ES2276673T3 - Fracciones de membranas bacterianas con efecto adyuvante. - Google Patents
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Abstract
Utilización de una fracción de membrana de Klebsiella pneumoniae mezclada con un antígeno o hapteno, siendo seleccionado dicho antígeno o hapteno de entre los antígenos o haptenos específicos de un agente infeccioso, o de entre los antígenos asociados con células tumorales, y siendo capaz dicha mezcla de orientar la respuesta inmunitaria hacia una respuesta de tipo Th1 y/o de tipo Th1/Th2 mixto dirigida contra dicho antígeno o hapteno, respuesta en la que la respuesta Th1 es próxima o mayor que la respuesta de tipo Th2, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la prevención o el tratamiento de enfermedades infecciosas o cánceres, caracterizada porque la fracción de membrana se prepara mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas: a) cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido de la centrifugación de dicho cultivo; b) en caso necesario, desactivar las enzimas líticas del pelete bacteriano obtenido en la etapa a), seguido de la centrifugación de la suspensión obtenida; c) extraer y eliminar las proteínas no membránicas y los ácidos nucleicos del pelete obtenido en la etapa a) o b) mediante por lo menos un ciclo de lavado del pelete en una disolución de extracción; d) digerir el pelete de la membrana obtenido en la etapa c) en presencia de enzimas proteásicas, seguido de una centrifugación; e) realizar por lo menos un ciclo de lavado del pelete obtenido en la etapa d) en disolución salina fisiológica y/o en agua destilada; y f) someter a ultrasonidos el pelete obtenido en la etapa e), o mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas: a) cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido, en caso necesario, de una centrifugación; b) congelar el medio de cultivo o el pelete obtenido en la etapa a), seguido de la descongelación y secado de las células; c) eliminar, por medio de una ADNasa, los ácidos nucleicos de las células secas obtenidas en la etapa b), las cuales se han resuspendido; d) moler las células obtenidas en la etapa c), y aclarar la suspensión obtenida; e) precipitar, en un medio ácido, la suspensión obtenida en la etapa d), y eliminar el pelete; f) neutralizar el sobrenadante obtenido en la etapa e) que contiene la suspensión de membrana, seguido de la diálisis y concentración de la suspensión de membrana; y g) esterilizar la suspensión de membrana concentrada obtenida en la etapa f).
Description
Fracciones de membranas bacterianas con efecto
adyuvante.
La presente invención se refiere a la
utilización de una fracción de membrana de bacterias gram negativas,
Klebsiella pneumoniae, combinada con un antígeno o hapteno,
para la preparación de una composición farmacéutica destinada a
orientar a la respuesta inmunitaria hacia una respuesta de tipo Th1
y/o de tipo Th1/Th2 mixto dirigida contra dicho antígeno o hapteno.
La invención comprende, además, las composiciones farmacéuticas que
las contienen y sus aplicaciones para la prevención y tratamiento de
enfermedades infecciosas, en particular infecciones provocadas por
paramixovirus tales como RSV, y cánceres, en particular aquellos
cuyos tumores que están asociados con antígenos tumorales.
La vacunación es un medio eficaz para prevenir o
reducir en particular infecciones. El éxito de las campañas de
vacunación en este campo ha hecho posible extender el concepto de
vacunas a los campos de enfermedades autoinmunitarias, cáncer y
fertilidad. Por otro lado, la vacunación de antígenos sólos no
siempre es capaz de inducir una respuesta rápida y sostenida del
anticuerpo, lo que requiere la presencia de adyuvantes, es decir,
compuestos que ayudan (del latín adjuvare: ayudar) a los
anticuerpos a inducir tales respuestas.
Los adyuvantes constituyen un grupo de
compuestos variados con respecto a su estructura y su origen. Así,
se encuentran, entre otros, en esta categoría, las emulsiones de
agua en aceite (adyuvante de Freund incompleto) o de aceite en
agua, los compuestos de origen bacteriano tales como derivados de
lipopolisacáridos procedentes de bacterias gram negativas, y sales
de aluminio. Actualmente, sólo se usan en seres humanos las sales de
aluminio como adyuvantes para preparaciones de vacunas.
El desarrollo de una respuesta de anticuerpos
dirigida contra un antígeno requiere una serie de sucesos complejos.
Implica células que presentan el antígeno, linfocitos T reguladores
(Th por T "auxiliar"), y linfocitos B productores de
anticuerpos. Según el perfil de citoquinas producidas, se pueden
distinguir dos tipos de linfocitos Th: los linfocitos Th de tipo 1,
productores de IFN-\gamma e IL-2,
y que promueven la formación de IgG2a en ratones, y los linfocitos
Th de tipo 2, productores de IL-4,
IL-5 e IL-10 con formación de IgG1
en ratones (Mosmann, T.R. y Sad S. Immunol. Today 1996, 17:138).
Además, se ha demostrado que, para el mismo antígeno dado, es el
adyuvante el que orienta hacia el isotipo predominante durante la
respuesta de anticuerpos (Toellner K.-M. et al. J. Exp. Med.
1998, 187:1193). Así, se sabe que las sales de aluminio, tales como
Alhydrogel, inducen, en ratones, una respuesta esencialmente de
tipo Th2, y promueven la formación de IgG1 o incluso de IgE
(Allison A.C. en Vaccine design - The role of cytokine networks Vol.
293, 1-9 Plenum Press 1997), lo que puede plantear
problemas en sujetos con una predisposición alérgica. Además, según
la diana terapéutica prevista, puede ser deseada una respuesta de
tipo Th1 o de tipo (Th1/Th2) mixto.
