MXPA01009346A - Fracciones de membrana bacterianas con efecto adyuvante - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso de una fracción de membrana de bacterias gram negativas, en particular de Klebsiella pneumoniae, combinada con un antígeno o hapteno, para preparar una composición farmacéutica diseñada a dirigir la respuesta inmune hacia una respuesta tipo Th1 y/o tipo Th1/Th2 mixta dirigida contra dicho antígeno o hapteno;la invención comprende además, métodos para preparar dichas fracciones de membrana y composiciones farmacéuticas que las contienen y sus usos para prevenir y tratar enfermedades infecciosas, en particular aquéllas que involucren paramixovirus tales como VRS, y cánceres, en particular aquellos con antígenos asociados con tumores.

Description

FRACCIONES DE MEMBRANA BACTERIANAS CON EFECTO ADYUVANTE MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere al uso de una fracción de membrana de bacterias gram negativas, en particular de Klebsiella pneumoniae, combinada con un antígeno o hapteno, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a orientar la respuesta inmune hacia una respuesta tipo Th1 y/o tipo Th1/Th2 mixta dirigida contra dicho antígeno o hapteno. Además, esta invención comprende métodos para la preparación de dichas fracciones de membrana y las composiciones farmacéuticas que las contienen y sus aplicaciones para la prevención y tratamiento de enfermedades infecciosas, en particular infecciones ocasionadas por paramixovirus tales como RSV, y cánceres, en particular aquéllos cuyos tumores están asociados con antígenos tumorales. La vacunación es un medio efectivo para prevenir o reducir en particular infecciones. El éxito de campañas de vacunación en el campo ha hecho posible extender el concepto de vacunas a los campos de enfermedades autoinmunes, cáncer y fertilidad. Por otro lado, los antígenos de vacunación solos no siempre son capaces de inducir una respuesta de anticuerpo rápida y sostenida, lo que requiere la presencia de adyuvantes, es decir, compuestos que los ayudan (de latín adjuvare: ayudar) a inducir dichas respuestas.

Los adyuvantes constituyen un grupo de compuestos variados con respecto a su estructura y su origen. De esta forma, existen entre otros, en esta categoría, emulsiones de agua en aceite (adyuvante de Freund's incompleto) o emulsiones de aceite en agua, compuestos de origen bacteriano tales como derivados del lipopolisacáridos de bacterias gram negativas y sales de aluminio. Actualmente, solamente se utilizan sales de aluminio en humanos como adyuvante para preparaciones de vacuna. El desarrollo de una respuesta de anticuerpo dirigida contra un antígeno requiere una serie de eventos complejos. Esto involucra células que presentan el antígeno, linfocitos T reguladores (Th para "auxiliar" T), y linfocitos B productores de anticuerpos. Se pueden distinguir dos tipos de linfocitos Th de acuerdo al perfil de citocinas producidas: linfocitos Th tipo 1 que producen IFN-? e IL-2 y promueven la formación de lgG2a en ratones, y linfocitos Th tipo 2 que producen IL-4, IL-5 e IL-10 con formación de lgG1 en ratones (Mosmann, T.R. y Sad S. Immunol. Today 1996, 17:138). Más aún, se ha mostrado que para el mismo antígeno determinado, es el adyuvante el cual se orienta hacia el isotipo predominante durante la respuesta de anticuerpo (Toellner K. -M. Et al. J. Exp. Med. 1998, 187:1193). Así, se sabe que las sales de aluminio, tales como Alhydrogel, inducen en ratones una respuesta esencialmente tipo Th2 y promueven la formación de lgG1 o incluso de IgE (Allison A.C. In Vaccine design -The role of cytokine networks Vol. 293, 1-9 Plenum Press 1997), lo cual puede representar problemas en sujetos con predisposición alérgica. Además, de acuerdo con el objetivo terapéutico planteado, se puede desear una respuesta tipo Th1 o tipo mixta (Th1/Th2). De esta forma, actualmente existe la necesidad de tener adyuvantes novedosos disponibles capaces de inducir una respuesta inmune del tipo Th1 o mixta (Th1/Th2), de preferencia una respuesta Th1/Th2 mixta para lo cual la respuesta Th1 es cercana o es mayor a la respuesta Th2. De manera sorprendente, los autores de la presente invención han demostrado propiedades particulares de la fracción de membrana de una bacteria gram negativa Klebsiella pneumoniae (llamada FMKp), en particular fracciones de membrana obtenidas mediante los métodos que se describen a continuación en los ejemplos. En efecto, los autores han descubierto que dicha fracción de membrana FMKp, combinada con un antígeno, no solamente tiene la capacidad de incrementar la respuesta de anticuerpo dirigida contra dicho antígeno, sino también tiene la capacidad de reorientar la respuesta de citocina hacia un perfil Th1/Th2, correspondiendo así a la actividad particular de adyuvante buscada, esto sin considerar el modo de administración de dichas fracciones de membrana. De esta forma, el objetivo de la presente invención es el uso de una fracción de membrana de bacteria gram negativa, en particular de Klebsiella pneumoniae, combinada con un antígeno para orientar la respuesta inmune hacia una respuesta tipo Th1 y/o tipo Th1/Th2 mixta dirigida contra dicho antígeno o hapteno, o para la preparación de una composición farmacéutica destinada a orientar la respuesta inmune hacia una respuesta tipo Th1 y/o tipo Th1/Th2 mixta dirigida contra dicho antígeno o hapteno. Por orientación de la respuesta inmune hacia una respuesta tipo Th1 y/o tipo Th1 Th2 mixta, se prefiere en particular orientación de la respuesta inmune la cual promueve la inducción de una respuesta Th1 relativa a la respuesta Th1/Th2 obtenida con el adyuvante de alumbre. Por orientación de la respuesta inmune hacia una respuesta tipo Th1 y/o tipo Th1/Th2 mixta, se prefiere particularmente una orientación de la respuesta Inmune la cual incrementa el título de anticuerpos lgG2a dirigidos contra el antígeno asociado por un factor de por lo menos 10, preferiblemente de por lo menos 25, 50 y 100 relativo al título de lgG2a obtenido con el adyuvante de alumbre. En una forma particularmente preferida, la respuesta inmune está orientada a una respuesta tipo Th1 y/o tipo Th1 Th2 mixta en la cual la respuesta Th1 es cercana o superior a la respuesta Th2. La expresión "cercana a" se entenderá como una respuesta la cual, cuando se expresa como título de anticuerpos lgG2a dirigidos contra el antígeno asociado, es por lo menos igual a 0.5 veces, de preferencia por lo menos igual a 0.75 veces, el título del anticuerpo lgG1 dirigido contra dicho antígeno, con un título de anticuerpo lgG1 dirigido contra el antígeno asociado cercano o mayor al título del anticuerpo lgG1 dirigido contra el antígeno asociado obtenido con el adyuvante de alumbre o de Freund.

