JP2502558B2 - 免疫原性複合体の製造方法 - Google Patents
免疫原性複合体の製造方法Info
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- JP2502558B2 JP2502558B2 JP62007384A JP738487A JP2502558B2 JP 2502558 B2 JP2502558 B2 JP 2502558B2 JP 62007384 A JP62007384 A JP 62007384A JP 738487 A JP738487 A JP 738487A JP 2502558 B2 JP2502558 B2 JP 2502558B2
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- iscom
- immunogenic
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- A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は免疫原性複合体、中でもB.Morein等によりNa
ture308(1984年)、457〜460頁において「イスコム」
(“iscom")と称されている免疫原性複合体(EP−A 0
109 942も参照できる)に関する。
ture308(1984年)、457〜460頁において「イスコム」
(“iscom")と称されている免疫原性複合体(EP−A 0
109 942も参照できる)に関する。
B.Morein等によると、イスコムは微生物、動物細胞、
タンパク質またはペプチドを緩衝された溶液中で可溶化
剤と混合し、この溶液を、場合により可溶化剤を除去し
た後に、少なくとも臨界ミセル濃度の濃度の、疎水性部
分と親水性部分とを有するグリコシドの一種または二種
以上を含有するグリコシド溶液を接触させることにより
得られる。この方法でいわゆる「イスコム」タンパク質
複合体が生成され、生成物は次いで精製する。この精製
は勾配遠心分離、透析、クロマトグラフイまたはその他
の方法により実施できる。キラヤ サポナリア モリナ
(Quillaja saponaria Molina)の樹皮から抽出される
キルA(Quil A)はグリコシドとして好ましく使用され
ている。
タンパク質またはペプチドを緩衝された溶液中で可溶化
剤と混合し、この溶液を、場合により可溶化剤を除去し
た後に、少なくとも臨界ミセル濃度の濃度の、疎水性部
分と親水性部分とを有するグリコシドの一種または二種
以上を含有するグリコシド溶液を接触させることにより
得られる。この方法でいわゆる「イスコム」タンパク質
複合体が生成され、生成物は次いで精製する。この精製
は勾配遠心分離、透析、クロマトグラフイまたはその他
の方法により実施できる。キラヤ サポナリア モリナ
(Quillaja saponaria Molina)の樹皮から抽出される
キルA(Quil A)はグリコシドとして好ましく使用され
ている。
イスコムは電子顕微鏡により特別の構造を有すること
が見い出されている。イスコムは約35nmの平均直径を有
する粒子である。各粒子は直径約12nmの環状サブユニッ
トを有する、粗く、透明なカゴ状構造を有する。パラ−
インフルエンザ−3、麻疹および狂犬病ウイルスの膜タ
ンパク質の場合に、イスコムの免疫原性活性は膜タンパ
ク質の凝集により形成されるミセルよりも少なくとも10
倍高いことが示された。
が見い出されている。イスコムは約35nmの平均直径を有
する粒子である。各粒子は直径約12nmの環状サブユニッ
トを有する、粗く、透明なカゴ状構造を有する。パラ−
インフルエンザ−3、麻疹および狂犬病ウイルスの膜タ
ンパク質の場合に、イスコムの免疫原性活性は膜タンパ
ク質の凝集により形成されるミセルよりも少なくとも10
倍高いことが示された。
EP−A 0 109 942では、イスコムがそれらの構造およ
びグリコシドの存在ばかりでなく、またイスコムが脂質
を含有していない点で、リポソームと異なることが強調
されている。しかしながら、ここに精製された抗原性タ
ンパク質およびキルAを用いると、イスコムを得ること
ができないことが見い出された。さらに、研究により、
既知のイスコムが脂質、コレステロールを含有すること
が見い出され、この物質は微生物、中でもグラム陰性細
菌または外皮を有するウイルスから可溶化剤により抗原
性タンパク質とともに明らかに遊離されることが見い出
された。
びグリコシドの存在ばかりでなく、またイスコムが脂質
を含有していない点で、リポソームと異なることが強調
されている。しかしながら、ここに精製された抗原性タ
ンパク質およびキルAを用いると、イスコムを得ること
ができないことが見い出された。さらに、研究により、
既知のイスコムが脂質、コレステロールを含有すること
が見い出され、この物質は微生物、中でもグラム陰性細
菌または外皮を有するウイルスから可溶化剤により抗原
性タンパク質とともに明らかに遊離されることが見い出
された。
Morein等により開示されたイスコム構造はコレステロ
ールのようなステロールとともにホスフアチジルエタノ
ールアミンのようなリン脂質が存在する場合にだけ得る
ことができることが見い出された。リン脂質が存在しな
いと、得らたれた生成物はイスコムの特徴である約35nm
の平均直径を有するカゴ状構造を有せず、生成物は約12
nmの直径を有するイスコム サブユニツトの多少二元的
な凝集体である。これらの構造体はまた抗原性タンパク
質またはペプチドと免疫原性複合体を形成し、この複合
体は抗原性タンパク質の凝集により生成されたミセルと
比較して、格別に改善された免疫原性活性を有すること
が見い出された。
ールのようなステロールとともにホスフアチジルエタノ
ールアミンのようなリン脂質が存在する場合にだけ得る
ことができることが見い出された。リン脂質が存在しな
いと、得らたれた生成物はイスコムの特徴である約35nm
の平均直径を有するカゴ状構造を有せず、生成物は約12
nmの直径を有するイスコム サブユニツトの多少二元的