De este modo, actualmente existe una necesidad
de disponer de nuevos adyuvantes capaces de inducir una respuesta
inmunitaria del tipo Th1 o (Th1/Th2) mixto, preferentemente una
respuesta Th1/Th2 mixta, para la que la respuesta de Th1 es próxima
a o mayor que la respuesta de Th2.
Sorprendentemente, se han demostrado propiedades
particulares de la fracción de membrana de una bacteria gram
negativa como Klebsiella pneumoniae (denominada FMKp), en
particular fracciones de membrana obtenidas mediante procedimientos
como se describen más abajo en los ejemplos. Se ha descubierto de
hecho que dicha fracción de membrana FMKp, combinada con un
antígeno, no sólo tuvo la capacidad de aumentar la respuesta de
anticuerpos dirigida contra dicho antígeno, sino también tuvo la
capacidad para reorientar la respuesta de citoquinas hacia un
perfil de Th1/Th2, correspondiendo así a la actividad del adyuvante
particular buscada, todo ello independientemente del modo de
administración de dichas fracciones de membrana.
De este modo, la presente invención tiene por
objeto la utilización de una fracción de membrana de bacterias de
Klebsiella pneumoniae, combinada con un antígeno o hapteno
para orientar la respuesta inmunitaria hacia una respuesta de tipo
Th1 y/o de tipo Th1/Th2 mixto dirigida contra dicho antígeno o
hapteno, o para la preparación de una composición farmacéutica
destinada a orientar la respuesta inmunitaria hacia una respuesta de
tipo Th1 y/o de tipo Th1/Th2 mixto dirigida contra dicho antígeno o
hapteno, caracterizada porque la fracción de membrana se prepara
mediante uno de los dos procedimientos tales como se describen a
continuación.
Por orientación de la respuesta inmunitaria
hacia una respuesta de tipo Th1 y/o de tipo Th1/Th2 mixto, se
prefiere en particular la orientación de la respuesta inmunitaria
que promueva la inducción de una respuesta de Th1 con relación a la
respuesta de Th1/Th2 obtenida con el adyuvante de alumbre.
Por orientación de la respuesta inmunitaria
hacia una respuesta de tipo Th1 y/o de tipo Th1/Th2 mixto, se
prefiere más particularmente una orientación de la respuesta
inmunitaria que incremente el título de anticuerpos de IgG2a
dirigidos contra el antígeno asociado en un factor de por lo menos
10, preferentemente de por lo menos 25, 50 y 100, con relación al
título de IgG2a obtenido con el adyuvante de alumbre.
En una manera particularmente preferida, la
respuesta inmunitaria se orienta hacia una respuesta de tipo Th1
y/o Th1/Th2 mixto, en la que la respuesta de Th1 es próxima a o
mayor que la respuesta de Th2. Mediante la expresión "próxima
a" se entenderá que significa una respuesta que, cuando se
expresa como título de anticuerpos de IgG2a dirigidos contra el
antígeno asociado, es por lo menos igual a 0,5 veces,
preferentemente por lo menos igual a 0,75 veces, el título del
anticuerpo de IgG1 dirigido contra dicho antígeno, con un título de
anticuerpo de IgG dirigido contra el antígeno asociado próximo a o
mayor que el título de anticuerpo de IgG dirigido contra el
antígeno asociado obtenido con el adyuvante de alumbre o de
Freund.
La invención también se refiere a la utilización
según la invención, caracterizada porque la fracción de membrana
comprende por lo menos fracciones de membrana de dos cepas
diferentes de bacterias.
Por lo tanto, la invención se refiere a una
utilización según la invención, caracterizada porque la fracción de
membrana se prepara mediante un procedimiento que comprende las
siguientes etapas:
- a)
- cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido de la centrifugación de dicho cultivo;
- b)
- en caso necesario, desactivar las enzimas líticas del pelete bacteriano obtenido en la etapa a), seguido de la centrifugación de la suspensión obtenida;
- c)
- extraer y eliminar las proteínas no membránicas y los ácidos nucleicos del pelete obtenido en la etapa a) o b) mediante por lo menos un ciclo de lavado del pelete en una disolución de extracción;
- d)
- digerir el pelete de la membrana obtenido en la etapa c) en presencia de enzimas proteolíticas, seguido de una centrifugación;
- e)
- realizar por lo menos un ciclo de lavado del pelete obtenido en la etapa d) en disolución salina fisiológica y/o en agua destilada; y
- f)
- someter a ultrasonidos el pelete obtenido en la etapa e).
La etapa b) de desactivación de las enzimas
líticas del pelete bacteriano obtenido en la etapa a) se puede
llevar a cabo mediante cualquier procedimiento conocido de
desactivación de enzimas, tal como, en particular, calentando el
pelete bacteriano resuspendido a una temperatura preferentemente
próxima a 100ºC, o añadiendo un inhibidor de la actividad de estas
enzimas.
La etapa c) de extracción y eliminación de las
proteínas no membránicas y de los ácidos nucleicos procedentes del
pelete obtenido en la etapa a) o b) se puede llevar a cabo, por
ejemplo, mediante por lo menos un ciclo de lavado del pelete en una
disolución de extracción que corresponde a la adición de una
disolución hipertónica (disolución de extracción), preferentemente
una disolución salina que tiene una molaridad próxima a 1 M,
seguido, después de un período de contacto que es suficiente para
el efecto deseado, de la centrifugación de la suspensión obtenida,
y la eliminación del sobrenadante obtenido tras dicha
centrifugación, siendo posible repetir varias veces este ciclo de
lavado.
