC, de ar de i0 litros /minuta s controlo de pH 7,,0 durante cerca de 2 horas,·. Para est foi de 0,732 após 2 horas. meia s condiçSes para a. 185 rpm com pulverização pH constante a cerca de e lote, a D.O»^^ final

Fermentador de Produção de 800-Litros

Foram utilizados aproximadaments 40 litros ds cultura de sementes para inocular um fermentador de 800 litros estéril contendo 568,2 litros da meio de produção completa (ver abaixo), Este lote foi incubado a 37°C, ί® Θ rpm com pulverização de ar de 60 Iitros/minuto e controlo porção, a D,0, final foi de de pH constante a pH /,0. Para e 5,58 treze horas após inoculação 3, Meio Completo para Frascos Erlenmeyer e fermen— tadores de 7Θ e 800—Iitros

Fracçlo A ácido L-q 1 utâmico 1,5 g/litro NaCl 6,0 -g/litro NaoHP0^, an idro 2,5 q/litro NH «Cl 4 1,25 g/litro KCl 0,09 g/litro L-cisteina HC1 0,02 q/litro 3 3

m »*o

Fracção B CDialisado de Levedura de Boischlich);

Foram dissolvidas 1280 q de Extraeto de Levedura de Difco em 6,4 litros de água destilada* A solução foi. dialisada em 2 unidades de diálise de fibra côncava. Amicon DC--3© com três cargas H10SM. Foram dissolvidos 384 g de MgSO^.7R,0 e 32®Θ g de dexirose no dialisado e o volume total levado até 15 litros com água destilada» 0 pH foi ajustado a 7,4 com NaOH, esterilizado por passagem através de um filtro de 0,22 μ, e transferido para o fermentador contendo a Fracçao A.

Para os frascos Erlenmeyer; Foram adicionados i litro de Fracção A e 25 mL de Fracçao B e o pH foi ajustado a 7,0-7,2 com NaOH»

Para o fermentador de 7® litros; Foram adicionados 41,8 litros de Fracção A e mL de Fracção B e o pH foi ajustado a 7,0-7,2 com NaOH»

Para o fermentatíor de 800 litros; Foram adicionados 553 litros de Fracção A e 15,0 mL de Fracção B e o pH foi ajustado a 7,,0-7,2 com NaOH» d» Colheita e InactivaçSo

Após a fermentação estar completa, foi adicionado fenol num vaso separado, para o qual o caldo de células foi então transferido, rendendo uma concentração em fenol final de cerca de ®,5%» 0 material foi mantido à temperatura ambiente com agitação cuidadosa até que a cultura não seja mais viável (cerca ds 24 horas)» e» Centrifugação de cultura inactivada foram centri' da ΐluxo continuo Sharplss* 0 peso tratamento com fenol foi de 3,875 4*Cç os 614,4 litros de fluído fugado através de centrífugas da pasta de células após kg =

B« Isolamento do OMPC

Passo 1. Concentração e diafiltração A cultura inactivada com fenol foi concentrada para cerca de 3Θ litros e diafiltrado em água destilada estéril uti1 içando filtros ds fibra côncava ã„2 u ÍEWKA).

Passo 2. Extracçlo

Um volume igual de tampão 2X TED Ctampão TRIS ®,1 W EDTA Θ,ΘΙ M, pH 8,,5, com desoxicolato de sódio a Θ,5%.1 foi adicionado às células diafiltradas concentradas. A suspensão foi transferida para um tanque de temperatura regulada para extracção do OMPC a 5ó*C com agitação durante 3Θ minutos» 0 extracto foi centrifugado a cerca de 18ΘΘΘ rpm numa centrífuga de fluxo contínuo Sharples a uma velocidade ds fluxo de cerca de 8© mL/minuto, a cerca de 4°C. 0 sobrenadante viscoso foi então recolhido e armazenado a 4°C« As pelotas de células extractadas foram reextractadas em tampão TE.0 como descrito acima,, Ds sobrenadantss foram reunidos s armazenados a 4°C.

Passo 5« Concentração por UItrafiltração 0 efítracto reunido foi transferido para um vaso de temperatura regulada ligado a filtros de poliesulfona ô,i micron AB-Tech. A temperatura do esítracto foi mantida e. 25°C no vaso ao longo do processo de concentração. A amostra foi cone:entrada dez vezes a uma pressão de transmembrana média entre 75,79 e 165,36 kPa.

Passo 4. Colheita e Lavagem do OHPC 0 retida do Passo 3 foi centrifugado a cerca de 160Φ&& κ g C35ΘΘΘ rpm) a cerca de 7®C'C numa centrífuga de fluKQ contínuo a uma velocidade de ίίακα entre 3Θ® a 5ΘΘ mL/minuto, e o sobre™ nadante è rejeitado. A pelota de OHPC foi suspensa em tampão TED (19® mL de tampão; 2® mL/g de pelota) e a Passo 2 e Passo 4 foram repetidos duas vezes (omitindo o Passo 3·),=

Passo 5. Recuperação do Produto QMPC

As pelotas lavadas do Passo 4 foram suspensas em 1Θ® mL de água desfilada com uma vareta de vidro e um homogeneizador Dounce para assegurar a suspensão completa. A suspensão de OHPC aquosa foi então esterilizada por filtro por passagem através de um filtro ds ®,22 μ, e o tampão TED foi substituído por água por diafiltração contra água destilada estéril utilizando um filtro de fibra côncava de ®S1 μ. 4Í EXEMPLO 2

Preparação do Polissacárido Capsular de H, influenzae tipo b CPRP)

Desenvolvimento dos Inóculo e Semente

Fase A: Um tubo liofilizado de Haemophilus influenzae tipo b,;. (cultivado a partir de Ross 7òS« recebida da State University of Wew York) foi suspenso em 1 mL de meio de inóculo de Haemophilos estéril (ver abaixo) e esta suspensão foi espalhada em 9 declives de Âgar Chocolate íBBL)„ 0 pH do meio de inóculo foi ajustado a 7,2 ± ® 51 (um valor típico foi pH 7,23) e a solução de meio foi esterilizada antes da utilização em autoclave a 121!:,C durante 25 minutos» Após 2® horas de incubação a 37°C num pote de vela, o crescimento de cada placa foi ressuspensa em 1-2 mL de meio ds inóculo de Haemophiluse foram reunidos pares de declives.

Meio de Inóculo de Haemophilos

g/Litro

Peptona. de soja

NaCl

NaH^PU^ 13, ±é volume

Wa^HPO. j*;. 4 K.J-1PQ. áciUei destilada

λ

As células ressuspensas de cada par de declives foram inoculadas em tr§s frascos Erlenmeyer de 250 mL contendo cerca de 10© mL de meio de Produção e de Semente de Haemophilus. Os frascos de Ξ5© mL foram incubados a 37*C durante cerca de 3 horas até ser alcançado uma DO.-de cerca de 1,3. Estas culturas foram utilizadas para inocular os frascos de 2 litros (abaixo).

Fase B; Frascos Erlenmeyer não despistado (Baffled) de 2 litros- foram utilizados 5 mL de cultura da "Fase A" (acima) intendo para inocular cada um de cinco frascos de dois-litros, cada um cerca de i?6 litros de meio de produção e de sementes de Haemophi1us completa (ver abaixo). Os frascos foram então incubados a 37°C num agitador rotativo a cerca de 2ΦΦ rpm durante cerca de 3 horas. Um valor de típico no fim da período de incuba ção foi de cerca de 1,6.

