FI81262B - Foerfarande foer isolering av ett med adenylat-cyklas-aktivitet associerat antigenpreparat ur bakterien bordetella pertussis. - Google Patents
Foerfarande foer isolering av ett med adenylat-cyklas-aktivitet associerat antigenpreparat ur bakterien bordetella pertussis. Download PDFInfo
- Publication number
- FI81262B FI81262B FI851859A FI851859A FI81262B FI 81262 B FI81262 B FI 81262B FI 851859 A FI851859 A FI 851859A FI 851859 A FI851859 A FI 851859A FI 81262 B FI81262 B FI 81262B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- pertussis
- acap
- vaccine
- process according
- buffer
- Prior art date
Links
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 title claims abstract description 39
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 22
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 26
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 26
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 24
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 10
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 9
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000009413 insulation Methods 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 35
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 abstract description 12
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 8
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 229940066827 pertussis vaccine Drugs 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 6
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 description 5
- 101710154643 Filamentous hemagglutinin Proteins 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 4
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710110818 Dermonecrotic toxin Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229960005097 diphtheria vaccines Drugs 0.000 description 2
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 2
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 2
- 229960002766 tetanus vaccines Drugs 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 238000006037 Brook Silaketone rearrangement reaction Methods 0.000 description 1
- 108010038061 Chymotrypsinogen Proteins 0.000 description 1
- 206010011469 Crying Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940024545 aluminum hydroxide Drugs 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 102000029724 enzyme binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091009282 enzyme binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003345 natural gas Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 1
- 239000005297 pyrex Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
1 81262
Menetelmä adenylaatti-syklaasi-aktiivisuuteen liittyvän antigeenipreparaatin eristämiseksi Bordetella pertussis-bakteerista 5 Keksinnön kohteena on menetelmä antigeenipreparaa tin, joka sisältää proteiiniainesta, johon liitty adeny-laatti-syklaasi-aktiivisuus (ACAP), eristämiseksi bakteerista Bordetella pertussis. Antigeenipreparaatteja käytetään soluttomissa rokotteissa Bordetella pertussis'ta 10 vastaan.
Bordetella pertussis aiheuttaa ihmisillä vakavan ja uuvuttavan sairauden, jolle lapset ovat erityisen alttiita ja joka pidetään kurissa kehittyneissä maissa suurmitta-kaavaisilla immunisointiohjelmilla. On havaittu, että im-15 munisointi on hyvin tärkeä tekijä vähennettäessä tätä sairautta ja että epäonnistuminen rokottamisessa voi johtaa tämän taudin lisääntyneeseen esiintymiseen. Käytännöllisesti katsoen kaikilla alueilla immunointi suoritetaan käyttäen kokosolu B.pertussis-rokotetta, jonka on havaittu 20 olevan suhteellisen tehokas taudin estämisessä. On kuiten kin todettu, että kokosolurokotteita rasittavat useat haitat. Siten esimerkiksi noin yhdellä jokaisesta 10 000 rokotetusta lapsesta esiintyy kliinisiä oireita, joita voivat olla kuume, paikalliset reaktiot ja jatkuva kirkumi-25 nen. Lisäksi tapahtuu, että jotkut erät kokosolurokotteesta eivät anna ollenkaan suojaa, vaikka niihin silti liittyy ei-toivottujen sivuvaikutusten mahdollisuus.
Tämän taudin nykyisellä vähäisellä esiintymisellä kehittyneissä maissa, joilla on immunisointiohjelmat, hyö-30 ty/vaara-suhde on huonosti määritelty ja monet lääkärit uskovat, että rokottamisen vaarat painavat enemmän kuin immunisoinnilla saavutetut edut. Tämän tuloksena monia lapsia ei rokoteta ja siten on olemassa vakava yleis-kulkutaudin luontoinen hinkuyskävaara. Sentähden on huo-35 mattavasti tutkimusponnisteluja suunnattu parannettujen 2 81262 hinkuyskärokotteiden kehittämiseksi ja erityisesti solut-tomien rokotteiden kehittämiseksi, joista puuttuvat aineosat, jotka liittyvät tähän asti käytettyjen kokosolurokotteiden myrkyllisiin vaikutuksiin sisältäen samalla ne 5 aineosat, jotka ovat välttämättömät suojaamaan tautia vastaan.
Turvallisemman, tehokkaan, soluttoman B.pertus-sis-rokotteen etsintää on aikaisemmin haitannut niukka informaatio, kokosolurokotteiden sisältämien B.pertussik-10 sien tautia synnyttävien, myrkyllisten ja suojaavien osien vaikutuksen luonteesta ja mekanismista. Työ on sen tähden keskitetty 20 tai useamman B.pertussis-organismin pinta-antigeenin eristämiseen ja puhdistamiseen ja niiden immuunireaktioita aikaansaavan kyvyn luonnehtimiseen (ks. 15 esimerkiksi J. Am. Med. Soc., 248 (1) 22-23). Esimerkkejä antigeeneistä, joita on ehdotettu tutkittaviksi, ovat imu-solurunsautta edistävä faktori (pertussis-toksiini/LPF), rihmainen hemagglutiniini (FHA), lipopolysakkaridi (LPS), agglutinogeenit, dermonekroottinen toksiini (DNT), lämpöä 20 kestämättömät ja lämmönkestävät toksiinit, liuskatumainen valkosolu-estofaktori, adenylaattisyklaasi sekä muut pin-takomponentit (Pertussis Vaccine Workshop. 11. helmikuu 1982, Bureau of Biologies, USA). Muita ehdotettuja eh-dokasantigeenejä tutkimusta varten ovat henkitorvi-sytok-25 siini ja erilaiset muut membraaniproteiinit.
L.Pillemer kehitti erään varhaisen uutosrokotteen (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (1950) 75, 704-705), joka perustui rikottuihin B.pertussis-soluihin ja jonka havaittiin antavan suojaa, mutta sitä ei hyväksytty kaupallises-30 ti preparaatin myrkyllisyyden takia.
Esimerkkejä tuoreemmista B.pertussis-uutosrokot-teista, joita on ehdotettu, ovat UK-patentissa 2 083 358A (Takeda) selostetut, joka patentti käsittää endotoksiinin poistamisen viljelyn päällä olevista nesteistä; ranska-35 lainen patentti FR-2 047 886 (Institut Merrieux) käsittää li 3 81262 mikrobisuspension uuttamisen anionisella pinta-aktiivi-sella aineella; ja japanilainen patentti JP-58-222032 (Teijin) käsittää alayksikkö-proteiinin, joka perustuu pertussis-toksiini (LPF):ään.
5 Suuri osa työstä, joka on suoritettu soluttomilla hinkuyskärokotteilla, on keskittynyt mahdollisuuteen perustaa tällainen rokote LPFiään. Uskotaan kuitenkin, että suurin osa (ellei kaikki) haitallisista vaikutuksista, joiden tähän asti on havaittu liittyvän hinkuyskärokotuk-10 seen, liittyneet toksiiniin. Yhdistelmänä tetanus- tai difteriatoksoidin ja LPS:n kanssa se pystyy aiheuttamaan kokeellisen aivotaudin herkissä hiirissä (L. Steinman, et ai. Nature (1982) 299, 738-740; Redhead et ai, Workshop on B.pertussis, Nat. Inst, of Biol. Standards & Controls, 15 Holy Hill, Hampstead, Lontoo, 1983). Siten LPF voi mahdollisesti olla vastuussa aivovauriosta, jos tällaisia komplikaatioita ilmenisi rokottamisen jälkeen.
