JP2000053585A - 抗原の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】抗原性調製物の製造方法を提供することを目的
とする。 【解決手段】１２％（ｗ／ｗ）ポリアクリルアミドゲル
電気泳動で測定して、相対分子量６７，０００〜７３，
０００であり、アミノ酸分析によりプロリン対グルタミ
ン酸の割合が約１：１である精製百日咳菌（Ｂｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗原を含む抗原性調
製物は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細
胞を培養し、培養物から外膜タンパク質を包含する粗調
製物をつくり、そして同粗調製物から、上記抗原性調製
物を得ることによって、製造できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、百日咳菌（Ｂｏｒ
ｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に対する無細胞
ワクチンに使用するための抗原性調製物（ａｎｔｉｇｅ
ｎｉｃ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）に関する。

【０００２】

【従来の技術】百日咳菌は人間において重いそして衰弱
させる疾病を生じさせ、子供が特にかかりやすく、それ
は先進国において大規模免疫計画により管理下に保たれ
ている。免疫はこの疾病の減少において非常に重要な因
子であることおよびワクチン接種の失敗はこの疾病の発
生率の増加を導きうることが見出されている。特に、す
べての地域において、この疾病の予防に比較的有効であ
ると認められている全細胞百日咳ワクチンを使用して免
疫が行われている。しかしながら、全細胞ワクチンはい
くつかの欠点のあることが認識されている。即ち、たと
えば、接種された子供１０，０００人のうち約１人に、
発熱、局所反応および泣き続けを包含する臨床症状が生
じる。更に、全細胞ワクチンのいくつかのバッチは、全
く無効であるか、望ましくない副作用を依然として付随
するものと見做される。免疫計画により先進国における
この疾病の現在の低い発現で、便宜／危険比率は不充分
に定義されており、そして多くの臨床医師は接種の危険
が免疫により獲得される便宜にまさると信じている。そ
の結果、多くの子供が接種されず、そこで百日咳の全国
流行の重大な危険が存在している。従って、かなりの研
究努力は改善された百日咳ワクチン、そして特にこの疾
病に対する保護に必要な成分を合体しながら、従来使用
された全細胞ワクチンと結合した成分を欠く無細胞ワク
チンの開発に向けられてきた。

【０００３】安全で有効な無細胞百日咳菌ワクチンにつ
いての研究は、過去において全細胞ワクチン中に含有さ
れる百日咳菌の病原性、毒性そして保護性の部分の本体
および作用のメカニズムに関する情報不足により制約さ
れてきた。従って、作業は百日咳菌体の２０種もしくは
それ以上の表面抗原を単離および精製し、そして免疫反
応を誘導するそれらの能力を特徴づけることに集中した
〔たとえば、ザ・ジャーナル・オブ・ジアメリカン・メ
ディカル・ソサエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ｓｏ
ｃ．）、２４８（１）２２〜２３、参照〕。調査が示唆
されてきた抗原の例は、リンホサイト−シス・プロモー
ティング・ファクター（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏｓｉｓ
ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）〔パーツシス・ト
キシン（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ）／ＬＰ
Ｆ〕、フィラメンタス・ヘムアグルチニン（ｆｉｌａｍ
ｅｎｔｏｕｓ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）〔ＦＨ
Ａ〕、リポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃ
ｃｈａｒｉｄｅ）〔ＬＰＳ〕、アグルチノーゲン（ａｇ
ｇｌｕｔｉｎｏｇｅｎｓ）、デルモネクロチック・トキ
シン（ｄｅｒｍｏｎｅｃｒｏｔｉｃ ｔｏｘｉｎ）〔Ｄ
ＮＴ〕、熱不安定性および安定性トキシン、ポリモルホ
ニュクレア・リューコサイト・インヒビター・ファクタ
ー（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ ｌｅｕｋｏ
ｃｙｔｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆａｃｔｏｒ）、アデ
ニレート・サイクラーゼ（ａｄｅｎｙｌａｔｅｃｙｃｌ
ａｓｅ）および他の表面成分を包含する〔パーツシス・
バクシーン・ワークショップ（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｖ
ａｃｃｉｎｅ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ）、１９８２年２月１
１日、ビュロー・オブ・バイオロジックス（Ｂｕｒｅａ
ｕ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）、アメリカ〕。調査のた
めの他の提案された候補抗原は、トレイキアル・サイト
トキシン（ｔｒａｃｈｅａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ）お
よび各種外膜蛋白質を包含する。

【０００４】初期の抽出物ワクチンはピレマー（Ｌ．Ｐ
ｉｌｌｅｍｅｒ）〔プロシーディングズ・オブ・ソサエ
ティ・エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メ
ディシン（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅ
ｄ．）、（１９５０）７５、７０４〜７０５〕により開
発され、それは崩壊させた百日咳菌細胞に基くものであ
り、そして保護を提供することが認められたがこの製剤
の毒性の見地から商業的には採用されなかった。示唆さ
れたより最近の百日咳菌抽出物ワクチンの例は、培養物
上澄液からのエンドトキシンの除去を含む英国特許明細
書第２，０８３，３５８Ａ号（武田）中に記載されたも
の；アニオン界面活性剤での微生物懸濁液の抽出を含む
フランス特許明細書第２，０４７，８８６号〔インスチ
チュート・メリュー（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｍｅｒｒｉｅ
ｕｘ）〕中に記載されたもの；およびパーツシス・トキ
シン（ＬＰＦ）に基くサブユニット蛋白質からなる日本
特許昭５８−２２２，０３２号（帝人）中に記載された
ものを包含する。

