JPS632933A - 免疫原性複合体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫原性複合体、中でもＢ、　Ｈｏｒｅｉｎ等
によりＮａｔｕｒｅ　　３０８（１９８４年）、４５７
〜４６０頁において「イスコム１　（“ｉｓｃｏｍ　”
　）と称されている免疫原性複合体（Ｅ　Ｐ−Ａ　　Ｏ
１０９９４２も参照できる）に関ηる。

ｅ、　Ｈｏｒｅｉｎ等によると、イスコムは微生物、動
物細胞、タンパク質またはペプチドを緩衝された溶液中
で可溶化剤と混合し、この溶液を、場合により可溶化剤
を除去した後に、少イ「くとも臨界ミセル濃度の濃度の
、疎水性部分と親水性部分とを有するグリコシドの一種
または１二ｆ手１ス上を含有するグリコシド溶液と接触
させることにより得られる。この方法でいわゆる「イス
コム」タンパク質複合体が生成され、生成物は次いで精
製する。この精製は勾配遠心分離、透析、クロマトグラ
フィまたはその伯の方法により実施できる。キラヤサボ
ナリア　モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ　５ａｐｏｎａｒｉ
ａＨｏｌｉｎａ）の樹皮から抽出されるキルＡ　（Ｑｕ
ｉｌ　Ａ）はグリコシドとして好ましく使用されている
。

イスコムは電子顕微鏡により特別の構造を有することが
見い出されている。イスコムは約３５ｎｍの平均直径を
有する粒子である。各粒子は直径的１２ｎｍの環状サブ
ユニットを有する、粗く、透明なカゴ状構造を有する。

バラ−インフルエンザ−３、麻疹および狂犬病ウィルス
の膜タンパク質の場合に、イスコムの免疫原性活性は膜
タンパク質の凝集により形成されるミセルよりも少なく
とも１０倍高いことが示された。

ＦＰ−Ａ’　　０　１０９　９４２では、イスコムがそ
れらの構造およびグリコシドの存在ばかりでなく、また
イスコムが脂質を含有していない点で、リポソームと異
なることが強調され−Ｃいる。しかしながら、ここに精
製された抗原性タンパク質およびキルΔを用いると、イ
スコムを（ｑることができないことが見い出された。ざ
らに、ω１究により、既知のイスコムが脂質、コレスデ
［Ｊ−ルを含有することが見い出され、この物質は微生
物、中でもグラム陰性細菌または外皮を右するウィルス
から可溶化剤により抗原性タンパク質ととｂに明らかに
遊離されることが見い出された。

Ｈｏｒｅｉｎ等により開示されたイスコム構造はコレス
テロールのようなステロールとともにホスファチジルエ
タノールアミノのようなリン脂質が存在する場合にだけ
得ることができることが見い出された。リン脂質が存在
しないと、得らたれた生成物はイスコムの特徴である約
３５ｎｍの平均直径を有するカゴ状構造を有せず、生成
物は約１２０ｍの直径を有するイスコム　サブユニット
の多少二元的な凝集体である。これらの構造体はまた抗
原性タンパク質またはペプチドと免疫原性複合体を形成
し、この複合体は抗原性タンパク質の凝集により生成さ
れたミセルと比較して、格別に改善された免疫原性活性
を有することが見い出された。

本発明は免疫原性複合体の製造方法に関し、この方法は
両親媒性抗原性タンパク質またはペプチドを溶解された
形または可溶化された形で、洗剤、ステロールおよび少
なくとも臨界ミセル形Ｉｉ、１１度の、疎水性部分と親
水性部分とを有するグリコシドを含有する溶液と接触さ
せ、洗剤を除去し、そして生成された免疫原性複合体を
精製することを特徴とする方法である。

