CN116970091A - 一种增强新城疫病毒免疫效果的抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及动物免疫学技术领域，尤其涉及一种增强新城疫病毒免疫效果的抗原及其制备方法和应用。该抗原是由Ii‑key‑F‑Fc重组载体经工程菌表达获得的融合蛋白，命名为Ii‑key‑F‑Fc融合蛋白；所述Ii‑key‑F‑Fc重组载体由NDV F蛋白上三个主要抗原表位片段拼接后再与鸡IgY Fc、Ii‑key分别串联获得。本发明通过将鸡新型载体Ii‑key‑Fc与F抗原表位进行串联，构建pCold‑TF‑Ii‑key‑F‑Fc原核表达质粒，并利用大肠杆菌表达系统对融合蛋白进行表达，获得同于提高禽类免疫效果的新的抗原。为开发一种新的NDV疫苗提供了新的思路，为改善家禽亚单位疫苗的免疫效果提供了一种新的策略。

Description

一种增强新城疫病毒免疫效果的抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及动物免疫学领域，尤其涉及一种增强新城疫病毒免疫效果的抗原及其制备方法和应用。
技术背景
新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的禽类疾病综合征，尤以高热、呼吸困难和消化系统病变为主要症状。截止目前为止，ND已造成四次大流行(Alexander D J,Aldous E W,Fuller C M.The long view:aselective review of 40years of Newcastle disease research[J].Avian Pathology,2012,41(4):329-335)，且每次大流行都会有新基因型的产生，导致原有疫苗不能有效抵抗病毒的入侵。
现行的ND疫苗主要是灭活苗和减毒疫苗，弱毒疫苗具有较好的保护作用，却存在易受母源抗体干扰、不完全保护和毒力返强等不足；灭活苗虽使用安全，但注射剂量较大，成本较高，给ND防控带来较大困难。因此，在保证安全的前提下，增强疫苗的免疫效果对ND防控和净化具有重大意义。
黏膜免疫可引起机体局部黏膜免疫反应，抵御细菌、病毒等微生物的入侵，同时还激起机体的全身性系统免疫应答。黏膜上皮细胞和固有层内的免疫效应细胞之间的密切联系表明，通过黏膜表面输送免疫原是实现黏膜免疫和潜在的全身免疫的理想途径。
NDV可以通过呼吸道黏膜表面感染机体，但目前仍缺乏可以抵御这种通过黏膜侵入机体的病原体的高效疫苗，如何通过疫苗引起家禽机体的局部黏膜免疫和全身性免疫反应，降低新城疫的发病率，是现有技术亟待解决的问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的之一是提供一种用于增强新城疫病毒免疫效果的抗原，该抗原是由Ii-key-F-Fc重组载体经感受态细胞表达获得的融合蛋白，命名为Ii-key-F-Fc融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述Ii-key-F-Fc重组载体由NDV F蛋白上三个主要抗原表位片段拼接后再与鸡IgY Fc、Ii-key分别串联获得，Ii-key-F-Fc重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述NDV F蛋白为新城疫病毒细胞膜上的表面糖蛋白，所述三个主要抗原表位片段分别位于NDV F蛋白第72(66-91aa)、161(147-182aa)和343(326-360aa)处，序列分别如SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。
优选的，所述NDV F蛋白上三个主要抗原表位片段拼接后产物为抗原表位组合肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的另一目的在于提供上述一种用于增强新城疫病毒免疫效果的抗原的制备方法，包括如下步骤：
S1.酶切获得鸡的IgY Fc基因以及NDV F蛋白的三个主要抗原表位片段，将NDV F蛋白的三个主要抗原表位片段连接形成抗原表位组合肽，抗原表位组合肽命名为F片段，将所述F片段分别与IgY Fc、恒定链活性片段Ii-key串联获得目的基因片段；
S2.目的基因片段连接到pCold-TF原核表达载体上后，将Ii-key-F-Fc重组载体转化进感受态细胞BL21中，利用感受态细胞表达Ii-key-F-Fc融合蛋白，该Ii-key-F-Fc融合蛋白为增强新城疫病毒免疫效果的抗原。
优选的，所述步骤S1中，提取鸡巨噬细胞RNA，反转录获得cDNA，以cFc-F/cFc-R为引物，扩增IgY Fc基因；以pcDNA3-F质粒为模板，分别以引物对NDV-F-F1/NDV-F-R1、NDV-F-F2/NDV-F-R2、NDV-F-F3/NDV-F-R3扩增含有NDV主要抗原表位的第72、161和343基因片段，最后以前3个PCR产物为模板，引物对NDV-F-F/NDV-F-R扩增抗原表位组合肽；
