MXPA00005127A - Vacunas con un adyuvante de enterotoxina termolabil - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una vacuna que contiene por lo menos un inmunógeno en partículas y una cantidad adyuvante de subunidades B de enterotoxina termolábil característica de E. coli;más en particular, esta invención se refiere a vacunas en donde la LTB adyuvante estálibre de holotoxina o subunidades A contaminantes;paraeste fin, de preferencia, se hace uso de LTB preparada mediante técnicas de ADN recombinante;los inmunógenos en partículas pueden estar relacionados a, o se pueden derivar de, por ejemplo, virus, bacterias u hongos;esta vacuna es particularmente adecuada para la inducción de una respuesta protectora contra dicho inmunógeno en partículas después de administración en mucosas, por ejemplo, por vía intranasal;se encontróque dicha administración provee protección sistémica y en mucosas contra el patógeno con el cual el inmunógeno en partículas estárelacionado.

Description

VACUNAS CON UN ADYUVANTE DE ENTEROTOXINA TERMOLABIL MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a una vacuna que contiene las subunidades B de enterotoxina termolábil (LTB) de Escherichia coli (E. coli) como inmunoadyuvante en mucosas. La invención se refiere en particular a una vacuna de este tipo para prevenir infecciones por influenza en humanos. Sin embargo, la invención no está restringida a la aplicación en vacunas contra la influenza. El objetivo de la vacunación contra enfermedades infecciosas es prevenir o por lo menos restringir la infección del sujeto vacunado, estimulando una respuesta inmune contra el agente infeccioso mediante la introducción de una formulación de antígeno derivada del patógeno en particular. Idealmente, la respuesta inmune ¡nducida debe consistir de dos componentes, una respuesta humoral (la producción de anticuerpos específicos del antígeno) y una respuesta celular (la generación de linfocitos T citotóxicos específicos, capaces de eliminar a las células infectadas por el patógeno). Muchos procedimientos de vacunación implican la administración de una formulación que contiene patógeno intacto inactivado o atenuado. Sin embargo, en el caso de ciertos patógenos, existe una desventaja considerable para la vacunación con el patógeno intacto, puesto que dichas preparaciones, aun cuando son usualmente altamente inmunógenas, pueden tener efectos secundarios indeseables. Esto explica la tendencia actual hacia el uso de vacunas sintéticas o vacunas de subunidades bien definidas, que carecen sustancialmente de los efectos secundarios adversos del agente infeccioso intacto. Sin embargo, comparativamente con el patógeno intacto, las vacunas sintéticas o las vacunas de subunidades no son con frecuencia muy inmunógenas, por lo menos en ausencia de un adyuvante añadido. Los adyuvantes son sustancias o materiales administrados en conjunto con el antígeno para estimular la respuesta inmune contra ese antígeno. Existe la necesidad de adyuvantes apropiados que potencien la respuesta inmune contra antígenos sintéticos o antígenos de subunidades, sin causar efectos secundarios indeseables. Las formulaciones de la vacuna contra la influenza han contenido durante mucho tiempo, y en algunos casos aún contienen, virus intactos inactivados o atenuados. Dichas formulaciones pueden tener efectos secundarios considerables, más notablemente fiebre y reacciones en el sitio de inyección. Hoy en día, la vacunación se realiza usualmente con una formulación de subunidades. Esta vacuna de subunidades, la cual causa menos reacciones secundarias, contiene únicamente los dos antígenos de superficie principales del virus, la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA), en una forma más o menos purificada. En la mayoría de las formulaciones actuales de vacuna, no existe adyuvante presente añadido.