Meio de Produção e deSemente de Haemophilus Completo

Por litro

3,1 g/L 13,7 g/L 10 g/L 1© g/L 2,5 g/L 5,0 g/L 5?(·? g/L 2 mg/L 5 mq/L

NaHJPG4

Ma^HPO A. 4

Peptona de Soja

Diafiltrado de extracto de levedura (1) k„hpo4

NaCl

Blucose (2)

Adeninadinucleótido de Nicotinamida ÍNAD) (3)

Hemina C4) 43

Os sai=> e a peptona de soja foram dissolvidos em pequenos volumes de á.gua livre de pirogênios, quente e levadas ao volume final correcto uom agua livre de pirogénios quente adicional» Os fermeniadores ou frascos foram então esterilizados em autoclave durante cerca de z.3 minutos ^ 121 C'C, e após arrefecimento foram adicionados, assepticemente, diafiltrado de eKtracto e Hemina C 4> aos frascos de levedura <í)5 glucose (2), NAD (3), ou fermentadores antes da inoculação. (1) Diafiltrado de extracto de leveduras foram dissolvidos 100 g de eKtracto de levedura de cervejeiro (Amher) em 1 litro de água destilada e ultrafiltrados utilizando uma unidade de fibra côncava Amicon DC>30 com carqas H10 κ 50 com um corte (cutoff)de 50 kd« 0 filtrada foi recolhida e esterilizada por passagem através de um filtre* de 0,22 μ, (2) A glucose foi preparada coma uma solução a 25% estéril em água destilada» (3) Uma solução armazenada de NAD contendo 20 mg/mL foi esterilizada por passagem através de um (filtro de 0,22 μ) e adicionada acepticamente imediatamente antes da inoculação.

(4) Uma solução concentrada de Hemina 3X foi preparada por dissolução de 200 mg em 10 mí_ de NaOH 0,1 II e o volume ajustado com água esterilizada, destilada até 100 mL. A solução foi esterilizada durante 20 minutos a 121°C e adicionada acepticamente ao meio final antes de inoculação.

Fase C: Fermentador de Sementes de 70-litros- Tr§s litros do produto da Fase B foram utilizados para inocular um fermentador contenda cerca de 40 litros de Meio de Produção e de Semente de Haemophilus completos (preparado coíbo descrito acima) 44 e 17 fflL de agente anti-espuma UCOW B625» 0 pH na inoculação foi da 7..4..

Fase Bs Fermentador de Produção de 80€»-litros— Foram utilizados aproKimadamente 4© litros do produto do "Fase C” para inocular um fermentador de 800-1itros contendo 570 litros de Maio □e Produção e de Semente de Haemophilus (preparado como descrito acima), medido atã ao volume necessário, e foram adicionados 72 ml. de agente anti-espuma UCON LB625» A fermentação rpm, com a D,0* ^ e ní' todas as duas horas até foi mantida a 37*C com agitação a 100 eis de pH medidos aproKimadamente em a DO,..Λ estabilizar durante um período de iyiiv foi terminada (uma DO,,.., <S <30 cerca de 2Θ horas)« duas horas, após o que a fermentação final típica fai. de cerca ds 1,2 apó-

COLHEITA E INACTIVAÇÃO por

Foram inactivados aproKimadamente oiheita num "tanque de morte" contendo ó-00 litros du lote 12 litros de timero- w.3.3. i

CLARIFICAÇÃO 4°C, α lote foi centri-Sharples com taça de ada para manter a clareza tros por minuto), 0 15ΘΘ0 rpm) foi utilizada

Após 18 horas de inactivação a fugado numa centrífuga de f'iu:-;o contínuo 10,16 cm a uma velocidade de fluwo ajusb do produto ( variável entre 1,3 e 3,® li sobrenadamte obtido após centrifugação í para recuperar o produto»

ISOLAMENTO E CONCENTRAÇÃO POR ULTRAFTLTRAçâO O sobrenadante de duas fermentações de produção foi reunido e concentrado de 2 a 8*C numa unidade de ultrafiltração

Romicon XM---C com vinte car •gas ds fibra côncava ícutoff) de 5Θ kd (érea de membran a 4,5 m'1-s flux: 137,8 kPa). A concentração foi tal que apés apro horas, cerca ds '19®® litros tinham sido concentrados para 57,4 litros- 0 filtrado foi rejeitado» PRECIPITAÇÃO DE ETANGL A 48% E 61%

.ssags !iTi através i de uma única pies de 1®,16 cm a IS®®® rpm de ®, 4 litros por minuto» A

Foram adicionados, gata-a-gota, aos 57,4 litros de retido por ultrafiltração, 53 litros de etanol a 95% durante í hora com agitação a 4°C para uma concentração final de etanol a 48% em volume» A mistura foi agitada durante duas horas adicionais a 4°C para assegurar a precipitação completa, e o sohrena-d ante foi recolhido a seguir á p« centrífuga de fluxo contínuo Shai uma velocidade de fluxo ds cerca pelota foi rejeitada e o fluido clarificado foi trasido para etanol a 82% com a adição de 4®,/ u.m peri odo de uma hora» A mistura adlcion ais para assegurar a preci

RECUPERAÇÃO DA SE8UNDA PELOTA et ano centr 0 precipitado a 48% resu. 11 an te fuga de fluxo corr insolúvel em e f oi reco1hi do ínuo Sharplas tanol a 82% e solúvel em por centrifugação numa de 1®,16 cm a 1 5®®© rpm com

e 0 ,Ξ4 i x tru'D por aui iutu t foi a 82%, 0 rendimento de produto sta húmida. uma velocidade de fluxo de cerca d rejeitado o sohrenadants em etanol bruto foi de cerca de 1,4 kg de pa

EXTRACÇSQ COM CLORETO DE CÃLCIO

0 1,4 kg do material insolúvel em etanol a 82%, foi misturado num vaso de dispersão Day maκ 2°-8°C com 24,3 litros de água destilada, fria, Foram adicionados a esta mistura, 24,3 litros de 0301.-,.28.-,0 2 M, frio, e a mistura foi incubada a 4°C JI» itlll durante 15 minutos» 0 vaso foi então lavado com 2 litros de CaC1^.2H^0 1 M, resultando em cerca de 5Θ litros de volume final, PRECIPITAçKO COM ETANOL A 23%

Os 5Θ litros de e>:tracto de 0aClo foram trazidos para tí. etanol a 25% por adição gota-a-gota da 16,7 litros ds etanol a 95% com agitação, a 4°C durante 3* minutos» Após agitação adicional durante 17 horas, a mistura foi recolhida por passagem através de uma centrífuga ds fluxo continuo Sharples a 4°C. 0 sobrenadante foi recolhido e a pelota foi rejeitada,

PRECIPITAÇSO COM ETANOL A 3B% E RECOLHA DA PASTA DE PRODUTO

BRUTO U soDrenadamisí soluvsl ens ea foi trazido par etanol a 38% pela adição gota-a-gota de 13,9 litros de etanol a 95%, com agitação, durante um período de 3Φ minutos» A mistura, foi então deixada premanecer com agitação durante uma hora, depois sem agitação durante 14 horas, para -assegurar a precipitação completa. A mistura resultante foi então centrífuga— da numa centrífuga de fluxo contínuo Sharples de Ιθ,ΐό cm a 1 5€’©© rpm (velocidade de fluxo de ô,2 litros por minuto) para recolher o precipitado de polissacárido de H. iπf 1 yen7. as bruto.