La etapa d) de digestión del pelete de la
membrana obtenido en la etapa c) se puede llevar a cabo en presencia
de una disolución de enzimas proteolíticas, tales como, por
ejemplo, tripsina, quimiotripsina, o cualquier enzima conocida con
actividad proteolítica, ajustándose preferentemente las condiciones
de reacción, el pH de la disolución, la temperatura y la duración
de la reacción a las condiciones óptimas para la actividad de la
enzima o enzimas seleccionadas, seguido de la centrifugación, siendo
posible repetir varias veces este ciclo de digestión con la misma
enzima, la misma combinación de enzimas o con una enzima diferente
para cada ciclo de digestión realizado.
La etapa e) de lavado del pelete obtenido en la
etapa d) se lleva a cabo recogiendo el pelete en disolución salina
fisiológica o en agua destilada, seguido, tras un período suficiente
de contacto, de la centrifugación, siendo posible repetir varias
veces este ciclo de lavado.
Finalmente, la etapa f) de someter al pelete a
ultrasonidos está destinada, en particular, a disgregar y
homogeneizar la fracción de membrana obtenida al final de la etapa
e). Las condiciones de tratamiento con ultrasonidos (duración e
intensidad) se determinarán por las personas expertas en la técnica,
por ejemplo según la cantidad de fracción de membrana a tratar.
La invención se refiere también a una
utilización según la invención, caracterizada porque la fracción de
membrana se prepara mediante un procedimiento que comprende las
siguientes etapas:
- a)
- cultivar dicha bacteria en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido, en caso necesario, de una centrifugación;
- b)
- congelar el medio de cultivo o el pelete obtenido en la etapa a), seguido de la descongelación y secado de las células;
- c)
- eliminar, por medio de una ADNasa, los ácidos nucleicos de las células secas obtenidas en la etapa b), las cuales se han resuspendido;
- d)
- moler las células obtenidas en la etapa c), y aclarar la suspensión obtenida;
- e)
- precipitar, en un medio ácido, la suspensión obtenida en la etapa d), y eliminar el pelete;
- f)
- neutralizar el sobrenadante obtenido en la etapa e) que contiene la suspensión de membrana, seguido de la diálisis y concentración de la suspensión de membrana; y
- g)
- esterilizar la suspensión de membrana concentrada obtenida en la etapa f).
Las condiciones de descongelación en la etapa b)
del procedimiento más abajo se determinarán, por supuesto, por la
persona experta en la técnica según la cantidad inicial de pelete a
tratar, y preferentemente se lleva a cabo a 4ºC durante por lo
menos 48 horas para el equivalente de 1 kg de células secas.
En la etapa c), la eliminación de los ácidos
nucleicos se lleva a cabo, por ejemplo, mediante adición de una
ADNasa, a una concentración final de 5 mg/ml de una suspensión
celular a una concentración equivalente a 5% de células secas.
La molienda de las células obtenidas en la etapa
c) se puede llevar a cabo por medio de cualquier sistema o aparato
conocido por la persona experta en la técnica para moler células,
tales como prensas o, preferentemente, tales como la molienda en un
bucle Manton Gaulinet durante 30 minutos.
El aclaramiento de la suspensión obtenida tras
la molienda se puede llevar a cabo por medio de cualquier sistema o
aparato conocido por la persona experta en la técnica para el
aclaramiento de productos molidos de células bacterianas, tal como
el sistema Sharpless.
La etapa e) de precipitación en medio ácido de
la suspensión obtenida en la etapa d) se puede llevar a cabo, por
ejemplo, con ácido acético. A la precipitación le sigue la
eliminación del pelete por medio de un sistema de tipo Sharpless, y
la recuperación del sobrenadante.
La etapa f) consiste en una etapa en la que el
sobrenadante, obtenido tras la precipitación en medio ácido, se
neutraliza, se diluye, se dializa y después se concentra.
Finalmente, la última etapa consiste en una
etapa de esterilización del concentrado de fracción de membrana
obtenido en la etapa anterior, tal como, por ejemplo, calentando a
121ºC durante alrededor de 35 minutos.
La invención se refiere particularmente a la
utilización según la invención, caracterizada porque dicho antígeno
o hapteno se selecciona de entre los antígenos o haptenos
específicos de un agente infeccioso, tal como un virus, una
bacteria, un hongo o un parásito, o de los antígenos asociados con
células tumorales.
Según la invención, dichos antígenos o haptenos
se seleccionan preferentemente de entre los péptidos, lipopéptidos,
polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos o lípidos.
Por supuesto, dicho antígeno o hapteno, cuando
tiene naturaleza peptídica, se puede obtener mediante síntesis
química o recombinante.
Los procedimientos para preparar péptidos
recombinantes son actualmente bien conocidos por las personas
expertas en la técnica, y no se desarrollarán en la presente
descripción. Entre las células que se pueden usar para la
producción de estos péptidos recombinantes, por supuesto se pueden
mencionar células bacterianas (Olins P.O. y Lee S.C., 1993, Recent
advances in heterologous gene expression in E. coli. Curr.
Op. Biotechnology 4:520-525), pero también células
de levaduras (Buckholz R.G., 1993, Yeast Systems for the Expression
of Heterologous Gene Products. Curr. Op. Biotechnology
4:538-542), así como células de animales, en
particular cultivos celulares de mamíferos (Edwards C.P. y Aruffo
A., 1993, Current applications of COS cell based transient
expression systems. Curr. Op. Biotechnology
4:558-563), pero también células de insectos en
cuyos procedimientos se pueden usar, que implican, por ejemplo,
baculovirus (Luckow V.A., 1993, Baculovirus Systems for the
expression of human gene products. Curr. Op. Biotechnology
4:564-572).
En una forma de realización preferida, la
invención comprende la utilización según la invención, caracterizada
porque dicho antígeno o hapteno está acoplado covalentemente con un
péptido de soporte para formar un complejo capaz de unirse
específicamente a seroalbúmina de mamífero, preferentemente dicho
péptido de soporte es un fragmento peptídico derivado de la
proteína estreptocócica G, en particular el fragmento
C-terminal denominado BB.