La invención también se refiere al uso como el que se reclama en la invención, distinguido porque la fracción de membrana comprende por lo menos fracciones de membrana de dos cepas diferentes de bacterias. La expresión fracción de membrana de una bacteria se refiere, en la presente invención, a cualquier fracción o extracto de membrana purificado o parcialmente purificado el cual se obtiene de un cultivo de dicha bacteria y cuyo método de preparación comprende por lo menos un paso para lisar las bacterias obtenidas después de cultivo y un paso para separar la fracción que contiene las membranas de dichas bacterias dei lisado total obtenido después del paso de lisis, en particular mediante centrifugación o filtración. La expresión fracción de membrana de una bacteria cuando dicha bacteria es Klebsiella pneumoniae también se refiere, en la presente invención, a proteína P40, una fracción activa de la fracción de membrana de Klebsiella pneumoniae, que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 2, o uno de sus fragmentos. De acuerdo con la invención, las fracciones de membrana se pueden preparar de acuerdo a los métodos conocidos para los expertos en la técnica, tales como por ejemplo el método descrito por Haeuw J. F. et al. (Eur. J. Biochem, 255, 446-454, 1998). De acuerdo con una modalidad particular, la invención se refiere a un uso como el que se reclama en la invención, distinguido porque la fracción de membrana se prepara utilizando un método que comprende los siguientes pasos: a) cultivo de dichas bacterias en un medio de cultivo el cual permita su crecimiento, seguido de centrifugación de dicho cultivo; b) cuando sea apropiado, desactivación de las enzimas líticas de la pella bacteriana obtenida en el paso a), luego centrifugación de la suspensión obtenida; c) extracción y eliminación de las proteínas que no son de membrana y de ácidos nucleicos de la pella obtenida en el paso a) ó b) con por lo menos un ciclo de lavado de la pella en una solución de extracción; d) digestión de la pella de membrana obtenida en el paso c) en presencia de enzimas proteolíticas, seguido de centrifugación; e) por lo menos un ciclo de lavado de la pella obtenida en el paso d) en una solución fisiológica y/o en agua destilada; y f) tratamiento con ultrasonido de la pella obtenida en el paso e). El paso b) para desactivar las enzimas líticas de la pella bacteriana obtenida en el paso a) se puede realizar utilizando cualquier método conocido para desactivar enzimas, tales como, en particular, calentando la pella bacteriana resuspendida a una temperatura de preferencia cercana a 100°C, o añadiendo un inhibidor de la actividad de estas enzimas. El paso c) para extraer y eliminar las proteínas que no son de membrana y de los ácidos nucleicos de la pella obtenida en el paso a) ó b) se puede realizar por ejemplo, con por lo menos un ciclo de lavado de la pella en una solución de extracción correspondiente a la adición de una solución hipertónica (solución de extracción), de preferencia una solución salina con una molaridad cercana a 1M, seguido, después de un período de contacto suficiente para el efecto deseado, de centrifugación de la suspensión obtenida y eliminación del sobrenadante obtenido después de dicha centrifugación, este ciclo de lavado posiblemente siendo repetido varias veces. El paso d) para digerir la pella de membrana obtenida en el paso c) se puede realizar en presencia de una solución de enzimas proteolíticas, tal como por ejemplo tripsina, quimotripsina o cualquier enzima conocida con actividad proteolítica, las condiciones de la reacción, pH de la solución, temperatura y duración de la reacción, de preferencia siendo ajustadas a las condiciones óptimas para la actividad de la enzima seleccionada, seguido de una centrifugación, este ciclo de digestión posiblemente siendo repetido varias veces con la misma enzima o con la misma combinación de enzimas, o con una enzima diferente para cada ciclo de digestión realizado. El paso e) para lavar la pella obtenida en el paso d) se realiza recogiendo la pella en una solución fisiológica o en agua destilada, seguido, después de un período suficiente de contacto, de una centrifugación, este ciclo de lavado siendo posiblemente repetido varias veces. Finalmente, el objetivo del paso f) para tratar con ultrasonido la pella está destinado, en particular, a desintegrar y homogeneizar la fracción de membrana obtenida al final del paso e). Las condiciones de tratamiento con ultrasonido (duración e intensidad) serán determinadas por los expertos en la técnica dependiendo por ejemplo, de la cantidad de fracción de membrana a tratar.

De acuerdo con otra modalidad particular, la invención se refiere a un uso como el que se reclama en la invención, distinguido porque la fracción de membrana se prepara utilizando un método que comprende los siguientes pasos: a) cultivo de dichas bacterias en un medio de cultivo el cual permite su crecimiento, seguido, cuando sea adecuado, de centrifugación; b) congelamiento del medio de cultivo o de la pella obtenida en el paso a), seguido de descongelamiento y secado de las células; c) eliminación, por medio de una DNasa, de los ácidos nucleicos de las células secas obtenidas en el paso b) las cuales han sido resuspendidas; d) trituración de las células obtenidas en el paso c) y clarificación de la suspensión obtenida; e) precipitación, en un medio ácido, de la suspensión obtenida en el paso d) y eliminación de la pella; f) neutralización del sobrenadante obtenido en el paso e) que contiene la suspensión de membrana, seguido de diálisis y concentración de la suspensión de membrana; y g) esterilización de la suspensión de membrana concentrada obtenida en el paso f). Las condiciones de congelamiento en el paso b) del método a continuación, serán determinadas desde luego por los expertos en la técnica dependiendo de la cantidad inicial de pella a ser tratada, de preferencia realizado a 4°C durante por lo menos 48 horas para el equivalente de 1 kg de células secas.