La vacuna del virus de la influenza intacto inactivado o atenuado, así como también la vacuna de subunidades, se administran usualmente mediante una inyección intramuscular (i.m.) individual. La protección contra la infección de la influenza lograda mediante cualquier procedimiento de vacunación es comparativamente reducida, particularmente en personas de edad avanzada. La eficacia relativamente reducida de la vacunación contra la influenza se debe en parte a la alta variabilidad antigénica del virus. Sin embargo, hay razones para pensar que la protección contra la infección por la influenza mediante la vacunación se puede mejorar mediante estimulación y/o modificación de la respuesta inmune ante el antígeno. En el caso de la influenza, o en general en casos en los cuales la infección es contraída mediante el tracto respiratorio, las estrategias para la eficacia mejorada de la vacunación deben dirigirse a la generación no sólo de una respuesta adecuada de la IgG dependiente de células T en la circulación, sino también una respuesta inmune local (IgA secretoria) en los pulmones y la cavidad nasal, como primera línea de defensa ante el virus infeccioso invasor. Además, una respuesta inmune celular (células T citotóxicas) podría ser también importante, particularmente para restringir la infección. Se ha demostrado que la administración de la vacuna contra la influenza mediante inyección intramuscular (la vía de administración usual), no da como resultado una respuesta local de la IgA en el trato respiratorio. La presente invención se refiere al hallazgo sorprendente de que la presencia de LTB en una formulación de vacuna intranasal no únicamente estimula la respuesta de la IgG en la circulación, respecto a la inmunización intramuscular con la vacuna inmunógena libre de adyuvante, sino también genera una respuesta local de la IgA en el tracto respiratorio. La enterotoxina termolábil (LT) intacta y su congénere, la toxina del cólera (CT), están formadas de una subunidad A y una estructura pentámera de anillo que consiste de cinco subunidades B idénticas. La subunidad A tiene actividad enzimática de ribosilación de ADP, y atribuye la actividad tóxica a las toxinas. En el epitelio intestinal, la subunidad A induce la síntesis persistente del segundo mensajero, el AMPc, dando como resultado secreción excesiva de electrolitros y fluido concomitante hacia el lumen del intestino. LT y CT son inmunógenos poderosos en mucosas. Después de la administración local en mucosas, estas moléculas dan lugar no sólo a la inducción de una respuesta de anticuerpo sistémica dirigida contra la toxina, sino también a la producción de anticuerpos localmente secretados, notablemente IgA secretoria (S-lgA). LT y CT son también inmunoadyuvantes poderosos en mucosas. Es decir, cuando son coadministradas con otro ¡nmunógeno no relacionado, LT o CT pueden estimular la respuesta de anticuerpo sistémica y en mucosas contra ese inmunógeno. Sin embargo, la toxicidad de LT o CT hasta ahora ha excluido esencialmente el uso de LT o CT en formulaciones de vacunas para humanos. En intentos por separar las actividades tóxicas de las actividades estimulatorias inmunes de LT o CT, se han examinado mutantes destoxif icados de las toxinas, o la subunidad B pentámera asilada no modificada (LTB o CTB, respectivamente), para determinar su actividad inmunoadyuvante. Claramente, puesto que la actividad tóxica de ribosilación de ADP de las toxinas reside en la subunidad A, la presencia de cantidades incluso mínimas de la subunidad A no modificada o de la holotoxina de LT o CT en una vacuna humana, es altamente indeseable. El uso de LTB como adyuvante para antígenos de influenza ha sido investigado por Tamura y colaboradores (Hirabashi et al.: Vaccine 8: 243-248 [1990]; Kikuta et al.: Vaccine 8: 595-599 [1990]; Tamura et al. J.: Immunology 3: 981-988 [1992]; Tamura et al.: Vaccine 12: 419-426 [1994]; Tamura et al.: Vaccine 12: 1083-1089 [1994]. En estos estudios, con base en el uso de una vacuna soluble de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza, extraída y purificada a partir del virus de la influenza mediante tratamiento con Tween/éter de acuerdo con Davenport et al (J. Lab. d Clin. Med. 63 (1): 5-13 [1964], se estableció que la LTB, libre de la subunidad A, carece de actividad inmunoadyuvante en mucosas cuando se administra intranasalmente en conjunto con el antígeno AH soluble en ratones. Se demostró además que la presencia de cantidades mínimas de holotoxina, por ejemplo holotoxina residual que permanece en preparaciones de la subunidad B aislada de holotoxina, restaura la expresión de la actividad adyuvante de la LTB hacia el antígeno HA soluble. Más en particular, cuando se usó LTB de fuentes recombinantes (y por lo tanto, completamente libres de incluso las cantidades mínimas más pequeñas de la subunidad A), se tuvo que añadir una cantidad mínima de holotoxina para que la LTB ejerciera su actividad en mucosas después de coadministración ¡ntranasal con el antígeno HA soluble. Sorprendentemente, se encontró que la LTB aislada de origen recombinante, y por lo tanto completamente libre de la subunidad A, posee actividad inmunoadyuvante poderosa, dependiendo de la naturaleza o la forma de presentación del inmunógeno coadministrado intranasalmente. Por ejemplo, la actividad adyuvante hacia antígenos solubles pequeños mezclados libremente, tales como la ovoalbúmina o el ectodominio soluble de la glucoproteína de la cubierta del virus de inmunodeficiencia humana (gp 120), es reducida y con frecuencia ¡ndetectable. Por otra parte, se encontró que la LTB ejerce actividad adyuvante muy poderosa hacia grandes inmunógenos agregados o en partículas mezclados libremente. Estos inmunógenos incluyen el antígeno de la subunidad del virus de influenza y la hemocianina de lapa (KLH). Por consiguiente, la presente invención se refiere a una vacuna que contiene por lo menos un inmunógeno en partículas y una cantidad adyuvante de LTB completamente libre de la subunidad A o la holotoxina LT tóxica. Como se define en la presente, "en partículas" significa cualquier asociación de antígenos virales, bacterianos o de hongos característicos de los microorganismos respectivos. Más en particular, el término "inmunógeno en partículas" comprende agregados, grupos, micelas, virosomas, rosetas, partículas inmunógenas en forma de virus, y similares.

