CN115975865A - 抗原载体菌株及在制备金黄色葡萄球菌口服疫苗中的应用 - Google Patents
抗原载体菌株及在制备金黄色葡萄球菌口服疫苗中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115975865A CN115975865A CN202211379199.4A CN202211379199A CN115975865A CN 115975865 A CN115975865 A CN 115975865A CN 202211379199 A CN202211379199 A CN 202211379199A CN 115975865 A CN115975865 A CN 115975865A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- recombinant
- strain
- staphylococcus aureus
- mntc
- isdb
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种抗原载体菌株、重组菌株及其在制备金黄色葡萄球口服疫苗中的应用，菌株为LR076，于2022年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25845，保藏地址为.北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为Limosilactobacillus reuteri；重组菌株由携带有外源金黄色葡萄球菌抗原片段的重组质粒转化至LR076菌株中形成；所述抗原片段包括HlaH35L、IsdB、MntC，分别如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.3所示。将重组菌株应用于制备金黄色葡萄球菌口服疫苗中，能有效缓解感染后肺脏的病变及减少金黄色葡萄球菌在肺脏的定值量。
Description
技术领域
本发明涉及金黄色葡萄球菌口服疫苗技术领域，更具体地说是涉及抗原载体菌株及在制备金黄色葡萄球菌口服疫苗中的应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)是全世界范围内最常见的人兽共患的病原体之一，其导致人类感染的疾病范围很广，包括肺炎在内的侵袭性感染是全球严重疾病和死亡的主要原因。随着多重耐药细菌所致感染的涌现及其引发疾病死亡率的逐年攀升，安全有效的S.aureus疫苗研发刻不容缓，而其疫苗研发均在临床试验阶段以失败而告终。基于对S.aureus免疫逃逸机制的认识，S.aureus疫苗在临床阶段失败的原因可能在于并没有将重点放在疫苗对细胞免疫和黏膜免疫的激活，而是专注于开发基于体液免疫应答的疫苗。越来越多的研究表明，基于活菌载体及纳米递送颗粒的黏膜疫苗可能是未来S.aureus疫苗研发的理想方向。
黏膜是人体和动物体中表面积最大的组织器官，包括消化道、呼吸道、泌尿生殖道等。黏膜表面与外界(如环境、食物、共生菌和病原菌等)直接接触，因此作为第一道防线在抗感染中发挥极其重要的作用。目前，大多数病原微生物与黏膜表面接触从而侵入机体，传统的全身性疫苗通常由皮下注射，不能诱导抗原特异性黏膜应答，无法防止上皮表面的致病性侵袭，而黏膜疫苗不仅能诱导黏膜免疫应答，还能诱导全身免疫应答，且能在病原体入侵的早期阶段发挥免疫保护作用，有效克服现有疫苗的局限性。使用合适的递送载体将抗原稳定递送至特定黏膜免疫诱导部位，能同时诱导黏膜和系统免疫反应，从而能达到针对黏膜侵袭性病原体的双层保护的效果。
乳酸菌作为极具发展潜力的呈递载体，在用于向黏膜呈递各种治疗性和预防性分子中表现出诸多优点。首先是通过口服途径免疫，使用方便，安全性好、最大限度地减少由肌肉内或静脉内注射带来的副作用和疼痛，还能减少污染。其次，不需要纯化表达的蛋白，产能迅速，蛋白产物中也不会混杂内毒素。另外，许多乳酸菌菌株特别是乳酸杆菌，在动物或人体内能够耐受极端的胃肠道环境(例如降解酶和极端pH环境等)，并且具有很强的黏附定植能力，利于长期投递药物分子。最重要的是，乳酸菌本身具有益生特性和佐剂特性，在更安全的同时，能保护抗原不被降解，延长抗原在黏膜位点的留存时间，促进外源蛋白向吞噬细胞的递呈。以乳酸菌为活菌载体开发的新型S.aureus黏膜疫苗是研究者们初涉的领域，并且越来越受到关注