En el paso c), la eliminación de los ácidos nucleicos, se realiza por ejemplo, por la adición de una DNasa a una concentración final de 5 mg/ml de una suspensión de células a una concentración equivalente a 5% de células secas. La trituración de las células obtenidas en el paso c) se puede realizar utilizando cualquier sistema o aparato conocido para los expertos en la técnica para triturar células, tales como prensas o de preferencia, tales como trituración de Mantón Gaulinet durante 30 minutos. La clarificación de la suspensión obtenida después de trituración se puede realizar utilizando cualquier sistema o aparato conocido para los expertos en la técnica para la clarificación de productos triturados de células bacterianas, tal como el sistema Sharpless. El paso e) de precipitación en medio ácido de la suspensión obtenida en el paso d), se puede realizar, por ejemplo, con ácido acético. La precipitación es seguida de eliminación de la pella utilizando por ejemplo, un sistema del tipo Sharpless y mediante recuperación del sobrenadante. El paso f) consiste en un paso en el cual el sobrenadante, obtenido después de precipitación en medio ácido, es neutralizado, diluido, dializado y luego concentrado. Finalmente, el último paso consiste en un paso para esterilizar el concentrado de fracción de membrana obtenido en el paso anterior, por ejemplo, calentando a 121°C durante aproximadamente 35 minuíos.

La invención se refiere particularmente al uso de acuerdo con la invención, distinguido porque la fracción de membrana es la proteína P40 de Klebsiella pneumoniae que tiene la secuencia SEQ ID No. 2, o uno de estos fragmentos. La expresión fragmento de proteína P40 se refiere en particular, a cualquier fragmento que tenga una secuencia de aminoácidos contenida en la secuencia de aminoácidos de la proteína P40, capaz de incrementar una respuesta inmune no específica y/o capaz de inducir una respuesta inmune antitumoral, y la cual comprende por lo menos 5 aminoácidos, de preferencia por lo menos 10 aminoácidos, o preferiblemente por lo menos 15 aminoácidos. Desde luego, dicha proteína P40, o sus fragmentos, se pueden obtener mediante síntesis química o en forma de péptidos recombinantes. La invención se refiere particularmente al uso de acuerdo con la invención, distinguido porque dicho antígeno o hapteno se selecciona de los antígenos o haptenos específicos para un agente infeccioso, tal como un virus, una bacteria, un hongo o un parásito, o de los antígenos asociados con células tumorales. De acuerdo con la invención, dichos antígenos o haptenos de preferencia se seleccionan de péptidos, lipopéptidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, lípidos o cualquier compuesto capaz de dirigir específicamente la respuesta inmune hacia una respuesta tipo Th1 y/o tipo Th1/Th2 mixta contra un antígeno o hapteno específico para un agente infeccioso o un antígeno asociado con una célula tumoral.

Desde luego, dicho antígeno o hapteno, cuando es de naturaleza peptídica, se puede obtener mediante síntesis química o recombinante. Los métodos para preparar péptidos recombinantes son actualmente conocidos para los expertos en la técnica y no se desarrollarán en la presente descripción. Entre las células las cuales se pueden utilizar para producir estos péptidos recombinantes, se debe hacer mención desde luego, de células bacterianas (Olins P.O. y Lee S.C., 1993, Recent advances in heterologous gene expression in E.coli. Curr. Op. Biotechnology 4:520-525), pero también células de levadura (Buckholz R.G., 1993, Yeast Systems for the Expression of Heterologous Gene Products. Curr. Op. Biotechnology 4:538-542), así como células animales, en particular cultivos de células de mamíferos (Edwards C.P. y Aruffo A., 1993, Current applications of COS cell based transient expression systems. Curr. Op. Biotechnology 4, 558-563), pero también células de insectos en las cuales se pueden utilizar métodos que involucren por ejemplo, baculovirus (Luckow V.A., 1993, Baculovirus systems for the expression of human gene products. Curr. Op. Biotechnology 4, 564-572). La invención comprende además, el uso de acuerdo con la invención, distinguido porque dicho antígeno o hapteno está acoplado o combinado con dicha fracción de membrana, en particular covalentemente acoplado con por lo menos uno de los compuestos contenidos en la fracción de membrana. En una modalidad preferida, la invención comprende el uso de acuerdo con la invención, distinguido porque dicho antígeno o hapteno está covalentemente acoplado con un péptido de soporte para formar un complejo capaz de unirse específicamente a albúmina de suero de mamífero, de preferencia dicho péptido de soporte es un fragmento de péptido derivado de proteína G de estreptococos, en particular el fragmento C-terminal llamado BB. Desde luego, dicho complejo se puede preparar mediante recombinación genética. El complejo quimérico o híbrido se puede producir mediante técnicas de ADN recombinante por inserción o adición de una secuencia que codifica para dicho antígeno o hapteno de una naturaleza de proteína para una secuencia de ADN que codifica para dicho fragmento de péptido de la proteína G de estreptococos. Los métodos para la síntesis de moléculas híbridas incluyen los métodos utilizados en manipulación genética para construir polinucleótidos híbridos que codifican para las secuencias de polipéptidos deseadas. Se puede hacer referencia de manera ventajosa, a la técnica para producir genes que codifican para proteínas de fusión la cual se describe por D.V. Goeddel (Gene expression technology, Methods in Enzymology, Vol. 185, 3-187, 1990). De acuerdo con la presente invención, el acoplamiento covalente se puede realizar mediante síntesis química. En una modalidad particular de la invención, será posible que uno o más elementos de enlace sean introducidos en por lo menos uno de los compuestos contenidos en la fracción de membrana y/o dicho antígeno o hapteno para facilitar el acoplamiento químico.