Por supuesto, dicho complejo se puede preparar
mediante recombinación genética.
El complejo quimérico o híbrido se puede
producir mediante técnicas de ADN recombinante, insertando o
añadiendo una secuencia que codifica dicho antígeno o hapteno de
naturaleza proteínica a una secuencia de ADN que codifica dicho
fragmento peptídico de la proteína estreptocócica G.
Los procedimientos para la síntesis de moléculas
híbridas incluyen los procedimientos usados en ingeniería genética
para construir polinucleótidos híbridos que codifican las secuencias
polipeptídicas deseadas. Se puede hacer ventajosamente referencia
a, por ejemplo, la técnica para producir genes que codifican
proteínas de fusión, que se describe por D.V. Goeddel (Gene
expression technology, Methods in Enzymology, vol. 185,
3-187, 1990).
La invención tiene asimismo por objeto la
utilización según la invención, caracterizada porque la composición
farmacéutica comprende, además, un agente que hace posible portar
dicha fracción de membrana asociada con dicho agente, hapteno o
complejo, en una forma que hace posible potenciar su estabilidad y/o
su inmunogenicidad, tal como en forma de una emulsión de tipo
aceite en agua o de agua en aceite, o en forma de una partícula de
tipo liposómico, de microesfera o de nanosfera, o cualquier tipo de
estructura que permita el encapsidamiento y la presentación, en
forma de partículas, de dicha fracción de membrana asociada con
dicho antígeno, hapteno o complejo.
La invención también se refiere a la utilización
según la invención, caracterizada porque dicho agente se selecciona
de entre sales de aluminio, sales de calcio, compuestos de origen
vegetal tales como Quil A o saponina, o compuestos de origen
bacteriano tales como los derivados del toxoide colérico, pertúsico
o tetánico, o de la toxina termolábil de E. coli.
También se comprende en la presente invención la
utilización según la invención, caracterizada porque la composición
farmacéutica comprende, además, un agente que hace posible regular
la respuesta inmunitaria inducida por dicha fracción de membrana
combinada con dicho agente, hapteno o complejo.
Entre dichos agentes reguladores, se prefieren
en particular las citoquinas, los factores de crecimiento, las
hormonas o los componentes celulares tales como ácidos nucleicos,
una proteína de la familia de las proteínas de choque térmico o los
ribosomas.
La invención tiene asimismo por objeto la
utilización según la invención, para la preparación de una
composición farmacéutica destinada a la prevención o el tratamiento
de enfermedades infecciosas de origen vírico, bacteriano, fúngico o
parasitario.
Entre dichas enfermedades infecciosas de origen
vírico, se prefieren particularmente las enfermedades infecciosas
provocadas por los paramixovirus, en particular por el virus de la
parainfluenzae, y más particularmente por el virus sincitial
respiratorio (RSV).
En una forma de realización particular, la
utilización según la invención se caracteriza porque dicho antígeno
asociado con la fracción de membrana comprende el péptido G2Na, un
fragmento de la proteína G del virus que tiene una secuencia de
aminoácidos SEC ID nº. 4, un péptido homólogo a G2Na cuya secuencia
muestra por lo menos 80%, preferentemente 90%, 95% y 99% de
identidad, tras el alineamiento o la secuencia SEC ID nº. 4, o el
péptido G2Na o uno de sus homólogos, acoplado covalentemente con un
fragmento C-terminal (BB) de la proteína
estreptocócica G para formar un complejo capaz de unirse a
seroalbúmina de mamífero, péptido BB el cual se describe en los
documentos de Power et al., 1997 (Virology, 230,
155-166) y WO 96/14416.
Mediante la expresión "porcentaje, grado o
nivel de identidad" entre dos secuencias de ácidos nucleicos o
de aminoácidos, para los fines de la presente invención, se entiende
que significa un porcentaje de restos nucleotídicos o de
aminoácidos idénticos entre las dos secuencias a comparar, obtenido
tras el mejor alineamiento, siendo este porcentaje puramente
estadístico, y estando las diferencias entre las dos secuencias
distribuidas aleatoriamente a lo largo de toda la longitud. Las
comparaciones de secuencias entre dos secuencias de ácidos
nucleicos o de aminoácidos se llevan a cabo tradicionalmente
comparando estas secuencias tras haberlas alineado de manera
óptima, llevándose a cabo dicha comparación mediante segmento o
mediante "ventana de comparación" para identificar y comparar
las regiones locales de similitud de secuencias. El alineamiento
óptimo de las secuencias para la comparación se puede llevar a cabo
manualmente o por medio del algoritmo de homología local de Smith y
Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], por medio del algoritmo de
homología local de Neddleman y Wunsch (1970) [J. Mol. Biol.
48:443], por medio del procedimiento de búsqueda de similitud de
Pearson y Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444],
mediante programas de ordenador que usan estos algoritmos (GAP,
BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de Wisconsin Genetics Software
Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, o
mediante los paquetes de comparación mediante programa de ordenador
BLAST N o BLAST P).
El porcentaje de identidad entre dos secuencias
de ácidos nucleicos o de aminoácidos se determina contando estas
dos secuencias, óptimamente alineadas, mediante la ventana de
comparación, en la que la región de la secuencia de ácidos
nucleicos o de aminoácidos a comparar puede comprender adiciones o
supresiones con relación a la secuencia de referencia para un
alineamiento óptimo entre estas dos secuencias. El porcentaje de
identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas
para las cuales el nucleótido o el resto del aminoácido es idéntico
entre las dos secuencias, dividiendo este número de posiciones
idénticas entre el número total de posiciones en la ventana de
comparación, y multiplicando el resultado obtenido por 100, a fin de
obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.