Nyt on keksitty, että tietty proteiiniaines, joka liittyy adenylaattisyklaasi-aktiivisuuteen, kuten jäljem-20 pänä selostetaan, ja jota löytyy B.pertussiksen viljelmistä, pystyy aikaansaamaan suojan B.pertussis-altistumis-ta vastaan, kun sitä annetaan koe-eläimille. Tämä havainto, että proteiiniaines, joka tavallisesti liittyy adeny-laatti-syklaasi-aktiivisuuteen, on tärkein suoja-antigeeni 25 B.pertussista vastaan, sallii rokotevalmisteiden valmis tamisen, jotka sisältävät antigeenipreparaatteja, jotka ovat vapaita, muista tunnetuista B.pertussis-komponenteis-ta, jotka ovat vastuussa kokosolurokotteiden omaavista myrkyllisistä sivuvaikutuksista tai jotka sisältävät pie-30 niä määriä niitä.
Käsitettä "proteiiniaines, joka liittyy adenylaat-ti-syklaasi-aktiivisuuteen" (lyhennetty tämän jälkeen "ACAP":ksi) käytetään tässä tarkoittamaan proteiiniaines-ta, joka uuttuu yhdessä adenylaatti-syklaasi-aktiivisuuden 35 kanssa, kun adenylaatti-syklaasi-aktiivisuuden uuttaminen 4 81262 suoritetaan käyttäen glysiinin vesipitoista, hapanta (pH 3) liuosta (0,25 M). ACAP, kuten se edellä määritellään, voi olla itse adenylaatti-syklaasi-entsyymi tai entsyymiä sitoava proteiini.
5 Adenylaatti-syklaasi-aktiivisuus määritettiin E.
Hewlett'in ja J.Wolff'in (J. Bacteriol. (1976) 127, 890-898) menetelmällä. Ensimmäiseksi tässä esitetään rokote-valmiste, joka suojaa B.pertussis'ta vastaan ja joka sisältää antigeeni-valmisteen, joka on peräisin ACAP':tä 10 sisältävästä B.pertussiksesta, joka on valinnaisesti tok-soidoitu käyttäen esim. formaliinia, glutaraldehydiä tai β-propiolaktonia, yhdessä sen farmaseuttisesti hyväksyttävän kantimen kanssa.
Yksityiskohtaisemmin ACAP voidaan havaita isoelekt-15 risella fokusoinilla kahtena nauhana, joista toisen iso-elektrinen piste (pl) on noin 7,0 ja toisen (haja)nauhan isoelektrinen piste on 7,2-7,4. Adenylaatti-syklaasi-ak-tiivisuus liittyy miltei kokonaan neutraaliin nauhaan (pl noin 7,0), mutta monoklonaaliset vasta-aineet ACAP:lie 20 sitoutuivat voimakkaasti kumpaankin nauhaan.
Edellä mainituissa valmisteissa olevan ACAP:n suhteellinen molekyylipaino on yleensä noin 67000-73000, erityisesti 69000, ja isoelektrinen piste 7,0-7,4 jäljempänä selostettavissa valmistusolosuhteissa.
25 "Suhteellisella molekyylipainolla” tarkoitetaan näennäistä molekyylipainoa määritettynä 12-%:isella (pai-no/paino) polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja stan-dardimolekyylipainon merkkiaineilla. Kuvattujen antigee-niproteiinien molekyylipaino voidaan siten mukavasti mää-30 rittää menetelmällä, jonka on selostanut U.K. Laemmli, Nature, 1970, 227, 680-685. Sopivia standardi molekyyli-painon merkkiaineita ovat esimerkiksi naudan seerumialbu-miini, kymotrypsinogeeni A ja ribonukleaasi.
Myös aminohappoanalyysi on osoittanut, että ACAP 35 sisältää epätavallisen suuren osuuden proliinia, niin että
II
5 81262 proliini/glutamiinihappo-suhde on noin 1:1 ja tämä ominaispiirre tekee mahdolliseksi ACAP:n erottamisen muista B.pertussis-proteiineista. Eräs toinen ACAP:n erottava ominaispiirre on, että sitä ei voida havaita tyrosiini-5 tähteiden radiojodauksella, ei klooriamiini T- eikä jodo-geenimenetelmin.
Erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti edellä mainittu ACAP on proteiiniaines, jota luonnehditaan sillä, että sillä on yksi tai useampi seuraavista ominaisuuk-10 sista: (i) proliini/glutamiinihappo-suhde pääasiallisesti 1:1; (ii) tyrosiini-tähteet eivät ole jodattavia; (iii) pääasiallisesti vapaa solunsisäisestä B.pertussis-aineksesta; 15 (iv) suhteellinen molekyylipaino 67000-73000; (v) isoelektrinen piste 7,0-7,4 ja (vi) se on happoa kestämätön pH:ssa alle noin 3.
Edellä mainitut rokotevalmisteissa käytettävät antigeenipreparaatit voivat, jos niin halutaan, sisältää 20 pieniä määriä muita antigeeni-yhdisteitä ACAP:n lisäksi, esimerkiksi aineksia, jotka saadaan yhdessä B.pertussis-organismista uutetun ACAP:n kanssa. Tällaiset ainekset voivat olla LPS- ja LPF-osasia, jotka ottaen huomioon niiden mahdolliset vahingolliset sivuvaikutukset, vaativat 25 toksoidoimista, esim. formaliinilla. Antigeenivalmisteet ovat kuitenkin, edullisesti, pääasiallisesti vapaat muista antigeenikomponenteista.
Adenylaatti-syklaasia on aikaisemmin eristetty B. pertussiksesta (E. L. Hewlett et ai., J. Bacteriol., 127, 30 890-898 ja Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 73, 1926-1930), mutta ei ole missään ehdotettu että tämä aines on B.pertussis’ ta vastaan suojaava antigeeni. Hewlett'in et ai., työn mukaisesti havaittiin ainoastaan noin 20 % B.per-tussis-organismin adenylaatti-syklaasi kokonaisaktiivi-35 suudesta, mikä edustaa noin 0,5 % kokonaisentsyymistä, 6 81262 viljelmän päällä olevasta nesteestä, jolloin loput 80 % on sitoutuneena soluihin. Sentähden tarvitaan uuttoprosessi, jolla ACAP voidaan saada hyvin puhtaana ja suurella saannolla, jotta saadaan riittäviä määriä, kaupallisessa mit-5 takaavassa, ACAPriä käytettäväksi edellä valmistetuissa antigeenipreparaateissä. Eräs päävaikeus, joka on voitettava tällaisessa uuttoprosessissa on, että ACAP, muiden proteiinien joukossa on osittain sitoutunut hyvin lujasti, ulkomembraanin LPS-runkoon. Aikaisemmin on yleisesti käy-10 tetty detergenttejä membraanin liuentamiseksi siihen liittyneiden proteiinien vapauttamiseksi. Detergenttien käytöllä ulkomembraanin proteiinien uuttamiseen B.pertussis-organismeista on kuitenkin havaittu olevan seuraavat haitat: 15 a) ulkomembraani liukenee, jolloin muodostuu misel-likasaumia, jotka sisältävät ulkomembraanin proteiinien seoksia; b) ulkomembraanin proteiinit voivat vahingoittua; c) saattaa syntyä uusia antigeenejä, joita ei esiinny bak- 20 teerissä; ja d) yleensä todetaan että uutettu aines on veteen liukenematonta detergentin poistamisen jälkeen.