な凝集体である。これらの構造体はまた抗原性タンパク
質またはペプチドと免疫原性複合体を形成し、この複合
体は抗原性タンパク質の凝集により生成されたミセルと
比較して、格別に改善された免疫原性活性を有すること
が見い出された。
本発明は免疫原性複合体の製造方法に関し、この方法
は両親媒性抗原性タンパク質またはペプチドを溶解され
た形または可溶化された形で、洗剤、ステロールおよび
少なくとも臨界ミセル形成濃度の、疎水性部分と親水性
部分とを有するグリコシドを含有する溶液と接触させ、
洗剤を除去し、そして生成された免疫原性複合体を精製
することを特徴とする方法である。
は両親媒性抗原性タンパク質またはペプチドを溶解され
た形または可溶化された形で、洗剤、ステロールおよび
少なくとも臨界ミセル形成濃度の、疎水性部分と親水性
部分とを有するグリコシドを含有する溶液と接触させ、
洗剤を除去し、そして生成された免疫原性複合体を精製
することを特徴とする方法である。
イスコム構造を有する免疫原性複合体を製造しようと
する場合には、抗原性タンパク質またはペプチドと接触
させる溶液がまたリン脂質を含有する。
する場合には、抗原性タンパク質またはペプチドと接触
させる溶液がまたリン脂質を含有する。
グリコシド、ステロールおよびリン脂質の使用はイス
コムの生成に必須であることが証明され、他方、純粋な
抗原性タンパク質またはペプチドはこの点では何の役割
も演じない。すなわち、抗原を使用しなくても、グリコ
シド、ステロールおよびリン脂質からイスコムが生成さ
れることが証明された。キルA、コレステロールおよび
ホスフアチジルエタノールアミンから得られたイスコム
の電子顕微鏡写真を第1図として示す(倍率:116,000
×)。リン脂質を使用しない場合には、二元的構造体が
形成される。このような構造体の例を第2図として示
す。この図はキルAおよびコレステロールから得られた
構造体の電子顕微鏡写真である(倍率:146,000×)。ス
テロールを混合物から省略すると、リポソーム構造体が
得られ、この製造は本発明に属さない。第3a図はキルA
およびホスフアチジルコリンを用いて得られたこのよう
な構造体の電子顕微鏡写真(倍率:146,000×)であり、
そして第3b図はキルAおよびホスフアチジルエタノール
アミンから得られた構造体の電子顕微鏡写真である。
コムの生成に必須であることが証明され、他方、純粋な
抗原性タンパク質またはペプチドはこの点では何の役割
も演じない。すなわち、抗原を使用しなくても、グリコ
シド、ステロールおよびリン脂質からイスコムが生成さ
れることが証明された。キルA、コレステロールおよび
ホスフアチジルエタノールアミンから得られたイスコム
の電子顕微鏡写真を第1図として示す(倍率:116,000
×)。リン脂質を使用しない場合には、二元的構造体が
形成される。このような構造体の例を第2図として示
す。この図はキルAおよびコレステロールから得られた
構造体の電子顕微鏡写真である(倍率:146,000×)。ス
テロールを混合物から省略すると、リポソーム構造体が
得られ、この製造は本発明に属さない。第3a図はキルA
およびホスフアチジルコリンを用いて得られたこのよう
な構造体の電子顕微鏡写真(倍率:146,000×)であり、
そして第3b図はキルAおよびホスフアチジルエタノール
アミンから得られた構造体の電子顕微鏡写真である。
本発明の方法による方法で使用されるべきグリコシド
はEP−A 0 109 942にあげられているグリコシドと同一
である。一般に、これらのグリコシドは両親媒性を示す
グリコシドであり、分子内に疎水性部分と親水性部分と
を有する。好適には、サポニン、特にQuillaja saponar
ia Molinaからのサポニン エキス、第一にはK.Dalsgaa
rd[Saponin Adjuvants,Bull.Off,Int.Epiz.77(7〜
8),1289〜1295頁(1972年)]に従つて製造されるDQ
−エキスおよびまたはK.Dalegaard[Saponin Adjuvanta
III,Archiv fr di gesame Virus-forschung44,243
〜254頁(1974年)]に従つて製造されるキルAを使用
する。その他の好適なサポニンはエスクルス ヒポカス
タヌム(Aesculus hippocastanum)からのエサイン[T.
PattおよびW.WinklerによるDas tnerapeutisch wirksam
e Prinzip der Rosskatanie(Aesculus hippocastanu
m),Arzneimittelfarschung10(4),273〜275頁(1960
年)]およびジプソフイリアストラチウム(Gypsophili
a struthium)からのサポアルビン[R.Vochen,P.Joosお
よびR.RuyssenによるPhysicochemical properties of s
apoalbin and their relation to the foam stability,
J.Pharm.Belg.42,213〜226頁(1968年)]である。キル
Aの使用が特に好ましい。
はEP−A 0 109 942にあげられているグリコシドと同一
である。一般に、これらのグリコシドは両親媒性を示す
グリコシドであり、分子内に疎水性部分と親水性部分と
を有する。好適には、サポニン、特にQuillaja saponar
ia Molinaからのサポニン エキス、第一にはK.Dalsgaa
rd[Saponin Adjuvants,Bull.Off,Int.Epiz.77(7〜
8),1289〜1295頁(1972年)]に従つて製造されるDQ
−エキスおよびまたはK.Dalegaard[Saponin Adjuvanta
III,Archiv fr di gesame Virus-forschung44,243
〜254頁(1974年)]に従つて製造されるキルAを使用
する。その他の好適なサポニンはエスクルス ヒポカス
タヌム(Aesculus hippocastanum)からのエサイン[T.