所述cFc-F/cFc-R序列如SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8所示，所述NDV-F-F1/NDV-F-R1序列如SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10所示，所述NDV-F-F2/NDV-F-R2序列如SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12所示，所述NDV-F-F3/NDV-F-R3序列如SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14所示，所述NDV-F-F/NDV-F-R序列如SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16所示。
优选的，所述步骤S1中，通过Overlap PCR方法将所述F片段、恒定链活性片段Ii-key、IgY Fc片段连接，其中F片段的上游引物F-up选用KpnI酶切位点，下游引物F-down插入Linker序列；Fc片段的上游引物Fc-up插入Linker序列，下游引物Fc-down选用HindIII酶切位点；
所述F-up序列如SEQ ID NO.17所示，F-down序列如SEQ ID NO.18所示，Fc-up序列如SEQ ID NO.19所示，Fc-down序列如SEQ ID NO.20所示，所述Linker序列如SEQ ID NO.21所示。
优选的，所述步骤S2中，利用感受态细胞表达Ii-key-F-Fc融合蛋白的具体操作为：挑取Ii-key-F-Fc阳性单克隆，接种于含50ug/mL Amp+/LB液体培养基中，在37℃，IPTG终浓度为0.4mmol/L下，15℃诱导表达24h。
优选的，所述步骤S2中获得的Ii-key-F-Fc融合蛋白，还可以进行纯化步骤，具体为：对表达后的融合蛋白进行超声破碎，离心收集上清液，上清液继续通过镍亲和层析法收集洗脱液，得到纯化后的Ii-key-F-Fc融合蛋白，该Ii-key-F-Fc融合蛋白为增强新城疫病毒免疫效果的抗原。
本发明再一目的是提供上述Ii-key-F-Fc融合蛋白在制备新城疫疫苗中的应用。
本发明还提供一种用于使禽类产生或增强机体对新城疫病毒免疫力的制剂，该制剂包含有效剂量的如上所述的Ii-key-F-Fc融合蛋白，该Ii-key-F-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述制剂为液体制剂或喷雾剂，通过粘膜免疫法接种所需个体。
本发明的有益效果在于：
F蛋白作为NDV毒力的重要组成部分，是造成病毒侵入和体内传播的关键基因，本发明选取F蛋白三段不同表位构建多表位抗原基因，将其导入pET-32a原核表达载体上并选用Rosetta宿主菌，获得表达良好的F蛋白。
鸡卵黄免疫球蛋白IgY Fc受体(FcRY)可以识别和转运IgY，将IgY Fc片段作为载体，与病毒保护性抗原融合，借助FcRY跨越黏膜免疫屏障，增强机体免疫应答。Ii-key是恒定链功能片段，作为免疫载体被广泛研究，与抗原肽串联后能显著增强免疫应答。
本发明通过将鸡新型载体Ii-key-Fc与F抗原表位进行串联，构建pCold-TF-Ii-key-F-Fc原核表达质粒，并利用大肠杆菌表达系统对融合蛋白进行表达，获得同于提高禽类免疫效果的新的抗原。
实验证明，新型载体(Ii-key-F-Fc)融合蛋白具备类似于IgY的结构，可以借助FcRy的双向胞转作用跨越鸡呼吸道黏膜免疫屏障，并延长其半衰期，维持有效的免疫应答，同时兼备MHCII类分子伴侣蛋白Ii链的抗原递呈作用。因此，新型载体(Ii-key-Fc)抗原能够刺激机体产生有效的局部黏膜免疫和全身免疫应答。
本发明为开发新的新城疫疫苗提供了新的思路，为改善家禽亚单位疫苗的免疫效果提供了一种新的策略。
附图说明
图1为IgY Fc基因片段和NDV-F基因片段的PCR扩增结果，图中a为IgY Fc基因，b为NDV-F基因，图1的a、b中M均为DNAMarker(DL2000)；a中1为IgY Fc基因PCR扩增结果，b中1为NDV-F基因PCR扩增结果。
图2为重组质粒pET-32a-Fc及pET-32a-F鉴定结果，图中a为重组质粒pET-32a-Fc菌液PCR及双酶切鉴定，图中b为重组质粒pET-32a-F菌液PCR及双酶切鉴定；图中M均为DNAMarker(DL2000)；a中1为pET-32a-Fc菌液PCR鉴定及双酶切鉴定，2为pET-32a-Fc重组质粒双酶切鉴定，3为pET-32a载体双酶切鉴定；b中1为pET-32a-F菌液PCR鉴定，2为pET-32a-F重组质粒双酶切鉴定，3为pET-32a载体双酶切鉴定。