因此，如何提供一种可以作为活菌载体的乳酸杆菌是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种抗原载体菌株及在制备金黄色葡萄球菌口服疫苗中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种抗原载体菌株，所述菌株为LR076，于2022年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25845，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为Limosilactob acillus reuteri。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株由携带有外源金黄色葡萄球菌抗原片段的重组质粒转化至LR076菌株中形成；所述抗原片段包括HlaH35L、IsdB、MntC，分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示。
作为上述技术方案优选的技术方案，重组质粒包括pNZ8148-sp-His-hlaH35L、pNZ8148-sp-His-isdB或pNZ8148-sp-His-mntC。
作为上述技术方案优选的技术方案，所述重组质粒的构建方法包括：
1)选择短小乳杆菌S层信号肽Sp和His标签，通过GenBank获得金黄色葡萄球菌hlaH35L、isdB、mntC全序列，根据L.reuteri的密码子偏好进行序列优化，Sp、His标签和抗原优化后的序列合成后连接到克隆载体pUC57-Si mple上；
2)经过双酶切、胶回收、连接、转化将hlaH35L、isdB或mntC连接到表达载体pNZ8148上，构建重组质粒。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的菌株在制备金黄色葡萄球菌口服疫苗中的应用。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的重组菌株在制备金黄色葡萄球菌口服疫苗中的应用。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的重组菌株制备得到的疫苗对小鼠进行免疫的方法，其特征在于，过程包括：对重组菌株进行活化，得到菌液，然后第1、15和29d使用菌液对小鼠灌胃处理。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明以L.reuteri LR076作为受体菌株，利用乳酸杆菌表面展示系统和诱导型启动子PnisA，构建了递送金黄色葡萄球菌抗原HlaH35L、IsdB、MntC的重组L.reuteri LR076(pNZ8148-sp-His-hlaH35L)、LR076(pNZ8148-sp-His-isdB)、LR076(pNZ8148-sp-His-mnt C)。重组L.reuteri的生理特性与野生菌无明显差异，重组质粒能稳定遗传，外源蛋白也能成功表达。重组L.reuteri LR076(pNZ8148-sp-His-hlaH35L)、LR076(pNZ8148-sp-His-isdB)、LR076(pNZ8148-sp-His-mntC)经过口服免疫小鼠后，血清中IgG和黏膜中sIgA水平均显著升高，且黏膜组织中的细胞因子IL-17和IFN-γ显著上调，三株重组菌对小鼠金葡菌肺炎感染均有不同程度的保护作用，能有效缓解感染后肺脏的病变及减少金黄色葡萄球菌在肺脏的定值量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为重组L.reuteri PCR鉴定结果图；A:M：Trans2K DNA Ma rker；1：LR076(pNZ8148-sp-His-hlaH35L)菌落PCR结果；B:M：Trans2K DN A Marker；1：LR076(pNZ8148-sp-His-isdB)菌落PCR结果；C:M：Trans2KDNA Marker；1：LR076(pNZ8148-sp-His-mntC)菌落PCR结果；
图2附图为重组L.reuteri Western blotting鉴定图；
图3附图为重组L.reuteri生长曲线图；
图4附图为重组L.reuteri耐受人工胃液的测定结果图；
图5附图为重组L.reuteri耐受含胆盐的人工肠液的测定结果图；
图6附图为重组L.reuteri遗传稳定性测定结果图；A:M：Trans8K DN A Marker；1-5：LR076(pNZ8148-sp-His-hlaH35L)第1、5、10、15、20代质粒提取结果；6-10：LR076(pNZ8148-sp-His-mntC)第1、5、10、15、20代质粒提取结果；B:M：Trans8K DNA Marker；1-5：LR076(pNZ8148-sp-His-isdB)第1、5、10、15、20代质粒提取结果；
图7附图为重组菌免疫后小鼠肺泡灌洗液中特异性抗体水平定量结果图；
图8附图为重组菌免疫后小鼠小肠黏膜中特异性抗体水平定量结果图；
图9附图为重组菌免疫后小鼠小肠粪便中特异性抗体水平定量结果图；