Nyt on keksitty, että vastakohtana detergenttien käytölle, B.pertussis-organismien ulkomembraanin uutta-25 minen käyttäen säädeltyjä, lievästi happamia olosuhteita johtaa olennaisesti lisääntyneisiin adenylaatti-syklaasin saantoihin (noin 40 kertaa parempi kuin tähän asti esitetyillä menetelmillä) muodossa, joka on vesiliukoinen.
Siten tämä keksintö kohdistuu menetelmään antigee-30 nipreparaatin, joka sisältää ACAP B.pertussiksesta, eristämiseksi. Menetelmälle on tunnusomaista, että Bordetella pertussis -solujen viljelmää käsitellään vesipitoisella aminohappopuskurilla, jonka pH on 2,5 - 3,5 ja joka sisältää tätä aminohappoa hypertoonisena pitoisuutena solu-35 jen suhteen, solut erotetaan syntyneestä supernatantista li 7 81262 ja eristetään ACAP'tä sisältävä antigeenipreparaatti su-pernatantista.
Edellä selostetussa menetelmässä käytetty puskuri antaa edullisesti pH:n noin 3 ja se sisältää edullisesti 5 epäorgaanista happoa, edullisesti kloorivetyhappoa, puskurin happamana komponenttina ja joko glysiiniä tai alanii-nia aminohappona. Solujen käsitteleminen puskurilla suori-teyaan edullisesti lämpötilassa 5-50°C, erityisesti 30-45eC:ssa ja ihanteellisesti 37°C:ssa, edullisesti 1-24 10 tunnin ajan, erityisesti 10-20 tunnin ajan aminohappoväke-vyydellä 0,1-1M, edullisesti 0,25 M. ACAP on happoa kestämätön ja voi tuhoutua, jos pH laskee alle 3:n uuton aika na.
Sen jälkeen kun solut on inkuboitu puskurin kanssa 15 solut hävitetään ja sentrifugoinnin jälkeen, esim. noin 100000 g:ssä (kaiken osasmaisen aineksen poistamiseksi) saatu päällä oleva neste saostetaan haluttaessa, esim. käyttäen ammoniumsulfaattia, kylmää etanolia tai asetonia.
Päällä olevasta nesteestä saatu uute on testattu 20 Kendrick-testissä, kuten seuraavassa selostetaan, ja sen on havaittu antavan suojan hiirillä aivojen sisäistä B. pertussis-altistumista vastaan. Vertailurokotteiden, jotka eivät sisältäneet adenylaatti-syklaasi-aktiivisuutta, havaittiin antavan vähän tai ei ollenkaan suojaa B.pertus-25 sis-altistumista vastaan, mikä tuo mieleen, että ACAP voi itse asiassa olla tärkein tekijä immnisuudessa. Ei-suojaa-vien kokosolurokotteiden panosten analyysi on myös osoittanut, että suojaamattomuudella on taipumus liittyä adeny-laatti-syklaasi-aktiivisuuden puutteeseen, mikä edelleen 30 johdattaa mieleen, että ACAP voi olla avain-antigeeni, joka on tarpeen immuunivasteen synnyttämiseksi B.pertus-sista vastaan.
Kendrick-testissä käytetty päällä olevasta nesteestä saatu uute voi kuitenkin sisältää myös ACAP:n pienissä 35 määrissä kompleksoituneena muiden proteiinien kanssa, jot- 8 81262 ka sisältävät LPS-osasia, jossa tapauksessa on toivottavaa puhdistaa ainesta edelleen, kun sitä käytetään ro-kotevalmisteissa. Siten edelleenpuhdistaminen voidaan suorittaa esimerkiksi ioninvaihtokromatografiällä ja/tai pre-5 paratiivisella isoelektrofokusoinnilla kompleksoituneen aineksen poistamiseksi. Vaihtoehtoisesti kaksi puhdistus-menetelmää voidaan yhdistää, ts aines, joka ei ole pidättynyt DEAE-geeliin (ts kompleksoitumaton aines) voidaan elektrofokusoida. Puhdistusmenetelmä voi käsittää myös 10 kromatofokusoinnin. Edellä selostettujen puhdistus- vaiheiden jälkeen ACAP':tä voidaan haluttaessa puhdistaa edelleen, esimerkiksi viemällä aines immunosorbentti-pylvään läpi, joka sisältää sopivaa monoklonaalista vasta-ainetta ACAP:tä vastaan.
15 Edellä selostettuja antigeenipreparaatteja, edellä selostetulla keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut mukaanlukien, voidaan yhdistää rokotevalmisteisiin immunisoinnin aikaansaamiseksi hinkuyskää vastaan ihmisellä. Tätä tarkoitusta varten antigeeniproteiinia voidaan antaa 20 yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantimen tai apuai neen kanssa.
Farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantimia ovat tässä tapauksessa nestemäiset väliaineet, jotka sopivat käytettäviksi välitysaineina antigeenin viemiseksi potilaaseen. 25 Eräs esimerkki tällaisesta kantimesta on suolaliuos. Anti-geeniproteiini voi olla liuoksessa tai suspendoituna kiinteänä aineena kantimeen.
Rokotepreparaatti voi sisältää myös apuaineen immuunivasteen stimuloimiseksi jolloin rokotteen vaikutus 30 lisääntyy. Sopivia käytettäviä apuaineita ovat esimerkiksi alumiinihydroksidi ja alumiinifosfaatti.
Sopivasti rokotevalmisteet tehdään sisältämään antigeeniproteiinia loppuväkevyydessä alueelta 0,01-5 mg/ml, edullisesti 0,03-2 mg/ml ja edullisimmin 0,3 mg/ml. Val-35 miiksimuodostamisen jälkeen rokote voidaan sisällyttää
II
9 81262 steriiliin säiliöön, joka sitten suljetaan ja varastoidaan matalassa lämpötilassa, esimerkiksi 4°C:ssa, tai se voidaan kylmäkuivata.
Immuuniteetin aikaansaamiseksi hinkuyskälle ih-5 misellä annetaan sopivasti muodostettua rokotetta yhtenä tai useampana annoksena. Suositellaan, että jokainen annos on 0,1-2 ml, edullisesti 0,2-1 ml, edullisimmin 0,5 ml rokotetta. Tässä kuvataan edelleen menetelmä immuniteetin aikaansaamiseksi hinkuyskälle ihmisellä, minkä mukaan te-10 hokas määrä edellä määriteltyä rokotevalmistetta annetaan isännälle.