Por ejemplo, será posible usar el programa
BLAST, "BLAST 2 sequences", disponible en el sitio
http://www.ncbi. nlm.nih.gov/gorf/b12.html, siendo
los parámetros usados aquellos dados por defecto (en particular para
los parámetros "open gap penaltie": 5, y "extension gap
penaltie": 2; siendo el molde seleccionado, por ejemplo, el molde
"BLOSUM 62" propuesto por el programa), calculándose el
porcentaje de identidad entre las dos secuencias a comparar
directamente por el programa.
De este modo, la invención se refiere a un
procedimiento para preparar una fracción de membrana de bacterias
gram negativas, en particular Klebsiella pneumoniae,
caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
- a)
- cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido de la centrifugación de dicho cultivo;
- b)
- en caso necesario, desactivar las enzimas líticas del pelete bacteriano obtenido en la etapa a), seguido de la centrifugación de la suspensión obtenida;
- c)
- extraer y eliminar las proteínas no membránicas y los ácidos nucleicos del pelete obtenido en la etapa a) o b) mediante por lo menos un ciclo de lavado del pelete en una disolución de extracción;
- d)
- digerir el pelete de membrana obtenido en la etapa c), en presencia de enzimas de proteasas, seguido de la centrifugación;
- e)
- realizar por lo menos un ciclo de lavado del pelete obtenido en la etapa d), en disolución salina fisiológica y/o en agua destilada; y
- f)
- someter a ultrasonidos el pelete obtenido en la etapa e).
La invención también describe el procedimiento
para preparar una fracción de membrana de bacterias gram negativas,
en particular Klebsiella pneumoniae, caracterizado porque
comprende las siguientes etapas:
- a)
- cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido, en caso necesario, de la centrifugación;
- b)
- congelar el medio de cultivo o el pelete obtenido en la etapa a), seguido de la descongelación y secado de las células;
- c)
- eliminar, por medio de una ADNasa, los ácidos nucleicos de las células secas obtenidas en la etapa b), las cuales se han resuspendido;
- d)
- moler las células obtenidas en la etapa c), y aclarar la suspensión obtenida;
- e)
- precipitar, en un medio ácido, la suspensión obtenida en la etapa d), y eliminar el pelete;
- f)
- neutralizar el sobrenadante obtenido en la etapa e) que contiene la suspensión de membrana, seguido de la diálisis y concentración de la suspensión de membrana; y
- g)
- esterilizar la suspensión de membrana concentrada obtenida en la etapa f).
El contenido de proteoglicano de las fracciones
de membrana capaces de ser obtenidas mediante dichos procedimientos,
un ingrediente activo de FMKp, representado por la suma de los
contenidos de galactosa y de proteína, está preferentemente
comprendido entre:
- -
- para galactosa: entre 1,2 g/l y 3,4 g/l;
- -
- para las proteínas: entre 7,5 g/l y 14,9 g/l.
Más preferentemente, este contenido será:
- -
- para galactosa: entre 1,6 g/l y 2,6 g/l;
- -
- para las proteínas: entre 9,3 g/l y 11,7 g/l.
La invención se refiere, además, a las
composiciones farmacéuticas que comprenden una fracción de membrana
capaz de ser obtenida mediante los procedimientos descritos
anteriormente según la utilización de la invención, y un antígeno,
un hapteno o un complejo, como se definen anteriormente, asociado
con dicha fracción de membrana, siendo el antígeno elegido entre
fragmentos peptídicos de paramixovirus.
Por supuesto, dichas composiciones farmacéuticas
según la invención pueden comprender, además, los agentes tales
como los vehículos y los agentes reguladores definidos
anteriormente.
En una forma de realización preferida, la
composición farmacéutica según la invención se caracteriza porque
el paramixovirus es un virus sincitial respiratorio o un virus
parainfluenzae, preferentemente porque dicho antígeno asociado con
la fracción de membrana comprende el péptido G2Na que tiene la
secuencia SEC ID nº. 4 del virus sincitial respiratorio, teniendo
uno de sus homólogos por lo menos 80% de identidad tal como se
define anteriormente, o dicho péptido G2Na, o uno de sus homólogos
que tiene por lo menos 80% de identidad, acoplado covalentemente
con un fragmento C-terminal (BB) de la proteína
estreptocócica G para formar un complejo capaz de unirse a
seroalbúmina de mamífero.
Las leyendas de las figuras y los ejemplos
proporcionados a continuación están destinados a ilustrar la
invención sin limitar de ninguna manera su alcance.
Figura 1: BBG2Na adyuvado con FMKp - estudio de
dosis y respuesta (títulos de IgG anti-G2Na del
suero).
*p < 0,05 (comparado con el grupo de PBS)
Figura 2: BBG2Na adyuvado con FMKp - títulos
IgG1 e IgG2a anti-G2Na.
Figura 3: BBG2Na adyuvado con FMKp - estudio de
protección.
Figura 4: Efecto adyuvante de FMKp con Immugrip
(vacuna de la gripe).
*p < 0,05 comparado con el grupo no adyuvado
("0") en el mismo día de la recogida de muestras.
Procedimiento nº
1
La extracción de las membranas de K.
pneumoniae I145 a partir del pelete de centrifugación de la
etapa está precedida preferentemente por una etapa de destrucción
de las enzimas líticas de los componentes celulares contenidos en
el pelete, por ejemplo calentando estos últimos a 100ºC,
opcionalmente tras redisolverlos en disolución.