TRITURAÇÃO A pelota da centrifugação foi transferida, para um misturador Warxng de 4,545 litros contendo 2 a 3 litros de etanol absoluto e misturada durante 3© segundos à velocidade maior. A mistura continuou, durante 3© segundos ligado (on), e 3© segundos desligado Cof), até resultar num pé branco duro. 0 pó foi recolhido num funil de Buchner com um disco de filtro de teflon e lavado sequencialmente, in situ. com duas porções de i litro de etanol absoluto e porções de 2 litros de acetona. 0 material foi então seco, in vácuo, a 4*0 durante 24 horas, resultando em cerca de 337 g (peso seco) de produto.

EXTRACÇSO COM FENOL

Cerca de 168 gramas do material seco do passo de trituração (cerca, de metade do total) foram ressuspensos em 12 litros de acetato de sódio ©,488 Μ, pH 6,9, com a ajuda de um vaso de dispersão Daymax. A solução de acetato de sódio foi irnediatemente extractada com 4,48 litros de uma solução de fenol aquosa fresca feita como se segues 59© mL de acetato de sódio !©;i488 M, pH 6,9, foram adicionados a cada uma de oito garrafas de 1,5 kg de fenol (Mallinckrodt cristalino) num vaso de pressão de 2© litros e misturados na suspensão. Cada axtracio de fenol foi centrifugado durante 2,5 horas a 3©β©© rpm e 4°C na ultracentri-fuga 1<2 (Electronucleonics) „ 0 efluente aquosa fai extractada ia tre's vezes adie dese r i to ac. ima

onais com solução de fenol aquosa fr*· As fases de fenol foram rejeitadas» oa ·_ o mo

ULTRAFILTRAÇSO A fase aquosa da primeira extraeção com fenol acima <3.2,2 litros) foi diluída com 3©@ litros de água destilada fresc* e diafiltrada a 4°C num aparelho de ultrafiltração Amicon DC-30 utilizando 3 cargas de corte (cutoff) de 10 kd, Η1ΘΡi&, para remover o fenol de transporte» A unidade Amicon foi lavada e a lavagem adicionada ao retido» tal que o volume final foi de 3i,5 litros» 0 ultrafiltrado foi rejeitado» PRECIPITACHO COM ETANOL A 677.

Foi adicionado 0,81 litros de CaCl^ 2,€i M aos 31,5 litros de dialisado do passo anterior <a concentração de CaCl.., final foi de θ,O5 M) e a solução foi trazida para eianol a 82% com adição gota-a-gota e agitação rápida durante uma hora, de 48,5 litros de etanol a 95%. Após 4 horas de agitação, depois da manutenção durante 12 horas a 4°C, o sohrenadante foi escoado por í?seio de sifão e o precipitado foi recolhido por centrifugação numa centrífuga de fluxo contínuo Sharples de 10,16 cm Π5000 rpm), a 4°C durante 45 minutos» A pelota de polissacárido resultante foi triturada num misturador Waring de 4,545 litros utilizando vibrações de 30 segundos com 2 litros de etanol absoluto, recolhido num funil de Buchner equipado com um disco de filtro de teflon, e lavada, in si tu, co/n quatro porções de 1 litro de etanol absoluto seguido por duas porções de 1 litro de acetona» A amostra foi então seca num prato pesado, in vácuo., a 4°C durante 20 horas» u rendimento de cerca íe i€*2 gramas de pó seco» 0 41? rendimento ds todas as εκ tracçoes com tsnoi foi * tiu.nj.uu rt^ul ^ando num total de 212:,6 gramas d© pó seco.

ULTRACENTRI FUGAçSO EM ETANOL A 29% E RECOLHA DO PRODUTO

FINAL

Os 212;,6 qramas do pó ssco acima, foram dissolvidos em 82,9 litros de água destilada, aos quais foram adicionados 2,13 ,5 mg de polissacári- litros ds CaCl„»2tL0 2 M, <CaCl0 ©,®5 M) do/mL>, s a mistura foi trazida para etanol a 29% com adição gota-a-gota de 29,86 litros de etanol a 95% durante 3© minutos. A mistura foi clarificada imediatamente por centrifugação numa ultracentrifuga K2 contendo uma taça de titânio K3 e um núcleo Noryl Kll (300ΘΘ rpm a 150 mL por minuto de velocidade de fluxo) a 4°C. A pelota foi rejeitada e o sobrenadante foi trazido para etanol a 38% pela adição de 17,22 litros de etanol a 95% durante •:S€3 minutos com agitação. Após agitação durante 3© minutos adicionais a mistura foi deixada premanacer sem agitação a 4*C durante 17 horas e o precipitado foi recolhido utilizando uma centrífuga de fluxo continuo Sharples da 10,16 cm a rpm (foram reque ridos 45 minutos). A pasta resultante foi transferida para um misturador ^ãt-nQ ds 4,545 litros contendo 2 litros de etanol absoluto e misturado à maior velocidade por 4 ou 5 ciclos de 3Θ segundas Ugado, 3® segundos desligado, até ser formado um pó branco duro. E-jue· pcs fox recolhido num funil de Buehner equipado com um disco de tetlon Zitex e lavado sequencialmente, in sita, com duas purçoes de ©,5 litros, frescas e uma porção de 1 litro de etanol absoluto, e com duas porçSes de i litro de acetona. 0 produto foi removido do funil e tran«ferido para um prato peBado para 5«

secagem, in vácuo. a 4C’U (durante 25 horas)» 0' rendimento final do produto foi de 79,1 gramas de peso seco» EXEMPLO 5

Clonagem do BNA genômico que codificação a ΗϊΡ

I

Foram colocadas cerca de 0,1 g das células de N, meninoitidis inactivadas com fenol (ver Exemplo i) num tubo fresco» As células inactivadas com fenol foram ressuspensas em 567 μί_ de tampão TE CTRIS-HC1 10 mH, EDTA 1 ibM, pH 8,63» As células ressuspensas foram adicionados 3Φ μί_ de SDS a 1 β%, e 3 μ!_ de 20 mg/mL de proteinase K (Sigma)« As células foram misturadas e incubadas a 37 °C durante cerca de 1 hora, após α que foram adicionados 100 μί_ de NaC 1 5 M e agitados vigorosamente» Foram então adicionados 8β uL de brometo de cetiltrimetilaroonio (CTAB) a 17» em NaCl 0,7 M, misturados vigorosamente, e incubados a 65 °C durante 10 minutos·. Foi adicionada um volume igual (cerca de 0,7 a 0,8 mL> de clorofórmio/alcool isoamílico (a uma razão de 24:1,

respectivamente), misturado vigorosamente e centrifugsdo a cerca de 10000 κ g durante cerca de 5 minutos» A fase aquosa (superior) foi transferida para um novo tubo e a fase orgânica foi rejeitada» Foi adicionado à fase aquosa um volume igual de fenol/cloro— :4s 1, respec tivamen-a 10000 ;í g durante foi transferida para férmio/alcool isoamilico (a uma razão de 25:; te), misturado vigorosamente, e centrifugado cerca de 5 minutos» A fase aquosa (superior)

um novo tubo e foram adicionados €*,& volumes (cerca de 420 μί_> de álcool isopropílico, misturados vigorosamente, e o DNA precipitado foi centrifugado a 1000© κ g durante i& minutos» D sobrena— d ante foi rejeitado, e a pelota foi lavada com etanol a 707». A 51 pelota de DMA foi seca ε ressuspensa em 10© μΙ_ de tampão TE, e representa o DMA genómico de N« meninoiiidis.