En la vacuna de conformidad con la presente invención, en particular, se puede utilizar LTB preparada a partir de tecnología de ADN recombinante. El inmunógeno o los inmunógenos se pueden derivar de agentes infecciosos, tales como virus o bacterias. Se encontró que las vacunas que se aplican a la descripción anterior no sólo inducen la inmunoglobulina sistémica (por ejemplo, IgG), contra el inmunógeno con la administración en mucosas (por ejemplo, intranasal), sino se encontró también que inducen la secreción local de IgA. Esta última propiedad es particularmente favorable para la inmunización contra enfermedades las cuales son transmitidas por infección de las mucosas con virus (tales como virus de influenza, virus de herpes, virus de papiloma), o bacterias (tales como Chlamydia, neumococos), u hongos. Una ventaja particular de la administración en mucosas es la facilidad de aplicación de la vacuna que, además, evita la fobia potencial que se le tiene a las agujas en el caso de vacunas que se usan en inmunización intramuscular. Aunque, por ejemplo en el caso de la infección por influenza, altos títulos de IgG en suero son importantes para prevenir la dispersión sistémica del virus, y proteger a los pulmones contra la infección, los anticuerpos S-lgA locales son cruciales como una primera línea de defensa para proteger al tracto respiratorio superior. Se ha reportado que la vacunación en mucosas, mediante la administración intranasal del virus de la influenza inactivado, en ausencia de un adyuvante en mucosas, no fue exitosa (Clancy: Drugs 50: 587-594 [1995]; Katz et al.; Infect. Dis. 175: 352-369 [1997], debido probablemente a que la administración directa de un antígeno al tejido de la mucosa no da como resultado una respuesta de S-lgA. La coadministración de un adyuvante en mucosas parece ser un prerrequisito para inducir una respuesta inmune local contra un inmunógeno. Notablemente, se encontró que mediante inmunización ¡ntranasal de conformidad con la presente invención, el denominado sistema inmune de mucosas común es activado, lo cual da como resultado la secreción de S-lgA no sólo en el sitio de aplicación (i.n.), sino también en tejidos de mucosas distantes (por ejemplo, en el tejido de la mucosa vaginal). De conformidad con la presente invención, las vacunas pueden contener inmunógenos, por ejemplo, de origen viral o bacteriano, tales como antígenos bacterianos, subunidades virales (opcionalmente inactivadas), virus separados (opcionalmente inactivados), bacterias o virus inactivados, o virus vivos atenuados (por ejemplo, adaptados al frío), en forma de partículas. La LTB usada de conformidad con la presente invención está estrictamente libre de LTA tóxica u holotoxina tóxica. De preferencia, la LTB se prepara mediante tecnología de ADN recombinante. En el presente contexto, libre de LTA tóxica significa estrictamente libre de LTA. En la vacuna de conformidad con la presente invención, la LTB se puede usar libremente mezclada con el antígeno en partículas, es decir, se puede establecer un acoplamiento covalente entre el antígeno y el adyuvante; sin embargo, no es necesario lograr un efecto adyuvante adecuado. Aparte de la LTB y uno o más inmunógenos, la vacuna de conformidad con la presente invención puede contener un solvente acuoso, en particular un regulador de pH, más en particular PBS (solución salina regulada en su pH con fosfato), así como también un estabilizador (por ejemplo, PEG o metil celulosa), y o glucosa. Los componentes de la vacuna de conformidad con la presente invención pueden ser secados por congelación, o estar en forma líquida. La vacuna de conformidad con la presente invención puede estar presente, por ejemplo, no envasada, o en una ampolleta, o en una jeringa, o en un nebulizador. La vacuna de conformidad con la presente invención se puede administrar mediante aplicación subcutánea, o intramuscular, o intrabronquial, o intranasal, o intravaginal, o por vía oral.