La extracción real de las membranas a partir del
pelete de centrifugación se lleva a cabo preferentemente tratando
los componentes celulares del pelete, tras la destrucción opcional
de las enzimas líticas, con una disolución salina, por ejemplo
cloruro sódico 1 M, una o varias veces, seguido de la
centrifugación, preferentemente a 20.000 g, de la suspensión
obtenida; el sobrenadante procedente de esta centrifugación, que se
elimina, contiene impurezas no membránicas tales como proteínas y
ácidos nucleicos, mientras que el pelete contiene las
membranas.
Tras la separación de la disolución salina que
contiene las impurezas, las membranas se digieren en presencia de
enzimas proteolíticas, preferentemente tripsina y quimiotripsina, en
disolución a pH 8 a 37ºC durante 4 horas.
Tras la digestión, la disolución se homogeneiza
mediante ultrasonidos. El producto así obtenido constituye la
fracción de membrana denominada FMKp.
El sobrenadante obtenido se centrifuga
nuevamente en las mismas condiciones, preferentemente a 140.000
g.
Esta fracción se prepara a partir del pelete
obtenido mediante centrifugación a 40.000 g durante 20 minutos.
Dicho pelete se resuspende en disolución salina fisiológica, y
después esta suspensión se calienta durante 10 minutos a 100ºC en
un baño maría de agua hirviendo, para inactivar las enzimas líticas.
Después de enfriar, el medio se centrifuga durante 30 minutos a
20.000 g. El pelete obtenido se extrae dos veces con NaCl 1 M a fin
de eliminar las proteínas y los ácidos nucleicos. Las membranas se
recuperan mediante centrifugación durante 30 minutos a
20.000 g.
20.000 g.
Después se someten a digestión con tripsina, a
pH 8 y a 37ºC durante 4 horas, y seguidamente con quimiotripsina en
las mismas condiciones.
Las membranas se recuperan entonces mediante
centrifugación a 2000 g durante 30 minutos, se lavan con disolución
salina fisiológica, y después con agua destilada, y se someten a
disgregación mediante ultrasonidos, durante 15 minutos.
Procedimiento nº
2
Después de descongelar a +4ºC durante un mínimo
de 48 h, se resuspendió 1 kg de células de K. pneumoniae
secas, en disolución a 5% de células secas. Se añadió ADNasa a 5
mg/l. Después se lleva a cabo una molienda en un bucle Manton
Gaulin durante 30 minutos, seguido del aclaramiento en SHARPLES a 50
l/h, seguido de la precipitación con ácido acético a pH = 4,2 + 0,1
durante 30 minutos. El pelete se eliminó (SHARPLES a 25 l/h), y el
sobrenadante se neutralizó y se diluyó hasta el doble del volumen
inicial con agua sometida a ósmosis. Después, se llevó a cabo la
diálisis a volumen constante en PUF 100 hasta 800 \Omegacm,
seguido de la concentración de la suspensión de membrana (MS) así
obtenida hasta 11 l/kg de células secas. La MS se sometió entonces a
autoclave a +121ºC durante 35 min., y se conservó a +4ºC durante 6
semanas.
Por definición, el contenido de proteoglicano,
un ingrediente activo de FMKp, es igual a la suma de los contenidos
de galactosa y de proteínas.
- -
- Galactosa: por término medio 2,2 g/l;
- -
- proteínas: por término medio 10,5 g/l.
BBG2Na es una proteína recombinante producida en
E. coli. Consiste en el péptido G2Na que tiene la secuencia
SEC ID nº: 4, el fragmento de la proteína G del virus sincitial
respiratorio (RSV) de tipo A que se extiende desde el resto 130
hasta el resto 230, fusionado con BB, un fragmento de la proteína
estreptocócica G, que tiene la capacidad para unirse a
seroalbúmina. BBG2Na es una vacuna anti-RSV (Power
U. Virology 1997, 230:155-166).
Ratones BALB/c recibieron 2 inyecciones
subcutáneas de 20 \mug de BBG2Na, y diversas cantidades de FMKp.
Se recogieron muestras de sangre en el D28, y se determinaron los
títulos de anticuerpos séricos mediante ELISA con G2Na en fase
sólida. Los resultados obtenidos se ilustran mediante la figura 1.
Sorprendentemente, muestran que FMKp aumenta significativamente la
respuesta de IgG anti-G2Na; el título de IgG
anti-G2Na alcanzado es similar a los inducidos por
el adyuvante de alumbre o de Freund. El efecto depende de la dosis:
se observa a partir de 5 \mug de FMKp, es máximo a partir de 50
\mug de FMKp, y permanece estable con 100 \mug de FMKp. Por lo
tanto, FMKp es un adyuvante potencial para BBG2Na.
Para conocer el efecto de FMKp sobre la
orientación de la respuesta inmunitaria, en términos de respuesta
de Th1/Th2, se determinaron los títulos de IgG1 e IgG2a
anti-G2Na en los sueros obtenidos como se especifica
anteriormente. Los resultados (figura 2) muestran que,
sorprendentemente, FMKp es capaz de modificar la relación
IgG1/IgG2a anti-G2Na, en contraste con lo que se
observa con el alumbre, para el cual el isotipo predominante es
IgG1. Este perfil está próximo al inducido mediante el adyuvante de
Freund. Esto indica que FMKp se puede usar como adyuvante de
inmunidad para inducir una respuesta de tipo (Th1/Th2) mixta.
Los animales inmunizados como se describe
anteriormente recibieron una exposición vírica mediante la vía nasal
con 10^{5} TCID_{50} de RSV-A. Esto se llevó a
cabo 3 semanas después de la última inmunización. Cinco días
después de la exposición vírica, los animales se sacrificaron, y se
retiraron los pulmones a fin de determinar los títulos de
RSV-A. Los resultados (figura 3) muestran que los
animales que recibieron BBG2Na adyuvado con FMKp están protegidos
contra una exposición de RSV-A.