图10附图为重组菌免疫后小鼠肺脏、脾脏和Peyer's Patches组织中细胞因子IL-17水平定量结果图；A:小鼠肺脏中细胞因子IL-17水平；B:小鼠脾脏中细胞因子IL-17水平；
图11附图为重组菌免疫后小鼠肺脏、脾脏和Peyer's Patches组织中细胞因子IFN-γ水平定量结果图；A:小鼠肺脏中细胞因子IFN-γ水平；B:小鼠脾脏中细胞因子IFN-γ水平；C:小鼠Peyer's Patches中细胞因子IFN-γ水平；
图12附图为小鼠口服免疫重组菌后在金黄色葡萄球菌肺炎模型中存活率的统计图；
图13附图为金黄色葡萄球菌感染后小鼠肺脏组织病理切片图；A：
组肺脏病理切片，B：PBS组肺脏病理切片，C：LR076(pNZ8148)组肺脏病理切片，D：LR076(pNZ8148-sp-His-isdB)组肺脏病理切片，E：LR076(pNZ8148-sp-His-mntC)组肺脏病理切片，F：LR076(pNZ8148-sp-His-hlaH35L)组肺脏病理切片；
图14附图为金黄色葡萄球菌感染后小鼠肺脏载菌量的测定结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中用到的菌株为LR076，于2022年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25845，保藏地址为.北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为Limosilactobacillus reuteri。
实施例1重组乳酸杆菌的构建
选择短小乳杆菌S层信号肽Sp和His标签，通过GenBank获得金黄色葡萄球菌hlaH35L、isdB、mntC所示全序列，根据L.reuteri LR076的密码子偏好进行序列优化，Sp、His标签和抗原优化后的序列hlaH35L，如SEQ ID NO.1所示、isdB，如SEQ ID NO.2所示、mntC，如SEQ ID NO.3所示合成后连接到克隆载体pUC57-Simple上，经过双酶切、胶回收、连接、转化将hlaH35L、isdB、mntC连接到表达载体pNZ8148上，分别构建重组质粒，然后将重组质粒电转至L.reuteri LR076中，分别构建重组L.reuteri，NisinA诱导表达后获得能够稳定表达hlaH35L、isdB、mntC的重组L.reuteri LR076(pNZ8148-sp-His-hlaH35L)、LR076(pNZ8148-sp-His-isdB)、LR076(pNZ8148-sp-His-mntC)。
实验过程中需要的菌株和质粒：Top10(pUC57-hlaH35L)、Top10(pUC57-isdB)、Top10(pUC57-mntC)、pNZ8148
具体过程为：
1)含密码子优化后重组质粒pUC57-hlaH35L、pUC57-isdB、pUC57-mntC的提取：将携带重组质粒的大肠杆菌Top10(pUC57-hlaH35L.)、Top10(pUC57-is dB)、Top10(pUC57-mntC)菌株活化后，根据北京全式金质粒小提试剂盒说明书提取重组质粒pUC57-hlaH35L、pUC57-isdB、pUC57-mntC。结束后用分光光度法测定产物浓度，质粒DNA保存在-20℃
2)重组质粒pNZ8148-sp-His-isdB、pNZ8148-sp-His-hlaH35L、pNZ8148-sp-His-mntC的构建
将乳酸乳球菌表达载体pNZ8148与重组质粒分别进行Pst I、Kpn I/Hind III双酶切反应。酶切体系：重组质粒≤2μg、10×FlyCut Buffer 5μL、FlyC ut Pst I 1.5μL、FlyCut Kpn I/Hind III 1.5μL、超纯水补足至50μL，37℃温育20min，反应结束后，使用上样缓冲液(10×DNA Loading Buffer)沉降酶切产物。
酶切产物电泳分析及胶回收：用1％琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。将电泳后的凝胶置于紫外灯下，切下目的条带所在位置的凝胶，用EasyPure Quic k GelExtraction Kit回收双酶切产物。
连接反应：将上述pNZ8148双酶切胶回收产物分别与pUC57-hlaH35L、pUC57-isdB、pUC57-mntC胶回收产物进行连接。连接操作按照T4 DNA Ligase试剂盒说明书。连接体系：pNZ8148双酶切胶回收产物1μL、pUC57-hlaH35L/isdB/mntC胶回收产物6μL、5×T4 DNALigase Buffer 2μL、T4DNA Ligase 1μL，混匀后，置于PCR仪中控温，25℃反应2h。