【０００５】無細胞百日咳ワクチンについて行われた作
業の多くはたとえばＬＰＦについてのワクチンを基礎と
することの可能性に集中している。しかしながら、百日
咳ワクチン接種と結合している従来観察された悪効果の
大部分（全部でないとしても）はトキシンに関係してい
る。破傷風またはジフテリアトキソイドおよびＬＰＳの
組合せにおいて、感受性マウスに実験的脳障害（ｅｎｃ
ｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）を誘導することが可能である
〔ステインマン（Ｌ．Ｓｔｅｉｎｍａｎ）等、ネーチュ
ア（Ｎａｔｕｒｅ）、（１９８２）、２９９、７３８〜
７４０；レッドヘッド（Ｒｅｄｈｅａｄ）等、ワークシ
ョップ・オン・ボルデテラ・パーツシス（Ｗｏｒｋｓｈ
ｏｐ ｏｎ Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ナショナル・
インスチチュート・オブ・バイオロジー（Ｎａｔ．Ｉｎ
ｓｔ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．）、スタンダーヅ・アンド・コ
ントロールズ（Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ＆ Ｃｏｎｔｒｏ
ｌｓ）、ホリーヒル（Ｈｏｌｌｙ Ｈｉｌｌ）、ハンプ
ステッド（Ｈａｍｐｓｔｅｄ）、ロンドン、１９８
３〕。従ってＬＰＦは、そのような合併症がワクチン接
種の後に生じるならば、多分脳損傷に責を有するであろ
う。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】百日咳菌の培養物中に
見出され、以下に記載する如きアデニレートサイクラー
ゼ活性と結合したある種の蛋白性物質は、実験動物に投
与するとき百日咳菌による攻撃に対し保護を提供しうる
ことが今や発見された。アデニレートサイクラーゼ活性
と通常結合した蛋白性物質が百日咳菌に対する主要な保
護抗原であるとのこの発見は、全細胞ワクチンで実証さ
れた毒性副作用に責を有する他の公知百日咳菌成分を含
有しないかまたは減少した量で含有する抗原製剤からな
るワクチン調合物（ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒｍｕｌａｔ
ｉｏｎ）の製造を許容する。“アデニレートサイクラー
ゼ活性と結合した蛋白性物質（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏ
ｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉ
ｔｈ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉ
ｖｉｔｙ）”なる語（以下、“ＡＣＡＰ”と略記する）
は、ここではアデニレートサイクラーゼ活性の抽出をグ
リシン（０．２５Ｍ）の水性の酸性（ｐＨ３）溶液を用
いて行うとき、アデニレートサイクラーゼ活性と一緒に
抽出される蛋白性物質を示すものである。アデニレート
サイクラーゼ活性は、ヒューレット（Ｅ．Ｈｅｗｌｅｔ
ｔ）およびウオルフ（Ｊ．Ｗｏｌｆｆ）の方法〔ザ・ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．）、（１９７６）、１２７、８９０〜８９８〕
により検定した。

【０００７】

【問題を解決するための手段】本発明は、次の特徴を有
する精製百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕ
ｓｓｉｓ）抗原を提供する：１２％（ｗ／ｗ）ポリアク
リルアミド ゲル電気泳動により測定して、６７，００
０−７３，０００の相対分子量；およびアミノ酸分析に
より測定して、実質的に１：１であるプロリン対グルタ
ミン酸比。

【０００８】本発明はまた、上記定義のとおりの精製百
日咳菌抗原を、医薬として許容される担体と混合して含
有するワクチンを提供する。本発明の抗原は、たとえば
ホルマリン、グルタルアルデヒドまたはβ−プロピオラ
クトンを使用してトキソイド化されていてもよい。この
ＡＣＡＰは、６７，０００−７３，０００、一般に、６
７，０００−６９，０００、特に６９，０００の相対分
子量を有する。さらにまた、このＡＣＡＰは一般に、上
記調製条件の下に、７．０−７．４の等電点を有する。
「相対分子量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｗｅｉｇｈｔ）」の用語は、１２％（ｗ／ｗ）ポリア
クリルアミド ゲル電気泳動および標準分子量マーカー
により決定された見掛けの分子量を意味する。従って、
本発明の抗原蛋白質の分子量は、レムリ（Ｕ．Ｋ．Ｌａ
ｅｍｍｌｉ）によりＮａｔｕｒｅ、１９７０、２２７、
６８０−６８５に記載された技術によって便宜に決定し
うる。便宜な標準分子量マーカーには、たとえばウシ血
清アルブミン、キモトリプシノーゲンＡおよびリボヌク
レアーゼが包含される。

【０００９】このＡＣＡＰは、等電点電気泳動により２
つのバンドとして検出でき、その１つは等電点（ＰＩ）
約７．０を有し、そして他の１つ（拡散）は等電点７．
２−７．４を有する。アデニレートサイクラーゼ活性は
中性バンド