PattおよびW.WinklerによるDas tnerapeutisch wirksam
e Prinzip der Rosskatanie(Aesculus hippocastanu
m),Arzneimittelfarschung10(4),273〜275頁(1960
年)]およびジプソフイリアストラチウム(Gypsophili
a struthium)からのサポアルビン[R.Vochen,P.Joosお
よびR.RuyssenによるPhysicochemical properties of s
apoalbin and their relation to the foam stability,
J.Pharm.Belg.42,213〜226頁(1968年)]である。キル
Aの使用が特に好ましい。
本発明による方法において、グリコシドは少なくとも
臨界ミセル形成濃度で使用する。キルAの場合のこの濃
度は0.03重量%である。
臨界ミセル形成濃度で使用する。キルAの場合のこの濃
度は0.03重量%である。
本発明による方法で使用するステロールは動物または
植物起源の既知のステロール、たとえばコレステロー
ル、ラノステロール、ルミステロール、スチグマステロ
ールおよびシトステロールである。好ましくは、本発明
による方法において、ステロールとしてコレステロール
を使用する。
植物起源の既知のステロール、たとえばコレステロー
ル、ラノステロール、ルミステロール、スチグマステロ
ールおよびシトステロールである。好ましくは、本発明
による方法において、ステロールとしてコレステロール
を使用する。
本発明に従い、イスコムの製造に必要であるリン脂質
はホスフアチジン酸およびそのエステル、たとえばホス
フアチジルコリンおよびホスフアチジルエタノールアミ
ンである。ホスフアチジルエタノールアミンの使用によ
り最良の結果が得られる。
はホスフアチジン酸およびそのエステル、たとえばホス
フアチジルコリンおよびホスフアチジルエタノールアミ
ンである。ホスフアチジルエタノールアミンの使用によ
り最良の結果が得られる。
抗原性タンパク質またはペプチドが水不溶性である場
合には、これは可溶化させねばならない。これは洗剤を
用いる、尿素によるまたはグアニジンによる既知の方法
で実施できる。
合には、これは可溶化させねばならない。これは洗剤を
用いる、尿素によるまたはグアニジンによる既知の方法
で実施できる。
抗原性タンパク質またはペプチドの可溶化のために、
ステロール、グリコシドおよび場合によりリン脂質を含
有する溶液中で使用される洗剤はEP−A 0 109 942にあ
げられているものと同一である。一般に、この目的には
非イオン性、イオン性または双イオン性洗剤、あるいは
コリン酸基材洗剤、たとえばナトリウム デソキシコレ
ートが使用できる。好ましくは、使用洗剤はオクチルグ
リコシドであるが、アルキルフエニルポリオキシエチレ
ン、エーテル、特に、たとえば商品名トリトン(Trito
n)X−100 で市販されている、9〜10個のオキシエチ
レン基を有するポリエチレングリコール p−イソオク
チルフェニルエーテル(オクトキシノール)もまた適し
ている。
ステロール、グリコシドおよび場合によりリン脂質を含
有する溶液中で使用される洗剤はEP−A 0 109 942にあ
げられているものと同一である。一般に、この目的には
非イオン性、イオン性または双イオン性洗剤、あるいは
コリン酸基材洗剤、たとえばナトリウム デソキシコレ
ートが使用できる。好ましくは、使用洗剤はオクチルグ
リコシドであるが、アルキルフエニルポリオキシエチレ
ン、エーテル、特に、たとえば商品名トリトン(Trito
n)X−100 で市販されている、9〜10個のオキシエチ
レン基を有するポリエチレングリコール p−イソオク
チルフェニルエーテル(オクトキシノール)もまた適し
ている。
本発明による方法は両親媒性を示さねばならない抗原
性タンパク質またはペプチドからの免疫原性複合体、中
でもイスコムの製造に使用できる。これらのタンパク質
またはペプチドはウイルス、細菌、マイコプラズマ寄生
物または動物細胞から単離される膜タンパク質または膜
ペプチドであることができる。多少のウイルス膜タンパ
ク質の疎水性部分(膜領域)に存在するセリンおよびス
レオニン基がエステル化されうることは知られている。
望ましい疎水性を持たない非膜タンパク質または非膜ペ
プチドは、これらを疎水性アミノ酸からなるペプチド
と、脂肪酸基と、アルキル基とおよび同様の基と、カプ
リングさせた後に免疫原性複合体中に組入れることがで
きる。これらのタンパク質またはペプチドはまた合成的
にあるいは組換えDNA一技法により調製である。一般
に、天然由来の抗原性タンパク質またはペプチドの精製
には超遠心分離または透析は充分なものではない。好ま
しくは、抗原はクロマトグラフイ、たとえばDEAE−セフ
アデツクス(Sephadex)のカラムでのクロマトグラフイ
により、あるいは免疫親和性クロマトグラフイにより精