イスコム構造を有する免疫原性複合体を製造しようとす
る場合には、抗原性タンパク質またはペプチドと接触さ
せる溶液がまたリン脂質を含有する。

グリコシド、ステロールおよびリン脂質の使用はイスコ
ムの生成に必須であることが証明され、使方、純粋な抗
原性タンパク質またはペプチドはこの点では何の役割も
演じない。すなわち、抗原を使用しなくても、グリコシ
ド、ステロールおよびリン脂質からイスコムが生成され
ることが証明された。キルＡ１コレステロールおよびホ
スファチジルエタノールアミンから得られたイスコムの
電子顕微鏡写真を第１図として示り（倍率：１１６．０
ＯＯＸ）。リン脂質を使用しない場合には、二元的構造
体が形成される。このＪ、うな構造体の例を第２図とし
て示す。この図はキル△およびコレステロールから得ら
れた構造体の電子顕微鏡写真である（倍率：１４６．０
ＯＯＸ）。ステロールを混合物から省略すると、リポソ
ーム構造体が得られ、この製造は本発明に属さない。第
３ａ図はキルＡおよびホスファチジルコリンを用いて得
られたこのような構造体の電子顕微鏡写真（倍率：１４
６．０ＯＯＸ）であり、そしく第３ｂ図はキルＡおよび
ホスファデジルエタノールアミンから得られた構造体の
電子顕微鏡写真（゛ある。

本発明の方法による方法で使用されるべきグリコシドは
ＥＰ−Ａ　　Ｏ１０９９４２にあげられているグリコシ
ドと同一である。−般に、これらのグリコシドは両親媒
性を示すグリコシドであり、分子内に疎水性部分と親水
性部分とを有する。

好適には、サポニン、特にＱｕｉｌｌａｊａ　５ａｐＯ
ｎａｒｉａＨｏｌｉｎａからのサポニン　エキス、第一
にはに　　Ｄａｌｓｇａａｒｄ　　［５ａｐｏｎｉｎ　
　Ａｄｊｕｖａｎｔｓ　　、　　Ｂｕｌｌ、Ｏｆｆ。

Ｉｎｔ、　ＥＤｉｚ、７７　（７〜８）　、　１２８９
〜１２９５頁（１９７２年）］に従って製造されるＤＱ
−エキスおよびまたはに、　Ｄａｌｅｇａａｒｄ　［５
ａｐｏｎｉｎＡｄｊｕｖａｎｔａ　ｍ　、　Ａｒｃｈｉ
ｖ　ｆｉｉｒ　ｄｉ６　ｇｅｓａｍｅ　Ｖｉｒｕｓ−ｆ
ｏｒｓｃｈｕｎｇ　４４．２４３〜２５４頁（１９７４
年）］に従って製造されるキルΔを使用する。その他の
好適なサポニンはエスクルス　ヒボ力スタヌム（Ａｃ５
ｃｕｌｕｓ　ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）からのエサ
イン［Ｔ、　Ｐａｔｔおよび−、　Ｗｉｎｋｌｅｒによ
る　Ｄａｓｔｎｃｒａｐｅｕｔｉｓｃｈ　ｗｉｒｋｓａ
ｍｅ　Ｐｒ１ｎｚｉｐ　ｄｅｒＲｏｓｓｋａｔａｎｉｅ
　（Ａｅｓｃｕｌｕｓ　ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）
　。

＾ｒＺｎｅｉｌｌｌｉｔｔｅｌｆａｒＳＣｈｕｎ（］上
０　（４）、　２７３〜２７５頁（１９６０年）］およ
びジブソフイリアストラチウム（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｉ
ａ　５ｔｒｕｔｈｉｕｎ＋　）からの勺ボアルピン［Ｒ
，ｖｏｃｈｅｎ、ｐ、、＋ｏｏｓおよびＲ８Ｒｕｙｓｓ
ｅｎによるＰｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐｒｏｐ
ｅｒｔｉｅｓ　ｏｆｓａｐｏａｌｂｉｎ　ａｎｄ　ｔｈ
ｅｉｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｆｏａｍｓ
ｔａｂｉｌｉｔｙ、　　Ｊ、　　Ｐｈａｒａ＋、　　Ｂ
ｅ１ｇ、　　／Ｉ　２　、　２１３〜２２６頁（１９６
８年）］である。４−ル△の使用が特に好ましい。