【外１】 と殆ど完全に連合したが、ＡＣＡＰに対するモノクロー
ナル抗体は両方のバンドに強く結合した。

【００１０】アミノ酸分析はまた、ＡＣＡＰが通常、た
とえばプロリン：グルタミン酸比率が約１：１であるよ
うに高比率のプロリンを含有し、そしてこの特徴はＡＣ
ＡＰを他の百日咳蛋白質と区別するのに役立つ。更にＡ
ＣＡＰを区別する特徴は、それがクロラミンＴまたはヨ
ウドゲン法のいずれかによるそのチロシン残基の放射ヨ
ウ素化により検出できないという事実である。

【００１１】ＡＣＡＰはさらにまた、次の性質の１つも
しくは２つ以上を有するという特徴を有する： （ｉ）チロシン残基がヨウ素化されえない； （ｉｉ）細胞内百日咳菌物質を実質的に含有していな
い； （ｉｉｉ）７．０から７．４までの等電点を有する；お
よび （ｉｖ）ｐＨ約３以下で酸不安定性である。

【００１２】本発明に従うワクチン調合物における使用
のための上記抗原調製物は、もしも所望ならば、ＡＣＡ
Ｐに加えて、小量の他の抗原性化学物質、たとえば百日
咳菌体から抽出されるＡＣＡＰと一緒で得られる物質を
含有しうる。そのような物質はＬＰＳおよびＬＰＦの断
片を包含しえ、それらは有害な副作用の可能性の見地に
おいて、たとえばホルマリンでトキソイド化することが
必要である。しかしながら、本抗原調製物は、好ましく
は他の抗原成分を実質的に含有していない。

【００１３】アデニレートサイクラーゼは、以前に百日
咳菌から単離されている〔ヒューレット（Ｅ．Ｌ．Ｈｅ
ｗｌｅｔｔ）等、ザ・ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、１２７、８９０〜
８９８、およびブロシーディングズ・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、アメリカ、７３、１９２６〜１
９３０〕が、この物質が百日咳菌に対する保護抗原を示
すことについては示唆されていない。ヒューレット等の
研究に従えば、総酵素量の約０．５％を示す百日咳菌体
からの総アデニレートサイクラーゼ活性の約２０％のみ
が培養上澄液中に見出され、残りの８０％は細胞と結合
していた。従って、抽出工程は、上記抗原調製物におけ
る使用のために充分な量のＡＣＡＰを商業規模で生成さ
せるために、ＡＣＡＰが高い純度および収率で得られる
ことを必要とする。そのような抽出工程で克服しなけれ
ばならない主要な困難は、他の蛋白質の中でＡＣＡＰは
外膜のＬＰＳ骨格に１部分非常に強固に結合しているこ
とである。過去においては、その結合した蛋白質を遊離
させるために、洗浄剤が一般に膜の可溶化のために使用
されてきた。しかしながら、百日咳菌体からの外膜蛋白
質のための洗浄剤の使用は、次の欠点を有することが見
出されている： （ａ）外膜は外膜蛋白質の混合物からなるミセル凝集物
を形成するために可溶化される； （ｂ）外膜蛋白質は損傷されうる； （ｃ）細菌中に存在しない新規抗原が創成される；そし
て、 （ｄ）抽出された物質は、通常洗浄剤が除去された後に
水不溶性であると認められる。

【００１４】我々は、洗浄剤の使用と対照的に、規制し
た緩和な酸性条件を使用する百日咳菌体の抽出は、外膜
から水溶性の形でアデニレートサイクラーゼの著しく増
加した収率（先に報告された技術に比し約４０×良い）
の抽出をもたらすことを見出した。従って、百日咳菌Ｂ
ｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからのＡＣＡ
Ｐを含有する抗原調製物は、百日咳菌の培養物を細胞に
関しアミノ酸の高張濃度からなるｐＨ２．５〜３．５の
水性アミノ酸バッファーで処理し、生成した上澄液から
細胞を分離し、そしてＡＣＡＰを含有する抗原調製物を
上澄液から単離することからなる方法によって製造する
ことができる。

【００１５】上記方法において使用されるバッファー
は、好ましくはｐＨ約３を提供し、そして有利にはバッ
ファーの酸成分として鉱酸、好ましくは塩酸、およびア
ミノ酸としてグリシンまたはアラニンのいずれかを有利
に包含する。バッファーでの細胞の処理は、５から５０
℃まで、好ましくは３０から４５℃まで、理想的には３
７℃の温度で、有利には１から２４時間、好ましくは１
０から２０時間まで、０．１〜１Ｍ、好ましくは０．２
５Ｍのアミノ酸濃度で好適に行われる。ＡＣＡＰは酸不
安定性であり、そしてもしもｐＨが抽出の間に３以下に
低下するならば破壊されうる。細胞とバッファーとのイ
ンキュベーションの後、細胞は捨て、そしてたとえば１
００，０００ｇにおける遠心分離（粒子物質のすべてを
除去）の後に得られた上澄液は、もしも所望ならば、た
とえば硫酸アンモニウム、冷エタノールまたはアセトン
を使用して沈澱させる。