Keksinnön mukaisesti valmistettu ACAP:n voidaan siis käyttää rokotteen valmistamiseksi, jota käytetään immuniteetin aikaansaamiseksi hinkuyskälle ihmisellä.
15 Näitä rokotteita voidaan antaa jollakin tavanomai sella menetelmällä rokotteiden antamista varten, kuten suun kautta ja ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta (esim. ihonalaisesti tai lihaksensisäisesti) ruiskeena. Käsittely voi käsittää yhden ainoan annoksen rokotetta tai jou-20 kon annoksia jonakin ajanjaksona.
Tässä esitetyt rokotteet voivat sisältää myös yhden tai useampia muita antigeenikomponentteja, kuten esimerkiksi sopivasti toksoidoituja tyfoidi- ja difteriatoksiineja tai muita B.pertussis-antigeenejä, kuten tok-25 soidoitua LPF, vähentämään B.pertussiksen mutanttikantojen todennäköisyyttä välttää samanaikainen immuunivaste.
Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä:
Esimerkki 1
Hapan glysiini-hydrolyysi ja ulkomembraanin raaka-30 proteiinien valmistus
Solut kerättiin talteen 3/4-osassa eksponentiaali-vaihetta ja sentrifugoitiin 8000 g:ssä (Sorvali, GSA-kar-tiopää) 20 min 4°C:ssa. Solujen päällä oleva neste erotettiin lappoa käyttäen ja solut suspendoitiin välittömästi 35 uudelleen varoen tislattuun veteen tiheyteen 20-30 mg/ml 10 81 262 solujen kuivapainoa. Lisättiin kolmannes tästä tilavuudesta IM glysiini-HCl-puskuria, pH 3,0, lievästi sekoittaen glysiinin loppuväkevyyden 250 mM saamiseksi. Glysiini-liuos sisälsi EDTA (antamaan 5 mM lopulliseen seokseen) 5 entsyymiaktiivisuuden pysähdyttämiseksi. pH tarkistettiin ja kun oli tarpeen, asetettiin uudelleen pH 3,0:aan käyttäen 1-2 M HC1. Seosta sekoitettiin varoen 37°C:sella vesihauteella kunnes lämpötila tasapainottui ja inkuboitiin sitten yli yön (18 tuntia) 37°C:ssa (ilman sekoittamista). 10 pH asetettiin sitten 7,2-7,4:ään käyttäen 10 M NaOH, joka lisättiin hitaasti paikallisten ylimäärien välttämiseksi. Soluja sedimentoitiin 5000 g:ssä 20 min 5°C:ssa, niiden päällä oleva neste erotettiin lapolla, jäähdytettiin jää-vesihauteella 1-2°C:seen ja lisättiin hitaasti 2 tilavuut-15 ta esijäähdytettyä asetonia (-20 - -40°C) välttäen lämpötilan nousua yli l-2°C:n. Seosta pidettiin -20eC:ssa 3-5 tuntia ja sakka koottiin esijäähdytetyssä (-10*C) kar-tiopäässä 4000 g:ssä 20 minuutin aikana. Päällä oleva neste lapottiin eroon ja hävitettiin. Sedimentoitu sakka 20 liuotettiin jäillä jäähdytettyyn tislattuun veteen noin 1/20-osaan solususpension alkuperäisestä tilavuudesta. Liuos vapautettiin sitten liukenemattomista aineksista ja rakkuloista sentrifugoimalla 50 000 g:ssä 90-120 min 5°C:ssa. Päällä oleva neste kerättiin ja pidettiin jäähdy-25 tettynä tai kylmäkuivattiin. Ennen kylmäkuivausta lisät tiin 1 %, paino/tilav., mannitolia. Saatiin 40-80 mg proteiinia grammaa kohti solujen kuivapainoa.
Esimerkki 2 (a) Ulkomembraanin raakaproteiini-valmisteiden erot-30 taminen DEAE-trisakryyli-kromatografiällä.
DEAE-trisakryyli-pylväs, 3 x 16 cm, tasapainotettiin 0,025 M Tris'illä, 0,035 M NaCl-puskurilla, pH 8,8, ja esimerkissä 1 saatu aines (korkeintaan 1 g proteiinia) dialysoitiin tasapainottavaa puskuria vastaan ja pumpat-35 tiin nopeudella 60 ml/h pylvään läpi. Jakeet 1-13 (99 pi-
II
11 81262 saraa/putki, noin 5 ml) yhdistettiin yhteispanokseksi. Osa käytetystä kokonaisproteiinista (noin 1/4) ei pidäty gee-likerrokseen ja kerääntyy laajaksi huipuksi (kuv. 1, 0,035 M). Pidättynyt aines eluoitiin sitten käyttäen 0,1, 5 0,2, 0,3 ja 1,0 M NaCl 0,025 M trispuskurissa (pH 8,8).
Jakeet yhdistettiin ja levitettiin SDS-PAGE-levylle proteiinien erottumisen toteamiseksi. ACAP oli läsnä aineksessa, jota pylväs ei pidättänyt, kuten SDS-PAGE osoittaa, mutta sitä oli läsnä myös pidättyneessä aineksessa, joka 10 eluoitui 0,2 M NaCl:lla.
(b) Preparatiivinen vaakakerros-isoelektrofokusointi rakeistetussa geelissä (IEF) Tämä suoritettiin LKB-suositusten mukaisesti (Application Note 198, LKB-Producter AB, Bromma, Ruotsi). 15 Suspensio, jossa oli 4 g Ultrodex (LKB) ja 5 ml esisekoi-tettua Ampholinea, pH 3,5-9,5, suspendoitiin tislattuun veteen 100 ml:n lopputilavuuteen, kaadettiin vaakasuoraan kaukaloon 10,8 x 24,3 cm ja haihdutettiin ilmavirran avulla suositeltuun rajaan. Kerrostettuja kolmen paperitukon 20 (LKB, 2117-106) liuskoja, joita oli liotettu saman
Ampholinen 1:20-laimennuksessa tislatussa vedessä, pantiin kaukalon kumpaankin päähän. Aines esimerkistä 2a upotettiin geeliin käyttäen levitysmatriisia (2 x 9,4 cm), joka puristettiin geeliin pituussuunnassaan 1/3-1/4-osan etäi-25 syydelle anodipäästä, sisäänsuljettu geeli poistettiin, siirrettiin 10 ml:n kertakäyttöruiskuun, suspendoitiin 3 ml:aan ainesta esimerkistä 2a (joka sisälsi korkeintaan 500 mg proteiinia) ja ruiskutettiin lopuksi takaisin tyhjään tilaan, joka syntyi sen poistamisesta. Geeliä tasoi-30 tettiin sitten lastalla tarpeen mukaan ja annettiin tasapainottua 20 minuuttia. Sillä välin yksi paperitukko imeytettiin fosforihapon (ominaispaino 1,75) 1:100-laimen-nuksella ja lisättiin liuskoihin anodi-päässä ja toinen imeytettiin 1 M Na0H:ssa ja pantiin katodi-päähän. Kauka-35 loalustaa vaakakerros IEF-laitteessa (Pharmacia tyyppi FBE-3000) jäähdytettiin juoksuttamalla vesijohtovettä (15°C) käytön aikana. Geeliä käytettiin muuttumattomalla 8 watin teholla.
i2 81 262 ACAP oli havaittavissa kahtena nauhana, toinen pl 7,0 ja toinen (haja) nauha pl 7,2-7,4:ssä. Adenylaatti-syklaasi-aktiivisuus yhdistyi miltei kokonaan keskus-nauhaan (pl 7,0), mutta monoklonaaliset vasta-aineet 5 ACAP:lie sitoutuivat voimakkaasti kumpaankin nauhaan.