图3为重组质粒pCold-TF-Ii-key-F-Fc菌液PCR及双酶切鉴定，M为DNA Marker(DL5000)，1为pCold-TF-Ii-key-F-Fc菌液PCR鉴定，2为pCold-TF-Ii-key-F-Fc重组质粒双酶切鉴定，3为pCold-TF载体双酶切鉴定。
图4为不同IPTG诱导终浓度pCold-TF-Ii-key-F-Fc表达水平，图中M为Proteinmarker，泳道1-6分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L IPTG诱导表达水平。
图5为pCold-TF-Ii-key-F-Fc融合蛋白表达及可溶性鉴定，图中M为Proteinmarker，1为pCold-TF-Ii-key-F-Fc融合蛋白未诱导结果，2为诱导超声后上清结果，3为沉淀结果。
图6为pCold-TF-Ii-key-F-Fc蛋白纯化后SDS-PAGE检测结果，图中M为Proteinmarker，1为流川液结果，2-3为洗涤液结果，4-7为洗脱液结果；
图7为His-F融合蛋白免疫小鼠血清抗体效价。
图8为F抗体的Western blot结果，图中M为Pre-stained Protein marker，1表示F蛋白未诱导，2表示F融合蛋白。
图9中a、b、c分别为Ii-key-F-Fc融合蛋白、F-Fc融合蛋白和F融合蛋白的Westernblot鉴定结果；图中M均表示Pre-stained Protein marker。
图10为融合蛋白跨越鸡呼吸道黏膜屏障的检测结果。
图11为血清中IgY抗体水平OD450nm值。
图12为免疫鸡肺脏冲洗液sIgA的抗体水平，图中a为肺脏冲洗液中sIgA的含量结果，b为气管冲洗液中sIgA的含量结果。
图13中a、b、c分别为血清中的IL-2、IL-4和IFN-γ含量结果。
图14为RT-qPCR技术检测免疫相关基因在鸡脾脏中的表达水平的结果。
具体实施方式
为了便于理解，下面结合实施例对本发明的技术方案做出更为具体的说明：
实施例1试验材料
1.实验动物来源
7日龄海兰褐蛋鸡购自安徽六安某孵化场。6-8周龄的雌性Balb/c小鼠由杭州子源实验动物科技有限公司提供。
2.菌株与质粒
原核表达载体pET-32a和大肠杆菌DH5α、Rosetta、BL21菌株由本实验室保存；pCold-TF质粒由安徽农业大学提供。
3.粘膜佐剂
生工生物工程(上海)股份有限公司合成小鼠黏膜佐剂CPG ODN2007：5'-TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT-3'，全链硫代磷酸化修饰、HPLC纯化。
4.培养基与主要抗生素的配置
LB液体培养基：NaCl 1％，胰蛋白胨1％，酵母浸出物0.5％，调pH至7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存备用。
LB固体培养基：NaCl 1％，胰蛋白胨1％，酵母浸出物0.5％，琼脂粉1.5％，调pH至7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存备用。
氨苄青霉素溶液的配置：氨苄2.0g，溶于20mL ddH2O，0.22μm滤器过滤，分装后-20℃保存。
5.琼脂凝胶电泳相关试剂的配制
琼脂凝胶电泳相关试剂的配制：50×TAE的配制：Tris 121g，EDTA14.6g，加入400mL去离子水，充分搅拌溶解，加入28.55mL的醋酸，充分混匀。加去离子水定容至500mL，室温保存。
1.5％琼脂糖凝胶的配制：0.45g琼脂糖，30mL 1×TAE缓冲液，混匀加热如加入0.9μL核酸染料并混匀。
6.蛋白诱导表达与纯化相关试剂的配制
IPTG溶液的配制：IPTG 0.24g，溶于10mL ddH2O，0.22μm滤器过滤，分装后-20℃保存。
结合缓冲液：20mM磷酸钠，0.5M NaCl，40mM咪唑，pH7.4，使用0.45μm滤膜过滤。
洗脱缓冲液：20mM磷酸钠，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH7.4，使用0.45μm滤膜过滤。
层析填料保存液：乙醇2mL溶于8mL dH2O，4℃保存备用。
7.纯化相关试剂的配制
结合(洗涤)缓冲液：Na2HPO4 0.28g，NaCl 0.88g，溶于ddH2O，调pH至7.0，定容至100mL。
洗脱液：0.75g Glycine，混匀定容至100mL，pH至3.0。
中和液：Tris 12.1g，溶于80mL ddH2O中，调pH至8.5，定容至100mL。
使用前将缓冲液通过0.45μm滤膜过滤。
8.主要仪器
实施例2：pET-32a-cFc和pET-32a-NDV-F重组质粒的构建
2.1 IgY Fc基因和F基因引物设计
参考NCBI-GenBank数据库中鸡IgG重链基因序列(登录号：X07174)CDS区，应用Primer Premier 5.0设计一对含KpnI和SalI限制性酶切位点及保护性碱基的特异性引物；参考NCBI-GenBank数据库中NDV-F基因组序列(登录号：AY508514)，设计5对特异性引物，并在引物NDV-F-F和NDV-F-R的5'端添加EcoRI和XhoI限制性酶切位点及保护性碱基，引物序列见表1。