EJEMPLO 1 Preparación de LTB recombinante y antígeno de subunidades de influenza LTB recombinante Genes para LTB recombinante y moléculas de LTB recombinantes, como se menciona en la presente invención, se pueden derivar de genes que codifican para moléculas de LT-I a partir, por ejemplo, de una fuente de porcino o humano. El gen para LT (pLT) de porcino fue subclonado en el vector pUC18 (Vieira y Messing: Gene 19: 259-268 [1982] usando técnicas de PCR (DeHaan et al.: Vaccine 14: 260-266 [1996]. El vector EWD299, descrito originalmente por Dallas et al. (J. Bacteriol, 139: 850-858 ]1979], se usó como molde en la reacción de PCR. Se encontró que la secuencia primaria de pLT de esta construcción está exactamente de acuerdo con la secuencia primaria de pLT como se refiere en el banco de datos de la secuencia de EMBL, según se verifica mediante secuenciación de ADN. A partir de la construcción pUC18-pLT, el gen para pLTB fue subclonado en el vector de expresión pROFIT, el cual contiene un promotor ?PR inducible por temperatura (van der Linden et al.: Eur. J. Biochem. 204: 197-202 [1992]). Se usó MC1061 de E. coli como cepa hospedera para las construcciones de plásmido pROFIT. Las bacterias fueron cultivadas en medio de Luria-Bertani que contenía 50 µg de kanamicina por ml. La inducción de la expresión de pLTB se obtuvo elevando la temperatura de cultivos MC1061 de fase logarítmica que alojan al vector pROFIT-LTB, de 28 a 42 grados Celsius, como es descrito por De Haan et al. (citado anteriormente). PTLTB, un vector de expresión derivado de pKK (Pharmacia Ltd.) que codifica para LTB de humano (es decir, un gen para LTB derivado de un gen para LT aislado de la bacteria E. coli enterotoxigénica en humanos), fue obtenido por Tamura y colaboradores. La secuenciación del ADN reveló tres sustituciones de aminoácidos en la LTB madura de humano (hLTB), comparativamente con pLTB (Thr4 a Ser, Glu46 a Ala y Lys102 a Glu). Se usó la cepa JM101 de E. coli como hospedero para pTLTB. Las bacterias fueron cultivadas en medio LB que contenía 100 µg de ampicilina por ml. La inducción de la expresión de hLTB se obtuvo mediante la adición de IPTG a cultivos de JM101 de fase logarítmica que alojan a pTLTB hasta una concentración final de 5 mM. Para la purificación de pLTB y hLTB, las bacterias que mostraban expresión excesiva fueron cosechadas y usadas entonces mediante tratamiento con sonido. Subsecuentemente, los restos de células fueron removidos mediante ultracentrifugación. Los extractos crudos de células que contenían pLTB o hLTB recombinantes, fueron aplicados entonces a una columna de D-galactosa (Pierce) inmovilizada. Después de lavado excesivo, se obtuvieron pLTB o hLTB purificadas recombinantes mediante elución con D-galactosa, como fue descrito previamente por Uesaka et al. (Microb. Path. 16: 71-76 [1994]). Se encontró que pLTB y hLTB recombinantes retienen propiedades óptimas de unión a GM1 en una prueba de ELISA de captura de GM1 , según se describió previamente (DeHaan et al.: Vaccine 14: 260-266 [1996]). Las fracciones de columna que contenían proteína purificada fueron agrupadas, dializadas contra PBS y almacenadas a 4°C.