Metallimatriisia käyttäen geelikerros jaettiin sitten 30reen rinnakkaiseen kenttään, geeli raaputettiin jokaisesta kentästä käyttäen lastaa ja siirrettiin koeputkiin, jotka sisälsivät 1 ml tislattua vettä. Jokaisen ja-10 keen pH mitattiin tässä vaiheessa. Geelisuspensiot siirrettiin sitten pieniin muovipylväisiin, eluoitiin 2 ml:11a 0,2 M ammoniumbikarbonaatti-puskuria, pH 7,0 ja geeli-vapaat eluaatit jäädytettiin (-40°C).
(c) Analyyttinen isoelektrinen fokusointi 15 (i) Käytettiin samaa menettelytapaa kuin edellä 2(b):lle, mutta käytettiin 12-%:sta polyakryyliamidigeeliä 8 M urean läsnäollessa. Saatiin samat tulokset kuin 2(b):lle.
(ii) Sama menetelmä, mutta käyttäen agaroosigeeliä 10 %:n 20 sorbitolia läsnäollessa antoi 4 immunoreaktiivista nauhaa pi 4,5-6,0. pl 4,0:n nauha pidätti adenylaatti-syklaasi-aktiivisuuden pääosan.
Esimerkki 3 ACAP:n puhdistaminen käyttäen monoklonaalista immu-25 nosorbentti-pylvästä
Hiiren vesivatsanestettä, joka sisälsi monoklonaalista immunoglobuliinia, joka on spesifinen ACAP:lie, saostettiin huoneen lämpötilassa lisäämällä 2 tilavuutta 27-%:sta, paino/tilav., Na2S04 ja annettiin seistä 2-4 tun-30 tia ennen sedimentoimista (2000 g, 15 min). Sedimentti liuotettiin uudelleen ja dialysoitiin PBS vastaan. 500 mg tätä proteiinia (UV-määritys) kytkettiin 70 ml:aan sullottua CNBr-Sepharose® CL4B’tä valmistajan (Pharmacia) ohjeita seuraten. Sephadex® g-50 (väliainetta) pantiin 35 500 mm x 25 mm:n pylvääseen kerroskorkeuteen 220 mm. Pyi-
II
i3 81 262 vään pesemisen jälkeen eluoimispuskurilla (0,2 M ammonium-bikarbonaatti, pH 7,0, joka sisälsi 0,01 % Thiomersal) kaadettiin Sephadex®- kerroksen päälle 5 mm: n paksuinen kerros nro 12 Ballotini-lasihelmiä. Lisäpesun jälkeen im-5 munosorbenttigeeliä kaadettiin Ballotini-lasihelmikerrok-selle, jolloin tämä erottui Sephadex^' ista sallien kummankin erottamisen. Pylvästä pestiin edelleen eluoimispuskurilla ja lopuksi pantiin 100 mm korkean immunosorbentti-kerroksen päälle toinen Ballotini-lasihelmikerros suojaa-10 maan pylvään yläpäätä.
ACAP:n erottamiseksi immunosorbentti-pylväällä lisättiin 180 ml pidättymätöntä eluaattia DEAE-tris-ak-ryyli-erotuksesta (esimerkki 2), joka sisälsi 1 mg/ml proteiinia (Lowry), 5°C:ssa immunosorbenttipylvääseen 15 nopeudella 0,25 ml/min, pestiin eluoimispuskurilla (0,2 M ammoniumbikarbonaatti, pH 7, 0,01 %, paino/tilav., Thiomersal) ja, senjälkeen kun perusviiva oli stabiloitunut, pylvääseen pantiin 50 ml 6 M ureaa eluoimispuskurissa absorboituneen aineksen eluoimiseksi.Immunosorbentti-ainek-20 sen sijoittaminen Sephadex® G-50-kerroksen päälle salli proteiinin samanaikaisen erottamisen ureasta käytön aikana.
Esimerkki 4 B.pertussiksen viljely 25 Määritelty elatusaine, jota käytettiin organismin viljelyyn, perustui Steiner'in ja Scholte'n (1971) kaavaan, kuten aikaisemmin on selostettu (Novotny ja Brookes, 1975). Kaikkia viljelyjä viljeltiin 36-37°C:ssa. Nestevil-jelyt irtonaisesti tulpilla suljetuissa ravistuspulloissa 30 (500 ml:n kartiomainen pullo, jossa on 200 ml elatusainet- ta) siirrostettiin viljelyllä, jota oli viljelty 48 tuntia Cohen-Wheeler-ravintoalustalla, jossa oli 2 % agaria ja 5 % hevosen verta, ja sekoitettiin antamaan kaasunvaih-tonopeus 20-40 μΜ 02/h. Tällaisia nesteviljelyjä käytettiin 35 elatusaineen siirrostamiseen 5 l:n tai 70 l:n kokonaan i4 81 262 lasista tehdyissä fermentoreissa, samalla pitäen pH 7,6:ssa lisäämällä säädetysti 2 M HC1 ja pitäen liuenneen hapen kyllästys 5-10 %:ssa potkurisekoituksella. Viljelyt korjattiin talteen eksponentiaalivaiheen päätyttyä, ts.
5 noin 36 tunnin inkuboinnin jälkeen (Novotny ja Cownley, 1978).
Esimerkki 5
Kendrick-koe T
Tämä suoritettiin WHO-vaatimusten mukaisesti Per-10 tussis-rokotetta varten käyttäen MFI tai NIH hiiriä (OLAC, kategoria 3, vapaat useimmista taudin synnyttäjistä B. bronchiseptica mukaanlukien), jotka painoivat 14-16 g. Antigeeni, 0,5 ml:n tilavuuksissa, annettiin vatsaontelon sisäisesti ja käsittivät huippulaimennuksen ja kolme 4-15 kertaista sarjalaimennusta. Kahden viikon kuluttua hiiriä provosoitiin aivojen sisäisesti käyttäen suositeltua pro-vosointikantaa 18-323 (100-200 LD50). Eloonjääneiden lukumäärää kussakin ryhmässä käytettiin ED50:n ja suhteellisen tehokkuuden laskemiseen suhteessa British Pertussis Refe-20 rence Vaccine 66/84:ään käyttäen yhdensuuntaisviivatoden-näköisyysanalyysiohjelmaa. Suoritettiin myös vertailukoe käyttäen FHA/LPF-rokotetta. Tulokset on esitetty taulukossa 1.