【００１６】得られた上澄抽出液は下記の如きケンドリ
ック試験（Ｋｅｎｄｒｉｃｋ Ｔｅｓｔ）で試験し、そ
してマウスにおける百日咳菌での脳内攻撃に対し保護を
提供することが見出された。アデニレートサイクラーゼ
活性を含有しない対照ワクチンは百日咳菌での攻撃に対
して保護を少ししかまたは全く提供しないことが見出さ
れ、ＡＣＡＰは、実際に、免疫において最も重要な因子
でありうることが示唆された。非保護全細胞ワクチンの
バッチの分析はまた非保護がアデニレートサイクラーゼ
活性の欠乏と結合する傾向のあることを示し、ＡＣＡＰ
は百日咳菌に対する免疫応答の誘導に必要な鍵抗原であ
りうることを更に示唆した。

【００１７】しかしながら、ケンドリック試験に使用さ
れる上澄抽出液はまたＬＰＳの断片を包含する他の蛋白
質と複合体化したＡＣＡＰを少量含有し、この場合、本
発明に従うワクチン調合物における使用のために本物質
を更に精製することが望ましい。従って、たとえば更に
この精製は、複合体化物質を除去するためのイオン交換
クロマトグラフィおよび（または）調製等電点電気泳動
によって行いうる。別途に、２つの精製法は組合せるこ
とができ、即ち、ＤＥＡＥゲルに保持されない物質（即
ち、非複合体化物質）は等電点濃縮されうる。精製法は
また等電点クロマトグラフィを包含しうる。上記精製工
程の後、ＡＣＡＰは、もしも所望ならば、たとえば本物
質をＡＣＡＰに対する適当なモノクロナール抗体を含有
する免疫吸着カラムに通すことにより更に精製しうる。

【００１８】本発明に従う上記方法により製造されたも
のを包含する上記抗原調製物は、人における百日咳に対
する免疫を誘導するためのワクチン調合物中に合体しう
る。この目的のために、抗原蛋白質は、医薬的に受容し
うる担体またはアジュバントとの結合において存在しう
る。この場合、医薬的に受容しうる担体は、患者に抗原
を導入するために担体として適当な液体媒質である。そ
のような担体の例は、食塩溶液である。抗原蛋白質は溶
液中に、あるいは担体中に固体として懸濁化されうる。

【００１９】ワクチン調合物はまた、免疫応答を刺激す
るためのアジュバントを包含しえ、それによってワクチ
ンの効果が高められる。本発明における使用のための便
宜なアジュバントは、たとえば水酸化アルミニウムおよ
びリン酸アルミニウムを包含する。調合の後、ワクチン
は滅菌容器中に入れられ、それはついで密封しそして低
温たとえば４℃で貯蔵され、あるいは凍結乾燥しうる。

【００２０】百日咳に対し人間に免疫を誘導するため
に、適当に調合されたワクチンの１もしくはそれ以上の
用量が投薬されうる。各投薬は、ワクチン０．１から２
ｍｌまで、好ましくは０．２から１ｍｌまで、好ましく
は０．５ｍｌであるのが推奨される。本発明は、更に他
の態様において、宿主に対し上記に限定した如きワクチ
ン調合物の有効量の投与からなる、人において百日咳に
対する免疫を誘導する方法を提供する。

【００２１】本発明はまた、人において百日咳に対する
免疫の誘導における使用のためのワクチンの製造におい
てＡＣＡＰ（上記に限定した如き）の使用を包含する。
本発明のワクチンは、経口および非経口（たとえば皮下
または筋肉内）注射を包含するワクチンの投与のための
任意の通常の方法により投与しうる。処置はワクチンの
１回投薬、あるいはある時間内の複数回の投薬からなり
うる。本発明に従うワクチンはまた、１種もしくはそれ
以上の他の抗原性成分、たとえば適当にトキソイド化さ
れたチフスおよびジフテリアトキシン、あるいは随伴す
る免疫応答を回避する百日咳菌の変異株の出現可能性を
減少させるために他の百日咳菌抗原たとえばトキソイド
化ＬＰＦを包含しうる。