Preferiblemente, dicho elemento de enlace introducido es un aminoácido. De acuerdo con la invención, es posible introducir uno o más elementos de enlace, en particular aminoácidos, para facilitar las reacciones de acoplamiento entre un compuesto de la fracción de membrana, y dicho antígeno o hapteno. El acoplamiento covalente entre dicho compuesto entre la fracción de membrana y dicho antígeno o hapteno de acuerdo a la invención, se puede conseguir en el extremo N- o C-terminal de dicho compuesto de la fracción de membrana o de dicho antígeno o hapteno, si estos últimos son por ejemplo de naturaleza peptídica. Los reactivos bifuncionales que permiten el acoplamiento se determinarán de acuerdo al extremo seleccionado para el acoplamiento y a la naturaleza de dicho antígeno o hapteno que serán acoplados. La invención comprende además el uso de acuerdo con la invención, distinguido porque el acoplamiento entre dicho antígeno, hapteno y complejo y por lo menos uno de los compuestos contenidos en la fracción de membrana, se realiza mediante recombinación genética cuando dicho antígeno, hapteno o complejo y dicho compuesto de membrana son de naturaleza peptídica. El acoplamiento entre dicho antígeno, hapteno o complejo, y por lo menos uno de los compuestos contenidos en la fracción de membrana, se puede realizar desde luego, mediante recombinación genética. Será posible, por ejemplo, antes de extraer su fracción de membrana, transformar de antemano dicha bacteria gram negativa con un vector que contiene una construcción nucleica que codifica para un antígeno de interés o dicho complejo, de modo que la bacteria así transformada, exprese el antígeno de interés o dicho complejo unido a la membrana o anclado en la membrana de dicha bacteria. Tales métodos para expresar proteínas recombinantes unidas a la membrana son bien conocidos y requieren, por ejemplo, la presencia de una secuencia reguladora específica, tal como una secuencia de señal de tipo péptido. El objetivo de la invención es además el uso de acuerdo con la invención, distinguido porque la composición farmacéutica comprende además, un agente el cual hace posible transportar dicha fracción de membrana asociada con dicho antígeno, hapteno o complejo en una forma la cual haga posible aumentar su estabilidad y/o su inmunogenicidad, tal como en forma de una emulsión del tipo de aceite en agua o agua en aceite, o en forma de una partícula del tipo liposoma, microesfera o nanosfera, o cualquier tipo de estructura que permita la encapsulación y presentación en forma de partícula, o dicha fracción de membrana asociada con dicho antígeno, hapteno o complejo. La invención también se refiere al uso de conformidad con la invención, distinguido porque dicho agente se selecciona de sales de aluminio, sales de calcio, compuestos de origen vegetal tales como Quil A o saponina, o compuestos de origen bacteriano tales como los derivados de cólera, tos ferina o toxoide tetánico o de la toxina termolábil de E. coli. También se incluye en la presente invención el uso de acuerdo con la invención, distinguido porque la composición farmacéutica comprende además un agente que hace posible regular la respuesta inmune inducida por dicha fracción de membrana combinada con dicho antígeno, hapteno o complejo. Entre dichos agentes reguladores, se prefieren particularmente, citocinas, factores de crecimiento, hormonas o compuestos celulares tales como ácidos nucleicos, una proteína de la familia de proteínas de choque térmico o ribosomas. El objetivo de la invención es además el uso de acuerdo con la invención, para la preparación de una composición farmacéutica destinada para la prevención o tratamiento de enfermedades infecciosas de origen viral, bacteriano, fúngico, o parasitario, o para la prevención o tratamiento de cánceres, en particular, cánceres en los cuales los tumores estén asociados con antígenos tumorales. Entre dichas enfermedades infecciosas de origen viral, son particularmente preferidas las enfermedades infecciosas ocasionadas por paramixovirus, en particular por el virus de parainfluenza y preferiblemente por el virus sincitial respiratorio (RSV). En una modalidad particular, el uso de acuerdo con la invención se distingue porque dicho antígeno asociado con la fracción de membrana comprende el péptido G2Na, un fragmento de la proteína G del virus que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 4, un péptido homólogo a G2Na cuya secuencia presenta por lo menos 80%, preferiblemente 90%, 95% y 99% de identidad, después de alineación con la secuencia SEQ ID No. 4, o el péptido G2Na o uno de sus homólogos, covalentemente acoplado con un fragmento C- terminal (BB) de la proteína G de estreptococos para formar un complejo capaz de unirse a albúmina de suero de mamífero, péptido BB como se describe en los documentos Power et al., 1997 (Virology, 230, 155-166) y WO 96/14416. La expresión "porcentaje, grado o nivel de identidad" entre dos secuencias de ácido nucleico o aminoácidos, está destinada a denotar un porcentaje de nucleótidos o de residuos de aminoácidos idénticos entre las dos secuencias a comparar, obtenidos después de la mejor alineación, este porcentaje siendo puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias siendo distribuidas aleatoriamente sobre toda su longitud. Las comparaciones de secuencia entre dos secuencias de ácido nucleico o aminoácidos se realizan tradicionalmente comparando estas secuencias después de haberlas alineado óptimamente, dicha comparación realizándose por segmento o por "comparación de ventana" con el fin de identificar y comparar las regiones locales de similitud de secuencia. La alineación óptima de las secuencias para comparación se puede realizar ya sea manualmente o por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], por medio de algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], por medio del método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444], por medio de programas y sistemas de programación de cómputo que utilizan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Programas y Sistemas de Programación de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl, o con el programa y sistemas de programación de comparación BLAST N o BLAST P). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico o aminoácidos se determina contando estas dos secuencias óptimamente alineadas mediante la ventana de comparación en la cual, la región de la secuencia de ácido nucleico o aminoácidos a comparar puede comprender adiciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia para una alineación óptima entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas para las cuales el nucleótido o residuo de aminoácidos es idéntico entre las dos secuencias, dividiendo este número de posiciones idénticas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado obtenido por 100, con el fin de obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias. Por ejemplo, será posible utilizar el programa BLAST "BLAST 2 sequences", el cual está disponible en el sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gon7bls.html, los parámetros utilizados siendo aquéllos dados por omisión (en particular, para el parámetro de "sanción por espacio abierto": 5 y parámetro de "sanción por espacio de extensión": 2; la matriz seleccionada siendo por ejemplo, la matriz "BLOSUM 62" propuesta por el programa), el porcentaje de identidad entre las dos secuencias a comparar calculándose directamente mediante el programa.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para preparar una fracción de membrana de bacterias Gram negativas, en particular Klebsiella pneumoniae, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) cultivo de dichas bacterias en un medio de cultivo el cual permita su crecimiento, seguido de centrifugación de dicho cultivo; b) cuando sea apropiado, desactivación de las enzimas líticas de la pella bacteriana obtenida en el paso a), luego centrifugación de la suspensión obtenida; c) extracción y eliminación de las proteínas que no son de membrana y de los ácidos nucleicos de la pella obtenida en el paso a) ó b) con por lo menos un ciclo de lavado de la pella en una solución de extracción; d) digestión de la pella de membrana obtenida en el paso c) en presencia de enzimas proteasa, seguido de centrifugación; e) por lo menos un ciclo de lavado de la pella obtenida en el paso d) en una solución fisiológica y/o en agua destilada; f) tratamiento con ultrasonido de la pella obtenida en el paso e). La invención comprende además el método para preparar una fracción de membranas de bacterias Gram negativas, en particular Klebsiella pneumoniae, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) cultivo de dichas bacterias en un medio de cultivo el cual permite su crecimiento, seguido, cuando sea adecuado, de centrifugación; b) congelamiento del medio de cultivo o de la pella obtenida en el paso a), seguido de descongelamiento y secado de las células; c) eliminación, utilizando una DNasa, de los ácidos nucleicos de las células secas obtenidas en el paso b) las cuales han sido resuspendidas; d) trituración de las células obtenidas en el paso c) y clarificación de la suspensión obtenida; e) precipitación, en medio ácido, de la suspensión obtenida en el paso d) y eliminación de la pella; f) neutralización del sobrenadante obtenido en el paso e) que contiene la suspensión de membrana, seguido de diálisis y concentración de la suspensión de membrana; y g) esterilización de la suspensión de membrana concentrada obtenida en el paso f). Las fracciones de membrana las cuales se pueden obtener utilizando dichos métodos, por supuesto, forman parte de la invención. El contenido de proteoglucano de las fracciones de membrana que se pueden obtener utilizando dichos métodos, un ingrediente activo de FMKp, representado por la suma del contenido de galactosa y proteína, de preferencia está entre: - para la galactosa: entre 1.2 g/l y 3.4 g/l; - para las proteínas: entre 7.5 g/l y 14.9 g/l. Preferiblemente, este contenido será: - para la galactosa: entre 1.6 g/l y 2.6 g/l; - para las proteínas: entre 9.3 g/l y 11.7 g/l.

La invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden una fracción de membrana la cual se puede obtener utilizando los métodos que se reclaman en la invención, preferiblemente, dichas composiciones farmacéuticas, comprenden además, un antígeno, un hapteno o un complejo, como se definió anteriormente, asociado con dicha fracción de membrana, en particular como antígenos virales o complejos específicos para paramíxovirus, o los antígenos asociados con células tumorales. Desde luego, dichas composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención, pueden comprender además, los agentes tales como los vehículos y los agentes reguladores antes definidos. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención está caracterizada porque dicho antígeno asociado con la fracción de membrana comprende el péptido G2Na que tiene la secuencia SEQ ID No. 4 del virus sincitial respiratorio, uno de sus homólogos como se definió anteriormente, dicho péptido G2Na, o uno de sus homólogos, covalentemente acoplado con un fragmento C-termina! (BB) de la proteína G de estreptococos para formar un complejo capaz de unirse a albúmina de suero de mamífero. La leyenda de las figuras y ejemplos a continuación pretenden ilustrar la invención sin limitar de ninguna manera el alcance de la misma.

Leyendas de las figuras: Figura 1 : BBG2Na complementado con FMKp - estudio de dosis -respuesta (títulos IgG anti-G2Na en suero). * p < 0.05 (comparado con el grupo PBS). Figura 2: BBG2Na complementado con FMKp - títulos lgG1 e lgG2a anti-G2Na. Figura 3: BBG2Na complementado con FMKp - estudio de protección. Figura 4: Efecto adyuvante de FMKp hacia Immugrip (vacuna de influenza). * p < 0.05 comparado con el grupo no complementado ("0") en el mismo día de la recolección de muestra.

EJEMPLO 1 Producción de la fracción de membrana de K. Pneumoniae (FMKp) Método No. 1 La extracción de las membranas de K. Pneumoniae 1145 de la pella de centrifugación del paso, de preferencia es precedida por un paso para destruir las enzimas líticas de los componentes celulares contenidos en la pella, por ejemplo calentando la pella a 100°C, opcionalmente después redisolución en solución.

La extracción real de las membranas de la pella de la centrifugación, de preferencia se realiza al tratar los componentes celulares de la pella, después de destrucción opcional de las enzimas líticas con una solución salina, por ejemplo 1 M de cloruro de sodio, una o más veces, seguido de centrifugación, de preferencia a 20,000 g, de la suspensión obtenida, el sobrenadante de esta centrifugación, el cual es eliminado, contiene impurezas que no son de membrana tales como proteínas y ácidos nucleicos, mientras que ia pella contiene las membranas. Después de la separación de la solución salina que contiene las impurezas, las membranas son digeridas en presencia de enzimas proteolíticas, de preferencia tripsina y quimotripsina, en solución a pH 8, a 37°C durante 4 horas. Después de la digestión, la solución es homogeneizada mediante tratamiento con ultrasonido. El producto así obtenido constituye la fracción de membrana llama FMKp. El sobrenadante obtenido es nuevamente centrifugado bajo las mismas condiciones, de preferencia a 140 000 g.