本発明による方法において、グリ」シトは少なくとも臨
界ミセル形成１１ｍ１ＪＩで使用する。キルＡの場合の
この濃度は０．０３重量％である。

本発明による方法で使用するステロールは動物または植
物起源の既知のステロール、たとえばコレステロール、
ラノスデロール、ルミステロール、スチグマステロール
およびシトスデ１」−ルである。

好ましくは、本発明による方法にＪ３いて、ステロール
としてコレステロールを使用りる。

本発明に従い、イスコムのＶＪ造に必要であるリン脂質
はホスファチジン酸およびそのエステル、たとえばホス
ファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミ
ンである。ホスファデジルエタノールアミンの使用によ
り最良の結果が得られる。

抗原性タンパク質またはペプチドが水不溶性である場合
には、これは可溶化させねばならない。

これは洗剤を用いる、尿素によるまたはグアニジンによ
る既知の方法で実施できる。

抗原性タンパク質またはペプチドの可溶化のために、ス
テロール、グリコシドおよび場合によりリン脂質を含有
する溶液中で使用される洗剤はＥＰ−Ａ　　０　１０９
　９４２にあげられているものと同一である。−般に、
この目的には非イオン性、イオン性または双イオン性洗
剤、あるいはコリン酸基材洗剤、たとえばナトリウム　
デソキシコレートが使用できる。好ましくは、使用洗剤
はオクチルグリコシドであるが、アルキルフェニルポリ
オキシエチレン　エーテル、特に、たとえば商品名トリ
トン（丁ｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１０００で市販されてい
る、９〜１０個のオキシエチレン基を有するポリエチレ
ングリコール　ｐ−イソオクチルフェニルエーテルもま
た適している。

本発明による方法は両親媒性を示さねばならない抗原性
タンパク質またはペプチドからの免疫原性複合体、中で
もイスコムの製造に使用できる。

これらのタンパク質またはペプチドはウィルス、＝　１
０− 細菌、マイコプラズマ寄生物または動物細胞から単離さ
れる膜タンパク質または膜ペプチドであることができる
。多少のウィルス膜タンパク質の疎水性部分く股領域〉
に存在】−るセリンおよびスレオニン基がエステル化さ
れうろことは知られている。望ましい疎水性を持たない
膜タンパク質または膜ペプチドの中でこれらを疎水性ア
ミノ酸と、脂肪酸基と、アルキル基とおにび同様の基と
カプリングさせた後に免疫原性複合体中に組入れること
ができるものはない。これらのタンパク質またはペプチ
ドはまた合成的にあるいは組換えＯＮ八−技法により調
製である。−般に、天然由来の抗原性タンパク質または
ペプチドの精製には超遠心分離または透析は充分なもの
ではない。好ましくは、抗原はクロマトグラフィ、たと
えばＤＥＡＥ−セファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）
のカラムでのクロマトグラフィにより、あるいは免疫親
和性クロマトグラフィにより精製する。

本発明による方法において、溶解または可溶化された抗
原は一般に、少なくとム臨界ミセル形成濃度のグリコシ
ド、ステロールおよび場合によりリン脂質を含有する溶
液と接触させる。この後で、洗剤を除去し、そして生成
された免疫原性複合体を精製する。

洗剤の除去には透析、勾配遠心分離またはクロマｉ・グ
ラフィのような既知の方法が使用できる。

洗剤の除去に、勾配遠心分館またはクロマトグラフィ的
方法、たとえばゲル波過を用いると、免疫原性複合体か
ら過剰のグリコシドおよびステロールのようなその他の
物質も広（除去される。−般に、この免疫原性複合体の
精製には透析は充分でないが、透析により洗剤を除去し
ても免疫原性複合体は生成される。

所望により、得られた免疫原性複合体の溶液は凍結乾燥
できる。凍結乾燥製剤は次いで水を添加して使用する前
に再構成させることができる。

さらにまた、本発明は本発明の方法により生成された免
疫原性複合体を含有する医薬組成物に関する。これらの
組成物は免疫原性複合体を非経口投与用に適する形にす
ることにより得られる。−般に、これらの医薬組成物は
、所望により緩衝剤および（または）塩化ナトリウムの
ような浸透圧の適合用の塩を含有する水性の生卵学的に
許容されつる媒質中に免疫原性複合体を含有する。