Antíqeno de subunidades de influenza Se preparó antígeno de subunidades de influenza a partir de virus B/Harbin/7/94 (B/Harbin) o a/Johannesburg/33/94 (A Johannesburg) desarrollado en huevos de pollo embrionados de acuerdo con el método descrito por Bachmayer et al. (especificación de patente GB 1 498 261 del 18 de enero de 1978) y por Chaloupka et al. (Eur. J. Microbiol. Infecí. Dis. 15: 121-127 [1996]). Este método comprende los pasos de tratamiento de los virus inactivados por formaldehído con un detergente catiónico adecuado y separación de los antígenos liberados (hemaglutinina y neuraminidasa), a partir del núcleo residual del virus. Este método conduce a la obtención de partículas, es decir, exposición de los antígenos en forma de micelas, después de la remoción de detergente. Se determinó la potencia de las preparaciones de antígeno de subunidades, expresada como µg por ml, en una prueba de difusión radial individual de conformidad con Wood et al. (J. Biol. Stand. 5: 237-241 [1977]).

EJEMPLO 2 Respuesta de anticuerpo sistémica a la vacuna de subunidades de influenza Grupos de cuatro ratones fueron inmunizados intranasalmente sin anestesia con 5 µg de antígeno de subunidades de influenza derivado de virus B/Harbin o A/Johannesburg preparado de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 1. El antígeno fue administrado solo (HA) o junto con 2.0 µg de pLTB, en todos los casos en un volumen de 20 µg en los días 0, 7 y 14. Los ratones control recibieron el mismo volumen de PBS. Los ratones fueron sacrificados en el día 28. Se determinó la respuesta de anticuerpo de IgG en suero en una prueba de ELISA directa. La figura 1 muestra las respuestas observadas de anticuerpo IgG en suero contra HA B/Harbin (barras oscuras) y HA A/Johannesburg (barras claras). La administración nasal del antígeno de subunidades sin adyuvante dio una respuesta de anticuerpo sistémica deficiente, mientras que la complementación del antígeno de subunidades con pLTB incrementó la respuesta de anticuerpo en suero en más de dos ordenes de magnitud. Las diferencias entre las respuestas de ratones inmunizados con B/Harbin y A/Johannesburg no fueron significativas. Estos resultados muestran que la pLTB no tóxica es un adyuvante poderoso capaz de inducir altas respuestas de anticuerpo sistémicas hacia antígenos de subunidades de influenza administrado intranasalmente.