【００２２】

【実施例】以下の実施例で本発明を説明する：

【００２３】例１ 酸グリシン加水分解および粗外膜蛋白質の製造 細胞を指数相に至る３／４で採取し、そして８０００ｇ
〔ソルバール（Ｓｏｒｖａｌｌ）、ＧＳＡ、アングルヘ
ッド〕で、４℃において２０分間回転した。上澄液をサ
イホン除去し、そして細胞を直ちに蒸留水中に、２０〜
３０ｍｇ／ｍｌ細胞乾燥重量の濃度で緩和に再懸濁し
た。この容量の１／３の１Ｍグリシン−ＨＣｌバッファ
ー（ｐＨ３．０）を緩和な攪拌下に加えて、２５０ｍＭ
グリシンの最終濃度を得た。グリシン溶液は、酵素活性
を停止させるためにＥＤＴＡ（最終混合物中に５ｍＭを
得るため）を含有した。ｐＨをチェックし、そして必要
な場合、１〜２Ｍ ＨＣｌを使用してｐＨ３．０に再調
節した。混合物を３７℃の水浴上で温度が平衡に達する
まで緩和に攪拌し、ついで３７℃で（攪拌なしに）１液
（１８時間）インキュベートした。ｐＨをついで、１０
Ｍ ＮａＯＨを使用して７．２〜７．４に調節し、それ
は局所過剰を避けるためにゆっくり加えた。細胞を５０
００ｇで、５℃において２０分間沈降させ、上澄液をサ
イホンで取り出し、氷水浴中で１〜２℃に冷却し、そし
て予冷却アセトン（−２０から−４０℃まで）２容量を
温度が１〜２℃以上に上昇するのを避けるためにゆっく
り加えた。ついで混合物を−２０℃に３〜５時間保ち、
そして沈澱を予冷却（−１０℃）アングルヘッド中に４
０００ｇ、２０分間で採取した。上澄液をサイホンで取
り出し、そして捨てた。沈降した沈澱を、氷冷蒸留水中
に、細胞懸濁液のもとの容量の約１／２０に溶かした。
ついで溶液から、５００００ｇで、５℃において９０〜
１２０分間回転することにより不溶物および担体を除去
した。上澄液を採取し、そして凍結して保存しまたは凍
結乾燥した。凍結乾燥前に１％Ｗ／Ｖマンニトールを加
えた。細胞の乾燥重量１ｇ当り４０から８０ｍｇまでの
蛋白質が得られた。

【００２４】例２ （ａ）ＤＥＡＥ−トリスアクリルクロマトグラフィによ
る粗外膜蛋白質調製物の分離 ＤＥＡＥ−トリスアクリルカラム（３×１６ｃｍ）を
０．０２５ＭＴＲＩＳ、０．０３５Ｍ ＮａＣｌバッフ
ァー（ｐＨ８．８）で平衡化し、そして例１で得られた
物質（蛋白質１ｇまで）を平衡化バッファーに対し透析
し、そしてカラムに６０ｍｌ／時間でポンプ注入した。
画分（１管当り９９滴、約５ｍｌ）を、プール（ｐｏｏ
ｌｓ）１〜１３において組合せた。適用した全蛋白質の
１部分（約１／４）はゲルベットによって遅延されず、
そして大きなピークとして採取された（第１図、０．０
３５Ｍ）。ついで保持された物質を、０．０２５Ｍトリ
スバッファー（ｐＨ８．８）中の０．１、０．２、０．
３および１．０Ｍ ＮａＣｌを使用して溶出した。画分
を保持し、そして蛋白の分離を確認するためにＳＤＳ−
ＰＡＧＥ板に適用した。ＡＣＡＰは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により示される如くカラムによって遅延されない物質中
に存在したが、０．２Ｍ ＮａＣｌにより溶出される遅
延された物質中にまた存在した。

【００２５】（ｂ）顆粒化ゲル中の調製フラットベット
等電点電気泳動（ＩＥＦ） これはＬＫＢ勧告（ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ）
〔アプリケーション・ノート（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
Ｎｏｔｅ）１９８、ＬＫＢ−プロダクターＡＢ（ＬＫ
Ｂ−Ｐｒｏｄｕｃｔｅｒ ＡＢ）、ブロマ（Ｂｒｏｍｍ
ａ）、スエーデン〕に従い行った。ウルトロデックス
（Ｕｌｔｒｏｄｅｘ）（ＬＫＢ）４ｇおよび予混合アム
ホリン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）５ｍｌの懸濁液（ｐＨ
３．５〜９．５）を、蒸留水中に最終容量１００ｍｌに
懸濁し、水平トレー（１０．８×２４．３ｃｍ）に注入
し、そして空気流下に勧告限界内に蒸発した。蒸留水中
の同じアムホリンの１：２０希釈中に浸した紙心（ｐａ
ｐｅｒ ｗｉｃｋｓ）（ＬＫＢ、２１１７−１０６）３
個の層にした片をトレーの各片に置いた。例２ａからの
物質を、適用型板（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｍｐ
ｌａｔｅ）（２×９．４ｃｍ）を使用して埋めこみ、そ
れは陰イオン末端からのその長さに沿って１／３〜１／
４の距離においてゲル中に圧しつけ、密封したゲルを除
去し、１０ｍｌ容の使い捨て注射器に移し、例２ａから
の該物質３ｍｌ（蛋白質５００ｍｇまでを含有）中に懸
濁し、そして最後にその除去により形成した空のスペー
スに戻し注入した。ついでゲルを必要ならばへらで平滑
にし、そして２０分間平衡化した。その間、紙心１個を
リン酸（比重１．７５）の１：１００希釈中に浸し、そ
して陰イオン末端において紙片に加え、そして１Ｍ Ｎ
ａＯＨ中の他のものは陽イオン末端においた。フラット
ベッドＩＥＦ装置〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）型ＦＢＥ−３０００〕中のトレー支持体を、操作の
間、水道水（１５℃）を流すことにより冷却した。ゲル
を一定の８ワットで操作した。

【００２６】ＡＣＡＰは２つのバンドとして検出され、
１つはｐＩ７．０のもの、そして他方（拡散）バンドは
ｐＩ７．２〜７．４のものであった。アデニレートサイ
クラーゼ活性は中心バンド（ｐＩ７．０）と殆んど完全
に結合したが、ＡＣＡＰに対するモノクロナール抗体は
両方のバンドに強く結合した。