本発明による医薬組成物は抗源竹タンパク質またはペプ
チドが凝集体の形で存在する組成物よりも実質的に強力
な免疫原性作用を示す。

次側において、本発明により免疫原性複合体の製造をさ
らに説明する。

例１ 麻疹ウィルス（Ｅｄｇｉｏｎｓｔｏｎ系のプラーク変巽
株）を常法［０ｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ、　５ｔａｎ
ｄａｒｄ　、±２，６５〜６９頁（１９７８年）］で培
養する。ウィルス懸濁液を濾過し、へｍ１ｃｏｎ中空臓
腑状カートリッジ（ＨｌｏＸｌｏｏ）により濃縮する。

ウィルス糖タンパク質（ヘマグルチニンおよび融合タン
パク質）を１１０ｌ１１トリス−ＨＣｊ２　（１１１１
７，８）　、１５０ａＨＮａＣ１，６００１８ＫＣ，１
，０，１ｓｔ）ｌＭｃ＞ＣＪ！　　、２％（容量／容部
）トリトンＸ−１０００および１ｍＮｍＮフルメチルス
ルホニルフルオライドに溶解する［　Ｊ、　Ｇｅｎ、　
Ｖｉｒｏｌ、　６５　、３５５〜３６６　（１９８４年
）］。可溶化および超遠心分子ｌｉｔ　（１００，０Ｏ
Ｏｘｏで６０分）の後に、融合タンパク質が免疫親和性
クロマトグラフィにより上澄液から分離される。この終
りまでに、この融合タンパク質に対するモノクロナル抗
体をセファルセ（Ｓｅｐｈａｒｃｓｅ　）　４　（３（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ　９４　）に共有的に結合させる。

融合タンパク質を２０ｉＨトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，
８）、１＋ａＨＥＤＴＡおよび２．０％（重量／容量）
オクチルグリコシド中（７）５８　ＮＨ４８ＣＮで溶出
スル。ＮＨ４８ＣＮは１０１１Ｈトリス−ＨＣＪ！　（
ｐＨ７、８）および１５０１ＨＮａｃｊ！に対して透析
することにより溶出液から除去する。溶出液を５ＤＳ−
ＰＡＧＥで分析し、溶出液中のタンパク質含有間を推測
する［＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅａ＋、８３　、３４６
〜３５６頁（１９７７年）］。

融合タンパク質のイスコムへの組入れ １８０μｌトリス−ＨＣｊ！　＜１）１１７．８＞、１
５０ｍＨＮａＣｊ！および２％オクヂルグルコシド中の
融合タンパク質（６０μｇ）を２％オクチルグルコシド
７００μｍ中の小スフアブジルエタノールアミン３５０
μ９およびコレステ［］−ル３５０μりと混合する。室
温で１時間インキコベーションした後に、キルＡ１．７
１１１！ｊを１０％（重１■／容量）ストック溶液とし
て加える。Ａクヂルグルコシドを１０１１１Ｈトリス−
ＨＣｊ！　（１１１１７，８）および１５０ｓＨｌ−１
ｃｊ！に対して４℃で１６時間透析することにより除去
する。融合タンパク質を含有するイスコムを連続ショ糖
勾配（１０〜６０重川／容量用）中で超遠心分離により
精製する（２８６゜０００　ＸＱで４時間、または６４
，０ＯＯＸ（ｌで１８時間）。勾配採取物を２２のフラ
クシヨンに集める［フラクション１＝底部フラクション
（最高密度）；フラクション２２＝上頂部フラクション
（最低密度）］。これらのフラクションを５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥで分析する。融合タンパク質を含有するフラクショ
ンを電子顕微鏡で検査する。融合タンパク質を含有する
イスコムの電子顕微鏡写真を第４図として示す（倍率：
９５．０ＯＯＸ）。

同一方法をホスファチジルエタノールアミンおよびコレ
ステロールを添加することなく行なった場合に、イスコ
ムは形成されなかった。この結果は第５図に示されてい
る（倍率：９５，０００×）。