EJEMPLO 3 Comparación de las respuestas de anticuerpo sistémicas con LTB de humano y de porcino Grupos de cuatro ratones fueron inmunizados intranasalmente sin anestesia con 5 µg de antígeno de subunidades de influenza derivado de virus de influenza B/Harbin preparado de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 1. El antígeno fue administrado solo o junto con 2.0 µg de pLTB (pLTB) o 2.0 µg de hLTB (hLTB), en todos los casos en un volumen de 20 µl en los días 0, 7 y 14. Los animales control recibieron PBS. Los ratones fueron sacrificados en el día 21. La respuesta de anticuerpo de IgG en suero se determinó en una prueba de ELISA directa en el día 21. La figura 2 muestra la respuesta observada de anticuerpo de IgG en suero contra HA B/Harbin. La administración nasal de antígeno de subunidades sin adyuvante, dio de nuevo respuestas de anticuerpo sistémicas pobres, mientras que la complementación del antígeno de subunidades con pLTB y con hLTB incrementó la respuesta de anticuerpo en suero al mismo grado en más de dos ordenes de magnitud. Las diferencias observadas entre animales tratados con pLTB y hLTB, no fueron significativas.

EJEMPLO 4 Inducción de respuesta de anticuerpo local en mucosas a la vacuna de subunidades de influenza Para investigar la capacidad de pLTB para evocar respuestas de S-lgA específicas de HA de influenza, los lavados nasales de los ratones del ejemplo 2 fueron analizados para determinar la presencia de anticuerpos IgA específicos de influenza. Los lavados nasales se obtuvieron aplicando con chorro 0.5 ml de PBS en forma retrógrada de la nasofaringe a la parte superior de la tráquea, realizando la misma operación, y recogiendo el fluido de lavado en los nostrilos. Los resultados se muestran en la figura 3. Los datos muestran que la pLTB recombinante indujo fuertes respuestas locales de S-lgA contra HA. Los dos antígenos de subunidades de influenza diferentes dieron resultados similares.

EJEMPLO 5 Comparación de la respuesta de anticuerpo en mucosas con LTB de humano y de porcino Para comparar las capacidades de pLTB y hLTB para incrementar respuestas de anticuerpo nasales específicas de HA, se tomaron en cuenta los lavados nasales de los ratones del ejemplo 3 como se describió anteriormente, y se analizaron para detectar la presencia de S-lgA específica de HA en el día 21. La figura 4 muestra que pLTB y hLTB indujeron respuestas de anticuerpo enérgicas específicas de HA nasal. Además, las respuestas obtenidas con pLTB y hLTB fueron comparables en magnitud, demostrando que ambas moléculas tienen propiedades adyuvantes comparables.

EJEMPLO 6 Inducción de respuesta de anticuerpo en mucosa genital a la vacuna de subunidades de influenza aplicada intranasalmente Para investigar la capacidad de la pLTB recombinante para evocar respuestas de S-lgA específicas de HA de influenza en sitios de mucosa diferentes del sitio de administración, se investigó la inducción de anticuerpos S-lgA específicos de influenza en el tracto genital después de inmunización intranasal en los ratones del ejemplo 2. Se realizaron lavados del tracto urogenital introduciendo y extrayendo un volumen de 100 µl de PBS 10 veces en la vagina usando la punta de una pipeta. Los lavados de la mucosa fueron almacenados a 4°C hasta la determinación de su contenido de IgA mediante prueba de ELISA. Los resultados se muestran en la figura 5. Los resultados muestran que la pLTB probó ser eficaz para inducir respuestas de S-lgA en este sitio de mucosa distante. Los antígenos B/Harbin y A/Johannesburg respondieron igualmente bien.

EJEMPLO 7 Cinética de la respuesta de IqG Cuatro grupos de ocho ratones BALB/c hembras (de 6 a 8 semanas) fueron tratados de la manera siguiente: Control tratado con PBS sin antígeno. 20 µl intranasalmente sin anestesia en los días 0, 7 y 14. pLTB 5 µg de HA y 2.0 µg de pLTB recombinante en 20 µl aplicados intranasalmente sin anestesia en los días 0, 7 y 14. HA s.c. 5 µg HA en 100 µl aplicados subcutáneamente sin anestesia en el día 0. Conv. ratones convalecientes, es decir, ratones infectados con 108 unidades infecciosas de virus PR8, en 20 µl aplicados intranasalmente sin anestesia en el día 0. Se obtuvieron muestras de sangre de cuatro ratones de cada grupo, de la vena de la cola en los días 6, 13 y 20. Además, en el día 28, todos los ratones fueron sacrificados y desangrados. En cada muestra, se midió la IgG en suero mediante prueba de ELISA. Los resultados se muestran en la figura 6. Las barras (de izquierda a derecha) para cada uno de los regímenes de vacunación, representan los títulos de IgG en los días 6, 13, 20 y 28, respectivamente.