製する。
性タンパク質またはペプチドからの免疫原性複合体、中
でもイスコムの製造に使用できる。これらのタンパク質
またはペプチドはウイルス、細菌、マイコプラズマ寄生
物または動物細胞から単離される膜タンパク質または膜
ペプチドであることができる。多少のウイルス膜タンパ
ク質の疎水性部分(膜領域)に存在するセリンおよびス
レオニン基がエステル化されうることは知られている。
望ましい疎水性を持たない非膜タンパク質または非膜ペ
プチドは、これらを疎水性アミノ酸からなるペプチド
と、脂肪酸基と、アルキル基とおよび同様の基と、カプ
リングさせた後に免疫原性複合体中に組入れることがで
きる。これらのタンパク質またはペプチドはまた合成的
にあるいは組換えDNA一技法により調製である。一般
に、天然由来の抗原性タンパク質またはペプチドの精製
には超遠心分離または透析は充分なものではない。好ま
しくは、抗原はクロマトグラフイ、たとえばDEAE−セフ
アデツクス(Sephadex)のカラムでのクロマトグラフイ
により、あるいは免疫親和性クロマトグラフイにより精
製する。
本発明による方法において、溶解または可溶化された
抗原は一般に、少なくとも臨界ミセル形成濃度のグリコ
シド、ステロールおよび場合によりリン脂質を含有する
溶液と接触させる。この後で、洗剤を除去し、そして生
成された免疫原性複合体を精製する。
抗原は一般に、少なくとも臨界ミセル形成濃度のグリコ
シド、ステロールおよび場合によりリン脂質を含有する
溶液と接触させる。この後で、洗剤を除去し、そして生
成された免疫原性複合体を精製する。
洗剤の除去には透析、勾配遠心分離またはクロマトグ
ラフイのような既知の方法が使用できる。洗剤の除去
に、勾配遠心分離またはクロマトグラフイ的方法、たと
えばゲル濾過を用いると、免疫原性複合体から過剰のグ
リコシドおよびステロールのようなその他の物質も広く
除去される。一般に、免疫原性複合体は、透析による洗
剤の除去により生成されているけれども、この免疫原性
複合体の精製には透析は充分ではない。
ラフイのような既知の方法が使用できる。洗剤の除去
に、勾配遠心分離またはクロマトグラフイ的方法、たと
えばゲル濾過を用いると、免疫原性複合体から過剰のグ
リコシドおよびステロールのようなその他の物質も広く
除去される。一般に、免疫原性複合体は、透析による洗
剤の除去により生成されているけれども、この免疫原性
複合体の精製には透析は充分ではない。
所望により、得られた免疫原性複合体の溶液は凍結乾
燥できる。凍結乾燥製剤は次いで水を添加して使用する
前に再構成させることができる。
燥できる。凍結乾燥製剤は次いで水を添加して使用する
前に再構成させることができる。
さらにまた、本発明は本発明の方法により生成された
免疫原性複合体を含有する医薬組成物に関する。これら
の組成物は免疫原性複合体を非経口投与用に適する形に
することにより得られる。一般に、これらの医薬組成物
は、所望により緩衝剤および(または)塩化ナトリウム
のような浸透圧の適合用の塩を含有する水性の生理学的
に許容されうる媒質中に免疫原性複合体を含有する。
免疫原性複合体を含有する医薬組成物に関する。これら
の組成物は免疫原性複合体を非経口投与用に適する形に
することにより得られる。一般に、これらの医薬組成物
は、所望により緩衝剤および(または)塩化ナトリウム
のような浸透圧の適合用の塩を含有する水性の生理学的
に許容されうる媒質中に免疫原性複合体を含有する。
本発明による医薬組成物は抗源性タンパク質またはペ
プチドが凝集体の形で存在する組成物よりも実質的に強
力な免疫原性作用を示す。
プチドが凝集体の形で存在する組成物よりも実質的に強
力な免疫原性作用を示す。
次例において、本発明により免疫原性複合体の製造を
さらに説明する。
さらに説明する。
例1 (麻疹融合タンパク質を含有するイスコム) 麻疹ウイルスの培養および融合タンパク質の精製 麻疹ウイルス(Edmonston系のプラーク変異株)を常
法[Develop.Biol.Standard,42,65〜69頁(1978年)]
で培養する。ウイルス懸濁液を濾過し、Amicon中空繊維
状カートリツジ(H10×100)により濃縮する。ウイルス
糖タンパク質(ヘマグルチニンおよび融合タンパク質)
を10mMトリス−HCl(pH7.8)、150mM Nacl、600mM KC
l、0.1mM MgCl2、2%(容量/容量)トリトンX−100
および1mMフエニルメチルスルホニルフルオライドに
溶解する[J.Gen.Virol.65,355〜366(1984年)]。可
溶化および超遠心分離(100,000xgで60分)の後に、融
合タンパク質が免疫親和性クロマトグラフイにより上澄
液から分離される。この終りまでに、この融合タンパク
質に対するモノクロナル抗体をセフアルセ(Sepharcs
e)4B(Pharmacia製)に共有的に結合させる。融合タン
パク質を20mMトリス−HCl(pH7.8)、1mM EDTAおよび2.