En conclusión, FMKp permite reorientar la
respuesta de anticuerpos sin afectar la capacidad de proteger a los
ratones frente a una exposición de VRS-A.
Ratones BALB/c recibieron una única inyección de
0,01 \mug de Immugrip^{TM} (vacuna de la gripe comercializada
por Laboratoires INAVA), y diversas cantidades de FMKp. Los
productos se coadministraron. La inyección se realiza
subcutáneamente en el D0. Las muestras de sangre se recogieron en
los días D7, D14 y D21. Se determinó el título de anticuerpos IgG
séricos anti-Immugrip mediante ELISA, con Immugrip a
2 \mug/ml en fase sólida. Los resultados presentados (figura 4)
muestran que FMKp incrementa significativamente el título de
anticuerpos anti-Immugrip, ocurriendo esto desde la
dosis más baja de FMKp, a saber, 0,1 \mug. El efecto adyuvante
depende de la dosis. Interesantemente, se observa que la presencia
de FMKp induce la generación de una respuesta de anticuerpos más
temprana, obtenida a partir del día D7, en comparación con el
control de Immugrip no adyuvado. Este efecto no se obtiene con el
adyuvante de referencia, el adyuvante Freund completo (CFA).
<110> PIERRE FABRE MEDICAMENT
\vskip0.400000\baselineskip
<120> UTILIZACIÓN DE FRACCIONES DE
MEMBRANAS BACTERIANAS CON EFECTO ADJUVANTE, SUS PROCEDIMIENTOS DE
PREPARACIÓN Y COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA QUE LAS CONTIENEN.
\vskip0.400000\baselineskip
<130> D17975
\vskip0.400000\baselineskip
<140> FR 99 03513
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
15-03-1999
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Vers. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1035
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Klebsiella pneumoniae
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1032)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1033)..(1035)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1032)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 344
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Klebsiella pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 303
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus sincitial respiratorio,
G2Na
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(303)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus sincitial respiratorio,
G2Na
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Utilización de una fracción de membrana de
Klebsiella pneumoniae mezclada con un antígeno o hapteno,
siendo seleccionado dicho antígeno o hapteno de entre los antígenos
o haptenos específicos de un agente infeccioso, o de entre los
antígenos asociados con células tumorales, y siendo capaz dicha
mezcla de orientar la respuesta inmunitaria hacia una respuesta de
tipo Th1 y/o de tipo Th1/Th2 mixto dirigida contra dicho antígeno o
hapteno, respuesta en la que la respuesta Th1 es próxima o mayor
que la respuesta de tipo Th2, para la preparación de una
composición farmacéutica destinada a la prevención o el tratamiento
de enfermedades infecciosas o cánceres, caracterizada porque
la fracción de membrana se prepara mediante un procedimiento que
comprende las siguientes etapas:
- a)
- cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido de la centrifugación de dicho cultivo;
- b)
- en caso necesario, desactivar las enzimas líticas del pelete bacteriano obtenido en la etapa a), seguido de la centrifugación de la suspensión obtenida;
- c)
- extraer y eliminar las proteínas no membránicas y los ácidos nucleicos del pelete obtenido en la etapa a) o b) mediante por lo menos un ciclo de lavado del pelete en una disolución de extracción;
- d)
- digerir el pelete de la membrana obtenido en la etapa c) en presencia de enzimas proteásicas, seguido de una centrifugación;
- e)
- realizar por lo menos un ciclo de lavado del pelete obtenido en la etapa d) en disolución salina fisiológica y/o en agua destilada; y
- f)
- someter a ultrasonidos el pelete obtenido en la etapa e), o
mediante un procedimiento que comprende las
siguientes etapas:
- a)
- cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido, en caso necesario, de una centrifugación;
- b)
- congelar el medio de cultivo o el pelete obtenido en la etapa a), seguido de la descongelación y secado de las células;
- c)
- eliminar, por medio de una ADNasa, los ácidos nucleicos de las células secas obtenidas en la etapa b), las cuales se han resuspendido;
- d)
- moler las células obtenidas en la etapa c), y aclarar la suspensión obtenida;
- e)
- precipitar, en un medio ácido, la suspensión obtenida en la etapa d), y eliminar el pelete;
- f)
- neutralizar el sobrenadante obtenido en la etapa e) que contiene la suspensión de membrana, seguido de la diálisis y concentración de la suspensión de membrana; y
- g)
- esterilizar la suspensión de membrana concentrada obtenida en la etapa f).
2. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque la fracción de membrana comprende por lo
menos fracciones de membrana de dos cepas distintas de
bacterias.
3. Utilización según la reivindicación 2,
caracterizada porque dicho antígeno o hapteno se selecciona
de entre péptidos, lipopéptidos, polisacáridos, oligosacáridos,
ácidos nucleicos o lípidos.
4. Utilización según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicho antígeno o
hapteno se acopla covalentemente a un péptido de soporte para
formar un complejo capaz de unirse específicamente a la
seroalbúmina de mamífero.
5. Utilización según la reivindicación 4,
caracterizada porque dicho péptido de soporte es un fragmento
peptídico que proviene de la proteína G del estreptococo.
6. Utilización según una de las
reivindicaciones 4 y 5, caracterizada porque dicho complejo
se prepara mediante recombinación genética.
7. Utilización según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque la composición
farmacéutica comprende además un agente que permite vehicular dicha
fracción de membrana asociada a dicho antígeno, hapteno o complejo,
en una forma que permite mejorar su estabilidad y/o su
inmunogenicidad.