Estos resultados muestran que después de la vacunación intranasal con HA/pLTB, la inducción de IgG es de por lo menos la misma magnitud que después de la vacunación subcutánea con HA sola, o como en ratones convalecientes.

EJEMPLO 8 Anticuerpos en mucosa nasal y pulmonar Los mismos ratones que se estudiaron en el ejemplo 7 fueron sometidos a lavados de la mucosa de la cavidad nasal y el trato urogenital después de ser sacrificados en el día 28, como se describió anteriormente. Los resultados se resumen en la figura 8. Las barras sombreadas representan los datos de los lavados nasales, y las barras claras muestran los datos de los lavados vaginales. Los resultados indican que el título de la primera línea de los anticuerpos de defensa (S-lgA) después de vacunación intranasal con HA/pLTB, es de por lo menos la misma magnitud que el título de S-lgA en ratones convalecientes, mientras que la vacunación subcutánea clásica con HA, no llevó a un título de IgA detectable en mucosas.

EJEMPLO 9 Protección de ratones vacunados ante la exposición Cuatro ratones de cada uno de los grupos del ejemplo 7 fueron infectados en el día 28 con 5x106 unidades infecciosas de virus PR8 intranasalmente en 20 µl sin anestesia. Tres días después de la exposición, la carga de virus se determinó en la nariz y el pulmón. Se llevó a cabo titulación del virus en homogeneizados de nariz y pulmón en células MDCK las cuales fueron cultivadas en EPISERF (Life Technologies, PAISLY, Escocia) en placas de microtítulo mediante diluciones de dos pasos, y mediante determinación de punto terminal subsecuente usando hemaglutinación con eritrocitos de conejillas de Indias. Los resultados se resumen en la figura 7. Las barras sombreadas representan los títulos del virus en la nariz, y las barras claras corresponden a los pulmones. Los títulos del virus en los pulmones para ratones convalecientes y después de vacunación con pLTB fueron insignificantes. Por lo tanto, estos datos muestran que mediante el uso de pLTB como adyuvante en mucosas, la protección contra la infección por influenza es completa.

Claims (7)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una vacuna para administración en mucosas, caracterizada porque contiene por lo menos un ¡nmunógeno en partículas y una cantidad adyuvante de subunidades B de enterotoxina termolábil (LTB) característica de E. coli, completamente libre de la subunidad A u holotoxina LT tóxica.

2.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la LTB se prepara mediante métodos de ADN recombinante.

3.- La vacuna de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada además porque se usan antígenos virales o bacterianos o de hongos como inmunógeno.

4.- La vacuna de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada además porque el inmunógeno provee inmunización contra una enfermedad la cual se trasmite mediante infección de mucosas.

5.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque se usan antígenos de influenza como ¡nmunógeno.

6.- El uso de las subunidades B de enterotoxina termolábil (LTB) características de E. coli, completamente libre de la subunidad A u holotoxina LT tóxica, en la preparación de una vacuna que comprende un inmunógeno en partículas y una cantidad adyuvante de dicha LTB adecuada para la inducción de una respuesta sistémica de inmunoglobulina contra dicho inmunógeno en un individuo después de administración en mucosas.

7.- El uso de las subunidades B de enterotoxina termolábil (LTB) características de E. coli, completamente libre de la subunidad A u holotoxina LT tóxica, en la preparación de una vacuna que comprende un inmunógeno en partículas y una cantidad adyuvante de dicha LTB adecuada para la inducción de una respuesta inmune común en mucosas contra dicho inmunógeno en un individuo después de administración local en mucosas.