0%(重量/容量)オクチルグリコシド中の5M NH4SCNで
溶出できる。NH4SCHは10mMトリス−HCl(pH7.8)および
150mM NaClに対して透析することにより溶出液から除去
する。溶出液をSDS−PAGEで分析し、溶出液中のタンパ
ク質含有量を推測する[Anal.Biochem.83,346〜356頁
(1977年)]。
法[Develop.Biol.Standard,42,65〜69頁(1978年)]
で培養する。ウイルス懸濁液を濾過し、Amicon中空繊維
状カートリツジ(H10×100)により濃縮する。ウイルス
糖タンパク質(ヘマグルチニンおよび融合タンパク質)
を10mMトリス−HCl(pH7.8)、150mM Nacl、600mM KC
l、0.1mM MgCl2、2%(容量/容量)トリトンX−100
および1mMフエニルメチルスルホニルフルオライドに
溶解する[J.Gen.Virol.65,355〜366(1984年)]。可
溶化および超遠心分離(100,000xgで60分)の後に、融
合タンパク質が免疫親和性クロマトグラフイにより上澄
液から分離される。この終りまでに、この融合タンパク
質に対するモノクロナル抗体をセフアルセ(Sepharcs
e)4B(Pharmacia製)に共有的に結合させる。融合タン
パク質を20mMトリス−HCl(pH7.8)、1mM EDTAおよび2.
0%(重量/容量)オクチルグリコシド中の5M NH4SCNで
溶出できる。NH4SCHは10mMトリス−HCl(pH7.8)および
150mM NaClに対して透析することにより溶出液から除去
する。溶出液をSDS−PAGEで分析し、溶出液中のタンパ
ク質含有量を推測する[Anal.Biochem.83,346〜356頁
(1977年)]。
融合タンパク質のイスコムへの組入れ 180μlトリス−HCl(pH7.8)、150mM NaClおよび2
%オクチルグルコシド中の融合タンパク質(60μg)を
2%オクチルグルコシド700μl中のホスフアチジルエ
タノールアミン350μgおよびコレステロール350μgと
混合する。室温で1時間インキユベーシヨンした後に、
キルA1.7mgを10%(重量/容量)ストツク溶液として加
える。オクチルグルコシドを10mMトリス−HCl(pH7.8)
および150mM HClに対して4℃で16時間透析することに
より除去する。融合タンパク質を含有するイスコムを連
続シヨ糖勾配(10〜60重量/容量%)中で超遠心分離に
より精製する(286,000xgで4時間、または64,000xgで1
8時間)。勾配採取物を22のフラクションに集める[フ
ラクシヨン1=底部フラクション(最高密度);フラク
シヨン22=上頂部フラクシヨン(最低密度)]。これら
のフラクシヨンをSDS−PAGEで分析する。融合タンパク
質を含有するフラクシヨンを電子顕微鏡で検査する。融
合タンパク質を含有するイスコムの電子顕微鏡写真を第
4図として示す(倍率:95,000×)。
%オクチルグルコシド中の融合タンパク質(60μg)を
2%オクチルグルコシド700μl中のホスフアチジルエ
タノールアミン350μgおよびコレステロール350μgと
混合する。室温で1時間インキユベーシヨンした後に、
キルA1.7mgを10%(重量/容量)ストツク溶液として加
える。オクチルグルコシドを10mMトリス−HCl(pH7.8)
および150mM HClに対して4℃で16時間透析することに
より除去する。融合タンパク質を含有するイスコムを連
続シヨ糖勾配(10〜60重量/容量%)中で超遠心分離に
より精製する(286,000xgで4時間、または64,000xgで1
8時間)。勾配採取物を22のフラクションに集める[フ
ラクシヨン1=底部フラクション(最高密度);フラク
シヨン22=上頂部フラクシヨン(最低密度)]。これら
のフラクシヨンをSDS−PAGEで分析する。融合タンパク
質を含有するフラクシヨンを電子顕微鏡で検査する。融
合タンパク質を含有するイスコムの電子顕微鏡写真を第
4図として示す(倍率:95,000×)。
同一方法をホスフアチジルエタノールアミンおよびコ
レステロールを添加することなく行なつた場合に、イス
コムは形成されなかつた。この結果は第5図に示されて
いる(倍率;95,000×)。
レステロールを添加することなく行なつた場合に、イス
コムは形成されなかつた。この結果は第5図に示されて
いる(倍率;95,000×)。
例2 (淋菌ポリン(porin)タンパク質を含有するイスコ
ム) 淋菌株の培養 淋菌株B2(血清型1)およびC3(血清型5)を常法で
培養する。培養物を56℃で30分間加熱することにより不
活性化する。遠心分離後に、細菌を凍結乾燥させる。C3
系の細胞を含有しない培養液は外膜複合体(OMC)の製
造に使用し、そして凍結乾燥した細菌からポリン タン
パク質(PI)を製造する。
ム) 淋菌株の培養 淋菌株B2(血清型1)およびC3(血清型5)を常法で
培養する。培養物を56℃で30分間加熱することにより不
活性化する。遠心分離後に、細菌を凍結乾燥させる。C3
系の細胞を含有しない培養液は外膜複合体(OMC)の製
造に使用し、そして凍結乾燥した細菌からポリン タン
パク質(PI)を製造する。
外膜複合体(OMC)の製造 細胞を含有しない培養液をAmicon中空繊維状カートリ
ツジ(H10P10)を用いて濃縮する(80×)。濃縮物を遠
心分離して(10,000xgで20分)、いづれの残留細菌も除
去する。OMCを遠心分離し(100.000xgで2時間)、60mM
トリス−HCl(pH7.2)および300mM NaClに懸濁し、再度
遠心分離し(100,000xgで2時間)、次いで蒸留水に懸
濁して、2mg/mlのタンパク質濃度を得る。
ツジ(H10P10)を用いて濃縮する(80×)。濃縮物を遠
心分離して(10,000xgで20分)、いづれの残留細菌も除
去する。OMCを遠心分離し(100.000xgで2時間)、60mM