【００２７】ついで、金属型板を使用して３０の平行な
場に分割し、ゲルをへらで各場からかき取り、そして蒸
留水１ｍｌを含有する試験管に移した。各画分のｐＨを
この段階で測定した。ついでゲル懸濁液を小さなプラス
チックカラムに移し、０．２Ｍ重炭酸アンモニウムバッ
ファー（ｐＨ７．０）２ｍｌで溶出し、そしてゲル不含
溶出液を凍結（−４０℃）した。

【００２８】（ｃ）分析等電点電気泳動 （ｉ）上記例２（ｂ）と同じ方法を用いたが、８Ｍ尿素
の存在における１２％ポリアクリルアミドゲルを使用し
た。例２（ｂ）と同じ結果が得られた。 （ｉｉ）同じ技術であるが１０％ソルビトールの存在に
おけるアガロースゲルを使用して、ｐＩ４．５から６．
０までの４つの免疫反応性バンドが示された。ｐＩ４．
０のバンドは大部分のアデニレートサイクラーゼ活性を
保持した。

【００２９】例３ モノクロナール免疫吸着カラムを使用するＡＣＡＰの精
製 ＡＣＡＰに特異のモノクロナールイムノグロブリンを含
有するマウス腹水を、室温において２７％Ｗ／Ｖ Ｎａ
₂ＳＯ₄２容量の添加により沈殿させ、そして２〜４時間
放置し、その後沈降（２０００ｇ、１５分間）させた。
沈降物を再溶解し、そしてＰＢＳに対し透析した。この
蛋白質５００ｍｇ（ＵＶ決定）を、製造者（ファルマシ
ア）の指示に従い、充填ＣＮＢｒ−セファロースＣＬ４
Ｂ７０ｍｌにカップリングさせた。セファデックスＧ−
５０（中程度）を５００ｍｍ×２５ｍｍカラムに２２０
ｍｍのベッドの高さにつめた。カラムを溶出バッファー
〔０．０１％チオメルサール（Ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ）
を含有する０．２Ｍ重炭酸アンモニウム、ｐＨ７．０〕
で溶出した後、Ｎｏ．１２バロチーニ（Ｂａｌｌｏｔｉ
ｎｉ）ガラス玉を５ｍｍの層の厚さにセファデックスベ
ッドの頂上部に注入した。更に洗滌した後、免疫吸着ゲ
ルをバロチーニガラス玉層に注入し、これはセファデッ
クスベッドから分離して両者を分離させた。カラムを溶
出バッファーで更に洗滌し、そして最後に別のバロチー
ニガラス玉層を１００ｍｍの高さの免疫吸着ベッドの頂
上部に入れてカラムの頂上部を保護した。免疫吸着カラ
ム上のＡＣＡＰを分離するために、蛋白質〔ロウリー
（Ｌｏｗｒｙ）〕１ｍｇ／ｍｌを含有するＤＥＡＥ−ト
リスアクリル分離（例２）からの非保持溶出液を、免疫
吸着カラムに５℃において０．２５ｍｌ／分で適用し、
溶出バッファー〔０．２Ｍ重炭酸アンモニウム、ｐＨ
７、０．０１％Ｗ／Ｖチオメルサール〕で洗滌し、そし
てベースラインが安定化された後に、溶出バッファー中
の６Ｍ尿素５０ｍｌをカラムに適用して吸着物質を溶出
した。セファデックスＧ−５０ベッド上の免疫吸着物質
の位置決定は、操作中に尿素からの蛋白質の同時分離を
可能とした。

【００３０】例４ 百日咳菌の培養 微生物の生育のために使用した限定培地は従来記載〔ノ
ボトニー（Ｎｏｖｏｔｎｙ）およびブルックス（Ｂｒｏ
ｏｋｅｓ）、１９７５〕された如きスタイナー（Ｓｔｅ
ｉｎｅｒ）およびショルト（Ｓｃｈｏｌｔｅ）（１９７
１）の組成に基くものであった。すべての培地は３６〜
３７℃で生育させた。ゆるく栓をした振盪フラスコ（培
地２００ｍｌを入れた５００ｍｌ容円錐フラスコ）中の
液体培地に、２％寒天および５％ウマ血液を加えたコー
エン・ウィラー培地（Ｃｏｈｅｎ−Ｗｈｅｅｌｅｒ ｍ
ｅｄｉｕｍ）上４８時間生育させ、そして２０〜４０μ
ＭＯ₂／時間のガス交換率を与えるために振盪した培養
物を接種した。そのような培養物を使用して５ｌまたは
７０ｌ容の全ガラス醗酵器中の培地に接種し、一方ｐＨ
は２Ｍ ＨＣｌの管理した添加により７．６に維持し、
そして渦動振盪により５〜１０％における溶存酸素飽和
を維持した。培養物を指数相終末期の前、即ち約３６時
間のインキュベーションの後採取した〔ノボトニー（Ｎ
ｏｖｏｔｎｙ）およびコウンレイ（Ｃｏｗｎｌｅｙ）、
１９７８〕。