表1 IgY Fc基因和F基因相关引物
2.2克隆NDV-F基因和鸡IgY-Fc基因
提取鸡巨噬细胞RNA，反转录获得cDNA。以cDNA为模板，以cFc-F/cFc-R为引物，扩增IgY Fc基因；以实验室保存的pcDNA3-F质粒为模板，分别以引物对NDV-F-F1/NDV-F-R1、NDV-F-F2/NDV-F-R2、NDV-F-F3/NDV-F-R3扩增含有NDV主要抗原表位的第72、161和343基因片段，最后以前3个PCR产物为模板，引物对NDV-F-F/NDV-F-R扩增抗原表位组合肽。高保真酶反应体系如表2-6。预变性98℃5min；变性98℃10s，退火60℃15s，延伸68℃1min，30个循环；终延伸72℃5min，以获得用于构建原核表达质粒的编码基因。
PCR反应结束后，立即进行琼脂糖凝胶电泳，按照凝胶回收试剂盒说明进行目的片段的收集。
如图1中a所示，以Fc-F/Fc-R引物，提取的鸡巨噬细胞mRNA为模板，经RT-PCR扩增获得长度为960bp的Fc基因片段，与预期鸡IgY-Fc基因片段大小相符；如图1中b所示，分别以3对NDV-F引物扩增含有抗原表位的基因片段，以实验室保存的pcDNA3-F质粒为模板，通过Overlap PCR扩增获得长度为294bp的NDV-F片段，电泳结果显示与预期相符。
2.3载体与目的片段的双酶切
胶回收的产物和质粒pET-32a使用相应的限制性内切酶进行双酶切，酶切体系见表2。37℃水浴30min，于琼脂糖凝胶电泳检测，随后进行胶回收。
表2双酶切反应体系
2.4载体与目的片段的连接与转化
2.4.1将回收的目的片段连接到pET-32a原核表达载体上。在EP管中加入相应成分见表3。混匀后，16℃金属浴反应1h。
表3构建重组质粒连接体系
2.4.2感受态细胞的制备
步骤如下：
S1.将DH5α或BL21甘油菌在普通LB平板上划线接种，37℃培养过夜。
S2.无菌操作下挑取单菌落，接种至4mL Amp+/LB培养液于37℃，180r/min培养12-16h过夜活化。
S3.将菌液按照1:100接种至新的LB液体培养基，37℃，200r/min培养3-4h
S4.1.3mL/管分装，冰浴30min，4℃4000r/min 5min，弃上清。
S5.120μL预冷CaCl2重悬离心，4℃4000r/min 5min，弃上清。再加入120μL预冷CaCl2重悬，冰浴30min，4℃4000r/min 3min，弃上清。
S6.50uL预冷CaCl2+50μL 30％甘油重悬，-80℃保存。
将连接体系转化至感受态细胞：从-80℃冰箱中取出感受态细胞置于冰上解冻，入连接产物，轻轻拨弹混匀，冰浴30min，42℃热激45s，置于冰上2min。加入500μL无抗性LB液体培养基，180r/min 37℃培养1h后，5000rpm离心1min，弃部分上清，剩余约100uL上清重悬沉淀，用移液枪吸取菌液移至带有Amp+/LB板，并用涂布器均匀涂布，放于37℃培养箱倒置培养12h，挑取单菌落进行筛选鉴定。
2.5阳性克隆鉴定
从Amp+/LB平板上挑取若干单克隆菌落于含有Amp+/LB液体培养基中，震荡培养6h后，吸取菌液进行PCR鉴定。
选取已鉴定为阳性菌液进行扩大培养，保存菌种，按照Axygen质粒小量DNA提取试剂盒说明提取质粒，具体步骤如下：
S1.取4mL在LB培养基中培养过夜的菌液，12,000rpm离心1min，弃尽上清；
S2.加250μL Buffer S1悬浮细菌沉淀，直至无菌块存在；
S3.加250μL Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，裂解不超过5min；
S4.加350μL Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12,000rpm离心10min；
S5.吸取步骤d中的离心上清并转移到制备管(置于2mL离心管中)，12,000rpm离心1min，弃滤液；
S6.将制备管置回离心管，加500μL Buffer W1，12,000rpm离心1min，弃滤液；
S7.将制备管置回离心管，加700μL Buffer W2，12,000rpm离心1min，弃滤液；再用700μL Buffer W2洗涤一次，弃滤液；
S8.将制备管置回2mL离心管中，12,000rpm离心1min；
S9.将制备管移入新的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加30μLEluent或去离子水，室温静置1min，12,000rpm离心1min。
对抽提的质粒进行双酶切鉴定，鉴定呈阳性的重组质粒送滁州通用生物技术有限公司测序。