トリス−HCl(pH7.2)および300mM NaClに懸濁し、再度
遠心分離し(100,000xgで2時間)、次いで蒸留水に懸
濁して、2mg/mlのタンパク質濃度を得る。
PIの精製 単離方法はタンパク質IIの単離についてBlakeおよびG
otschlichにより使用された方法[J.Exp.Med.159,452〜
462頁(1984年)]にもとづいて行なう。凍結乾燥させ
た淋菌を0.5M CaCl2中の3−(N−テトラデシル−N,N
−ジメチル−アンモニウム)−1−プロパン スルホネ
ート(23−14)2.5gによりpH4.0で抽出する。一時間後
に、完全細胞および細胞断片を遠心分離により除去する
(20,000xgで20分)。上澄液にエノールを加えて2%の
濃度にする。30分後に、沈殿物を遠心分離により除去す
る(10,000xgで20分)。上澄液を限外濾過(Amicon中空
繊維状カートリツヂ:H10×50)し、50mMトリス−HCl、1
0mM EDTA、0.05%(重量/容量)23−14、pH8.0(緩衝
剤A)を加え、次いで容量を30%まで減少させる;この
処理を5回反復して塩化カルシウムおよびエタノールを
完全に除去する。次いで、このタンパク質溶液を緩衝剤
Aで平衡化したDEAE−セフアロースのカラムに装入す
る。タンパク質は緩衝剤A中のNaClの0.0〜0.6Mの線状
勾配で溶出する。フラクシヨンはSDS−PAGEで分析し、P
I含有フラクシヨンを集める。部分的に精製されたこのP
Iを50mMトリス−HCl、200mM NaCl、10mM EDTA、0.05%
(重量/容量)23−14、pH7.2で予め平衡化したセフア
クリル(Sephacryl)s−300カラムに装入する。PI含有
フラクシヨンを集める。得られた生成物は精製PIと称す
ることにする。この例で使用したC3系からのタンパク質
をコレステロールおよびリン脂質の存在について分析す
る。リン脂質の分析には無機リン酸塩測定法を使用す
る。得られたタンパク質はコレステロールを含有せず、
そしてタンパク質1モル当り1.5モルのリン酸塩を含有
した。多分、このリン酸塩はリポポリサツカライド不純
物に由来するものと見做れる。
otschlichにより使用された方法[J.Exp.Med.159,452〜
462頁(1984年)]にもとづいて行なう。凍結乾燥させ
た淋菌を0.5M CaCl2中の3−(N−テトラデシル−N,N
−ジメチル−アンモニウム)−1−プロパン スルホネ
ート(23−14)2.5gによりpH4.0で抽出する。一時間後
に、完全細胞および細胞断片を遠心分離により除去する
(20,000xgで20分)。上澄液にエノールを加えて2%の
濃度にする。30分後に、沈殿物を遠心分離により除去す
る(10,000xgで20分)。上澄液を限外濾過(Amicon中空
繊維状カートリツヂ:H10×50)し、50mMトリス−HCl、1
0mM EDTA、0.05%(重量/容量)23−14、pH8.0(緩衝
剤A)を加え、次いで容量を30%まで減少させる;この
処理を5回反復して塩化カルシウムおよびエタノールを
完全に除去する。次いで、このタンパク質溶液を緩衝剤
Aで平衡化したDEAE−セフアロースのカラムに装入す
る。タンパク質は緩衝剤A中のNaClの0.0〜0.6Mの線状
勾配で溶出する。フラクシヨンはSDS−PAGEで分析し、P
I含有フラクシヨンを集める。部分的に精製されたこのP
Iを50mMトリス−HCl、200mM NaCl、10mM EDTA、0.05%
(重量/容量)23−14、pH7.2で予め平衡化したセフア
クリル(Sephacryl)s−300カラムに装入する。PI含有
フラクシヨンを集める。得られた生成物は精製PIと称す
ることにする。この例で使用したC3系からのタンパク質
をコレステロールおよびリン脂質の存在について分析す
る。リン脂質の分析には無機リン酸塩測定法を使用す
る。得られたタンパク質はコレステロールを含有せず、
そしてタンパク質1モル当り1.5モルのリン酸塩を含有
した。多分、このリン酸塩はリポポリサツカライド不純
物に由来するものと見做れる。
P1含有免疫原性複合体の調製 両系の精製PIをエタノールで沈殿させ、遠心分離し、
次いで10mMトリス−HCl(pH7.8)、150mM NaClおよび2
%オクチルグリコシド中に溶解する。これらの溶液をホ
スフアチジルエタノールアミン、コレステロールおよび
キルAと混合する(表A参照)。オクチルグルコシドの
除去および免疫原性複合体の精製は例1に従い行なう。
さらに、超遠心分離工程の代りに、Superose6(pharmac
ia製)によるゲル濾過工程を用いる。イスコムはカラム
のボイドボリユウム(void volume)中に溶出される。
精製工程(透析および超遠心分離またはカラムクロマト
グラフイ)は両方共に、カラムに0.2%キルA溶液(カ
ラム容積の約2%)およびタンパク質、洗剤、リン脂
質、コレステロールおよびキルAよりなる混合物をカラ
ムに順次装填することによりカラムで実施できる。この
場合にもまたイスコムかカラムのボイドボリユウム中の
溶出される。
次いで10mMトリス−HCl(pH7.8)、150mM NaClおよび2
%オクチルグリコシド中に溶解する。これらの溶液をホ
スフアチジルエタノールアミン、コレステロールおよび
キルAと混合する(表A参照)。オクチルグルコシドの
除去および免疫原性複合体の精製は例1に従い行なう。
さらに、超遠心分離工程の代りに、Superose6(pharmac
ia製)によるゲル濾過工程を用いる。イスコムはカラム
のボイドボリユウム(void volume)中に溶出される。
精製工程(透析および超遠心分離またはカラムクロマト
グラフイ)は両方共に、カラムに0.2%キルA溶液(カ
ラム容積の約2%)およびタンパク質、洗剤、リン脂
質、コレステロールおよびキルAよりなる混合物をカラ
ムに順次装填することによりカラムで実施できる。この
場合にもまたイスコムかカラムのボイドボリユウム中の
溶出される。