例２ 淋菌株の培養 淋菌株Ｂ２（血清型１）およびＣ３（血清型５）を常法
で培養する。培養物を５６℃で３０分間加熱することに
より不活性化する。遠心分離後に、ｌｌｌ１菌を凍結乾
燥させる。Ｃ３系のａ胞を含有しない培養液は外膜複合
体（ＯＭＧ）の製造に使用し、そして凍結乾燥した細菌
からボリン　タンパク質（ＰＩ）を製造する。

外股複合体（ＯＭＣ）の製造 細胞を含有しない培養液をＡｍ１ｃｏｎ中空繊維状力一
トリツジ（８１０Ｐ１０）を用いて粛縮する（８０Ｘ）
。濃縮物を遠心分離して（１０，０００ｘｏで２０分）
、いづれの残留細菌も除去する。

ＯＭＧを遠心分離しく１００．０ＯＯＸ（ＩＴ”２時間
）、６０１Ｍトリス−１−ＩＣＩ　（１１１１７，２）
および３００ｓＨＮａＣ１に懸濁し、１り度遠心分離し
く１００，０ＯＯｘｏｒ２時間）、次イテ蒸留水に懸濁
して、２■／Ｉｄのタンパク質濃度を得る。

氏上五亙ｌ 単離方法はタンパク質■の単動についてＢｌａｋｅおよ
びＧｏｔｓｃｈｌ　ｉｃｈにより使用された方法［Ｊ。

Ｅｘｐ、Ｒｅｄ、１５９，４５２〜’Ｉ６２頁（１９８
４年）］にもとづいて行なう。凍結乾燥させた淋菌を０
，５８　ＣａＣｊ！２中の３−（Ｎ−アトラデシルーＮ
、Ｎ−ジメチルーアンモニウム）−１−プロパン　スル
ホネート（２３−１４＞２．５９によりｐ＋＋４．、ｏ
で抽出するａ１時間後に、完全細胞および細胞断片を遠
心分離ににり除去する（２０゜０００Ｘ（ｌで２０分）
。上澄液に」エタノールを加えて２％の製電にする。３
０分後に、沈殿物を遠心分離により除去する（１０，０
ＯＯＸ（＋で２０分）。

上澄液を限外濾過（Ａｎ＋ｔｃｏｎ中空繊維状カートリ
ッヂ：ｔ−１１０ｘ５０）Ｌ、５０１１Ｈトリス−ＨＣ
，！、１０ｎＨＥＤＴＡＳｏ、０５％゛（重量／容量）
２３−１４、ｐＨ８，０（緩衝剤Ａ）を加え、次いで容
量を３０％まで減少させる；この処理を５回反復して塩
化カルシウムおよびエタノールを完全に除去する。次い
で、このタンパク質溶液をａｍ剤八へ平衡化したＤＥＡ
Ｅ−セファロースのカラムに装入する。タンパク質は！
Ｉｉｉ剤Ａ中のＮａＣ１。

の０．０〜０．６Ｈの線状勾配で溶出する。フラクショ
ンは５ＤＳ−’ＰＡＧＥで分析し、ＰＩ含有フラクショ
ンを集める。部分的に精製されたこのＰＩを５０ｍＨ１
−リス−ＨＣ１，２００ｍＨＮａＣ１，１０ＩｌｌＨ−
ＥＤＴＡｌｏ、０５％（重量／容量）２３−１４、ＤＨ
７，２で予め平衡化したセファクリル（Ｓｅｏｈａｃｒ
ｙｌ　）　ｓ　−３００カラムに装入する。Ｐｌ含有フ
ラクションを集める。得られた生成物は精製ＰＩと称す
ることにする。この例で使用したＣ３系からのタンパク
質を］レステロールおよびリン脂質の存在について分析
する。

リン脂質の分析には無機リン酸塩測定法を使用する。得
られたタンパク質は」レスｊ−【コールを含有せず、そ
してタンパク質１モル当り１．５モルのリン酸塩を含有
した。多分、このリン酸塩はりポボリサツカライド不純
物に由来Ｊ−るものと見做れる。