25 30 35
II
is 81262
Taulukko 1
Bordetella pertussis-jakeiden suojausteho hiirien suojaustestissä B.pertussis 18-323:n aivojen sisäistä provokaatiota vastaan ("Kendrick-testi" ) 5 Aines ED50 Suhteel- 41.U pg:ssa prote- pg linen te- iinia (=yksinker-hokkuus täinen ihmisen an- I.U./pg annos) proteii- 10 _nia_ B.pertussiksen 20 0,02 190 raaka glysiini-hydrolysaatti, 15 hydrolysoitu 37eC:ssa B.pertussiksen 77 0,003 1333 raaka glysiini-hydrolysaatti, 20 hydrolysoitu 4°C:ssa - hydrolysoitu 20 0,011 363 37°C:ssa - hydrolysoitu 149 0,001 4000 25 53eC:ssa B.pertussis-immu- 19 0,011 364 nopuhdistettu ade- nylaatti-syklaasi FHA/LPF-rokote 77 0,003 1333 30
Esimerkki 6 ACAP:n aminohappoanalyysi
Aminohappoanalyysi suoritettiin käyttäen Rank Hil-ger Chromaspek-aminohappoanalysaattoria. Näytteet valmis-35 tettiin lisäämällä 250 pl 6N HC1 (laimennettu BDH
Aristar-laadusta), joka sisälsi 0,1 % (paino/tilav.) fenolia, kuivattuun näyteainekseen paksuseinäisessä Pyrex-koeputkessa (7,5 x 1,2 cm). Putkia vedettiin sitten happi /luonnonkaasu poltinliekillä kapean aukon aikaansaami-40 seksi. Sisällön pakastamisen jälkeen kiinteässä C02- etanolihauteessa, jokainen putki yhdistettiin jakoputkis- ie 81262 ton ja loukun kautta suurtyhjöpumppuun ja annettiin olla 10 minuuttia ilman poistamiseksi. Putket sulatettiin sitten umpeen ja pantiin 110°C:seen uuniin hydrolyysiä varten. Hydrolysoidut näytteet kuivattiin tyhjöeksikaatto-5 rissa natriumhydroksidipelleteillä. Kuivattu jäännös liuotettiin 250 pl:aan aminohappoanalysaattorin lähtöpusku-ria automaattista analyysiä varten.
Taulukossa 2 esitetyt aminohappoarvot ovat keskiarvoja tuloksista, jotka saatiin rinnakkaisista 24:n, 10 48:n ja 68:n tunnin hydrolyyseistä paitsi valiinin ja isoleusiinin tapauksessa, jolloin käytettiin 68 tunnin hydrolyysiarvoja.
Kystiinin, kysteiinin ja tryptofaanin arvoja ei voitu määrittää tällä menetelmällä.
15 Taulukko 2 Tähteet
Asparagiinihappo(+ asparagiini) 48
Treoniini 33 20 Seriini 33
Glutamiinihappo(+ glutamiini) 62
Proliini 60
Glysiini 77
Alaniini 82 25 Väliini 54
Metioniini 4
Isoleusiini 22
Leusiini 50
Tyrosiini 7 30 Fenyylialaniini 11
Histidiini 13
Lysiini 19
Arginiini 37 35 17 81 262
Esimerkki 7 Rokotevalmisteita
Immunisoinnissa käytettäviä rokotteita valmistetaan tavallisin menetelmin seuraavin aineosin: 5 a) Difteria-, Tetanus- ja Pertussis-rokote yksinkertaisessa liuoksessa. Jokainen 1 ml rokotetta sisältää: Difteria-toksoidia >60 I.U.
Tetanus-toksoidia >120 I.U.
Keksinnön mukaisesti valmistettua 10 Pertussis-antigeeniä >0,363 mg
Natriumboraattia <10,03 mg
Meripihkahappoa <3,10 mg
Thiomersal 0,04-0,2 mg
Natriumkloridia <8,5 mg 15 Vettä 1 ml:ksi b) Adsorboitu Difteria-, Tetanus- ja Pertussis-rokote Difteria-, Tetanus- ja Pertussis-komponentit adsorboidaan alumiinihydroksidigeelille standardimenetelmin. Jokainen 20 1 ml rokotetta sisältää:
Difteria-toksoidia >60 I.U.
Tetanus-toksoidia >120 U.L.
Keksinnön mukaisesti valmistettua >0,363 mg antigeeniä 25 Liukenemattomia alumiini-suoloja < samanarvoinen 0,093 moolille (2,5 mg) AI.
Natriumboraattia <8,01 mg
Meripihkahappoa <2,48 mg 30 Thiomersal 0,04-0,2 mg
Natriumkloridia <6,8 mg
Vettä 1 ml:ksi c) Pertusiss-rokote
Jokainen 1 ml rokotetta sisältää: 35 Keksinnön mukaisesti valmistettua >0,363 mg antigeeniä
Thiomersal 0,04-0,2 mg
Natriumkloridia <8,5 mg
Vettä 1 ml:ksi
Claims (9)
1. Menetelmä antigeenipreparaatin, joka sisältää proteiiniainesta, johon liitty adenylaatti-syklaasi-ak- 5 tiivisuus (ACAP), eristämiseksi bakteerista Bordetella pertussis, tunnettu siitä, että Bordetella pertussis -solujen viljelmää käsitellään vesipitoisella ami-nohappopuskurilla, jonka pH on 2,5 - 3,5 ja joka sisältää tätä aminohappoa hypertoonisena pitoisuutena solujen suh-10 teen, solut erotetaan syntyneestä supernatant!sta ja eristetään ACAP'tä sisältävä antigeenipreparaatti super-natantista.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pH on pääasiallisesti 3.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely puskurilla kestää 10 - 20 tuntia.
4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely pus- 20 kurilla suoritetaan lämpötilassa 30 - 45 °C.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lämpötila on pääasiallisesti 37 °C.
6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen me-25 netelmä, tunnettu siitä, että aminohappo on gly- siini tai alaniini.
7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eristäminen super-natantista käsittää ioninvaihtokromatografiaa.
8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen me netelmä, tunnettu siitä, että eristäminen super-natantista käsittää isoelektrista fokusointia.