如图2中a所示，经双酶切获得的Fc目的片段和pET-32a表达载体通过胶回收、连接及转化得到的单菌落，依次进行菌液PCR鉴定、质粒提取及双酶切鉴定，电泳结果显示片段大小为960bp，均与预期相符。重组质粒pET-32a-Fc测序结果与NCBI上传序列的同源性为99.79％。如图2中b所示，将已酶切的NDV-F目的片段和pET-32a表达载体，通过胶回收、连接及转化获得的单菌落，依次进行菌液PCR鉴定、质粒提取及双酶切鉴定，电泳结果显示片段大小为294bp，均与预期相符，测序结果显示序列与预期目标序列完全一致。
实施例3 pCold-TF-Ii-key-F-Fc重组质粒构建
将NDV-F基因和IgY Fc基因之间添加一段大小为36bp的Linker[(G4S)3]，Linker[(G4S)3]的序列为ACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC，应用Overlap PCR方法将F片段、Linker片段和Fc片段三者连接，NDV-F片段的上游引物(F-up)引物选用KpnI酶切位点，下游引物(F-down)引物插入Linker序列。Fc片段的上游引物(Fc-up)插入Linker序列，下游引物(Fc-down)选用HindIII酶切位点，引物设计见表4。
表4新型载体(Ii-key-Fc)相关引物
由于Ii-key片段较小，大小只有12bp，因此将这段序列直接设计在F基因上游引物上，选用Ii-key-F-F/Fc-down引物和pCold-TF-F-Fc质粒模板扩增Ii-key-F-Fc拼接基因。
扩增获得长度为1302bp的目的基因，将其与pCold-TF载体连接转化至BL21感受态细胞。经菌液PCR鉴定、质粒提取及双酶切鉴定，如图3所示，电泳结果显示与预期片段大小一致。菌液测序结果经比对与预期设计序列一致，表明pCold-TF-Ii-key-F-Fc重组质粒构建成功。
实施例4融合蛋白诱导表达及纯化
4.1融合蛋白最佳诱导剂浓度优化
挑取pCold-TF-Ii-key-F-Fc(已测序)的单菌落接种于含有50ug/mL浓度Amp+/LB液体培养基中，过夜培养。次日以1:100比例接种6组新的1mL Amp+/LB液体培养基中，37℃振荡培养4h后，其中一组作未加诱导剂的空白对照组，在剩余5组中加入不同终浓度的IPTG溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L)并做好标记，37℃振荡培养5h，收菌经SDS-PAGE凝胶电泳检测，确定诱导剂的最佳浓度。
如图4所示，SDS-PAGE电泳结果显示，当IPTG终浓度达到0.4mmol/L时，蛋白表达量并无明显增加，因此最佳诱导浓度为0.4mmol/L。
4.2融合蛋白表达形式鉴定
将过夜培养的pCold-TF-Ii-key-F-Fc重组菌，按照1:100的比例接种于100mL LB(Amp+)液体培养基，37℃180r/min培养至OD600＝0.4-0.5，立即将培养液至15℃30min。再加入最适IPTG浓度，15℃诱导表达24h。诱导结束后对菌液进行超声破碎，最后取20μL的上清液和沉淀重悬液进行检测，经SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达形式。
如图5所示，电泳结果显示，pCold-TF-Ii-key-F-Fc融合蛋白主存在上清中，主要以可溶性的形式进行表达，且组融合蛋白表达量较高。
4.3融合蛋白的大量表达及纯化
在已确定可溶性表达条件下诱导重组菌表达，离心收集沉淀，PBS重悬后，在冰水浴中超声破碎，超声处理完成后，4℃，8000rpm离心10min，收集上清。根据以下纯化步骤纯化收集His标签蛋白。
S1.取2mL His Ni2+亲和层析填料装入重力柱，使用dH2O洗去镍柱中20％乙醇，并用8个柱体积的结合缓冲液平衡重力柱。
S2.将3mL蛋白加入重力柱并用移液枪吹打混匀，低温振荡孵育1h，收集流川液，并用结合缓冲液洗涤，收集洗涤液。
S3.用500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱，收集4-5mL洗脱液，将所有收集的各缓冲液组分进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。
S4.将洗脱液收集于透析袋中，并置于透析液中，期间通过磁力搅拌器匀速缓慢搅动，每隔6-8h更换一次缓冲液，4℃梯度透析去除高浓度的盐及咪唑。透析彻底后4℃用蔗糖适度浓缩，按照BCA蛋白浓度试剂盒测定其浓度。
如图6所示，收集的洗脱液中在99.5kDa处检测到与目的蛋白相一致的条带，获得pCold-TF-Ii-key-F-Fc融合蛋白的可溶性表达。
实施例5多克隆抗体的制备及抗体效价检测
参考实施例3、4方法获得pCold-TF-F-Fc和pCold-TF-F融合蛋白作为对照。
5.1融合蛋白的Western blot鉴定
以纯化后的Ii-key-F-Fc、F-Fc、F融合蛋白作为抗原，分别用抗His标签及鼠抗F多克隆抗体一抗，HRP山羊抗鼠二抗进行Western blot检测。