Preparación de los glucopéptidos de membrana Esta fracción se prepara a partir de la pella obtenida mediante centrifugación a 40,000 g durante 20 minutos. Dicha pella es resuspendida en solución salina fisiológica y luego esta suspensión es calentada durante 10 minutos a 100°C en un baño de agua en ebullición para desactivar las enzimas líticas. Después de enfriamiento, el medio es centrifugado durante 30 minutos a 20,000 g. La pella obtenida es extraída 2 veces con 1M NaCI con el fin de eliminar las proteínas y los ácidos nucleicos. Las membranas son recuperadas mediante centrifugación durante 30 minutos a 20,000 g. Luego son sometidas a digestión con tripsina a pH 8 y a 37°C durante 4 horas, luego con quimotripsina bajo las mismas condiciones. Las membranas son entonces recuperadas mediante centrifugación a 2,000 g durante 30 minutos, lavadas con solución salina fisiológica y luego en agua destilada y sometidas a 15 minutos de desintegración por ultrasonido.

Método No. 2 Después de descongelarse a +4°C durante un mínimo de 48 horas, 1 kg de células secas de K. pneumoniae es resuspendido en células secas al 5%. Se añade DNasa a 5 mg/l. Luego, se realiza la trituración de Mantón Gaulin durante 30 minutos, seguido de una clarificación en SHARPLESS a 50 1/h, seguido de precipitación con ácido acético a pH = 4.2 + 0.1 durante 30 min. La pella es eliminada (SHARPLESS a 25 1/h) y el sobrenadante es neutralizado y diluido a 2 veces el volumen inicial con agua sometida a osmosis. Luego se realiza diálisis a volumen constante en PUF 100 hasta 800 Ocm, seguido de concentración de la suspensión de membrana (MS) obtenida, para 11 1/kg de células secas. La MS es entonces sometida a autoclave a +121°C durante 35 min y conservada a +4°C durante 6 semanas.

Características de la FMKp Por definición, el contenido de proteoglucano, un ingrediente activo de FMKp, es igual a la suma del contenido de galactosa y proteína, -galactosa: en promedio 2.2 g/l -proteínas: en promedio 10.5 g/l EJEMPLO 2 Efecto adyuvante de FMKp sobre una proteína recombinante, BBG2Na BBG2Na es una proteína recombinante producida en E. coli. Consta del péptido G2Na que tiene la secuencia SEQ ID NO 4, el fragmento de la proteína G del virus sincitial (RSV) tipo A que se extiende desde el residuo 130 hasta el residuo 230, fusionada con BB, un fragmento de la proteína G de estreptococos, que tiene la capacidad de unirse a albúmina de suero. BBG2Na es una vacuna anti-RSV (Power U. Virology 1997, 230:155-166). Ratones BALB/c reciben 2 inyecciones subcutáneas de 20 µm de BBG2Na y diferentes cantidades de FMKp. Se recolectan muestras sanguíneas en D28 y los títulos de anticuerpos en suero se determinan mediante ELISA con G2Na en fase sólida. Los resultados obtenidos se ilustran en la figura 1. De manera sorprendentemente, muestran que FMkp incrementa de manera significativa la respuesta de IgC anti-G2Na; el título IgG anti-G2Na alcanzado es similar a aquel inducido por adyuvante de alumbre o de Freund. El efecto depende de la dosis: se observa a partir de 5 µm de FMKp, es máximo de 50 µm de FMKp y permanece estable con 100 µm de FMKp. Por lo tanto, FMKp es un adyuvante potencial para BBG2Na. Para conocer el efecto de FMKp sobre la orientación de la respuesta inmune, en términos de la respuesta Th1/Th2, los títulos lgG1 y lgG2a anti-G2Na se determinaron en sueros obtenidos como se especificó anteriormente. Los resultados (figura 2) muestran, de manera sorprendente que FMKp es capaz de modificar la relación de igG1/lgG2a anti-G2Na, en contraste con lo observado con alumbre, para lo cual el isotipo predominante es lgG1. Este perfil es cercano a aquel inducido por el adyuvante de Freund. Esto indica que FMKp se puede utilizar como adyuvante de inmunidad para inducir una respuesta tipo (Th1/Th2) mixta. Los animales inmunizados como se describió anteriormente, recibieron un ataque viral por la vía nasal con 105 TCID50 de RSV-A. Esto se realizó 3 semanas después de la última inmunización. Cinco días después del ataque viral, los animales fueron sacrificados y los pulmones removidos con el fin de determinar los títulos de RSV-A. Los resultados (figura 3) muestran que los animales que recibieron BBG2Na complementado con FMKp están protegidos contra un ataque de RSV-A. En conclusión, FMKp hace posible reorientar la respuesta de anticuerpo sin afectar la capacidad para proteger a ratones en contra de un ataque de RSV-A.

EJEMPLO 3 Efecto adyuvante de FMKp sobre un virus inactivado (vacuna de influenza) Ratones BALB/c recibieron una inyección sencilla de 0.01 µg de Immugrip™ (vacuna de influenza comercializada por Laboratoires I NAVA), y diferentes cantidades de FMKp. Los productos son coadministrados. La inyección se realiza subcutáneamente en DO. Se recolectan muestran sanguíneas en D7, D14 y D21. El título de anticuerpo IgG en suero Anti-lmmugrip es determinado mediante ELISA con Immugrip a 2 µg/ml en fase sólida. Los resultados presentados (figura 4) muestran que FMKp incrementa de manera significativa el título de anticuerpo anti-lmmugrip, esto siendo a partir de la dosis más baja de FMKp, a saber 0.1 µg. El efecto adyuvante depende de la dosis. Se observa de manera interesante, que la presencia de FMKp induce la generación de una respuesta de anticuerpo temprana, obtenida de D7, en comparación con el control de Immugrip no complementado. Este efecto no se obtiene con el adyuvante de referencia, adyuvante de Freund completo (CFA).