连接产物的转化：将上述连接产物转化至50μL E.coli DH5α感受态细胞中，冰浴30min。42℃水浴45s后继续冰浴2min。加入940μl LB液体培养基，37℃，200r/min复苏1h后取100μL涂布于LB(Cm+)平板上，37℃培养过夜。
阳性克隆的筛选与鉴定：挑取平板上白色单菌落培养进行阳性克隆的筛选及鉴定，按照北京全式金质粒小提试剂盒说明书提取重组质粒pNZ8148-sp-His-hlaH35L、pNZ8148-sp-His-isdB、pNZ8148-sp-His-mntC进行Pst I和Kpn I/Hind III双酶切鉴定，双酶切体系及反应如前。重组质粒双酶切结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。
3)重组L.reuteri的构建
提取重组质粒：乳酸杆菌细胞壁较厚，电转化时外源DNA进入胞内的效率很低，除了优化电转化的条件提高转化效率，还需要提取大量的质粒重复转化实验。因此根据Omega质粒中提试剂盒说明书操作。结束后用分光光度法测定产物浓度，质粒DNA保存在-20℃。
L.reuteri LR076感受态的制备：MRS平板上各挑取一个野生型L.reute riLR076的单菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃过夜培养；将L.reuteri LR076的过夜培养物按1％接种量接种于弱化细胞壁结构培养基R(MRS肉汤中加入1％甘氨酸，完全溶解后，0.22μm滤膜过滤除菌)中，稀释至600nm处的光密度值为0.2A(OD 600＝0.2A)；将上述培养液在37℃静止培养至OD600＝0.5A，4℃，离心10min，5000r/min收集细胞；用3mL预冷的无菌超纯水洗涤细胞两次，再用3mL洗涤缓冲液(10％甘油)洗涤细胞一次；用洗涤缓冲液重悬细胞至初始体积的百分之一；将细胞悬液按每份200μL分装于无菌冷却的冻存管中，储存在-80℃备用。
重组质粒电转至L.reuteri LR076感受态细胞：从-80℃冰箱中取L.reuteriLR076的感受态，冰上融化；向细胞悬液中加入2-3μg的重组质粒或空载体，冰上放置10min；将溶液转移到预冷的2mm电击杯中，放入电激槽中；调节电极仪，设置点击条件为1.9-2.2kV、25μF、200Ω，电脉冲时间为4-5ms；电击结束后，尽快加入1mL再生液体培养基R(MRS肉汤中加入0.5mol/L蔗糖，2mmol/L CaCl2和20mmol/L MgCl2，完全溶解后，0.22μm滤膜过滤除菌)，轻击混均后转移到1.5mL的无菌离心管中，37℃静止培养2.5-3h；取200μL复苏后菌液，涂布于MRS培养基平板上，37℃倒置培养3d，筛选转化子。
转化子的筛选：从转化的平板中，随机挑取多个转化子在MRS液体培养基进行培养。取少量菌液进行离心收集菌体，取少量菌体加入10μL最佳伴侣，100℃金属浴处理10min，离心取上清作为模板，菌液PCR扩增目的基因进行检测，PCR体系Template DNA 1-2μL，2×M5 Hiper超光速mix(withblue dye)10μL，Primer 1(10μM)0.5μL、Primer 2(10μM)0.5μL，Nuclease-free ddH2O补足至20μL。反应条件：95℃3min、32-36cycles of(94℃25sec、55-64℃25sec、72℃30-60sec/kb DNA)、72℃5min、4℃forever，引物为P15'-GTCGATAACGCGAGCATAATAAA-3'和P2
5'-TTTGGCTATCAATCAAAGCAACA-3'。PCR结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。见图1。
重组L.reuteri的诱导表达：在固体平板上挑单克隆菌落加入到MRS液体培养基中，37℃静止培养过夜；将重组L.reuteri的过夜培养物按2％接种量转移到45mL含有25μg/mL氯霉素的MRS液体培养基中，37℃静止培养到OD600达到0.7A；向重组L.reuteri中加入终浓度为5-10ng/mL的Nisin A，继续静止培养6h。
样品准备：取40mL菌液在6000r/min，4℃离心8min，吸取上清于另一管，向其中加入4g三氯乙酸混均后放4℃冰箱中过夜；表达菌体用超纯水洗涤3次；用1/20培养基体积的PBS(含有Lysozyme)重悬菌体，37℃孵育40min；置于冰上超声波处理20min；分别吸取适量溶菌悬液及溶菌上清，加入等体积的6×Protein Loading Buffer，金属浴煮沸10min；蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，以溶菌上清为对照。