如图7所示，DAB显色后，PVDF膜中只能看到相应的特异性蛋白条带，结果与SDS-PAGE凝胶检测到的蛋白条带分子量大小一致。因此多项结果表明，Ii-key-F-Fc、F-Fc、F融合蛋白具有良好的反应原性。
5.2融合蛋白跨越鸡呼吸道黏膜免疫屏障的检测
用生物素标记的融合蛋白滴鼻免疫7日龄的海兰褐蛋鸡，分为4个组，每组接种3只，每只接种剂量为200ug。8h后各组翅下静脉采血，分离血清，通过间接ELISA检测血清中生物素的OD值来间接检测融合蛋白的含量。
生物素标记方法：
S1.取2mg待标记蛋白溶解于1mL磷酸盐缓冲液中，将蛋白溶液加入超滤管中，并加入不超过超滤管最大体积的标记缓冲液，12,000rpm离心10min；可以重复此步骤多次；最后一次超滤完成，可以加入适量标记缓冲液调整抗体的浓度到2mg/mL左右；
S2.将试剂盒提前20min取出平衡至室温，用助溶剂将活性超级生物素配制成10mM；加入13.3μL溶解的活性生物素至上述超滤管中，并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光温育30min。
S3.12,000rpm离心10min，加入适量标记缓冲液至超滤管，并轻轻吹打混匀，12000rpm离心10min，重复此次步骤多次。
S4.收集超滤管中的溶液(即生物素标记的蛋白)，加入等体积保存液，-20℃保存。
如图8所示，通过检测发现Ii-key-F-Fc、F-Fc融合蛋白的含量与IgY阳性对照组差异不显著(P>0.05)，与F融合蛋白相比差异极显著(P<0.01)，表明Ii-key-F-Fc融合蛋白可以跨越鸡呼吸道黏膜免疫屏障进入血液。
5.3新型载体融合蛋白滴鼻免疫鸡的效果研究
5.3.1免疫程序
将88只7日龄海兰褐蛋鸡平均分为4组，每组22只，分组情况和免疫剂量如表6，并在7日龄、21日龄和35日龄进行三次免疫。
表6滴鼻免疫分组
5.3.2样品制备
1)血清制备
分别在免疫后的第2、3、4、5、6周，各组均提前断水断食8h，每组随机抽取3只鸡，进行翅静脉采血，分离血清，置于-20℃保存。
2)气管和肺脏冲洗液的制备
在免疫后的第3、4、5、6周，各组均提前断水断食8h，每组随机取3只，心脏采血处死，将其置于75％酒精中全身消毒数分钟。将鸡仰卧固定于解剖板上，使用无菌眼科镊和眼科剪剪开颈部皮肤，暴露气管并分离气管，喉头下方插入气管内，用1mL无菌PBS反复冲洗气管3次，所得冲洗液12,000rpm离心5min，-20℃保存。分离肺脏，放入10mL离心管中，加入2mL无菌PBS，用剪刀将肺脏剪碎，12,000rpm离心5min，所得上清液即为肺脏冲洗液，-20℃保存。
3)分离脾脏
将鸡脾脏完整取出，将其分成适当大小，置于通用型组织固定液中，-80℃保存备用。
5.3.3相关免疫指标检测
指标包括：
1)间接ELISA检测鸡血清特异性IgY抗体水平；
2)ELISA检测气管和肺脏冲洗液中特异性sIgA分泌水平；
3)血清中免疫因子IL-2、IL-4和IFN-γ的检测。
所有试验数据经Execl整理后，结果按照平均值(S)±标准差表示(SD，n＝3)，使用GraphPad Prism 9.0软件进行单因素方差分析，并对其显著性进行标注，无共同小写字母表示差异显著(P<0.05)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
结果如下：
如图11所示，以三种融合F结构域的蛋白首免14d后，各实验组开始产生特异性IgY抗体，加强免疫后，各实验组诱导产生的特异性IgY抗体水平呈上升趋势，在免疫后第35-42d，Ii-key-F-Fc滴鼻免疫组诱导的抗体水平达到最高，通过ELISA检测特异性IgY的抗体效价达到1:6400，而F-Fc、F滴鼻免疫组抗体效价分别为1:1600、1:800，表明新型载体(Ii-key-F-Fc)组能够刺激鸡产生更高的IgY抗体。统计分析发现，新型载体(Ii-key-F-Fc)组血清中抗NDV-F的IgY抗体水平要优于其他各组(P<0.05)，单载体(F-Fc)组与F抗原组相比IgY抗体水平差异显著(P<0.05)，各融合蛋白免疫组与PBS对照组相比，IgY抗体水平差异极显著(P<0.001)。
如图12中a所示，在免疫后第21d，可以在各免疫组气管冲洗液中检测到sIgA，且与PBS对照组相比差异显著(P﹤0.05)；加强免疫后，各免疫组sIgA抗体水平逐步升高，在35d达到最高，气管冲洗液中各组峰值点平均sIgA水平为：F组：1811.09ng/mL；F-Fc组：1960.83ng/mL；Ii-key-F-Fc组：2400.39ng/mL。统计分析发现，在检测的任一时间点，新型载体(Ii-key-F-Fc)组sIgA水平均高于其他组(P<0.05)；在免疫后第21d和第35d，单载体(F-Fc)组sIgA抗体水平与F抗原组无统计学意义，其余时间点单载体(F-Fc)组sIgA抗体水平与F抗原组相比差异显著(P<0.05)，且各融合蛋白免疫组与PBS对照组相比差异极其显著(P<0.001)。