本例の下記部分に記載されている結果は例1に記載の
方法に従い得られた複合体に関するものである。
方法に従い得られた複合体に関するものである。
マウスの免疫処置 一群8匹のマウスにPIC3含有複合体を腹腔内注射す
る。投与量はタンパク質2.5μgである。4週間後に血
清試料を採取する。
る。投与量はタンパク質2.5μgである。4週間後に血
清試料を採取する。
ELISA法 集めた血清試料中の抗体レベルを0.15M NaClで希釈し
たOMCを微滴定板に被覆することにより評価する。後続
の工程はInfect.Immun.40,369〜380(1983年)に記載の
とおりに行なう。
たOMCを微滴定板に被覆することにより評価する。後続
の工程はInfect.Immun.40,369〜380(1983年)に記載の
とおりに行なう。
複合体の分析および免疫原性力 表Aに記載の混合物の勾配フラクシヨンをSDS−PAGE
で分析する。フラクション1〜4の分析結果は表Bに示
す。この表はホスフアチジルエタノールアミンおよびコ
レステロールの添加あるいはコレステロールだけの添加
が両方のPIの沈降挙動に影響することを示している。ホ
スフアチジルエタノールアミンおよびコレステロールを
組合せたPI(混合物1および3)は既知のイスコムを同
一のフラクシヨン中に見い出される。コレステロールは
配合するがホスフアチジルエタノールアミンは配合され
ていない混合物4はまた類似の沈降挙動を有する複合体
を生成する。これに対して、コレステロールもホスフア
チジルエタノールアミンも配合されていない混合物2の
タンパク質は全体的に異なるフラクシヨン(15〜17)に
見い出される。
で分析する。フラクション1〜4の分析結果は表Bに示
す。この表はホスフアチジルエタノールアミンおよびコ
レステロールの添加あるいはコレステロールだけの添加
が両方のPIの沈降挙動に影響することを示している。ホ
スフアチジルエタノールアミンおよびコレステロールを
組合せたPI(混合物1および3)は既知のイスコムを同
一のフラクシヨン中に見い出される。コレステロールは
配合するがホスフアチジルエタノールアミンは配合され
ていない混合物4はまた類似の沈降挙動を有する複合体
を生成する。これに対して、コレステロールもホスフア
チジルエタノールアミンも配合されていない混合物2の
タンパク質は全体的に異なるフラクシヨン(15〜17)に
見い出される。
各勾配フラクシヨンについて、表Bに記載のフラクシ
ヨンを集め、透析した後に、電子顕微鏡で検査する。PI
B2含有イスコム(混合物1)の電子顕微鏡写真を第6図
に示す(倍率:95,000×)。しかしながら、混合物をホ
スフアチジルエタノールアミンおよびコレステロールの
添加なしに調製した場合(混合物2)には、イスコムは
得られない(第7図参照;倍率:95,000×)。混合物3
および4を用いて得られた複合体の写真はそれぞれ第8
図および第9図として示す(倍率:76,000×)。
ヨンを集め、透析した後に、電子顕微鏡で検査する。PI
B2含有イスコム(混合物1)の電子顕微鏡写真を第6図
に示す(倍率:95,000×)。しかしながら、混合物をホ
スフアチジルエタノールアミンおよびコレステロールの
添加なしに調製した場合(混合物2)には、イスコムは
得られない(第7図参照;倍率:95,000×)。混合物3
および4を用いて得られた複合体の写真はそれぞれ第8
図および第9図として示す(倍率:76,000×)。
混合物6から調製されたイスコムは強い沈降傾向を有
した。
した。
混合物1,3,5および6から調製されたイスコムのコレ
ステロール、キルAおよびタンパク質含有量を測定し
た。結果を表Cに示す。この表はこれら3種の成分がイ
スコムに明白に検知できることを示している。
ステロール、キルAおよびタンパク質含有量を測定し
た。結果を表Cに示す。この表はこれら3種の成分がイ
スコムに明白に検知できることを示している。
抗体測定は本発明によるイスコム形のおよび二元的構
造体形のPIC3が免疫原性であることを示した。イスコム
形のおよび二元的構造を有する複合体形のタンパク質の
免疫原性力はリポソームに組入れられたタンパク質のも
のよりも高い。
造体形のPIC3が免疫原性であることを示した。イスコム
形のおよび二元的構造を有する複合体形のタンパク質の
免疫原性力はリポソームに組入れられたタンパク質のも
のよりも高い。
第1図〜第9図は粒子構造を示す電子顕微鏡写真であ
り、第1図(倍率:116,000×)はキルA、コレステロー
ルおよびホスフアチジルエタノールアミンから得られた
イスコムを、第2図(倍率:146,000×)はキルAおよび
コレステロールから得られた構造体を、第3a図(倍率:1
46,000×)はキルAおよびホスフアチジルコリンから得
られた構造体を、第3b図(倍率:89,000×)はキルAお
よびホスフアチジルエタノールアミンから得られた構造
体を、第4図(倍率:95,000×)は例1の融合タンパク
質を含有する生成イスコムを、第5図(倍率:95,000
×)はホスフアチジルエタノールアミンおよびコレステ
ロールを使用しない場合の生成物を、第6図(倍率:95,
000×)は例2のPIB2含有イスコムを、第7図(倍率:9
5,000×)は例2のホスフアチジルエタノールアミンお
よびコレステロールを使用しない場合の生成物を、そし
て第8図および第9図(倍率:76,000×)が例2の混合
物3および4を用いて得られた複合体をそれぞれ示す。
り、第1図(倍率:116,000×)はキルA、コレステロー
ルおよびホスフアチジルエタノールアミンから得られた
イスコムを、第2図(倍率:146,000×)はキルAおよび
コレステロールから得られた構造体を、第3a図(倍率:1
46,000×)はキルAおよびホスフアチジルコリンから得
られた構造体を、第3b図(倍率:89,000×)はキルAお
よびホスフアチジルエタノールアミンから得られた構造
体を、第4図(倍率:95,000×)は例1の融合タンパク