ＰＩ含有免疫原性複合体の調製 両系の精製ＰＩをエタノールで沈殿さゼ、遠心分離し、
次いで１０ｍＨトリスーＩ−Ｉ　ＣＪ（１１１１７，８
）、１５０ｍＨＮａＣｊ！および２％オクチルグルコシ
ド中に溶解する。これらの溶液をホスファチジルエタノ
ールアミン、コレステロールおよびキルＡと混合する（
表Ａ参照）。オクチルグルコシドの除去および免疫原１
！］　ｌｉ会合体精製は例１に従い行なう。さらに、超
遠心分離工程の代りに、５ｕｐｅｒｏｓｅ６（Ｐｈａｒ
ｌｌｌａＣｉａ￥Ｊ）ににルゲル濾過工程を用いる。イ
スコムはカラムのボイドボリュウム（ｖｏｉｄ　ｖｏｌ
ｕｍｅ　）中に溶出される。精製工程（透析および超遠
心分離またはカラムクロマ１・グラフィ）は両方共に、
カラムに０．２％キルＡ溶液（カラム容積の約２％）お
よびタンパク質、洗剤、リン脂質、コレステロールおよ
びキルΔよりなる混合物をカラムに順次装ＳＶることに
よりカラムで実施できる。この場合にもまたイスコムは
カラムのボイドボリュウム中に溶出される。

本例の下記部分に記載されている結果は例１に記載の方
法に従い得られた複合体に関するものである。

マウスの免疫処置 一群８匹のマウスにＰＩＣ３含有複合体を腹腔的注射す
る。投与量はタンパク質２．５μ０である。４週間後に
血清試料を採取する。

ＥＬＩＳＡ法 集めた血清試料中の抗体レベルを０．１５ＨＮａ（、！
で希釈したＯＭＧを微滴定板に被覆することにより評価
する。後続の工程はＩｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、４０，３６９〜３８０　（１９８３年）に
記載のとおりに行なう。

複合体の分析および免疫原性力 表Ａに記載の混合物の勾配フラクションを５Ｏ８−ＰＡ
ＧＥで分析する。フラツジ」ン１〜４の分析結果は表Ｂ
に示す。この表はホスファチジルエタノールアミンおよ
びコレスフ０−ルの添加あるいはコレステロールだ【ノ
の添加が両方のＰＩの沈降挙動に影響することを示して
いる。ホスファチジルエタノールアミンおＪ、びコレス
プロールと組合せたＰＩ（混合物１および３）は既知の
イスコムと同一のフラクション中に見い出される。コレ
ステロールは配合するがホスファチジルエタノールアミ
ンは配合されていない混合物４はまた類似の沈降挙動を
有する複合体を生成する。

これに対して、コレステロールもホスファチジルエタノ
ールアミンも配合されていない混合物２のタンパク質は
全体的に異なるフラクション（１５〜１７）に見い出さ
れる。

各勾配フラクションについて、表８に記載のフラクショ
ンを集め、透析した後に、電子顕微鏡で検査する。ＰＩ
Ｂ２含有イスコム（混合物１）の電子顕微鏡写真を第６
図に示１−　（倍率：９５，０００×）。しかしながら
、混合物をホスファデジルエタノールアミンおよびコレ
ステロールの添加なしに調製した場合（混合物２）には
、イスコムは得られない（第７図参照；倍率：９５．０
００×）。混合物３および４を用いて得られた複合体の
写真はそれぞれ第８図および第９図として示す（倍率：
　７６．０００ｘ）。

混合物６から調製されたイスコムは強い沈降傾向を有し
た。

混合物１，３．５および６から調製されたイスコムのコ
レステロール、キルＡおよびタンパク質含有量を測定し
た。結果を表Ｃに示す。この表はこれら３種の成分がイ
スコムに明白に検知できることを示している。

抗体測定は本発明によるイスコム形のおよび二元的構造
体形のＰＩＣ３が免疫原性であることを示した。イスコ
ム形のおよび二元的構造を有する複合体形のタンパク質
の免疫原性力はリポソームに組入れられたタンパク質の
ものよりも高い。