如图12中b所示，肺脏冲洗液中sIgA抗体水平于免疫后第35d达到最高，各组峰值点平均sIgA含量分别为：F组：1980.59ng/mL；F-Fc组：2102.05ng/mL；Ii-key-F-Fc组：2265.19ng/mL。统计分析发现，在免疫后第28d-35d，新型载体组(Ii-key-F-Fc)肺脏冲洗液中sIgA水平均高于单载体组(F-Fc)(P<0.05)和F抗原组(P<0.01)，单载体(F-Fc)组sIgA水平与F抗原组相比差异极显著(P<0.01)。各融合蛋白免疫组sIgA抗体水平与PBS对照组相比差异显著(P<0.05)。
如图13中a所示，IFN-γ平均检测量在免疫后第28-35d达到最高值，新型载体组(Ii-key-F-Fc)血清中IFN-γ最高水平为875.34pg/mL，单载组(F-Fc)的含量为802.47pg/mL，两组之间差异极显著(P﹤0.01)；F抗原组IFN-γ最高值为692.58pg/mL，新型载体组与F抗原组差异极显著(P<0.01)；免疫后同一检测时间点，新型载体组(Ii-key-F-Fc)中IFN-γ检测量均高于其它免疫组(P<0.05)，单载体组(F-Fc)IFN-γ平均检测量与F抗原组相比差异显著(P<0.05)，各免疫组IFN-γ检测量与PBS对照组相比差异显著(P<0.05)。
如图13中b所示，在免疫后第28-35d各免疫组血清中IL-2含量达到最高，新型载体组(Ii-key-F-Fc)血清中IL-2最高水平为266.37pg/mL，单载组(F-Fc)的含量为246.53pg/mL，F抗原组最高含量为229.87pg/mL。统计分析发现，除免疫后第21d，Ii-key-F-Fc组IL-2水平与单载体组无统计学意义，其余时间点均显著高于其他免疫组(P<0.01)，单载体组(F-Fc)与F抗原组差异显著(P<0.01)，各融合蛋白免疫组IL-2平均检测量均高于对照组(P<0.01)。
如图13中c所示，IL-4平均检测量在免疫后第28-35d达到最高值，新型载体组(Ii-key-F-Fc)血清中IL-4最高水平为116.07pg/mL，单载组(F-Fc)的含量为93.92pg/mL，两组之间差异极显著(P﹤0.05)；F抗原组IL-4最高值为78.04pg/mL，与新型载体组差异极其显著(P<0.0001)，各免疫组IL-4平均检测量均高于PBS对照组(P<0.001)。
5.3.4免疫相关基因的表达
为了进一步评估新型载体的免疫增强作用，在免疫后采用RT-qPCR技术检测免疫相关基因在鸡脾脏中的表达水平。检测的相关基因是主要组织相容性复合体MHCIα类、MHCIIβ类、核因子-kB(NF-kB)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。
结果如图14所示：由图14中a可知，在第42d，MHCIα转录水平达到最高，且新型载体组(Ii-key-F-Fc)与单载体组(F-Fc)差异极显著(P<0.001)，各免疫组与对照组相比差异极其显著(P<0.0001)；由图14中b可知，在第42d，MHCIIβ转录水平达到最高值，且在任何一个检测时间点新型载体组(Ii-key-F-Fc)MHCIIβ转录水平均与其他组差异极显著(P<0.01)；图14中c可知，在检测的任何一个时间点，新型载体组(Ii-key-F-Fc)NF-kB基因转录水平与其他组相比差异极显著(P<0.0001)；由图14中d可知，在检测的任何一个时间点，新型载体组(Ii-key-F-Fc)TNF-α转录水平与其它组相比差异极显著(P<0.001)，且与NF-kB基因转录水平检测结果相一致。
通过上述分析说明，Ii-key-F-Fc组抗原对机体的刺激强于F-Fc组和F组，F-Fc组强于F组。因此，新型载体(Fc-Ii-key)抗原组对机体刺激效果强于单载体(Fc)，单载体(Fc)对机体的免疫强度优于“裸”F抗原肽。
以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案，而并非对本发明的限制；尽管参照前述实施方式对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：凡在本发明创造的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种增强新城疫病毒免疫效果的抗原，其特征在于，该抗原是由Ii-key-F-Fc重组载体经工程菌表达获得的融合蛋白，命名为Ii-key-F-Fc融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；