【００３１】例５ ケンドリック（Ｋｅｎｄｒｉｃｋ）試験 これは、体重１４〜１６ｇのＭＦ１またはＮＩＨマウス
〔ＯＬＡＣ、カテゴリー３、気管支敗血症菌（Ｂ．ｂｒ
ｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）を包含する病原菌の多くを
含まない〕を使用し、百日咳ワクチンについてのＷ．
Ｈ．Ｏ．要求に従い遂行した。０．５ｍｌ容量中の抗原
を腹腔内に接種し、そして最高希釈および３回の４倍連
続希釈からなった。２週間後に、推奨された攻撃株１８
−３２３（１００〜２００ＬＤ₅₀）を使用して、マウス
を攻撃した。各群の生存数を、パラレル・ライン・プロ
ビット分析（Ｐａｒａｌｌｅｌ ｌｉｎｅ ｐｒｏｂｉ
ｔａｎａｌｙｓｉｓ）の計画表を使用し、ブリティッシ
ュ・パーツシス・リファレンス・ワクチン（Ｂｒｉｔｉ
ｓｈ Ｐｅｒｔｕｓｉｓ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｖａｃ
ｃｉｎｅ）６６／８４に関係して、ＥＤ₅₀および相対強
度の計算に使用した。ＦＨＡ／ＬＰＦワクチンを使用し
て、比較試験をまた行った。結果を表１に示す。

【００３２】

【表１】

【００３３】例６ ＡＣＡＰのアミノ酸分析 アミノ酸分析を、ランク・ヒルガー・クロマスペック
（Ｒａｎｋ Ｈｉｌｇｅｒ Ｃｈｒｏｍａｓｐｅｋ）ア
ミノ酸分析機を使用して行った。検体は、厚壁（ｔｈｉ
ｃｋ−ｗａｌｌｅｄ）パイレックス試験管（７．５×
１．２ｃｍ）中の乾燥した検体物質に、０．１％（Ｗ／
Ｖ）フェノールを含有する６Ｎ ＨＣｌ〔ＢＤＨアリス
ター（Ａｒｉｓｔａｒ）等級から希釈〕２５０μｌの添
加により製造した。ついで狭い穴を導くために試験管
を、酸素−天然ガス流−トーチ焔中で引き延ばした。内
容物をドライアイス−エタノール浴中で凍結した後、各
試験管を分岐管およびトラップを経て高真空ポンプに連
結し、そして空気を除去するために１０分間放置した。
ついで試験管を封印し、そして加水分解のために１１０
℃において炉中に入れた。加水分解した検体を真空乾燥
器中、粒状水酸化ナトリウム上で乾燥した。乾燥した残
渣を、自動分析のために、アミノ酸分析器出発バッファ
ー２５０μｌに溶かした。表２に示すアミノ酸値は、６
８時間加水分解値を使用したバリンおよびイソロイシン
の場合を除いて、２回の２４、４８および６８時間加水
分解から得られた結果の平均である。シスチン、システ
インおよびトリプトファンの値は、この方法によっては
決定できなかった。

【００３４】

【表２】

【００３５】例７ ワクチン調合物 免疫における使用のためのワクチンは、通常の技術によ
り次の成分から製造しうる： ａ）単一溶液中のジフテリア、破傷風および百日咳ワク
チンワクチン各１ｍｌは次のものを含有する： ジフテリアトキソイド ＞６０Ｉ．Ｕ． 破傷風トキソイド ＞１２０Ｉ．Ｕ． 本発明の百日咳菌抗原 ＞０．３６３ｍｇ ホウ酸ナトリウム ＜１０．０３ｍｇ コハク酸 ＜３．１０ｍｇ チオメルサール ０．０４〜０．２ｍｇ 塩化ナトリウム ＜８．５ｍｇ 水 適量 全量１ｍｌ

【００３６】ｂ）吸着したジフテリア、破傷風および百
日咳ワクチン ジフテリア、破傷風および百日咳菌成分を、水酸化アル
ミニウムゲル上に標準技術により吸着させる。ワクチン
各１ｍｌは次のものを含有する： ジフテリアトキソイド ＞６０Ｉ．Ｕ． 破傷風トキソイド ＞１２０Ｕ．Ｌ． 本発明に従う抗原 ＞０．３６３ｍｇ 不溶性アルミニウム塩 ＜０．０９３ミリモル（２．５ｍｇ）Ａｌ．に当量 ホウ酸ナトリウム ＜８．０１ｍｇ コハク酸 ＜２．４８ｍｇ チオメルサール ０．０４〜０．２ｍｇ 塩化ナトリウム ＜６．８ｍｇ 水 適量 全量１ｍｌ

【００３７】ｃ）百日咳ワクチン ワクチン各１ｍｌは次のものを含有する： 本発明に従う抗原 ＞０．３６３ｍｇ チオメルサール ０．０４〜０．２ｍｇ 塩化ナトリウム ＜８．５ ｍｇ 水 適量 全量１ｍｌ