9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eristäminen käsittää edel-35 leen eristetyn aineksen viemisen immunosorbenttipylvään läpi, joka sisältää sopivaa monoklonaalista vasta-ainetta ACAP'tä vastaan. Il is 81262
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8412207 | 1984-05-12 | ||
| GB848412207A GB8412207D0 (en) | 1984-05-12 | 1984-05-12 | Antigenic preparations |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI851859A0 FI851859A0 (fi) | 1985-05-10 |
| FI851859L FI851859L (fi) | 1985-11-13 |
| FI81262B true FI81262B (fi) | 1990-06-29 |
| FI81262C FI81262C (fi) | 1990-10-10 |
Family
ID=10560891
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI851859A FI81262C (fi) | 1984-05-12 | 1985-05-10 | Foerfarande foer isolering av ett med adenylat-cyklas-aktivitet associerat antigenpreparat ur bakterien bordetella pertussis. |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (8) | US5648080A (fi) |
| EP (1) | EP0162639B1 (fi) |
| JP (3) | JPH07116053B2 (fi) |
| AT (1) | ATE61937T1 (fi) |
| CA (1) | CA1253073A (fi) |
| DE (1) | DE3582272D1 (fi) |
| DK (1) | DK165358C (fi) |
| ES (1) | ES8802275A1 (fi) |
| FI (1) | FI81262C (fi) |
| GB (1) | GB8412207D0 (fi) |
| LU (1) | LU90203I2 (fi) |
| NL (1) | NL980006I1 (fi) |
| NO (2) | NO165478C (fi) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8412207D0 (en) | 1984-05-12 | 1984-06-20 | Wellcome Found | Antigenic preparations |
| FR2597344B1 (fr) * | 1986-04-16 | 1989-06-23 | Merieux Inst | Perfectionnement au procede de purification d'antigenes proteiques de bacteries appartenant au genre bordetella, en vue de l'obtention d'un vaccin acellulaire. |
| US4762710A (en) * | 1986-06-16 | 1988-08-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Novel method of preparing toxoid by oxidation and metal ions |
| SE455946B (sv) * | 1986-10-20 | 1988-08-22 | Trion Forskning & Utveckling | Nya pertussistoxin-polypeptider och antigener samt testsatser, vacciner och intradermala hudtestkompositioner |
| FR2606789B1 (fr) * | 1986-11-17 | 1991-05-31 | Pasteur Institut | Preparations d'adenylate cyclase purifiees, procede d'obtention de ces preparations et leurs applications biologiques |
| EP0267998A1 (en) * | 1986-11-17 | 1988-05-25 | Institut Pasteur | Means for protecting against bordetella infections and toxic processes |
| CA1337859C (en) * | 1987-04-24 | 1996-01-02 | Masashi Chazono | Method for culturing bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine |
| US5139776A (en) * | 1987-04-24 | 1992-08-18 | The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University | Method for culturing Bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine |
| EP0338170A1 (en) * | 1988-04-19 | 1989-10-25 | Institut Pasteur | Immunoprotective antigenic protein against pathogenic bacteria |
| EP0338169B1 (en) * | 1988-04-19 | 1996-07-24 | Institut Pasteur | Method for obtaining protective antigens against bordetella infections and toxic processes |
| GB8910570D0 (en) | 1989-05-08 | 1989-06-21 | Wellcome Found | Acellular vaccine |
| FR2646776B1 (fr) | 1989-05-12 | 1994-06-03 | Pasteur Institut | Utilisation de preparations vaccinantes a base d'adenyl cyclase ou de bacteries les produisant en tant qu'antigenes protecteurs contre les effets des bordetella |
| DE69018926T2 (de) * | 1989-09-04 | 1995-08-24 | Wellcome Found | Vakzine gegen Bordetella. |
| US5276142A (en) * | 1989-12-11 | 1994-01-04 | American Cyanamid Company | Process for purification of a 69000 dalton antigenic protein from Bordetella pertussis |
| US6197548B1 (en) | 1990-04-02 | 2001-03-06 | Medeva Pharma Limited | Transformed Pichia expressing the pertactin antigen |
| GB9007657D0 (en) * | 1990-04-04 | 1990-05-30 | Connaught Lab | Purification of a pertussis outer membrane protein(omp69) |
| EP0484621A3 (en) * | 1990-07-11 | 1992-08-26 | American Cyanamid Company | Efficacious vaccines against bordetella pertussis comprising a combination of individually purified pertussis antigens |
| GB9021004D0 (en) * | 1990-09-27 | 1990-11-07 | Wellcome Found | Acellular vaccines |
| US6444211B2 (en) | 1991-04-03 | 2002-09-03 | Connaught Laboratories, Inc. | Purification of a pertussis outer membrane protein |
| GB9304399D0 (en) * | 1993-03-04 | 1993-04-21 | Smithkline Beecham Biolog | Novel process |
| FR2728170A1 (fr) * | 1994-12-15 | 1996-06-21 | Pasteur Institut | Vaccin de type acellulaire anti-bordetella |
| FR2736064B1 (fr) | 1995-06-30 | 1997-09-05 | Pasteur Institut | Epitopes protecteurs de l'adenyl cyclase-hemolysine(ac-hty). leur application au traitement ou a la prevention des infections par bordetella |
| ZA981370B (en) * | 1997-02-20 | 1998-09-07 | Cerberus Developments Bv | Method and apparatus for continuous flow isoelectric focusing for purifying biological substances |
| GB201105981D0 (en) | 2011-04-08 | 2011-05-18 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel process |
| NZ630868A (en) | 2013-03-08 | 2017-02-24 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Acellular pertussis vaccine |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3141824A (en) * | 1961-05-19 | 1964-07-21 | Lilly Co Eli | Pertussis antigen |
| US3395219A (en) * | 1964-12-11 | 1968-07-30 | Merck & Co Inc | Process for production of pertussis antigen |
| US3465078A (en) * | 1965-10-21 | 1969-09-02 | Sydney Z Spiesel | Method of recovering antigens from bordetella pertussis cells |
| FR2047886A1 (en) * | 1969-06-30 | 1971-03-19 | Merieux Inst | Non-toxic anti-whooping cough vaccine |
| FR2393065A1 (fr) * | 1977-05-31 | 1978-12-29 | Merieux Inst | Procede de separation de lipides d'endotoxines bacteriennes et notamment d'endotoxine de bordetella pertussis |
| GB2014452B (en) * | 1978-02-17 | 1982-07-21 | Secr Social Service Brit | Producing cell envelope preparations |
| DE2961293D1 (en) * | 1978-02-17 | 1982-01-14 | Nat Res Dev | Immunogenic cell envelope preparations |
| JPS5750925A (en) * | 1980-09-12 | 1982-03-25 | Takeda Chem Ind Ltd | Preparation of pertussis toxoid |
| US4551429A (en) * | 1983-09-15 | 1985-11-05 | American Home Products Corporation | Stimulation of antigen production by Bordetella pertussis |
| GB8412207D0 (en) * | 1984-05-12 | 1984-06-20 | Wellcome Found | Antigenic preparations |
| US5237052A (en) * | 1984-05-12 | 1993-08-17 | Burroughs Wellcome Company | Antigenic preparations and isolation of such preparations |
| US4705686A (en) * | 1986-05-09 | 1987-11-10 | American Cyanamid | Process for the preparation of acellular Bordetalla pertussis vaccine |
| FR2606789B1 (fr) * | 1986-11-17 | 1991-05-31 | Pasteur Institut | Preparations d'adenylate cyclase purifiees, procede d'obtention de ces preparations et leurs applications biologiques |