所述Ii-key-F-Fc重组载体由NDV F蛋白上三个主要抗原表位片段拼接后再与鸡IgYFc、Ii-key分别串联获得，Ii-key-F-Fc重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述NDV F蛋白为新城疫病毒细胞膜上的表面糖蛋白，所述三个主要抗原表位片段分别位于NDVF蛋白第72、161和343片段处，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。
2.如权利要求1所述的一种增强新城疫病毒免疫效果的抗原，其特征在于，所述NDV F蛋白上三个主要抗原表位片段拼接后产物为抗原表位组合肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。
3.一种如权利要求1所述的增强新城疫病毒免疫效果的抗原的制备方法，包括以下步骤：
S1.酶切获得鸡的IgY Fc基因以及NDV F蛋白的三个主要抗原表位片段，将NDV F蛋白的三个主要抗原表位片段连接形成抗原表位组合肽，抗原表位组合肽命名为F片段，将所述F片段分别与IgY Fc、恒定链功能性片段Ii-key串联获得目的基因片段；
S2.目的基因片段连接到pCold-TF原核表达载体上后，将Ii-key-F-Fc重组载体转化进感受态细胞BL21中，利用感受态细胞表达Ii-key-F-Fc融合蛋白，该Ii-key-F-Fc融合蛋白为增强新城疫病毒免疫效果的抗原。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，提取鸡巨噬细胞RNA，反转录获得cDNA，以cFc-F/cFc-R为引物，扩增IgY Fc基因；以pcDNA3-F质粒为模板，分别以引物对NDV-F-F1/NDV-F-R1、NDV-F-F2/NDV-F-R2、NDV-F-F3/NDV-F-R3扩增含有NDV主要抗原表位的第72、161和343基因片段，最后以前3个PCR产物为模板，引物对NDV-F-F/NDV-F-R扩增抗原表位组合肽；
所述cFc-F/cFc-R序列如SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8所示，所述NDV-F-F1/NDV-F-R1序列如SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10所示，所述NDV-F-F2/NDV-F-R2序列如SEQ ID NO.11/SEQID NO.12所示，所述NDV-F-F3/NDV-F-R3序列如SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14所示，所述NDV-F-F/NDV-F-R序列如SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16所示。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，通过Overlap PCR方法将所述F片段、恒定链活性片段Ii-key、IgY Fc片段连接，其中F片段的上游引物F-up选用KpnI酶切位点，下游引物F-down插入Linker序列；Fc片段的上游引物Fc-up插入Linker序列，下游引物Fc-down选用HindIII酶切位点；
所述F-up序列如SEQ ID NO.17所示，F-down序列如SEQ ID NO.18所示，Fc-up序列如SEQ ID NO.19所示，Fc-down序列如SEQ ID NO.20所示，所述Linker序列如SEQ ID NO.21所示。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，利用感受态细胞表达Ii-key-F-Fc融合蛋白的具体操作为：挑取Ii-key-F-Fc阳性单克隆，接种于含50ug/mL Amp+/LB液体培养基中，在37℃，IPTG终浓度为0.4mmol/L下，15℃诱导表达24h。
7.如权利要求3或6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中获得的Ii-key-F-Fc融合蛋白，包括纯化步骤，具体为：对表达后的融合蛋白进行超声破碎，离心收集上清液，上清液继续通过镍离子亲和层析法收集洗脱液，得到纯化后的Ii-key-F-Fc融合蛋白，该Ii-key-F-Fc融合蛋白为增强新城疫病毒免疫效果的抗原。
8.一种增强新城疫病毒免疫效果的抗原在制备新城疫疫苗中的应用，所述增强新城疫病毒免疫效果的抗原为如权利要求1所述的Ii-key-F-Fc融合蛋白。
9.一种提供或增强机体对新城疫病毒免疫力的制剂，其特征在于，所述制剂包含有效剂量的如权利要求1所述的Ii-key-F-Fc融合蛋白，该Ii-key-F-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
10.如权利要求8所述的制剂，其特征在于，所述制剂为液体制剂或喷雾剂。
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