SDS-PAGE蛋白电泳：将7.5mL的丙烯酰胺凝胶溶液(12％分离胶)混匀后转移至制胶板上两块玻璃板之间，蒸馏水滴注在分离胶上层，静置1.5h；用滤纸吸干蒸馏水，将2.5mL丙烯酰胺凝胶溶液(5％浓缩胶)混匀后转移至分离胶上层，轻缓地水平插入梳子，静置1h，水平取出梳子；取35μL准备的蛋白样品，加入胶孔中；接上电极，设置电泳仪电压为90V运行2.5h。
Westernblotting蛋白鉴定：取下玻璃板之间的凝胶，整体转移至电泳转移缓冲液(1×TransferBuffer)中浸泡40min；将PVDF膜在甲醇溶液中处理15s后，转移到双蒸水中漂洗10min，然后将PVDF膜和两块海绵浸泡在电泳转移缓冲液中30min；按照半干法转膜装置，即：(－)-海绵-PVDF膜-凝胶-海绵-(+)组合后，设置转膜仪电压为25V运行45min；将转印后的PVDF膜转移至5％封闭液中，25℃振荡孵育1-2h，1×TBST Buffer漂洗PVDF膜；将转印后的PVDF膜转移至一抗溶液中，4℃振荡孵育过夜，1×TBST Buffer漂洗PVDF膜；将转印后的PVDF膜转移至二抗溶液中，25℃振荡孵育1h，1×TBST Buffer漂洗PVDF膜；ECL混合溶液检测蛋白目的条带，见图2。
实施例2重组L.reuteri的生理特性及遗传稳定性分析
重组L.reuteri的生长曲线
活化重组L.reuteri及野生菌株：将活化后的菌液稀释到OD600＝0.02，以1％(v/v)的接种量接种于96孔板中，每孔加入200μL MRS液体培养基(Cm+/-)。用生长曲线测定仪检测，绘制生长曲线，见图3。
重组L.reuteri耐受人工胃液的测定
活化重组L.reuteri及野生菌株。培养液离心收集细菌，灭菌PBS重悬制备菌悬液，以1:9的比例加入到人工胃液中，混均，37℃厌氧静止培养。分别在0h和3h吸取培养液涂布于MRS平板(Cm+/-)上，设置三个平行，37℃厌氧静止培养48h，计乳酸菌菌落总数，统计生存率。见图4。
生存率(％)＝(3h平板上的菌落数/0h平板上的菌落数)×100％
重组L.reuteri耐受含胆盐的人工肠液的测定
活化重组L.reuteri及野生菌株。以1:25的比例将培养液加入到含胆盐的人工肠液中，37℃厌氧静止培养。分别在0h和24h吸取培养液涂布于MRS平板(Cm+/-)上，设置三个平行，37℃厌氧静止培养48h，计乳酸菌菌落总数，统计生存率。见图5。
生存率(％)＝(24h平板上的菌落数/0h平板上的菌落数)×100％
遗传稳定性
活化重组L.reuteri及野生菌株。以1:100的比例将重组L.reuteri及野生菌株分别加入到10mL MRS液体培养基(Cm+/-)中连续传代培养20天，每天传一代，每天提取质粒通过PCR法检测各株重组菌中的重组质粒是否稳定遗传。取第10天和第20天重组菌质粒PCR鉴定结果为代表进行作图，见图6。
实施例3重组L.reuteri黏膜疫苗免疫原性的检测
L.reuteri LR076(pNZ8148-sp-His-isdB)、LR076(pNZ8148-sp-His-hlaH35L)、LR076(pNZ8148-sp-His-mntC)是实验组，空载菌LR076(pNZ8148)是阴性对照组；
疫苗的制备及灌服剂量的确定：取储存在-80℃冰箱的重组L.reuteri LR076(pNZ8148-sp-His-isdB)、LR076(pNZ8148-sp-His-hlaH35L)、LR076(pNZ8148-sp-His-mntC)和空载菌LR076(pNZ8148)在MRS平板(Cm+)上划线活化，挑单克隆菌落加入到液体培养基(Cm+)中，培养液按4％的接种量加入到10mL MRS液体培养基(Cm+)中，无氧静止培养至600nm处的光密度在0.6～0.8之间时加入NisinA，其终浓度为5-10ng/mL。继续培养6h，离心收集细菌，用灭菌PBS调整细菌浓度，通过灌服的免疫方式对小鼠进行给药。将培养液稀释至10-7-10-9，取100μL涂布于MRS平板(Cm+)上，37℃厌氧培养48h，计乳酸菌菌落总数。
免疫策略及样品采集：所有小鼠均通过口服免疫200μL，共三次，在第1、15和29天使用重组乳酸杆菌疫苗，灌胃剂量为1.0×109-1011CFU/mL。对照组的小鼠以相同的方式单独给予PBS。分别于第二次、第三次免疫后第7天小鼠眼眶取血一次，3000r/min离心15min，ELISA法对血清中抗体水平进行定量；分别对第二次、第三次免疫后第7天处死小鼠，取小鼠肺泡灌洗液，小肠黏膜和小肠粪便，0.1g样品用1mL PBS重悬，3000r/min离心10min，ELISA法对样品中抗体水平进行定量；于第三次免疫后第7天，处死小鼠，取小鼠肺脏、脾脏和Peyer's Patches，研磨离心取上清，ELISA法对样品中细胞因子IL-17和IFN-γ的水平进行定量。