Foram sintetisados dois oligonucleótidos de DMA que correspondem ao terminal 5* do gene ΗΪΡ e ao terminal 3' do gene MIP CMurakami, E.C., et al», (1989), Infection and Immunity, 57», pg, 231S--233, A sequência do oligonucieótido de DMA específica para o terminal 5' do gene MIP foi ?. 5“ -ACTAGTTSCAATSAAAAAATCC··· CT8--3'5 e para o terminal 3' do gene MIP fois 5'-BAATTCABATTAB-8AATTT8TT--3 *. Estes oligonucleótidos de DNA foram utilizados como iniciadores para a amplificaçSo da reacção de cadeia da polimera-se <PCR) do gene MIP utilizando 1Θ nanogramas de DNA genómico de N« msninqitidis» 0 passo de amplificação de PCR foi realizado de acordo com os procedimentos fornecidos pelo fabricante <F*erfcin Elmer). 0 DNA de MIP amplificado foi então digerido com as endonucleases de restrição Sqst e EcoRI. 0 fragmento de DNA 1,3 kxlobas© tkb), contendo & região de codificação completa h» M.IP? foi isolado por electroforesa num gel de agarose a i,5%„ e recuperado do gel por electroiluiçSo ECurrent Protocols ir. Molecular Biology, (1987), Ausubel, R,M», Brent, R., Kingston, R.»EC, Hoore, D.u», Smith, D ? Seidmanj D «8« e Struhl, K«, edições, Greene Publishing .Assoe. 3 = 0 vector plasmidio pUC-19 foi digerido com Spel e ê£2ÍUL« 0 DNA de MIF' SpglzloQRI purificado em gel foi ligado $n vector pUC-19 Sae.I-EçoRI. e foi utilizado para transformar a estirpe de E_»—çulA DH5. Os transformantes contendo o vector pUC~19 com o DNA de MIP 1*3 kpb foram identificados por elaboração de um mapa com endonucl@dse de restrição, e o DNA de MIP frji sequfnciado para assegurar a sua identidade» EXEMPLO 4

Construção do vector pcl/1.6alH3o(B)ADHlL = 0 proíiiotor Sai 1@ foi isolado a partir do plasmidio yrrpS'2 CBroach, atai», (iv82«) trfli Experimental Manipulation of Esípression» In ouve, MÍEd) Academic Press pgs. 83—1171 por trificação em gel do fragmento de ®s5 kilo pares de bases (kph) r,-Dt.ido após clivagem com Sau 3ft e Hind isolado a partir do vector pSAP.tADH2 gene? 4é, pg» 135-1413 por purificação 035 kpb obtido por clivagem com Hind mentos foram ligados com a DNA ligase III» 0 terminador ADH1 foi t«niskern„ et al., í 198é), em gel do fragmento de III e S-pel „ Qs dois írag-T4 ao vector oucIBdeitaHind III purificado em gel ío sítio Hind III foi eliminado por digestão do pUC18 com Hind III. terminação coesiva com o fragmento Klenow de DMA palimerase I de E. cali, e ligação com DMA ligase T4) que tinha sido digerido com BamHI e Sphl para criar o vector de origem pSalΙΘ-tADHl« Este tem um sitio da clonagem Hind III único na junção Ga 1í β p»ABH1 j.« 0 sítio de clonagem Hind III único de Bslϊθρ» tADHl foi mudado para um sitio de clonagem BamHI único por digestão de 8a110p»tADHi com Hind III» purificação em gel do DMA cortado, e ligação, utilizando DNA ligase T4, ao seguinte ligando Hind III--BamHI i 5'—A8CTCG6ATCCG-3' 3 *-BCCTAGGCTCGA-5' de lecionou, único»

G plasmidio resultante, pGall€KB)tADHi, sitio Hind III e gerou um sítio de clonagem BamHI 0 fragmento GalΙΘρ» tADHi foi isolado s partir de pGal 10CB) tftDHl por digestão com SmaI e 5phlterminado coesiva, mente com DNA polimerase? T'4, e purificada por gel» 0 vector de vai-vem (shuttle) de levedura pCi/í EBrake st al»(1984), Proc., Nat'l. Ac a d, Sei» EUA, 81., pg. 4642-46463 foi digerido com Sphl» terminado coesivamente com DMA polimerase T4, nao purificado, Este fragmento foi ligado ao vector com DNA ligase, A mistura nsaecional de ligação foi sntSo utilizada para transformar células, de E. ca3.i HB1 © 1 para células ampicilina—resistentes, e os transformadores foram anlisados por hibridação numa linha única do ligando Hirtd III Ba mH I marcado com A nova constru ção do vector, pcil 1,8all€>p<B)ADHli foi confirmada por digestão com Hind III e Ba/nHI.

EXEMPLO

Construção de um Vector de Expressão de MIP de Levedura com MIP + Sequências de DNA iniciadoras Clider)

Usn fragmento de DNA contend* ΐ cri li _í. cí Ú SÍ r» rk ::odi" completa ds MIP foi gerado por digestão do pUC19»MIP #7" com Spel ε EcoRI,. purificação sm gel do DMA da MIP, terminado coesivamente com DNA polimerase T4» 0 vector de expressão interna de 1 evedura pC1/1« foi digerido com BamHI» d e s f o s f o r i 1 ado com fosfat de intestino de vitelo. e terminado coesiv amente •e T4» U DNA foi purificado em gel para remover o í 8)ADH1^ alcalina ρϋ J. J..) íi tv í' cl

Sal ií?p~ ase com DNA vector não cortado 54

0 fragmenta, terminada coesivamentej i, i kpb h» MVp ·ρη·; ligado ao vector pCl/1»Gai10p(B>ADHl.» terminado coeciv-, t· iV«niente, e a mistura reaccional de ligado foi utilizada para tr«n<=·* ~>ss rarmar células de E. coli DH5 competentes oara células anmir-i i .· ------ . i h Aiina-resis“·

tentes» Os transformadores foram analisados por hibri-H u‘'lÇ«o num oligonucleótido de DMA marcada com ^Ps 5'... AABCTCBBATCCTABTT6CAATB-..3', que foi concebidn para ser homóloga com sequências que se sobrepoem á junção a& MIP- - vector» Foram feitas preparações de DNfi a partir da hib»-idaç?er'

de transformantes positivas e digeridas com KonI e SaH --para verificar que o fragmento de MIP estava na orientação *. v -orrec ta para expressão do promotor 8allô- A confirmação adicional da construção de DMA foi obtida por didesoxi-sequenciação cio promotor Salie na região ds codificação ds MIP. A expressão da MIP pelos transformantes foi detectada por análise de mancha Western. A MIP recombinante produzida nas transformantes co-migrou em geles de poliacrilamida com a jvpp purificada a partir de vesículas ds OMPC, e foi imunologicasnente reactiva com anticorpos específicos para a HIP. EXEriPLO é

Construção de um Vector de Expressão de MIP de Levedura com uma Sequência de DNA de MIP modificada em 5'

Um oligonucleótido de DMA contendo um sítio Hindi II, uni iniciador (líder) não traduzido 5' de levedura conservada ÍNTL), um codão de iniciação de metionina (ATS), os primeiros 89 codãos 55 ft

da πϊΡ madura (começando com Asp na posição +2Θ) e um sitio KonI (na posição +89) foi gerado utilizando a técnica de reacçlo em cadeia de polimerase CPCR). A POR foi realizada como especificado pelo fabricante CPerkin Elme-r Cetus) utilizando o plastnídio pUC19Ml'P42#7 como a matriz e os oligóíneros de DMA seguintes como iniciadoress 3 * CTftA0CTTAACAAAAT66ACeTTACCTTSTACS8TACAATT3' 3 AC8GTACC6AAGCCGCCTTTCAA63 .