LISTADO DE SECUENCIAS <110> PIERRE FABRE MEDICAMENT <120> FRACCIONES DE MEMBRANA BACTERIANAS CON EFECTO ADYUVANTE <130> D17975 <150> FR 99 03 153 <151> 1999-03-15 <150> PCT/FR00/00622 <151> 2000-03-15 <160> 2 <170> Patentln Vers . 2.0 <210> 1 <211> 1035 <212> ADN <213> Klebsiella pneuraoniae <220> <221> exdn <222> (1) .. (1032) <220> <221> intrón <222> (1033) .. (1035) <220> <221> CDS <222> (1) .. (1032) <400> 1 atg aaa gca att ttc gta ctg aat gcg gct ccg aaa gat aac acc tgg 48 Met Lys Ala He Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp 1 5 10 15 tat gca ggt ggt aaa ctg ggt tgg tec cag tat cae gac acc ggt ttc 96 Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe 20 25 30 tac ggt aac ggt ttc cag aac aac aac ggt ccg acc cgt aac gat cag 144 Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln 35 40 45 ctt ggt gct ggt gcg ttc ggt ggt tac cag gtt aac ccg tac etc ggt 192 Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly 50 55 60 ttc gaa atg ggt tat gac tgg ctg ggc cgt atg gca tat aaa ggc age 240 Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser 65 70 75 80 gtt gac aac ggt gct ttc aaa gct cag ggc gtt cag ctg acc gct aaa 288 Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys 85 90 95 ctg ggt tac ccg ate act gac gat ctg gac ate tac acc cgt ctg ggc 336 Leu Gly Tyr Pro He Thr Asp Asp Leu Asp He Tyr Thr Arg Leu Gly 100 105 110 ggc atg gtt tgg cgc gct gac tec aaa ggc aac tac gct tet acc ggc 384 Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly 115 120 125 gtt tec cgt age gaa cae gac act ggc gtt tec cea gta ttt gct ggc 432 Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly 130 135 140 ggc gta gag tgg gct gtt act cgt gac ate gct acc cgt ctg gaa tac 480 Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp He Ala Thr Arg Leu Glu Tyr 145 150 155 160 cag tgg gtt aac aac ate ggc gac gcg ggc act gtg ggt acc cgt ect 528 Gln Trp Val Asn Asn He Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro 165 170 175 gat aac ggc atg ctg age ctg ggc gtt tec tac cgc ttc ggt cag gaa 576 Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu 180 185 190 gat gct gca ccg gtt gtt gct ccg gct ccg gct ccg gct ccg gaa gtg 624 Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val 195 200 205 gct acc aag cae ttc acc ctg aag tet gac gtt ctg ttc aac ttc aac 672 Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn 210 215 220 aaa gct acc ctg aaa ccg gaa ggt cag cag gct ctg gat cag ctg tac 720 Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr 225 230 235 240 act cag ctg age aac atg gat ccg aaa gac ggt tec gct gtt gtt ctg 768 Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu 245 250 255 ggc tac acc gac cgc ate ggt tec gaa gct tac aac cag cag ctg tet 816 Gly Tyr Thr Asp Arg He Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser 260 265 270 gag aaa cgt gct cag tec gtt gtt gac tac ctg gtt gct aaa ggc ate 864 Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly He 275 280 285 ccg gct ggc aaa ate tec gct cgc ggc atg ggt gaa tec aac ccg gtt 912 Pro Ala Gly Lys He Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val 290 295 300 act ggc aac acc tgt gac aac gtg aaa gct cgc gct gcc ctg ate gat 960 Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu He Asp 305 310 315 320 tgc ctg gct ccg gat cgt cgt gta gag ate gaa gtt aaa ggc tac aaa 1008 Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu He Glu Val Lys Gly Tyr Lys 325 330 335 gaa gtt gta act cag ccg gcg ggt taa 1035 Glu Val Val Thr Gln Pro Ala Gly 340 <210> 2 <211> 344 <212> PRT <213> Klebsiella pneumoniae <400> 2 Met Lys Ala He Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp 1 5 10 15 Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe 20 25 30 Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln 35 40 45 Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly 50 55 60 Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser 65 70 75 80 Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys 85 90 95 Leu Gly Tyr Pro He Thr Asp Asp Leu Asp He Tyr Thr Arg Leu Gly 100 105 110 Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly 115 120 125 Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly 130 135 140 Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp He Ala Thr Arg Leu Glu Tyr 145 150 155 160 Gln Trp Val Asn Asn He Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro 165 170 175 Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln slu 180 185 190 Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val 195 200 205 Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn 210 215 220 Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr 225 230 235 240 Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu 245 250 255 Gly Tyr Thr Asp Arg He Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser 260 265 270 Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly He 275 280 285 Pro Ala Gly Lys He Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val 290 295 300 Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu He Asp 305 310 315 320 Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu He Glu Val Lys Gly Tyr Lys 325 330 335 Glu Val Val Thr Gln Pro Ala Gly 340

Claims (33)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de una fracción de membrana de Klebsiella pneumoniae, combinada con un antígeno o hapteno, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a orientar la respuesta inmune hacia una respuesta tipo Th1 y/o tipo Th1/Th2 mixta dirigida contra dicho antígeno o hapteno, en la cual la respuesta Th1 es cercana o mayor a la respuesta tipo Th2.

2.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la fracción de membrana comprende por lo menos fracciones de membrana de dos cepas diferentes de bacterias.

3.- El uso como el que se reclama en una de las reivindicaciones 1 y 2, en donde la fracción de membrana se prepara utilizando un método que comprende los siguientes pasos: a) cultivo de dichas bacterias en un medio de cultivo el cual permita su crecimiento, seguido de centrifugación de dicho cultivo; b) cuando sea apropiado, desactivación de las enzimas líticas de la pella bacteriana obtenida en el paso a), luego centrifugación de la suspensión obtenida; c) extracción y eliminación de las proteínas que no son de membrana y de ácidos nucleicos de la pella obtenida en el paso a) ó b) con por lo menos un ciclo de lavado de la pella en una solución de extracción; d) digestión de la pella de membrana obtenida en el paso c) en presencia de enzimas proteolíticas, seguido de centrifugación; e) por lo menos un ciclo de lavado de la pella obtenida en el paso d) en una solución fisiológica y/o en agua destilada; y f) tratamiento con ultrasonido de la pella obtenida en el paso e).