8. Utilización según la reivindicación 7,
caracterizada porque dicho agente es una emulsión de tipo
aceite en agua o agua en aceite.
9. Utilización según la reivindicación 7,
caracterizada porque dicho agente es una partícula de tipo
liposoma, microesfera, nanoesfera o cualquier tipo de estructura
que permita el encapsulamiento y la presentación en forma de
partículas de dicha fracción de membrana asociada a dicho antígeno,
hapteno o complejo.
10. Utilización según la reivindicación 7,
caracterizada porque dicho agente se selecciona de entre
sales de aluminio, sales de calcio, compuestos de origen vegetal
tales como Quil A o saponina, o compuestos de origen bacteriano
tales como los derivados del toxoide colérico, pertúsico o tetánico,
o de la toxina termolábil de E. coli.
11. Utilización según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque la composición
farmacéutica comprende además un agente que permite regular la
respuesta inmunitaria inducida por dicha fracción de membrana
asociada a dicho antígeno, hapteno o complejo.
12. Utilización según la reivindicación 11
caracterizada porque dicho agente de regulación se selecciona
de entre citoquinas, factores de crecimiento, hormonas o
componentes celulares tales como ácidos nucleicos, una proteína de
la familia de las proteínas de choque térmico o los ribosomas.
13. Utilización según una de las
reivindicaciones 1 a 12, para la preparación de una composición
farmacéutica destinada a la prevención o tratamiento de
enfermedades infecciosas, caracterizada porque la enfermedad
infecciosa es de origen vírico, bacteriano, fúngico o
parasitario.
14. Utilización según la reivindicación 13,
para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la
prevención o tratamiento de infecciones mediante paramixovirus.
15. Utilización según la reivindicación 14,
caracterizada porque el paramixovirus es un virus sincitial
respiratorio.
16. Utilización según la reivindicación 15,
caracterizada porque dicho antígeno asociado con la fracción
de membrana comprende el péptido G2Na de secuencia SEC ID nº 4, o
uno de sus homólogos cuya secuencia presenta un grado de identidad
de por lo menos 80% con la secuencia SEC ID nº 4.
17. Utilización según la reivindicación 16,
caracterizada porque dicho péptido G2Na o uno de sus
homólogos se acopla mediante unión covalente a un fragmento
C-terminal (BB) de la proteína G de estreptococo
para formar un complejo capaz de unirse a la seroalbúmina de
mamífero.
18. Utilización según la reivindicación 14,
caracterizada porque el paramixovirus es un virus
parainfluenzae.
19. Composición farmacéutica,
caracterizada porque comprende una fracción de membrana y un
antígeno o hapteno mezclado con dicha fracción de membrana,
caracterizada porque dicho antígeno se selecciona de entre
fragmentos peptídicos de paramixovirus, y caracterizada
porque la fracción de membrana se prepara mediante un procedimiento
que comprende las siguientes etapas:
- a)
- cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido de la centrifugación de dicho cultivo;
- b)
- en caso necesario, desactivar las enzimas líticas del pelete bacteriano obtenido en la etapa a), seguido de la centrifugación de la suspensión obtenida;
- c)
- extraer y eliminar las proteínas no membránicas y los ácidos nucleicos del pelete obtenido en la etapa a) o b) mediante por lo menos un ciclo de lavado del pelete en una disolución de extracción;
- d)
- digerir el pelete de la membrana obtenido en la etapa c) en presencia de enzimas proteásicas, seguido de una centrifugación;
- e)
- realizar por lo menos un ciclo de lavado del pelete obtenido en la etapa d) en disolución salina fisiológica y/o en agua destilada; y
- f)
- someter a ultrasonidos el pelete obtenido en la etapa e), o
mediante un procedimiento que comprende las
siguientes etapas:
- a)
- cultivar dicha bacteria en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido, en caso necesario, de una centrifugación;
- b)
- congelar el medio de cultivo o el pelete obtenido en la etapa a), seguido de la descongelación y secado de las células;
- c)
- eliminar, por medio de una ADNasa, los ácidos nucleicos de las células secas obtenidas en la etapa b), las cuales se han resuspendido;
- d)
- moler las células obtenidas en la etapa c), y aclarar la suspensión obtenida;
- e)
- precipitar, en un medio ácido, la suspensión obtenida en la etapa d), y eliminar el pelete;
- f)
- neutralizar el sobrenadante obtenido en la etapa e) que contiene la suspensión de membrana, seguido de la diálisis y concentración de la suspensión de membrana; y
- g)
- esterilizar la suspensión de membrana concentrada obtenida en la etapa f).
20. Composición farmacéutica según la
reivindicación 19, caracterizada porque el paramixovirus es
un virus sincitial respiratorio o un virus parainfluenzae.
21. Composición farmacéutica según la
reivindicación 20, caracterizada porque dicho antígeno
asociado con la fracción de membrana comprende el péptido G2Na de
secuencia SEC ID nº 4 del virus sincitial respiratorio, o un
péptido cuya secuencia presenta un grado de identidad de por lo
menos 80% con la secuencia SEC ID nº 4.
22. Composición farmacéutica según la
reivindicación 20, caracterizada porque dicho péptido G2Na o
uno de sus homólogos se acopla mediante unión covalente a un
fragmento C-terminal (BB) de la proteína G de
estreptococo para formar un complejo capaz de unirse a la
seroalbúmina de mamífero.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9903153A FR2790959B1 (fr) | 1999-03-15 | 1999-03-15 | Utilisation de fractions membranaires bacteriennes a effet adjuvant, leurs procedes de preparation et composition pharmaceutique les contenant |
| FR9903153 | 1999-03-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2276673T3 true ES2276673T3 (es) | 2007-07-01 |
Family
ID=9543184
Family Applications (1)
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