小鼠肺泡灌洗液中金黄色葡萄球菌抗原特异性sIgA抗体定量：采用间接ELISA法分别对第二次、第三次免疫后第7天的小鼠肺泡灌洗液上清中金黄色葡萄球菌蛋白抗原IsdB、MntC和HlaH35L特异性sIgA抗体水平进行定量。加样时肺泡灌洗液上清以1:80的比例稀释。抗体水平均表示为OD值。图7显示重组菌引起小鼠肺泡灌洗液中抗原特异性sIgA抗体水平。小鼠口服免疫PBS、LR076(pNZ8148)和重组菌株LR076(pNZ8148-sp-His-hlaH35L)、LR076(pNZ8148-sp-His-isdB)、LR076(pNZ8148-sp-His-mntC)后第7天，取小鼠肺泡灌洗液，测定sIgA水平。图A显示肺泡灌洗液中hlaH35L特异性sIgA抗体水平；图B显示肺泡灌洗液中isdB特异性sIgA抗体水平；图C显示肺泡灌洗液中mntC特异性sIgA抗体水平。
小鼠小肠黏膜中金黄色葡萄球菌抗原特异性sIgA抗体定量：采用间接ELISA法分别对第二次、第三次免疫后第7天的小鼠小肠黏膜上清中金黄色葡萄球菌蛋白抗原isdB、mntC和HlaH35L特异性sIgA抗体水平进行定量。加样时小肠黏膜上清以1:80的比例稀释。图8显示重组菌引起小鼠小肠黏膜中抗原特异性sIgA抗体水平。小鼠口服免疫PBS、LR076(pNZ8148)和重组菌株LR076(pNZ8148-sp-His-hlaH35L)、LR076(pNZ8148-sp-His-isdB)、LR076(pNZ8148-sp-His-mntC)后第7天，取小鼠小肠黏膜，测定sIgA水平。图A显示小肠黏膜中hlaH35L特异性sIgA抗体水平；图B显示小肠黏膜中isdB特异性sIgA抗体水平；图C显示小肠黏膜中mntC特异性sIgA抗体水平。
小鼠小肠粪便中金黄色葡萄球菌抗原特异性sIgA抗体定量：采用间接ELISA法分别对第二次、第三次免疫后第7天的小鼠小肠粪便上清中金黄色葡萄球菌蛋白抗原IsdB、MntC和HlaH35L特异性sIgA抗体水平进行定量。加样时小肠粪便上清以1:80的比例稀释。图9显示重组菌引起小鼠小肠粪便中抗原特异性sIgA抗体水平。小鼠口服免疫PBS、LR076(pNZ8148)和重组菌株LR076(pNZ8148-sp-His-hlaH35L)、LR076(pNZ8148-sp-His-isdB)、LR076(pNZ8148-sp-His-mntC)后第7天，取小鼠小肠粪便，测定sIgA水平。图A显示小肠粪便中hlaH35L特异性sIgA抗体水平；图B显示小肠粪便中isdB特异性sIgA抗体水平；图C显示小肠粪便中mntC特异性sIgA抗体水平。
小鼠肺脏、脾脏和Peyer's Patches组织中细胞因子IL-17水平定量：测定第三次免疫后第7天小鼠肺脏、脾脏和Peyer's Patches组织上清中细胞因子IL-17水平。按照小鼠IL-17ELISA试剂盒说明书对组织中细胞因子IL-17水平进行定量。用ELISA自动读数仪测量在450nm处的组织中IL-17光密度值。图10显示重组菌引起小鼠肺脏、脾脏和Peyer'sPatches中IL-17水平。小鼠口服免疫PBS、LR076(pNZ8148)和重组菌株LR076(pNZ8148-sp-His-hlaH35L)、LR076(pNZ8148-sp-His-isdB)、LR076(pNZ8148-sp-His-mntC)后第7天，取小鼠肺脏、脾脏和Peyer's Patches，测定IL-17水平。图A显示肺脏中IL-17水平；图B显示脾脏中IL-17水平；图C显示Peyer's Patches中IL-17水平。
小鼠肺脏、脾脏和Peyer's Patches组织中细胞因子IFN-γ水平定量：测定第三次免疫后第7天小鼠肺脏、脾脏和Peyer's Patches组织上清中细胞因子IFN-γ水平。按照试剂盒说明书对组织中细胞因子IFN-γ水平进行定量。用ELISA自动读数仪测量在450nm处的组织中IFN-γ光密度值。图11显示重组菌引起小鼠肺脏、脾脏和Peyer's Patches中IFN-γ水平。小鼠口服免疫PBS、LR076(pNZ8148)和重组菌株LR076(pNZ8148-sp-His-hlaH35L)、LR076(pNZ8148-sp-His-isdB)、LR076(pNZ8148-sp-His-mntC)后第7天，取小鼠肺脏、脾脏和Peyer's Patches，测定IFN-γ水平。图A显示肺脏中IFN-γ水平；图B显示脾脏中IFN-γ水平；图C显示Peyer's Patches中IFN-γ水平。
实施例4重组L.reuteri在金黄色葡萄球菌引发的小鼠肺炎模型中的保护作用探究
建立小鼠肺炎模型：按照前面所述的策略免疫小鼠，第36天给小鼠滴鼻感染金黄色葡萄球菌建立肺炎模型。具体步骤如下：
LB液体培养基中培养金黄色葡萄球菌，灭菌PBS调整细菌浓度为5×1010-1011CFU/mL。麻醉剂使用4％的水合氯醛，小鼠腹腔注射160μL，然后将40μL金黄色葡萄球菌悬浮液缓慢滴入小鼠左鼻孔中，小鼠以仰卧位的姿势放回笼中。