| EP0267998A1 (en) * | 1986-11-17 | 1988-05-25 | Institut Pasteur | Means for protecting against bordetella infections and toxic processes |
| GB8807860D0 (en) * | 1988-04-05 | 1988-05-05 | Connaught Lab | Pertussis vaccine |
| US5101014A (en) * | 1989-02-10 | 1992-03-31 | United States Of America | Process for the purification of a 69,000 da outer membrane protein of Bordetella pertussis |
| GB8910570D0 (en) * | 1989-05-08 | 1989-06-21 | Wellcome Found | Acellular vaccine |
| US5276142A (en) * | 1989-12-11 | 1994-01-04 | American Cyanamid Company | Process for purification of a 69000 dalton antigenic protein from Bordetella pertussis |
| GB9007416D0 (en) * | 1990-04-02 | 1990-05-30 | Wellcome Found | Expression of heterologous protein in yeast |
| GB9007657D0 (en) * | 1990-04-04 | 1990-05-30 | Connaught Lab | Purification of a pertussis outer membrane protein(omp69) |
| IT1248735B (it) * | 1990-06-21 | 1995-01-26 | Sclavo Spa | Vaccini acellulari contro la pertosse |
| EP0484621A3 (en) | 1990-07-11 | 1992-08-26 | American Cyanamid Company | Efficacious vaccines against bordetella pertussis comprising a combination of individually purified pertussis antigens |
-
1984
- 1984-05-12 GB GB848412207A patent/GB8412207D0/en active Pending
-
1985
- 1985-05-10 FI FI851859A patent/FI81262C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-05-10 NO NO851878A patent/NO165478C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-05-10 JP JP60099413A patent/JPH07116053B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-10 DE DE8585303302T patent/DE3582272D1/de not_active Revoked
- 1985-05-10 EP EP85303302A patent/EP0162639B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-10 DK DK198502089A patent/DK165358C/da not_active IP Right Cessation
- 1985-05-10 AT AT85303302T patent/ATE61937T1/de active
- 1985-05-10 ES ES543026A patent/ES8802275A1/es not_active Expired
- 1985-05-10 CA CA000481336A patent/CA1253073A/en not_active Expired
-
1994
- 1994-03-21 US US08/210,458 patent/US5648080A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-11 US US08/240,814 patent/US5438120A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-07 US US08/470,590 patent/US6127151A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 US US08/478,046 patent/US6048700A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-08-01 NO NO1997010C patent/NO1997010I1/no unknown
-
1998
- 1998-01-27 NL NL980006C patent/NL980006I1/nl unknown
- 1998-01-28 LU LU90203C patent/LU90203I2/fr unknown
-
1999
- 1999-06-17 US US09/334,690 patent/US6210685B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-30 US US09/343,399 patent/US20020150595A1/en not_active Abandoned
- 1999-07-07 JP JP11193416A patent/JP2000072690A/ja active Pending
- 1999-07-07 JP JP11193312A patent/JP2000053585A/ja active Pending
-
2002
- 2002-09-16 US US10/243,930 patent/US20030077294A1/en not_active Abandoned
- 2002-12-27 US US10/329,946 patent/US20030108572A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NL980006I1 (nl) | 1998-04-01 |
| NO851878L (no) | 1985-11-13 |
| ES8802275A1 (es) | 1988-05-01 |
| EP0162639B1 (en) | 1991-03-27 |
| LU90203I2 (fr) | 1998-04-06 |
| US20020150595A1 (en) | 2002-10-17 |
| CA1253073A (en) | 1989-04-25 |
| NO165478B (no) | 1990-11-12 |
| US5648080A (en) | 1997-07-15 |
| EP0162639A3 (en) | 1988-02-03 |
| NO165478C (no) | 1991-02-20 |
| JPH07116053B2 (ja) | 1995-12-13 |
| ATE61937T1 (de) | 1991-04-15 |
| US6127151A (en) | 2000-10-03 |
| US6210685B1 (en) | 2001-04-03 |
| FI81262C (fi) | 1990-10-10 |
| JP2000053585A (ja) | 2000-02-22 |
| DK208985A (da) | 1985-11-13 |
| DK165358B (da) | 1992-11-16 |
| DE3582272D1 (de) | 1991-05-02 |
| NO1997010I1 (no) | 1997-08-25 |
| US5438120A (en) | 1995-08-01 |
| DK165358C (da) | 2000-11-06 |
| ES543026A0 (es) | 1988-05-01 |
| DK208985D0 (da) | 1985-05-10 |
| US6048700A (en) | 2000-04-11 |
| US20030108572A1 (en) | 2003-06-12 |
| JPS60246321A (ja) | 1985-12-06 |
| GB8412207D0 (en) | 1984-06-20 |
| US20030077294A1 (en) | 2003-04-24 |
| FI851859L (fi) | 1985-11-13 |
| JP2000072690A (ja) | 2000-03-07 |
| FI851859A0 (fi) | 1985-05-10 |
| EP0162639A2 (en) | 1985-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI81262B (fi) | Foerfarande foer isolering av ett med adenylat-cyklas-aktivitet associerat antigenpreparat ur bakterien bordetella pertussis. | |
| Huebner et al. | Production of type-specific C antigen in virus-free hamster tumor cells induced by adenovirus type 12 | |
| Forni et al. | Heterologous sera: a target for in vitro cell-mediated cytotoxicity | |
| EP0432203A1 (en) | Legionellosis vaccines and methods for their production | |
| AU641711B2 (en) | Process for purification of a 69 000 dalton antigenetic protein from bordetella pertussis | |
| Novotny et al. | Adenylate cyclase activity of a 68,000-molecular-weight protein isolated from the outer membrane of Bordetella bronchiseptica | |
| RU2447898C2 (ru) | Вакцина ipv-dpt | |
| ES2095874T5 (es) | Vacuna acelular. | |
| JP2999480B2 (ja) | 百日咳感染及び毒性過程に対する保護抗原を得るための方法 | |
| CN1059471A (zh) | 副鸡嗜血杆菌疫苗 | |
| Garcia et al. | Characterization of antigens from the yeast phase of Histoplasma capsulatum | |
| US5237052A (en) | Antigenic preparations and isolation of such preparations | |
| EP0180012A1 (de) | Immunogene Polypeptidsequenz des Hepatitis B-Virus | |
| Lopez-Merino et al. | Immunization by an insoluble fraction extracted from Brucella melitensis: immunological and chemical characterization of the active substances | |
| Petersen et al. | Proliferative responses to purified and fractionated Bordetella pertussis antigens in mice immunized with whole-cell pertussis vaccine | |
| Cameron et al. | Identification of the protective and toxic antigens of Corynebacterium pseudotuberculosis | |
| PT95396B (pt) | Processo para a preparacao duma vacina para a proteccao contra a hemofilose suina | |
| Khabas et al. | An investigation of purified tetanus toxoid by the method of precipitation in agar | |
| Joint Publications Research Service | JPRS Report: Science and Technology, USSR.. Life Sciences | |
| Horaud | Joint IABS/WHO congress on standardization and control of biologicals produced by recombinant DNA technology |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: EVANS MEDICAL LIMITED |
|
| SPCG | Supplementary protection certificate granted |
Spc suppl protection certif: L145 Extension date: 20100509 Spc suppl protection certif: L144 Extension date: 20090327 |
|
| FG | Patent granted |
Owner name: EVANS MEDICAL LIMITED |
|
| MA | Patent expired |