質を含有する生成イスコムを、第5図(倍率:95,000
×)はホスフアチジルエタノールアミンおよびコレステ
ロールを使用しない場合の生成物を、第6図(倍率:95,
000×)は例2のPIB2含有イスコムを、第7図(倍率:9
5,000×)は例2のホスフアチジルエタノールアミンお
よびコレステロールを使用しない場合の生成物を、そし
て第8図および第9図(倍率:76,000×)が例2の混合
物3および4を用いて得られた複合体をそれぞれ示す。
Claims (12)
- 【請求項1】両親媒性抗原性タンパク質またはペプチド
を溶解した形または可溶化した形で、洗剤、ステロー
ル、リン脂質および少なくとも臨界ミセル形成濃度にお
いて、疎水性部分と親水性部分とを含むグリコシドを含
有する溶液と接触させ、洗剤を除去し、そして生成した
免疫原性複合体を精製することを特徴とする免疫原性複
合体の製造方法。 - 【請求項2】グリコシドがサポニンである、特許請求の
範囲第1項に記載の方法。 - 【請求項3】サポニンがキラヤ サポナリア モリナ
(Quillaja saponaria Molina)、エスクルス ヒポカ
スタヌム(Aesculus hippocastanum)またはジプソフイ
リア ストラチウム(Gypsophilia struthium)からの
サポニンである、特許請求の範囲第2項に記載の方法。 - 【請求項4】サポニンがDQ、キルA(Quil A)、サポア
ルビンまたはエサインである、特許請求の範囲第3項に
記載の方法。 - 【請求項5】サポニンがキルAである、特許請求の範囲
第4項に記載の方法。 - 【請求項6】ステロールがコレステロールである、特許
請求の範囲第1項に記載の方法。 - 【請求項7】リン脂質がホスフアチジルエタノールアミ
ンである、特許請求の範囲第1項に記載の方法。 - 【請求項8】使用する洗剤が非イオン性、イオン性また
は双イオン性洗剤あるいはコール酸ベース洗剤である、
特許請求の範囲第1項に記載の方法。 - 【請求項9】洗剤がオクチルグルコシドである、特許請
求の範囲第8項に記載の方法。 - 【請求項10】洗剤がアルキルフェニルポリオキシエチ
レン エーテルである、特許請求の範囲第8項に記載の
方法。 - 【請求項11】洗剤がオクトキシノールである、特許請
求の範囲第10項に記載の方法。 - 【請求項12】洗剤の除去および免疫原性複合体の精製
を密度勾配による遠心分離により、透析により、または
クロマトグラフイにより行う、特許請求の範囲第1項に
記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NL8600066 | 1986-01-14 | ||
NL8600066 | 1986-01-14 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP7309056A Division JP2703528B2 (ja) | 1986-01-14 | 1995-11-28 | 免疫原性複合体を含有するワクチン |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS632933A JPS632933A (ja) | 1988-01-07 |
JP2502558B2 true JP2502558B2 (ja) | 1996-05-29 |
Family
ID=19847414
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62007384A Expired - Lifetime JP2502558B2 (ja) | 1986-01-14 | 1987-01-14 | 免疫原性複合体の製造方法 |
JP7309056A Expired - Lifetime JP2703528B2 (ja) | 1986-01-14 | 1995-11-28 | 免疫原性複合体を含有するワクチン |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP7309056A Expired - Lifetime JP2703528B2 (ja) | 1986-01-14 | 1995-11-28 | 免疫原性複合体を含有するワクチン |
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Country | Link |
---|---|
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EP (1) | EP0231039B1 (ja) |
JP (2) | JP2502558B2 (ja) |
AT (1) | ATE71303T1 (ja) |
CA (1) | CA1279012C (ja) |
DE (1) | DE3775783D1 (ja) |
DK (1) | DK166762B1 (ja) |
ES (1) | ES2039229T3 (ja) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102009028265A1 (de) | 2008-08-06 | 2010-02-18 | DENSO CORPORATION, Kariya-shi | Drehmomentsteuerung für einen Energiegenerator an einem Fahrzeug |
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NZ230747A (en) * | 1988-09-30 | 1992-05-26 | Bror Morein | Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina |
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