4.- El uso como el que se reclama en una de las reivindicaciones 1 y 2, en donde la fracción de membrana se prepara utilizando un método que comprende los siguientes pasos: a) cultivo de dichas bacterias en un medio de cultivo el cual permite su crecimiento, seguido, cuando sea adecuado, de centrifugación; b) congelamiento del medio de cultivo o de la pella obtenida en el paso a), seguido de descongelamiento y secado de las células; c) eliminación, por medio de una DNasa, de los ácidos nucleicos de las células secas obtenidas en el paso b) las cuales han sido resuspendidas; d) trituración de las células obtenidas en el paso c) y clarificación de la suspensión obtenida; e) precipitación, en un medio ácido, de la suspensión obtenida en el paso d) y eliminación de la pella; f) neutralización del sobrenadante obtenido en el paso e) que contiene la suspensión de membrana, seguido de diálisis y concentración de la suspensión de membrana; y g) esterilización de la suspensión de membrana concentrada obtenida en el paso f).

5.- El uso como el que se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho antígeno o hapteno se selecciona de los antígenos o haptenos específicos para un agente infeccioso o de los antígenos asociados con células tumorales.

6.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 5, en donde dicho antígeno o hapteno péptidos, lipopéptidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, lípidos o cualquier compuesto capaz de dirigir específicamente la respuesta inmune hacia una respuesta tipo Th1 y/o tipo Th1/Th2 mixta contra un antígeno o hapteno específico para un agente infeccioso o un antígeno asociado con una célula tumoral.

7.- El uso como el que se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho antígeno o hapteno está acoplado o combinado con dicha fracción de membrana.

8.- El uso como el que se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho antígeno o hapteno está covalentemente acoplado con un péptido de soporte para formar un complejo capaz de unirse específicamente a albúmina de suero de mamífero.

9.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 8, en donde dicho péptido de soporte es un fragmento de péptido derivado de proteína G de estreptococos.

10.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9, en donde dicho complejo se prepara mediante recombinación genética.

11.- El uso como el que se reclama en una de las reivindicaciones 7 a 10, en donde dicho antígeno, hapteno o complejo está covalentemente acoplado con por lo menos uno de los compuestos contenidos en la fracción de membrana.

12.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 11 , en donde el acoplamiento covalente es un acoplamiento realizado mediante síntesis química.

13.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 12, en donde están introducidos uno o más elementos de enlace en por lo menos uno de los compuestos contenidos en la fracción de membrana y/o en dicho antígeno, hapteno o complejo para facilitar el acoplamiento químico.

14.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 13, en donde dicho elemento de enlace introducido es un aminoácido.

15.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 11 , en donde el acoplamiento entre dicho antígeno, hapteno o complejo y por lo menos uno de los compuestos contenidos en la fracción de membrana, se realiza mediante recombinación genética cuando dicho antígeno, hapteno o complejo y dicho compuesto de membrana son de naturaleza peptídica.

16.- El uso como el que se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la composición farmacéutica comprende además, un agente el cual hace posible transportar dicha fracción de membrana asociada con dicho antígeno, hapteno o complejo en una forma la cual haga posible aumentar su estabilidad y/o su inmunogenicidad.

17.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 16, en donde dicho agente es una emulsión del tipo de aceite en agua o agua en aceite.

18.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 16, en donde dicho agente es una partícula del tipo liposoma, microesfera o nanosfera, o cualquier tipo de estructura que permita la encapsulación y presentación en forma de partícula de dicha fracción de membrana asociada con dicho antígeno, hapteno o complejo.

19.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 16, en donde dicho agente se selecciona de sales de aluminio, sales de calcio, compuestos de origen vegetal tales como Quil A o saponina, o compuestos de origen bacteriano tales como los derivados de cólera, tos ferina o toxoide tetánico o de la toxina termolábil de E. coli.

20.- El uso como el que se reclama en las reivindicaciones 1 a 19, en donde la composición farmacéutica comprende además un agente que hace posible regular la respuesta inmune inducida por dicha fracción de membrana combinada con dicho antígeno, hapteno o complejo.

21.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 20, en donde dicho agente regulador se selecciona de citocinas, factores de crecimiento, hormonas o compuestos celulares tales como ácidos nucleicos, una proteína de la familia de proteínas de choque térmico o ribosomas.

22.- El uso como el que se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 21 , para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la prevención o tratamiento de enfermedades infecciosas o cánceres.

23.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 22, en donde la enfermedad infecciosa es de origen viral, bacteriano, fúngico o parasitario.

24.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 23, para la preparación de una composición farmacéutica destinada para la prevención o tratamiento de infecciones por paramixovirus.

25.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 24, en donde el paramixovirus es un virus sincitial respiratorio.

26.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho antígeno asociado con la fracción de membrana comprende el péptido G2Na que tiene la secuencia SEQ ID No. 4, o uno de sus homólogos cuya secuencia presenta un grado de identidad de por lo menos 80%, con la secuencia SEQ ID No. 4.

27.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 26, en donde dicho péptido G2Na o uno de sus homólogos está covalentemente acoplado con un fragmento C-terminal (BB) de la proteína G de estreptococos para formar un complejo capaz de unirse a albúmina de suero de mamífero.

28.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 24, en donde el paramixovirus es un virus de parainfluenza.

29.- Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una fracción de membrana preparada por el método descrito en cualquiera de las reivindicaciones 3 y 4, y un antígeno o hapteno asociado con dicha fracción de membrana.

30.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque dicho antígeno es seleccionado de fragmentos de péptido de paramixovirus.

31.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque el paramixovirus es un virus sincitial respiratorio o un virus de parainfluenza.

32.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque dicho antígeno asociado con la fracción de membrana comprende el péptido G2Na que tiene la secuencia SEQ ID No. 4 del virus sincitial respiratorio o un péptido cuya secuencia presenta un grado de identidad de por lo menos 80% con la secuencia SEQ ID No. 4.

33.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque dicho péptido G2Na o uno de sus homólogos está covalentemente acoplado con un fragmento C-terminal (BB) de la proteína G de estreptococos para formar un complejo capaz de unirse a albúmina de suero de mamífero.