−２，３− 表　　Ｂ 超遠心分１！１４ｕの勾配フラクションのＳＤＳ　　Ｐ
ＡＧＥ分析 タンパク質　　混合物　　ＰＩ金含有示したの゛　　　
　　　　号　　フラクションＰｒＢ２　　　　１　　　
７−８−９ ＰＩＢ２　　　　２　　　１５−１６−１７ＰｒＣ３３
８−９ １１ｃ３　　　　４　　　６−７−８

【図面の簡単な説明】

第１図〜第９図は粒子構造を示す電子顕微鏡写真であり
、第１図（倍率＋　１１６．０ＯＯｘ）はキルＡ１コレ
ステロールおよびホスファチジルエタノールアミンから
得られたイスコムを、第２図（倍率：１４６．０ＯＯＸ
）はキルＡおよびコレステロールから得られた構造体を
、第３ａ図（倍率＋１４６，０ＯＯＸ）はキルＡおよび
ホスファチジルコリンから得られた構造体を、第３ｂ図
（倍率：８９．０ＯＯＸ）はキルＡおよびホスファチジ
ルエタノールアミンから得られた構造体を、第４図（倍
率：９５，０ＯＯＸ）は例１の融合タンパク質を含有す
る生成イスコムを、第５図（倍率：９５，０ＯＯＸ）は
ホスファチジルエタノールアミンおよびコレステロール
を使用しない場合の生成物を、第６図（倍率：９５．０
ＯＯＸ）は例２のＰＩＢ２含有イスコムを、第７図（倍
率：９５．０ＯＯＸ）は例２のホスファチジルエタノー
ルアミンおよびコレステロールを使用しない場合の生成
物を、そして第８図および第９図（倍率二７６．０ＯＯ
Ｘ）は例２の混合物３および４を用いて得られた複合体
をそれぞれ示す。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）両親媒性抗原性タンパク質またはペプチドを溶解
   された形または可溶化された形で、洗剤、スチロールお
   よび少なくとも臨界ミセル形成濃度の、疎水性部分と親
   水性部分とを含むグリコシドを含有する溶液と接触させ
   、洗剤を除去し、そして生成された免疫原性複合体を精
   製することを特徴とする免疫原性複合体の製造方法。
2. （２）抗原性タンパク質またはペプチドと接触させる溶
   液がリン脂質をさらに含有する、特許請求の範囲第１項
   に記載の方法。
3. （３）グリコシドがサポニンである、特許請求の範囲第
   １項に記載の方法。
4. （４）サポニンがキラヤサポナリアモリナ （Ｑｕｉｌｌａｊａ　ｓａｐｏｎａｒｉａ　Ｍｏｌｉｎ
   ａ）、エスクルスヒポカスタヌム（Ａｅｓｃｕｌｕｓ　
   ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）またはジプソフイリアス
   トラチウム（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｉａｓｔｒｕｔｈｉｕ
   ｍ）からのサポニンである、特許請求の範囲第３項に記
   載の方法。
5. （５）サポニンがＤＱ、キルＡ（ＯｕｉｌＡ）、サポア
   ルビンまたはエスキンである、特許請求の範囲第４項に
   記載の方法。
6. （６）サポニンがキルＡである、特許請求の範囲第５項
   に記載の方法。
7. （７）スチロールがコレステロールである、特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。
8. （８）リン脂質がホスファチジルエタノールアミンであ
   る、特許請求の範囲第２項に記載の方法。
9. （９）使用する洗剤が非イオン性、イオン性または双イ
   オン性洗剤あるいはコリン酸基材洗剤である、特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。
10. （１０）洗剤がオクチルグルコシドである、特許請求の
    範囲第９項に記載の方法。
11. （１１）洗剤がアルキルフェニルポリオキシエチレンエ
    ーテルである、特許請求の範囲第９項に記載の方法。
12. （１２）洗剤がトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００＾
    ■である、特許請求の範囲第１１項に記載の方法。
13. （１３）洗剤の除去および免疫原性複合体の精製を密度
    勾配による遠心分離により、透析により、またはクロマ
    トグラフィにより行なう、特許請求の範囲第１項に記載
    の方法。
14. （１４）前記特許請求の範囲の一項または二項以上の方
    法により得られた免疫原性複合体を含有する医薬組成物
    、特にワクチン。