统计小鼠生存率：金黄色葡萄球菌感染各组小鼠(10只/组)后72h，观察并连续纪录所有小鼠的死亡情况，统计生存率。图12显示重组菌有效保护小鼠免受金黄色葡萄球菌引起的肺炎。重组菌
LR076(pNZ8148-sp-His-hlaH35L)、LR076(pNZ8148-sp-His-isdB)及LR076(pNZ8148-sp-His-mntC)组小鼠的存活率分别为70％、60％、50％，空载菌LR076(pNZ8148)及PBS组存活率为10％、0％。
小鼠肺脏组织病理学分析：攻毒24h后处死各组小鼠(3只/组)，取完整的左肺放入4％多聚甲醛中，用于组织病理学分析。图13显示重组菌可以有效缓解金黄色葡萄球菌感染后的肺脏病变。小鼠感染金黄色葡萄球菌后24h，取小鼠左肺，HE染色。A为
组、B组为PBS组、C为LR076(pNZ8148)组、D为LR076(pNZ8148-sp-His-isdB)组、E为LR076(pNZ8148-sp-His-mntC)组、F为LR076(pNZ8148-sp-His-hlaH35L)组。
小鼠肺脏载菌量测定：攻毒24h后取小鼠肺脏，以1:10的比例(m/v)加入无菌PBS，用组织匀浆仪将肺脏打散并研磨成均匀的糊状物。匀浆液涂布于LB平板，次日计金黄色葡萄球菌菌落总数，确定感染小鼠肺脏组织中的金黄色葡萄球菌数量。图14显示重组菌可以显著降低金黄色葡萄球菌在肺脏的定植量。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一种抗原载体菌株，其特征在于，所述菌株为LR076，于2022年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25845，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为Limosilactobacillus reuteri。
2.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株由携带有外源金黄色葡萄球菌抗原片段的重组质粒转化至LR076菌株中形成；所述抗原片段包括HlaH35L、IsdB、MntC，分别如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的一种重组菌株，其特征在于，重组质粒包括pNZ8148-sp-His-hlaH35L、pNZ8148-sp-His-isdB或pNZ8148-sp-His-mntC。
4.根据权利要求3所述的一种重组菌株，其特征在于，所述重组质粒的构建方法包括：
1)选择短小乳杆菌S层信号肽Sp和His标签，通过GenBank获得金黄色葡萄球菌hlaH35L、isdB、mntC全序列，根据L.reuteri的密码子偏好进行序列优化，Sp、His标签和抗原优化后的序列合成后连接到克隆载体pUC57-Si mple上；
2)经过双酶切、胶回收、连接、转化将hlaH35L、isdB或mntC连接到表达载体pNZ8148上，构建重组质粒。
5.权利要求1所述的菌株在制备金黄色葡萄球菌口服疫苗中的应用。
6.权利要求2-4任一所述的重组菌株在制备金黄色葡萄球菌口服疫苗中的应用。
7.以权利要求4所述的重组菌株制备得到的疫苗对小鼠进行免疫的方法，其特征在于，过程包括：对重组菌株进行活化，得到菌液，然后第1、15和29d使用菌液对小鼠灌胃处理。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211379199.4A CN115975865A (zh) | 2022-11-04 | 2022-11-04 | 抗原载体菌株及在制备金黄色葡萄球菌口服疫苗中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211379199.4A CN115975865A (zh) | 2022-11-04 | 2022-11-04 | 抗原载体菌株及在制备金黄色葡萄球菌口服疫苗中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115975865A true CN115975865A (zh) | 2023-04-18 |
Family
ID=85961389
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211379199.4A Pending CN115975865A (zh) | 2022-11-04 | 2022-11-04 | 抗原载体菌株及在制备金黄色葡萄球菌口服疫苗中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115975865A (zh) |