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｋ 14/235 Ｃ０７Ｋ 14/235 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １２％（ｗ／ｗ）ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動で測定して、相対分子量６７，０００〜７
   ３，０００であり、アミノ酸分析によりプロリン対グル
   タミン酸の割合が約１：１であることを特徴とする、精
   製百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉ
   ｓ）抗原を含む抗原性調製物の製造方法であって、 （ａ）Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細胞
   を培養し、 （ｂ）培養物から外膜タンパク質を包含する粗調製物を
   つくり、そして （ｃ）同粗調製物から、上記抗原性調製物を製造する、
   ことからなる方法。
2. 【請求項２】 上記抗原が、１２％（ｗ／ｗ）ポリアク
   リルアミドゲル電気泳動で測定して、相対分子量６９，
   ０００を有することをさらに特徴とする、請求項１に記
   載の方法。
3. 【請求項３】 上記抗原が、アミノ酸分析により測定し
   て、下記のアミノ酸組成を実質的に有することをさらに
   特徴とする、請求項１または２のいずれか一つに記載の
   方法： 残基の数 アスパラギン酸（＋アスパラギン） ４８ スレオニン ３３ セリン ３３ グルタミン酸（＋グルタミン） ６２ プロリン ６０ グリシン ７７ アラニン ８２ バリン ５４ メチオニン ４ イソロイシン ２２ ロイシン ５０ チロシン ７ フェニルアラニン １１ ヒスチジン １３ リジン １９ アルギニン ３７。
4. 【請求項４】 上記抗原が、クロラミンＴ法またはヨウ
   ドゲン法のいずれかによる、そのチロシン残基の放射性
   ヨウ素化により検出できないことをさらに特徴とする、
   請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 【請求項５】 上記抗原が、ｐＨ約３以下で酸不安定で
   あることをさらに特徴とする、請求項１〜４のいずれか
   一項に記載の方法。
6. 【請求項６】 １２％（ｗ／ｗ）ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動で測定して、相対分子量６７，０００〜７
   ３，０００であり、クロラミンＴ法またはヨウドゲン法
   のいずれかによる、そのチロシン残基の放射性ヨウ素化
   により検出できないことを特徴とする、精製百日咳菌
   （Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗原を
   含む抗原性調製物の製造方法であって、 （ａ）Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細胞
   を培養し、 （ｂ）培養物から外膜タンパク質を包含する粗調製物を
   つくり、そして （ｃ）同粗調製物から、上記抗原性調製物を製造する、
   ことからなる方法。
7. 【請求項７】 上記抗原が、１２％（ｗ／ｗ）ポリアク
   リルアミドゲル電気泳動で測定して、相対分子量６９，
   ０００を有することをさらに特徴とする、請求項６に記
   載の方法。
8. 【請求項８】 上記抗原が、アミノ酸分析により測定し
   て、約１：１のプロリン対グルタミン酸比を有すること
   をさらに特徴とする、請求項６または７のいずれか一つ
   に記載の方法。
9. 【請求項９】 上記抗原が、アミノ酸分析により測定し
   て、下記のアミノ酸組成を実質的に有することをさらに
   特徴とする、請求項６，７または８のいずれか一つに記
   載の方法： 残基の数 アスパラギン酸（＋アスパラギン） ４８ スレオニン ３３ セリン ３３ グルタミン酸（＋グルタミン） ６２ プロリン ６０ グリシン ７７ アラニン ８２ バリン ５４ メチオニン ４ イソロイシン ２２ ロイシン ５０ チロシン ７ フェニルアラニン １１ ヒスチジン １３ リジン １９ アルギニン ３７。
10. 【請求項１０】 上記抗原が、ｐＨ約３以下で酸不安定
    性であることをさらに特徴とする、請求項６〜９のいず
    れか一項に記載の方法。
11. 【請求項１１】 Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓ
    ｓｉｓ培養物を、細胞に対して高張濃度の上記アミノ酸
    を含有するｐＨ２．５〜３．５の水性アミノ酸緩衝液で
    処理し、生成する上清から細胞を分離し、次いでこの上
    清を採取することによって粗調製物を製造する、請求項
    ６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 【請求項１２】 上記抗原性調製物を、イオン交換クロ
    マトグラフイを包含する方法によって、上記粗調製物か
    ら製造する、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方
    法。
13. 【請求項１３】 上記イオン交換クロマトグラフィに続
    いて、免疫吸着カラムクロマトグラフィーを行う、請求
    項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 抗原性調製物が少なくとも１種の追加
    のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原を包
    含する請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 【請求項１５】 追加の抗原が白血球増加促進因子（Ｌ
    ＰＦ）である請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 請求項１〜１５のいずれか一項に記載
    の方法によって抗原性調製物を製造し、同調製物を医薬
    として許容される担体と混合することからなる、百日咳
    菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に対
    するワクチンの製造方法。
17. 【請求項１７】 抗原性調製物を、少なくとも１種の追
    加の抗原と混合する、請求項１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 追加の抗原が、テタヌス トキソイド
    またはジフテリアトキソイドである、請求項１７に記載
    の方法。
19. 【請求項１９】 抗原性調製物をさらにアジュバントと
    混合する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方
    法。
20. 【請求項２０】 上記アジュバントが、水酸化アルミニ
    ウムまたはリン酸アルミニウムである、請求項１９に記
    載の方法。