I

Para remover a região 5' do clone ds iilP, o plasmideo pUC19MIP42#7 foi digerido com KonI e HindiII s o fragmento de vactor 3.,4 kpb foi purificado em gel ds agarose. 0 fragmento PCR de 2S@ pb foi digerido com ΚρηI e HindiII, purificada em gel de agarose? e ligado com o fragmento de vector de 3,i kpb., Os transformantes de E, coli ΗΒ1Θ1 (BRL) foram analisados por hibridação de oligonucleótidos de DMA e o DMA de transformantes positivos foi analisado por digestão com enzima de restrição.

Para assegurar que não foram introduzidas mutações durante o passo PCR, o DMA gerado por PCR de 28Θ pb dos transformantes positivos foi sequinciado. 0 plasmídso resultante contém uma inserção HindIII-EcqRI consistindo em MTL de levedura, cotíio ATS, s a estrutura de leitura aberta completa (ORF) ds ΜΣΡ começando no codão Asp (arainoácido +2#).

Os vectores de expressão de MIP ds levedura foram construídos como se segue. Os vectores pGal10/pci/l e pGAP/pCi/i flVlasuk, 6.P», et ai.. (Í9S9) 264s pg. 12106-121123 foram digeridos com BamHI, terminados não coesivamente íflush) com o fragmento KXenow de BNA polimerase I, e desfosforilados com fosfatase alcalina de intestino da vitelo. Estes vectores lineares foram ligados com o Klenow tratado e o fragmento

hindi J.i fc.cuRI purzfzcacso m g^x doccrx.to acma.. qu.s contém o ÍMTL. de levedura,, ATB e ORF de MIP e formando pBalΙθ/pci/MIP e p6AP/~ pG AP / pC 1 / ΜIP« A estirpe de 5a c c ha rcmyces cerevisiae U? Cqal10pgaI4“> foi transformada com σ plasmídeo pGalΙΘ/ρ/pcl/MXP» Os clones recombinantes foram isolados e examinados para. a expressão de ΜΣΡ. Os clones foram feitos crescer a 37°C com agitação em meio sintéctieo <leu-> contendo qlucoss a 2% ío/v> para uma D.0»,,rt de òfc-tí cerca de 6,G. Foi então adicionada galactose a 2% íp/v) para induzir a expressão de MIP a partir do promotor Sa11Θ„ As células foram feitas crescer durante 45 horas adicionais a seguir á indução com ga 1 actose a uma D.O», ,... ds cerca ds 9,/¾). As células foram então colhidas por centrifugação» A pelota celular foi lavada com água destilada* e congelada»

Mancha Western para MIP Recombinante

Para determinar se a levedura estava a exprimir MIF‘, foi feita a análise de mancha Western» São utilizados geles Novex Laemmli de 1Θ a 15 cavidades, 1 mm, a doze por cento» As células de levedura foram partidas em H^O utilizando pérolas de vidro (pode ser utilizado dodecilsulfato de sódio (SDS) a 2% durante o processo de quebra)„ Os detritos celulares foram removidos por centrifugação durante 1 minuto a 1ΘΘΘΦ κ g« até o marcador de 0 sobrenadarte foi misturado com tampão de desenvolvimento de amostra, como descrito para a purificação em gel de poliacrilamida da MIP. As amostras foram desenvolvidas a 35 mA, utilizando QMPC como um controlo de referência» corante hromofenol sair do gel,,

As proteínas foram transferidas para papel de nitro-csiulose, tamanho de poro Θ,,45 μ, utilizando um aparelho de transferência NOVEX . Após transferência o papel de nitroceiulose foi bloqueado com albumina de soro de bovina a 5% em solução salina tamponada com fosfato durante 1 hora» após o que foram adicionados 15 mL de uma diluição 1 s 1ΦΘΘ de antissoro anti-MIP de coelho (gerado por imunização com MIP purificado em gel utilizando procedimentos padrão)„ Após incubação durante a noite ã temperatura, ambiente foram adicionados 15 mL de uma diluição 1.1001) de IgG anti-coel ho de cabra conjugada com fosfatase alcali n a» Após 2 horas de incubação a mancha foi d esenvo1v i da uti I izandc: j FAST RED TR oAL .T (Sigma) e fosfat □ de Naphthoi-AS-MX (Siqma). EXEMPLO 7 Εκpressão bacteriana da MIP recombinante 0 plasmídeo pUC19-HIP contendo a inserção de gene MIP de 1,3 kilo pares de bases, foi digerido com endonucleasiss de restrição SpeI e EcoRI . 0 fragmento de 1,1 kpb foi isolado e purificado num gel de agarose utilizando técnicas padrão conhecidas na arte. O plasmídeo pTACSB, contendo o promotor TAC de dois cistrSes e um sítio ECQR1 único, foi digerido com ECQRI. Foram formados extremidades coesivas quer no DMA de MIP de 1.3 kpb quer no vector pTACSD, utilizando DMA polimerase T4 (Boehringer Mannhsim) de acordo com as directivas do fabricante. 0 DMA de MIP de 1,3 kpb terminado coesivamente foi ligado ao vector terminado cDBsivâinente utilizando DMA ligass T4 (boehringer Mannheim) de acordo com as directivas do fabricante. 0 DMA ligado foi utilizado para transformar a estirpe E. coli DHSalQMAX (BRL) de acordo com as directivas do fabricante. As células transformadas foram

colocadas em placas de ágar contendo 25 μα de canamicina/mL e 50 uç de penici1ina/mL, e incubada durante cerca de 15 horas a 37 °C. Um oligonucleótida de DMA com uma sequfncia homóloga cora MIP foi “ζ·? marcado com """P e utilizado para analisar filtros de nitroceiu-~ lose contendo colónias desnaturadas· lisadas das placas de trans-formantes utilizando técnicas de hibridaçâo de* DMA padrão. As colónias que eram positivas por hibridaçâo foram assinaladas em mapa utilizando endonucleases de restrição para determinar a orientação do gene MIP» A BKpresslo da MIP pelos transformantes foi detestada por análise de manchas Western» A MIP recombinante produzida nos transformantes comigrou em geles de poliacrilamida com a MIP purificada a partir de vesículas de OMPC, e foi imunologicamente resctiva com os anticorpos sspsciTicos para a nlP» EXEMPLO 8

Preparação da MIP Purificada a partir de lipossomas OMPC ou a partir de Células Recombinsntes por Electroforese em Gel de Poliacrilamida

Foram utilizados- os qsls ilamida/BIS (37,5sl)« 18 s< 14 cm, 3 mm de es pe-ssu r a. U gel de ag1umeração foi po 1 i ac r .11 am ida a 4/. e o osí ds separação foi de poliacr á. 1 θ. (τι .1 ú s. &. Í2%» Foram utili zados aprοκ í mad amante 5 μq de proteína de OMPC ou 105°C durante proteína de célula hospedeira recombinante por gel. Foi adicionado a 1 mL de OMPC 0,5 mL de tampão de amostra Cglicerol a 4%, DT7 3ΘΘ mMs TRIS 100 mH, Azul de bromo feno 1 a θ5Θ@ί7;1 pH 7?Θ5. A mistura foi aquecida a 1€>5°C durante 2Θ minutos e deitada

arrefecer até à temperatura ambiente antes de carregada no gel. O gel foi desenvolvido a 20Θ--4Θ® mi 1 iamperes, com arrefecimento, até α azul de bromofenol realizar o fundo do gel» Foi cortada urna faiKa vertical do gel (cerca de 1—2 cm de largura) © corada com Coomassie/acetato cúprica (0,1%.)= A faixa foi descorada até a banda de MIP (cerca de 38 Kd) se tornar visível» A faixa foi então colocada na sua posição em gel original e a área ue MIP foi excisada a partir do restante do gel utilizando um bisturi» A área excisada foi cortada em cubos (cerca de 5 mm) e eluída com tampão TRIS ©,ΘΙ M, pH 0,1= Após 2 ciclos de eluição o eluido foi avaliado quanto à pureza por SDS~F‘A6E = 0 sluído foi combi nado c om um conjunto (ooo 1) c omum de eluidos i dur Bl t te 48 horas contra amónia 0Φ mH ácido fórmxco nat »i V amante , a proteína el uída pod e ser dialisada > acé ti ca a 5 07. em água» Apó s d i. ális •e a proteína elu rad 8. até â secur a» 0 mater ial foi F*W i írificado adiei* pas sa .gem at ravés da uma co luna de ta i man ha PD 1Θ (P h- Pis C*3 taway? M -J) , e foi arm azsn ado à temperatura am EXEMPLO 9

I

Actividade de Veículo da MIP num Conjugado PRP—OMPC Covalentes

Imunizações? Ratinhos C3H/BeM machos (Charles Ri ver, Wilmingfcon, MA) Taram imunizados intraperi tonealmente ííF') com HRP covalentemente ligado a OMPC (F‘RP—OMPCp comprendsndo 2,5 uo de PRP e 17 μα de OMPC) ou PRP acoplado a DT (PRP-DT? contendo 2,5-2,7 pg de PRP e 1,8-5,4 pg de DT) (Connaught Laboratories, kh.l loKídale, OMT), suspensos em €·,5 mL de solução salina de ϊ os Ta to··· camnão (PBo) 1 M» Um segundo grupo de ratinhos C3H—HeM

mschcss, receberam ompc-iaa (OHPC de fechado <capped> BMperifncias de t VB2ss i’P’s com 21 recolhidas 1© dia de células de

quer 17 p.g ds HIP, 17 p.g de OMPC, quer 17 μςι de riv&do com N-acetil—homocisteina tioiaciona, e com iodoacetamida). Dadores de células para ransfsrfncia adoptiva foram imunizados duas dias de intervalo, s as células de baço foram í=- após a segunda imunização» Ds recipientes de transferência adoptiva foram ratinhos C3H/HsN machos dando uma •irradiação gama no corpo total de 5£@R a partir de uma fonte de 137_ _ C» e reconstituídos imediatamente por injecçSo intravenosa de ^ κ 10' células ds baço de cada um de dois dadores singeneicos inoculados separadamente com PRP-DT, e QilPC, filP, ou OMPC-IAA» Os ratinhos da controlo receberam 8 κ l©/ células de baço de um natinho inoculado com PRP-OMPC a um número igual daço a partir de um ratinho dador não inoculado. ELISA para anticorpo anti-PRPs Foram introduzidas sminas reactivas em PRP de H. infiuenzae purificado por tratamento com carbonildiimidazol a reacção com butanodiamina como descrito por Marburg et al»« Patente dos EUA 4 882 317. Este PRP derivado foi cromaiografado sobre Sephadex 8-25 em tampão de bicarbonato de sódio Φ,Ι π, pH 8,4. Foi adicionada N—hidroxis— succinimidobiotina (Pierce Chemical, Rockford, IL) em dimetil-sulfóxido ao eluído a uma concentração final de *3,3 mg/mL e feita reagir no escuro durante 4 horas à temperatura ambiente (cerca de 25--28°C). A N—hidroxissuccinimidobiotina que nlo reagiu foi removida por filtração em gel sobre Sephadex 8-25 em PBS» As placas ELISA de cloreto d© polivinilo Costar (Cambridge, MA) foram revestidos com 50 pg/cavidade de avidina (Pierce Chemical) a í Φ pg/mL em tampão de bicarbonato de sódio 0,1 M, pH 9,5, durante a noite á temperatura ambiente e humidade de 1ΘΦ%» As placas foram lavadas 3 vezes com solução salina tamponada com TRIS 0,05 H, pH 8,5, contendo Tween-2© a ©,&5K (TBS-T), e bloqueadas com TBS-T mais gelatina a 0,1% (tampão de bloqueio) à temperatura ambiente e humidade de 100% durante 1 hora. As placas foram manchadas sam lavagem, foram adicionados- 50 pg/cavidade de PRP-~b.iot.ina em PBS a 15-40 pg/mL, e as placas foram incubadas durante 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com TBS-T antes da adição da amostra.. As amostras foram adicionadas em série de duas diluições em tampão de bloqueio» e incubadas durante 2 horas à temperatura ambiente e humidade de '100%. As placas foram então lavadas 3 vezes com TBS-T.. e foram adicionadas anti-imunoglobu-linas conjugadas de fosfatase alcalina apropriadas diluídas em tampão de bloqueio» Os anticorpos utilizados foram a Igli anti-ra— tinho de cabra Ulackson Immunoresearch» West Breve, PA), IgB (Fc> Cjackson luimunoressarch), IgSl Cgama) <BRL, Saithersburg , MD), IgS2a Cgama) (BRL>, Ig82b (gama) (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL>, IgB3 (gama) (Southern Biotechnology Associates), e IgB anti-coelho de cabra (Jackson Im/nunoresearch)» As placas foram incubadas durante 2 horas á temperatura ambiente e humidade de 100%, lavadas com tampão de bloqueio, e o desenvolvimento do substracto foi realizado utilizando fosfato de p—nitro— fenilo (1 mg/mL em dietanolamina '1 M, Kirkegaard and Perry, Saithersburg, MD)» As diluições foram consideradas positivas se a absorvãncia da amostra excedesse a absorvSncia média mals 3 vezes o desvio padrão da 8 brancos de reagentes, e se a diferença na absorvSncia entre sucessivas diluições fosse de 0,01 ou maior» Os títulos terminais foram definidos como o recíproco da maior diluição que deu uma reacção positiva no ELISA como descrito acama» Os logaritmos dos títulos recíprocos foram comparados entre os grupos em tratamento por análise de duas vias da vari-ancia ELindeman, R.H» et ah, (1980), Introduction to Bivariate and Muibivariate Analysis, Scott Foresman Cpub»), New York3.

RIA para quantifícacão de anticorpo anti—PRP

As amostras experimentais ds soro a serem testadas quanto à quantidade de anticorpos anti-PRP foram diluídas a 1s25

' 9 H PRP marcado com 12-í, soro de feto de vi La 1 í-j c orno o diluente» Ϊ soro di luida ΟΓ* Λ .n? transfer idos, en! R .1A d 0 0 ,5 mL i -t. θ«ιΓ 3 t edt ) „ Um a solução de . dilu ída pa ra í*| ar en tre 3@0 e 80Θ conta- sr 50 pLs utili 2 ando sol ução salina ϊ os iflio O dil uente, 50 μί_ de X «WoW V A -PRP diluído cada τ r* a scd RI A , mis tur ados v i go rosamente :a de i-d horas s 4°C» —YJ—· / vj uL d e uma. solução saturada de sulfato de amónio a 4°C foram adicionados a cada frasco RIA , misturados viqorosamente e incubados a 4*C durante 1 hf iora„ Os frascos RIA foram então centrifugados durante 10 minutos a 1ΘΘ00 x g, o sobrenadante foi rejeitado e os cpm na pelota foi medida num contador qama íLKB>»

Uma curva padrão consistindo em séries de duas diluições de um antisscro contendo uma quantidade conhecida de anticorpos anti-PRP foi preparada como descrito acima e foram ensaiadas concumitantemente com as amostras de soro experimentais» A quantidade de -anticorpos anti “PRP na curva padrão está entre 14 pg/fflL como a maior quantidade de anticorpos e £?,05ó pg/mL como a menor quantidade de anticorpos» Todas as amostras foram desenvolvi o as em dupl icaeio» A cpm média das amostras duplicadas foi comparada com curva padrão para calcular a quantidade de anticorpos anti-PRP presentes nas amostras de soro experimentais.

Respostas de Anticorpo de Recipientes de transferência adoptivos: Os recipientes de células de baço inoculados separada-mente com PRP-DT, e ou ΜΪΡ ou OMPC qu IAA-QMPC, responderam à imunização com PRP-OHPC por produção de quantidades equivalentes de anticorpo anti-PRP IgBi e lgB2a de soro em 4 dias (ver Figura 1), Os ratinhos irradiados reconstituídos com células de baço que foram inoculadas com veículo de ΜΓΡ ou OMPC ou IAA--OMPC, tinham significativamente maiores títulos de anticorpo anti-PRP IgBi (ρ<Θ,ΒΘΙ) e IgB2a íρ<θ,Θ4> após imunização com PRP-OMPC do que os ratinhas de controlor> dando células da baça inoculadas- com PRP-DT mas não com células de baço inoculadas com OMPC. fis respostas de anticorpo do soro á imunização com PRP-OMPC em ratinhos aos quais foram dados células de baço inoculadas separadamente com PRP-DT e ou MIP ou OMPC ou IAA-OMPC foram comparáveis -àquelas em ratinhos aos quais foram dados células de baço inoculadas com PRP-OMPC (p>#s12 para anticorpo IqBl nos dias a—13, e p>fc··,'5 para anticorpo IçjB2a nos dias 9-13) , Mão foi observada qualquer resposta a anticorpo quando os ratinhas irradiados reconstituídos com células de baço PRP-DT inoculadas com e células de baço inoculadas ou com MIP ou com OMPC foram imunizados com PRP sem um veículo de proteína., A análise estatística foi feita por análise de duas vias da variancia (ANOVA) ÍLindeman? R.H. et al,. Intro-duction to Bivariate -and Multivariate Analysis, (198Φ), Scott Faresman ípub.)5 New York3. HíP funcionou em resposta ds células IgB anti-PRP.

T

Estes resultados demonstram que ratinhos assim corfiQ o OMPC para induzir um auKÍliares de veículo, para gerar anticorpo

A EXEMPLO 10

ftctivídads mitoqériica da MIP A MÍP purificada a partir da OMPf foi testada quanto è actividade mitogénica num ensaio de proliferação de 1 inf6c.it.os,; Os lintácitos esplénicos de murino foram obtidos a partir de ratinhos C3H/HaN, C3H/FeJ, C3H/Hev, ou Baib/c» Os ratinhos ou eram naturais ou tinham sido vacinados previamente com PRP-OMPC. As células de baço foram passadas através de um peneiro de malha fina., estéril para remover detritos estremais e suspensos em meio K ERPMI 1640 CGIBCO) ma is soro de fato de vitela a lô% Cfirmour), Slutamina 2 snM (8XBC0), Hepes 1Θ mfi (6ΪBCO) , 1Θ0 μ/mL de peniciIina/100/pg/mL de estreptomicina (SIBCO), e js-fflercaptoetanol μΜ (Biorad)3. A Seguir á pipetagem para romper grupos de células, a suspensão foi centrifugada a 300 & *5 pelota foi ressuspensa num tampS o de verme1h límH^CI 0,16 H a 90¾ CF isher), TR1S--HC1 €1,7 M a 10¾ (sigma), pH 7,23 à temperatura ambiente, 0,1 rnL de células/mL de tampão durante dois minutos» As células foram estratificadas com 5mL de soro de feto de vitelo e centrifugadas a 4000 x g durante 1Θ minutos» depois lavadas com meio K duas vezes e ressuspensas em meio K a 5 κ 10“ células/mL» Estas células foram implantadas em placas de 96 cavidades (100 μΐ/cavidade) juntamente com 1ΘΘ μΐ de proteína ou amostra de péptido, em t r i p1icado„ A MIP de M, meninoitidis foi purificada como previamente descrito no Exemplo 7» As proteínas de controlo incluem albumina de soro de bovino, PRP-OMPC e o próprio OMPC, e o lipopolissacárido íendotoxina). Todas as amostras foram diluídas em me x d para concentrações de '1, 6,5, 13, 26, 52, 105, e 130

AFt μο/mi-.5 depois implantadas em placas como descrito acima tal que as suas concentrações finais fossem metade- das suas concentrações-originais,, As cavidades em triplicado foram também incubadas para cada tipo de célula suspensa só em meio K, para. determinar a linha de base da proliferação celular.

Nos dias 3, 5, ou 7 de cultura, as cavidades foram pulsadas com 25 pL de ‘"'H-timidina (Amersham) contendo í mCi/25 μί_ = As cavidades foram recolhidas 16-18 horas msis tarde num colecíor Skatron, e as contagens por minuto CCPii) foram medidas num contador ds cintilação de liquido» A troca da rede em cpm foi calculada, por subtracç-So do número médio de cpm tomado por cavidade ds por células só em meio >’<5 da média da cpm experimental » D indice de estimulação foi determinado por divisão da cpm e;··;perimental média pela média de cpm das cavidades de controlo»

Como mostrado na Pigura 2, b. v-scins de HÍP assim como a vacina de OMPC e PRP—OMPC rssu1 taram na prol .1 feração ds linfóci- tos de ratinhos vacinados prevismente» Esta actividsde mitoqénica não pareceu ser devida ao lipopolissacárido (LPS) uma vez que a MIH estava livre de LPS detectável, medida ρ-or ensaios de piro— genic.idade em coelho, © o efeito p*roiifsraCxvo foi maior do que aquele que poderia ter sido causado pelo LPS presente em quantidades abaixo do nível de detectabilidade em geles de poliacril— ío.n’{ jL0 B. 3_ OÍ^SCí 0¾ C ΟΐΤϊ pÍ'"*StlSs

EXEMPLO 11

Conjugação do polissacárido PRP de H. infiuenzae tipo-b à MIP de N. rneningitidis ;orafi5 cond uzidas de acor do ; com EU-Pi n iãmer O boxí' ~y 17» i | v| τ p eu, 3 mL de ta mpão de í sal r-í ? .“*· r~ uis-s C'Le u lj Q ácida Sigma Chem icals) e *ύ m q de sluçãc ) d (rr proteín a foi v arr ida lados 1 ’7‘fv mg de N "~e. c&ti 1 ~ho mo™ tis) à sol ução de M ÍIPji B » 3. ambiente durante ϊ s. 6 hor 'as* Foi borato 0*1 M, pH 11*5, o x t x o b r 01.1 o 1 \ s x g m a o h s in i. a 1} então duas vexes dial i.sada sob fi_, contra 2 L de tampão de borato €>,1 M pH 9,5, contendo EDTA 4 mH, durante 24 horas á temperatura ambiente» A proteína tiolada foi então ensaiada para o teor em tiol pelo reagente de Eliman (Sigma Chemicals) e a concentração sm proteína foi determinaria por reagente Bradford (Pierce Chemicals) » Para a conjugação da MIP ao PRP,· foi adicionado um excesso de 1*5 vexes (p/p) da PRP de H» infIuenzae serotipo b bromoaestilado â solução de MIP e o pH foi ajustado a 9-9,5 com NaOH IN» A mxstura tox deixada incubar sob N.-» durante 6 a 8 horas à temperatura ambiente» No fim do tempo de reacção, foram adicionados Ξ5 p.L de M-acetiIcisteamina (Chemicals Dynamics) à mistura, s foi 18 I toras sob N..„, à tempera1 toi acidi fiçada ate entre :ura ambien-pH 3 a 4 com

1 -V conjugado de HCi 1 N, e centrifugada a 100ΘΘ x g durante 1.D minutos» i mL do sobrenadante foi aplicado directamente numa coluna de Superose 6B FPLC (1,6 x 50 cm. Pharmacia) e o conjugado foi eluído com PBS» 0 pico de volume vazio que contêm o

poiissacáritio—proteina <PRP-ΜIP), foi reunido» A" solução de conjugado foi então filtrada através de um filtro de Θ,22 μ para ©ster111zaç ão = EXEMPLO 12

Demonstração de Imunogenicidade dos conjugados de PRF—MIP

Imunizações: Ratinhas Balfa/c machos <Charles River, Wilminaton·.! MA) foram imunizados ΣΡ com PRP covalentemente ranjugada a MIP como descrito no Exemp nln 11 , ,.l .i i a i cr .... -i... ct L,i 1 j, ^ ά/ ÍUi·! ·£· tf y<J |»iy Uul PRP em Θ,5 mL de alumén pré-formado» Os ratinhos de controle? foram imunizados com quantidades equivalentes de PRP dado como PRP-CRM Eftnderson, M.E, et al., (1985), J. Pediatrics, i07, pg. 346-3513 (2,5 pg ds PRP/6,25 pg de CRMg 1/4 da dose humana), PRP—DT (2,5 pg de PRP/1,8 pg de DT§ 1/1Θ da dose humana tal que fossem utilizadas quantidades constantes de PRP), e PRP-OMPC (2,5 pg de PRP/35 pg de OMPC? 1/4 da dose humana)» us recém- nascidos. w io,5 toçrfífiSiias de idade onjugados de PRP—M IP adsorvidos em a 1umén» 25 mL de conjugado em dois sítios di ferεπ uma dose total de 0,5 mL„ Os macacos ί oram

Mar imunizados nos dias Θ, 28, e 56, e foram retiradas amostras de sangue todas as duas a quatro semanas»

As respostas de anticorpo foram medidas peio ELISA descrito no Exemplo 9, que destingue a classe e subclasse da resposta de imunoglobulina. Um RIA que quantifica o anticorpo anti—PRP total (ver Exemplo 9) foi também utilizado para avaliar

a resposta do macaco* As resposta de anticorpo de recipientes de conjaqados de PRP-ΜΣΡ são mostrados na Fiaura 3.

Os resultados mostram que os conjugados de PRP-iiIP sSc capazes de gerar uma resposta imune em ratinhos consistindo em anticorpo ant.i~PRP IgG e numa resposta de memória. Isto está em 4· t~ UÍ i contraste com o PRP-CRij e PRP-DT que não induzem ant

I ant.i—PRP mensurável. Assim, a MIP funciona como uma proteína de veiculo imunológico para o PRP e é capaz de produzir uma resposta de? anticorpo anti-PRP quando conjugada covalentemente ao anti-génio de PRP. A MIP purificada é por conseguinte uma proteína de veículo imunológico eficaz substituindo o OMPC heterogénio na construção de vacinas de conjugado de polissacârido bacteriano.

Claims (1)

1. 69

   r'i <Ϊ2. REIVINDICAÇÕES: Ia. - Processo para a preparação de uma proteína numa forma substancialmente pura proveniente da membrana exterior de uma bactéria Gram-negativa que possui actividade de intensificação e mitogénica imunológicas, em mamíferos, especialmente em humanos adultos e crianças, caracterizado por compreender: a) a purificação da proteína directamente a partir de Neis-seria Meninaitidis (ou de qualquer outra bactéria Gram-negativa) através de: i) cultura de N. Meninaitidis (ou de qualquer outra bactéria Gram-negativa); ii) recolha das células; iii) purificação da proteína até à homogeneidade; ou b) a produção da proteína por meio de técnicas de DNA recom-binante e purificação da proteína a partir de células hospedeiras recombinantes, através dos passos de i) clonagem de DNA recombinante do gene codificador da proteína num vector de expressão; ii) transferência do vector de expressão para um hospedeiro recombinante? iii) expressão da proteína no hospedeiro recombinante; e iv) purificação da proteína até à homogeneidade. 70 2a. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, carac-terizado por a bactéria Gram-negativa ser do género Neisseria. 3a. - Processo de acordo com a Reivindicação 2, carac-terizado por a bactéria ser Neisseria Meninaitidis. 4a. - Processo de acordo com a Reivindicação 3, carac-terizado por a referida proteína corresponder à proteína de Classe II da membrana exterior da bactéria Neisseria Meninaitidis. 5a. - Processo de acordo com a Reivindicação 4, para a preparação de uma proteína que possui, de preferência, actividade de veículo imunológico ou actividade mitogénica imunológica, caracterizado por a referida proteína corresponder à proteína da classe II da membrana exterior de Neisseria Meninaitidis f sero-grupo B. 6a. - Processo para a preparação de uma proteína recombinante na forma substacialmente pura, caracterizado por se tratar uma célula hospedeira recombinante, que corresponde a uma proteína de membrana exterior de uma bactéria Gram-negativa e que possui actividade de intensificação e mitogénica imunológica, em mamíferos. 7a. - Processo de acordo com a Reivindicação 6, para a preparação de uma proteína que possui, de preferência, actividade de intensificação e mitogénica imunológica, em humanos adultos e crianças, caracterizado por o hospedeiro recombinante ser, ou células de levedura ou células bacterianas. 8a. - Processo de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por a bactéria Gram-negativa ser do género Neisseria. 71 9*. - Processo de acordo com a Reivindicação 8, caracte-rizado por a bactéria ser Neisseria Meninqitidis. 10*. - Processo de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado por a referida proteína corresponder à proteína de classe II da membrana exterior da bactéria Neisseria Meningiti-dis. 11*. - Processo de acordo com a Reivindicação 10, para a preparação de uma proteína que possui, de preferência, activi-dade de veículo imunológico ou actividade mitogénica imunológica, caracterizado por a referida proteína corresponder à proteína da classe II do membrana exterior de Neisseria Meninqitidis. Lisboa, 18 de Julho de 1990

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