-
2022
- 2022-11-04 CN CN202211379199.4A patent/CN115975865A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Immunogenicity of oral vaccination with Lactococcus lactis derived vaccine candidate antigen (UreB) of Helicobacter pylori fused with the human interleukin 2 as adjuvant | |
| CN104593397B (zh) | 一种优化的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原基因序列及其在预防断奶仔猪腹泻中的应用 | |
| CN108410891A (zh) | 治疗性hpv卵黄抗体及其应用 | |
| CN103013895B (zh) | 猪流行性腹泻病毒重组猪霍乱沙门氏菌基因工程活疫苗及制备与应用 | |
| CN108728473B (zh) | 一种表达幽门螺杆菌NapA蛋白的重组载体、重组菌株及其制备方法、应用 | |
| JP2003509008A (ja) | 感染症の治療のための弱毒化微生物 | |
| Chen et al. | Oral immunization with recombinant Lactobacillus casei displayed AHA1-CK6 and VP2 induces protection against infectious pancreatic necrosis in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) | |
| CN116396974B (zh) | 非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体、重组植物乳酸菌及其制备方法和应用 | |
| CN114085860A (zh) | 一种表达狂犬病毒g蛋白的重组乳酸菌、构建方法及应用 | |
| CN102838680B (zh) | 一种幽门螺杆菌多表位融合蛋白及其制备的多表位疫苗 | |
| CN109303916A (zh) | 焦亡相关蛋白gsdmd在制备菌蜕疫苗中的应用 | |
| CN108396032A (zh) | 保护性hpv卵黄抗体及其应用 | |
| KR101151004B1 (ko) | 소의 병원성 대장균의 부착인자가 형질전환된 약독화 살모넬라균 변이주 및 이를 포함하는 소의 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신조성물 | |
| CN102732473B (zh) | 表达猪肺炎支原体p46蛋白的重组猪霍乱沙门氏菌及制备方法与应用 | |
| CN115975865A (zh) | 抗原载体菌株及在制备金黄色葡萄球菌口服疫苗中的应用 | |
| CN114806994A (zh) | 表达sat2型口蹄疫病毒结构蛋白vp1的枯草芽孢杆菌及应用 | |
| CN114854783A (zh) | 一种表达pedv流行毒株s1基因重组乳酸乳球菌及其制备方法和应用 | |
| Jiao et al. | Immunization effect of recombinant Lactobacillus casei displaying Aeromonas veronii Aha1 with an LTB adjuvant in carp | |
| CN103421733A (zh) | 一种副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程苗 | |
| CN113980101A (zh) | 一种胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗 | |
| CN101049508A (zh) | 携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗 | |
| CN114456240B (zh) | 一种非洲猪瘟病毒基因工程亚单位口服疫苗 | |
| CN112442472B (zh) | 抗艰难梭菌的重组乳酸乳球菌、活载体疫苗及其制备方法 | |
| CN117625505B (zh) | 用于产肠毒素大肠杆菌k88基因型的乳酸乳球菌载体口服疫苗及应用 | |
| CN102676570A (zh) | 一种重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |