CN100335130C - 疫苗 - Google Patents

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Abstract

在此公开了如下作用剂作为免疫调节剂用于抗感染性疾病疫苗的用途：(ⅰ)无全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ⅱ)具有GM1-结合活性、不同于EtxB或GxB的作用剂，或者是具有Gb3-结合活性、不同于VtxB的作用剂；或(ⅲ)对于由GM-结合或Gb3结合介导的细胞内信号事件具有影响的作用剂。

Description

疫苗
本发明涉及一种用于疫苗的免疫调节剂，并计划将这种疫苗用于对抗多种传染性病原体。进而，本发明还涉及一种包含这种免疫调节剂的疫苗组合物，以及应用此免疫组合物进行免疫接种的方法，优选地是这种免疫调节剂与抗原组合在一起。
霍乱毒素(Ctx)和与之密切相关的大肠杆菌热不稳定性肠毒素(Etx)是强有力的免疫原和粘膜佐剂。但是，它们固有的毒性致使它们不适合用于人。例如，虽然对于实验动物Ctx是最常用的粘膜佐剂，但是由于它强有力的诱发腹泻的特性而不适合用于人。已试图使毒性与佐剂活性分离开，例如通过使用Ctx和Etx的成份作为其全毒素本身的替换物。大肠杆菌Vero细胞毒素(Vtx)是另一种已知的细菌毒素。
Ctx和Etx是由酶活性亚单位A及五聚体亚单位B组成的异六聚体蛋白。已知CtxB和EtxB结合于GM1-神经节苷脂(GM1)，这是一种被发现普遍存在于哺乳动物细胞表面的糖神经鞘脂。Vtx结合于与GM1相似类型的受体Gb3。
在试图防止疫苗研制的毒性问题时，先前已对非毒性亚单位B的佐剂活性进行了研究。但是，许多报告描述的是用CtxB或CtxB的商品制剂进行的实验。这些制剂不可避免地被小量的但生物有效量的活性毒素所污染。因此，不能将归因于亚单位B的佐剂活性与全毒素的佐剂活性区分开(Wu和Rwssell(1993)，感染与免疫61：314-322，US-5182109)。随后使用重组CtxB(xCtxB)进行的研究已表明，CtxB是不良的粘膜佐剂，只有加入天然全毒素才能诱发强旁观性应答(bystander responses)(Tamnra等(1994)疫苗12：419-426)。另一些研究已表明，rctxB缺乏全毒素的ADP-核糖基化活性和cAMP-刺激活性，并且表明，因为佐剂机制与这些能力相关联，所以CtxB不适合用作佐剂(Vaidy和Lycke(1992)，免疫学75：488-492，Lycke等(1992)，欧洲免疫学杂志22：2277-2281，Douce等(1997)。盛染与免疫65：2821-2828)。
在另一个研究中，鼻内给予使用rCtxB作佐剂的卵清蛋白导致了不良的抗体应答。在亚单位A中具有突变的CtX非毒性衍生物也对旁观抗原(bystander antigens)产生微弱的应答，而存在活性亚单位A却显著地提高了佐剂活性，表明活性亚单位A是必不可少的(Douce等(1997)同上)。
还已显示，可以用rCtxB和rEtxB增进对异源性抗原的耐受性(Sum等(1994)国家科学院学报91：4610-4614，Sum等(1996)国家科学院学报93：7196-7201，Bergerot等(1997)国家科学院学报94：4610-4614，Williams等(1997)国家科学院学报94：5290-5295)，表明这些分子可能不适合于用作佐剂。
本发明的基础
尽管本领域一般认为CtxB和EtxB具有不良的佐剂活性，并且实际上可以用作耐受原，但是，本发明者仍然在鼠模型中研究了rEtxB(因此不含有残留的全毒素或亚单位A)在鼻内HSV疫苗中的用途，并且惊人地发现，它能够刺激对病毒攻击的保护性免疫应答。特别是本发明者发现：
i)作用剂如EtxB和CtxB可刺激产生高水平的局部(粘膜)抗体(虽然使用rEtxB的免疫接种比使用Ctx/CtxB组合刺激产生了较低水平的全血清抗体)；
ii)所产生抗体的分布偏移向非补体性固定抗体，特别是S-IgA和IgG1；
iii)作用剂如EtxB和CtxB还可刺激局部和全身的T-细胞增殖性应答；
iv)作用剂如CtxB和EtxB有助于使免疫应答从Th1-关性应答转变为Th2-相关性应答；
v)当使用作用剂如CtxB和EtxB作免疫调节剂时，可避免Th2-相关性应答的某些有害作用，如产生IgE；
vi)与rCtxB相比较，rEtxB是更有效的免疫调节剂；
vii)作用剂如EtxB和CtxB能够改变抗原呈递细胞用于内在化和加工处理抗原的方式，增加抗原的持续性；
viii)如果使作用剂如BtxB和CtxB连接于一种抗原，那末可能通过改变对此免疫调节剂的连接而改变对该抗原的加工处理途径；以及
ix)VtxB在体外对白细胞群行使类似于由EtxB和CtxB行使的免疫调节作用。
这些重要的发现是本发明诸方面的基础，并且使本发明者能够预料到，可结合于GM1或Gb3的，或者可模拟对GM1或Gb3结合作用的纯EtxB，CtxB和VtxB以及其它作用剂作为免疫调节剂是有用的，可在疫苗中用于对抗HSV-1感染以及其它感染的预防和治疗性免疫接种，对这些感染的预防和治疗将从上面列举的免疫调节作用类型获得益处。
对免疫应答的刺激作用
能够结合于GM1或Gb3的，或者能够模拟对GM1或Gb3结合作用的EtxB，CtxB，VtxB和其它作用剂，可以起免疫调节剂的作用并刺激针对抗原攻击的特异性免疫应答。
根据本发明的第一方面，在此提供了下列作用剂作为对抗感染性疾病疫苗的免疫调节剂的用途：
(i)无全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；
(ii)具有GM1-结合活性，不同于EtxB或CtxB的作用剂，或者是具有Gb3-结合活性、不同于VtxB的作用剂；或
(iii)对由GM1-结合或Gb3-结合介导的细胞内信号传输过程具有影响的作用剂。
根据本发明的第二方面。在此提供了一种用于针对感染性疾病的疫苗组合物，这些感染性疾病是由感染性病原体引起的，其中疾疫苗组合物包含一种抗原决定因子和选自如下作用剂的免疫调节剂；
(i)无全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；
(ii)具有GM1-结合活性、不同于EtxB或CtxB的作用剂，或者是具有Gb3-结合活性、不同于VtxB的作用剂；或
(iii)对由GM1-结合或Gb3-结合介导的细胞内信号传输过程具有影响的作用剂；
其中的抗原决定因子是所述感染性病原体的抗原决定因子。
可以使该抗原和疫调节剂连接，例如共价地或遗传地连接，形成单一的有效作用剂。在本发明的特定实施方案中，是使抗原和免疫调节剂化学偶联。例如，可使用异型双功能交联试剂将抗原和免疫调节剂化学偶联。在本发明此方面的大多数应用中，优选地是分别给药(其中的抗原和免疫调节剂没有被这样连接)，因为这样能够分别给予不同的部分。
根据本发明的第三方面，在此提供了一种试剂盒，用于对哺乳动物对象如人或兽医对象接种疫苗，对抗感染性疾病，此试剂盒包含：
a)如下作用剂中的一种：
(i)无全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；
(ii)具有GM1-结合活性、不同于EtxB或CtxB的作用剂，或者是具有Gb3-结合活性、不同于VtxB的作用剂；或
(iii)对由GM1-结合或Gb3-结合介导的细胞内信号传输过程具有影响的作用剂；以及
b)一种抗原决定因子，它是感染性疾病的抗原决定因子，用于与所述疫苗的免疫调节剂一起共同给药。
可按照预防或治疗性疫苗接种方法使用本发明第二方面的疫苗组合物和本发明第三方面的试剂盒，在此是将“预防性疫苗”给予未免疫的个体以便防止疾病发生，而将治疗性疫苗给予已存在感染的个体，以便使感染减少或降低至最少或者消除疾病的免疫病理学后果。
一旦感染发生，作用剂如EtxB具有改变免疫应答性质的能力。可能发现，含有这种作用剂的治疗性疫苗(即不需要含有抗原的疫苗)在免疫应答已不能消除感染的情况下特别有用。这种应用对于治疗慢性疾病可能特别有效，例如对于选自如下致病因素引起的疾病，疱疹病毒、肝炎病毒，HIV，TB和寄生虫。
根据本发明的第四方面，在此提供了一种对宿主预防或治疗疾病的方法，该方法包括对宿主接种含有至少一种抗原决定因子和免疫调节剂的疫苗，在此该免疫调节剂是：
(i)无全毒素的EtxB或VtxB；
(ii)具有GM1-结合活性、不同于EtxB或CtxB的作用剂，或者是具有Gb3-结合活性、不同于VtxB的作用剂；或
(iii)对由GM1-结合或Gb3-结合介导的细胞内信号传输过程具有影响的作用剂。
可将此疫苗包装成用于共给药，并且可通过多种不同途径给药，例如鼻内给药，口腔给药，阴道内给药，尿道给药或眼内给药。目前优选的途径是鼻内免疫接种。当疫苗通过鼻内给药时，可作为喷雾剂或液体的形式给药。
可作为单剂量或者按多剂量对给药对象给予抗原决定因子和免疫调节剂。
在第一个实施方案中，本发明第一方面的免疫调节剂，本发明第二方面的疫苗，本发明第三方面的试剂盒和本发明第四方面的方法被用于针对其感染性病原体是多种疱疹病毒家族成员的疾病。例如，其感染性病原体可能选自HSV-1，HSV-2，EBV，VZV，CMV，HHV-6，HHV-7和HHV-8。特别是其感染性病原体可能是HSV-1，HSV-2，CMV或EBV。
在此第一实施方案中，抗原决定因子优选地是疱疹病毒的即时早期，早期或晚期的基因产物(例如表面糖蛋白)。
如果感染性病原体是HSV-1或HSV-2，那末抗原决定因子可以是选自如下种类基因产物的抗原决定因子：gD，gB，gH，gC或潜伏相关的转录物(LAT)。
如果感染性病原体是EBV，那末抗原决定因子可以是gp340或gp350的抗原决定因子，或者是潜伏性蛋白(例如EBNA1，2，3A，3B，3C和-LP，LMP-1，-2A和2B，或EBER)的抗原决定因子。
在第二个实施方案中，本发明第一方面的免疫调节剂，本发明第二方面的疫苗，本发明第三方面的试剂盒和本发明第四方面的方法被用于针对其感染性病原体是流感病毒的疾病。
在此第二实施方案中，抗原决定因子优选地是病毒包衣蛋白(例如血球凝集毒和神经氨酸苷酶)的或内部蛋白(例如核蛋白)的抗原决定因子。
在第三实施方案中，本发明第一方面的免疫调节剂，本发明第二方面的疫苗，本发明第三方面的试剂盒和本发明第四方面的方法被用于针对其感染性原体是付流感病毒的疾病。
在第四实施方案中，本发明第一方面的免疫调节剂，本发明第二方面的疫苗，本发明第三方面的试剂盒和本发明第四方面的方法被用于针对其感染性病原体是呼吸合胞体病毒的疾病。
在第五实施方案中，本发明第一方面的免疫调节剂，本发明第二方面的疫苗，本发明第三方面的试剂盒和本发明第四方面的方法被用于针对其感染性病原体是肝炎病毒的疾病。例如，其感染性病原体可能选自甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎和丁型肝炎病毒，特别是此感染性病原体可能是甲型肝炎或丙型肝炎病毒。
在第六实施方案中，本发明第一方面的免疫调节剂，本发明第二方面的疫苗，本发明第三方面的试剂盒和本发明第四方面的方法被用于针对脑膜炎。在此第六实施方案中，其感染性病原体可能选自脑膜炎奈瑟氏首，B型流感嗜血杆菌和肺炎链球菌。
在第七实施方案中，本发明第一方面的免疫调节剂，本发明第二方面的疫苗，本发明第三方面的试剂盒和本发明第四方面的方法被用于针对肺炎或呼吸道感染。在此第七实施方案中，其感染性病原体可能选自肺炎链球菌，嗜肺军团菌和结核分支杆菌。
在第八实施方案中，本发明第一方面的免疫调节剂，本发明第二方面的疫苗，本发明第三方面的试剂盒和本发明第四方面的方法，被用于针对性传播的疾病。在此第八实施方案中，其感染性病原体可能选自淋病奈瑟氏菌，HIV-1，HIV-2和沙眼衣原体。
在第九实施方案中，本发明第一方面的免疫调节剂，本发明第二方面的疫苗，本发明第三方面的试剂盒和本发明第四方面的方法被用于针对胃肠道疾病。在此第九实施方案中，其感染性病原体可能选自致肠道病的，产肠毒素的和侵入肠道的大肠杆菌，轮状病毒，肠炎沙门氏菌，伤寒沙门氏菌，幽门螺杆菌，蜡状芽孢杆菌，空肠弯曲杆菌和霍乱弧菌。
如果其感染性病原体是选自致肠道病的，产肠毒素的，侵入肠道的，致肠出血的和肠道聚性的大肠杆菌，那末此抗原决定因子可能是细菌毒素或粘附因子的抗原决定因子。
在第十实施方案中，本发明第一方面的免疫调节剂，本发明第二方面的疫苗，本发明第三方面的试剂盒和本发明第四方面的方法被用于针对表面感染。在此第十实施方案中，其感染性病原体可能选自金黄色葡萄球菌，化脓链球菌和变异链球菌。
在第十一实施方案中，本发明第一方面的免疫调节剂，本发明第二方面的疫苗，本发明第三方面的试剂盒和本发明第四方面的方法，被用于针对寄生虫病。在此第十一实施方案中，其感染性病原体可能选自疟原虫，锥体虫属种，冈氏弓形虫，杜氏利什曼原虫和盘尾丝虫属种。
对粘膜免疫应答的刺激作用
能够结合于GM1或Gb3的、或者能够模拟对GM1或Gb3结合作用的EtxB，CtxB，VtxB和其它作用剂，可特异性地上调粘膜抗体的产生。
对于通过体内粘膜免疫应答可实现预防感染或治疗的疾病，本发明第一方面的疫苗免疫调节剂，本发明第二方面的疫苗组合物和本发明第三方面的试剂盒特别有效。例如，对于在感染过程中其感染性病原体结合于粘膜，定居于粘膜或可穿越进入粘膜的疾病有效。这类疾病的实例包括：由病毒(HIV，HSV，EBV，CMV，流感病毒，麻疹病毒，流行性腮腺炎病毒，轮状病毒等)引起的疾病，由细菌(大肠杆菌，沙门氏菌，志贺氏菌，衣原体，淋病奈瑟氏菌，T.Pallidum，包括引起龋齿的链球菌属种)引起的疾病，以及由寄生虫引起的疾病。
在本发明第二方面的优选实施方案中，在此提供了一种针对HSV-1感染的疫苗，它包含至少一种HSV-1抗原决定因子和免疫调节剂，其中免疫调节剂是：
(i)无全毒素的EtxB，CtxB，VtxB；
(ii)具有GM1-结合活性、不同于EtxB或CtxB的作用剂，或者是具有Gb3-结合活性、不同于VtxB的作用剂；或
(iii)对于由GM1-结合或Gb3-结合介导的细胞内信号传输过程具有影响的作用剂。
优选地此免疫调节剂是EtxB。
在本发明第三方面的优选实施方案中，在此提供了一种用于针对HSV-1，对哺乳动物对象疫苗接种的试剂盒，它包括：
a)是如下作用剂的疫苗免疫调节剂；
(i)无全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；
(ii)具有GM1-结合活性、不同于EtxB或CtxB的作用剂，或者是具有Gb3-结合活性、不同于VtxB的作用剂；或
(iii)对于由GM1-结合或Gb3-结合介导的细胞内信号传输过程具有影响的作用剂；以及
b)至少一种HSV-1抗原决定因子，用于与所述疫苗免疫调节剂一起共同给药。
根据本发明的第五方面，在此提供了如下作用剂在粘膜表面上调抗体产生中的用途：
(i)无全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；
(ii)具有GM1-结合活性、不同于EtxB或CtxB的作用剂，或者是具有Gb3-结合活性、不同于VtxB的作用剂；或
(iii)对于由GM1-结合或Gb3-结合介导的细胞内信号传输过程具有影响的作用剂；
非补体性固定血清抗体的产生也可能被上调。优选地，根据本发明的第五方面可产生S-IgA。
按照本发明的此第五方面，可连同一个或几个抗原决定因子一起使用此作用剂。
下调免疫应答的病理成分
本发明者还发现，当按照所述的方式将纯EtxB用作免疫调节剂时，避免了Th2相关应答的有害作用，如产生高水平的潜在病理性IgE。尽管如此，由使用EtxB(或者CtxB或VtxB)作免疫调节剂所触发的免疫应答看来有助于诱导Th2相关的细胞因子。换句话说，EtxB(或CtxB)可诱导从Th1-型应答向Th2-型应答转移。这已使本发明者能够预料到，可结合于GM1或Gb3、或者可模拟对GM1或Gb3结合作用的纯EtxB，CtxB或VtxB，以及其它作用剂，将能够下调与Th1和Th2激活有关的免疫应答病理成分。
根据本发明的第六方面，在此提供了如下作用剂下调Th2-相关的免疫应答病理成分的用途：
(i)无全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；
(ii)具有GM1-结合活性、不同于EtxB或CtxB的作用剂，或者是具有Gb3-结合活性，不同于VtxB的作用剂；或
(iii)对于由GM1-结合或Gb3-结合介导的细胞内信号传输过程具有影响的作用剂。
Th1-相关的免疫应答病理成分也可以被下调。
已知EtxB和CtxB结合于GM1，并对淋巴细胞群诱发不同的作用，包括特异性排除CD8+T细胞和对B细胞的相关激活(WO97/-02045)。因此，认为EtxB和CtxB可改变免疫应答的平衡，以致于使引起炎症的Th1相关反应被下调，而Th2相关的应答被上调。Th1应答包括由激活的T-细胞分泌8IFN，导致巨噬细胞激活和迟发型超敏反应。这样一些应答可能是许多病原体感染过程中的重要病理原因。Th2应答包括激活T-细胞产生细胞因子如IL-2，IL-5，IL-10，并已知可促进分泌高水平的抗体，特别是IgA。
现已出人意料地发现，当将EtxB按所述方式用作免疫调节剂时，可避免Th2相关应答的有害作用，如产生高水平的潜在性病理IgE。因此，EtxB和CtxB能够下调与Th1和Th2激活相关的免疫应答病理成分。这样一些免疫应答被调节有助于产生高水平的非补体性固定血清抗体，并在粘膜表面产生分泌性IgA。
将根据本发明第六方面的作用剂用于治疗性病苗接种，对于涉及免疫病理学机制的疾病特别有效。这些疾病的例子是HSV-1，HSV-2，TB和HIV。
可以将本发明的第一和第六方面组合在一起。换句话说，作用剂如EtxB可以被同时用作免疫调节剂和治疗剂。例如对于涉及免疫病理学的疾病，使用掺入作用剂如EtxB或CtxB的疫苗不但可以起限制感染的作用，而且也可消除疾病的病理过程。因此，这种免疫调节剂既起预防作用，又有治疗作用。对于按这种方式接种疫苗因此很可能特别有效果的感染，其例子包括由疱疹病毒家族，胃肠道和呼吸道病原体引起的疾病。
对抗原加工处理途径的免疫调节作用
a)延长呈递
本发明者还发现，当将EtxB或(CtxB或VtxB)用作免疫调节剂时，抗原的内在化过程和加工处理途径被改变了。B亚单位的存在导致延长了其呈递，可能是通过改变在抗原呈递细胞内抗原运输，以致使抗原的降解作用被延缓，因此可保持较长的一段时间。B-亚单位与抗原呈递相关的这种特征意味着，根据本发明掺入作用剂的疫苗将具有增加的抗原持续性，并导致可保持的免疫记忆。
根据本发明的第七方面，在此提供下列作用剂在疫苗中作为免疫调节剂的用途，以便延长抗原呈递，并对哺乳动物对象给予可保持的免疫记忆：
(i)无全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；
(ii)具有GM1-结合活性、不同于EtxB或CtxB的作用剂，或者是具有Gb3-结合活性、不同于VtxB的作用剂；或
(iii)对于由GM1-结合或Gb3-结合介导的细胞内信号传输过程具有影响的作用剂。
根据本发明的第八方面，在此提供了一种疫苗组合物，用于针对感染性疾病，它含有抗原决定因子和选自如下作用剂的免疫调节剂；
(i)无全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；
(ii)具有GM1-结合活性、不同于EtxB或CtxB的作用剂，或者是具有Gb3-结合活性、不同于VtxB的作用剂；或
(iii)对于由GM1-结合或Gb3-结合介导的细胞内信号传输过程具有影响的作用剂；
其中所述的抗原决定因子是该感染性疾病的抗原决定因子，其中的免疫调节剂可延长抗原决定因子的存在时间，并给予可保持的免疫记忆。
b)在细胞内将抗原定向于MHC-I或MHC-II相关的途径
如上面所述，可以将治疗或预防疫苗中的抗原和免疫调节剂连接在一起，例如共价地或遗传性地连接形成有效的单一作用剂。本发明者发现，通过改变抗原对免疫调节剂的连接有可能使此抗原定向于细胞的不同腔室，而因此定向于不同的抗原呈递途径。
通过以某种方式使抗原或抗原决定因子连接于免疫调节剂，有可能促进抗原转位越过胞浆膜进入胞液。本发明者预料，这将使加载到MHC-I分子上的抗原肽量增加。因此，抗原-免疫调节剂的偶联物可被用于特异性地促进对细胞毒T细胞(CTL)的激活。诱导CTL对于许多疾病的预防和治疗是有益的，特别是对于由病毒，细胞内的细菌和寄生虫引起的疾病。
还可以对抗原-免疫调节剂偶联物的连接进行选择，致使抗原可被传递进入细胞核。
根据本发明的第九方面，在此提供了一种偶联物，它包含抗原或抗原决定因子以及选自如下作用剂的免疫调节剂：
(i)无全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；
(ii)具有GM1-结合活性、不同于EtxB或CtxB的作用剂，或者是具有Gb3-结合活性、不同于VtxB的作用剂；或
(iii)对于由GM1-结合或Gb3-结合介导的囊泡内在化过程具有影响的作用剂。
根据本发明的第十方面，在此提供了一种用于针对感染性疾病的疫苗组合物，这种感染性疾病是由感染性病原体引起的，该疫苗组合物包含一种抗原或抗原决定因子与免疫调节剂的偶联物，此免疫调节剂选自如下作用剂：
(i)无全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；
(ii)具有GM1-结合活性、不同于EtxB或CtxB的作用剂，或者是具有Gb3-结合活性、不同于VtxB的作用剂；或
(iii)对于由GM1-结合或Gb3结合介导的囊泡内在化过程具有影响的作用剂；
其中所述的抗原或抗原决定因子是所述感染性病原体的抗原或抗原决定因子。
可通过多种方法，包括遗传性连接或化学偶联将抗原或抗原决定因子连接于免疫调节剂。在第一个优选的实施方案中，此偶联物是通过将抗原或抗原决定因子遗传性连接于免疫调节剂而构成的融合蛋白。优选地是将抗原或抗原决定因子遗传性地连接于免疫调节剂的C-端。在第二个优选的实施方案中，是将抗原或抗原决定因子化学偶联于免疫调节剂。优选地是应用双功能交联剂，如异型双功能交联剂，将抗原或抗原决定因子偶联于免疫调节剂。更优选的交联剂是N-γ(-马来亚氨基-丁氧基)-琥珀酰亚胺酯(GMBS)或N-琥珀酰亚胺基-(3-吡啶基-二硫)-丙酸酯(SPDP)。此疫苗组合物可通过多种不同的途径给药，例如鼻内给药，口腔给药，阴道内给药，尿道给药或眼内给药。优选的是鼻内免疫接种。
根据本发明的第十一方面，提供如下作用剂的用途：
(i)无全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；
(ii)具有GM1-结合活性、不同于EtxB或CtxB的作用剂，或者是具有Gb3-结合活性、不同于VtxB的作用剂；或
(iii)对于由GM1-结合或Gb3-结合介导的囊泡内在化过程具有影响的作用剂；
用于一种与抗原或抗原决定因子的偶联物中，以便将该抗原或抗原决定因子定向传递至抗原呈递细胞的胞液或细胞核。
根据本发明的第十二方面，在此提供了如下作用剂的用途：
(i)无全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；
(ii)具有GM1-结合活性，不同于EtxB或CtxB的作用剂，或者是具有Gb3-结合活性、不同于VtxB的作用剂；或
(iii)对于由GM1-结合或Gb3结合介导的囊泡内在化过程具有影响的作用剂；
用于一种与抗原或抗原决定因子的偶联物中，通过MHC-I类分子上调该抗原决定因子或来自所述抗原的抗原决定因子的呈递。
优选地是将本发明第十二方面偶联物的用途用于与本发明第五方面作用剂的用途协同，以激发强CTL应答，并上调粘膜抗体的产生。这种活性对于预防和治疗病毒性感染；例如流感，特别有效。
EtxB是优选的免疫调节制
以前认为EtxB和CtxB具有相似的特性。但是，本发明者发现，与rCtxB相比较，rEtxB是更强有力的和更有效的免疫调节剂。因此，优选的免疫调节剂是EtxB，或者是模拟EtxB作用的作用剂。
EBV
EBV是已知的八种人疱疹病毒中的一种。感染通常发生在幼年时代，但是，在此阶段临床症状通常微弱不能察觉。EBV的原发性感染后来在生命中与感染性单核细胞增多症(IM)有关，在美国青年人中它是第二种最常见的疾病。EBV还具有致癌的潜力。EBV与地方性Burkitcic淋巴瘤(BL)和未分化的鼻咽癌(NPC)之间存在密切关系。发生在免疫受损病人的高比例淋巴瘤也是由EBV引起的，并已表明在某些Hodgkin氏淋巴瘤与EBV之间存在某种联系。
潜伏性EBV-感染的细胞表达少量所谓的“潜伏性”蛋白。包括六种核蛋白(EBVAs 1，2，3A，3B，3C和-LP)，三种膜整合蛋白(LMP-1，2A和2B)，以及二种在RNA剪接中有作用的非-聚腺苷酸化病毒衍生的RNAs(EBERs)。
EBV潜伏性膜蛋白1(LMP-1)存在于感染细胞的质膜中。它也在鼻咽癌(NPC)和EBV-阳性Hodgkin氏淋巴瘤(HD)中被表达，表明LMP-1在这些肿瘤形成过程中的作用。LMP-1基因可以改变未感染细胞的表型，引起细胞表面激活标志的上调，促进细胞增殖。LMP-1还能改变信号传输途径，并具有抗细胞凋亡作用。在健康的携带者或肿瘤病人中尚未证实针对这种病毒抗原的细胞免疫应答具有任何程度的必然性。
许多动物病毒都具有避免被宿主免疫系统察觉的进化性机制。通常这些机制涉及干扰TAP-相关的肽转移系统。认为EBV也具有避免免疫系统察觉的类似进化性机制，因此使它能够持久地存在于宿主体内。这可解释为什么某些细胞免疫应答不能发现EBV潜在性蛋白EBVA1，并可解释为什么显然不存在这种能对抗LMP1的应答。
根据本发明的第十三方面，在此提供了一种疫苗组合物，它含有：
a)如下作用剂中的一种：
(i)无全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；
(ii)具有GM1-结合活性、不同于EtxB或CtxB的作用剂，或者是具有Gb3-结合活性、不同于VtxB的作用剂；或
(iii)对于由GM1-结合或Gb3结合介导的细胞内信号传输过程具有影响的作用剂；以及
b)一种EBV抗原
用于治疗和/或预防EBV相关疾病。
特别是本发明第十三方面的这种疫苗组合物含有EtxB，CtxB或
具有GM1-结合活性、不同于EtxB或CtxB的作用剂。
根据本发明的第十四方面，在此提供了一种治疗性组合物，用于治疗EBV-相关的疾病，此组合物含有：
(i)无全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；
(ii)具有GM1-结合活性、不同于EtxB或CtxB的作用剂，或者是具有Gb3结合活性、不同于VtxB的作用剂；或
(iii)对于由GM1-结合或Gb3-结合介导的细胞内信号传输过程具有影响的作用剂。
特别是本发明第十四方面的这种治疗性组合物含有EtxB，CtxB或具有GM1-结合活性、不同于EtxB或CtxB的作用剂。
由于已知EtxB共覆盖有LMP1，并且EtxB可促进LMP-1断裂，因此推论EtxB(以及具有GM1结合活性的其它类似CtxB的作用剂)对于刺激抗EBV免疫应答是有效的。这种活性可应用于疫苗以便预防EBV相关的疾病，并可应用于治疗，只要疾病已发生就可治疗这种疾病。
如果不希望受理论的约束，据认为当EtxB共覆盖有LMP-1时，可通过不同的细胞内途径加工此抗原，这使抗原能够绕过被病毒阻断的正常加工途径。因此在细胞表面可有效地呈递该抗原。如果通过常规的途径加工此抗原；EtxB的这种作用还可使被呈递的抗原以不同的抗原表位呈现在细胞表面。
可将本发明十三方面的疫苗用于预防EBV感染，或者对于EBV-感染的个体用于防止EBV相关疾病的发展。此疫苗还可包含单独的佐剂，或者此作用剂(如EtxB或CtxB)本身恰好可起佐剂作用。
对于已经形成EBV-相关疾病的对象，可单独(即不含抗原)将本发明第十四方面指定的作用剂用于治疗这种疾病。
用于本发明第十三和第十四方面的优选作用剂是EtxB。
EBV抗原是可以从EBV本身获得的抗原，或者是由EBV的作用引起被EBV-感染的宿主细胞表达产生的抗原。此抗原优选地是EBV潜伏性膜蛋白。特别优选的是抗原LMP-1，LMP-2A，LMP-2B和ENBA-1，以及它们的抗原片段。可从EBV感染的细胞中分离出此抗原，或者通过合成或重组的方法制备。
本发明的第十三和第十四方面特别适合于治疗和/或预防下列疾病：感染性单核细胞增多症，Burkitt氏淋巴瘤，鼻咽癌和Hodgkin氏淋巴瘤。据信本发明的这些方面特别适合于治疗和/或预防鼻咽癌和Hodgkin氏淋巴瘤。
通过对哺乳动物对象给予免疫有效剂量，可将本发明第十三和第十四方面的疫苗或治疗组合物用于防止或治疗对象发生或发展EBV-相关的疾病。
这种哺乳动物对象可能是例如健康的EBV-感染的或未感染的个体，免疫缺损的个体，或患有EBV-相关疾病的个体。
可通过任何合适的途径给予这种疫苗。可将此作用剂和抗原对哺乳动物对象共同给药，或者分开给药。此作用剂和抗原可以是单独的，或者被连接，例如共价地或遗传性地被连接，形成有效的单一作用剂。
GM1和Gb3-相关的信号传输
如果不想受理论的约束，可认为GM1或Gb3结合可直接或间接地触发细胞内信号传输。本发明者还发现证据，表明EtxB与至少另一种受体相互作用，这种受体与GM1相关的细胞内信号事件有关。可能EtxB(或CtxB)对GM1的结合有助于对一种蛋白质的结合，这种蛋白质可触发细胞内的信号传输。不知道是什么特异性地触发这种信号传输过程，可能是GM1或该蛋白质的磷酸化作用。当EtxB/CtxB将GM1结合在此细胞的表面时，结合的GM1在囊泡中被内在化(Williams等(1999)今日免疫学20：95-101)。已知GM1和其它糖脂类(如Gb3)被优先定位于“膜筏”中，在其中还发现几个关键性蛋白质受体。因此如下情况是可能的：由于B-亚单位的结合，GM1的内在化作用引起这些蛋白质的共覆盖，导致它们被触发介导细胞内信号传输过程。
定义
佐剂是一种可非特异性地增强对抗原免疫应答的物质，不同于疫苗载体，佐剂的目的在于使抗原靶向所需的部位。在此名词“免疫调节剂”被用于表示如佐剂一样起作用的作用剂，用于激治某些免疫应答，但是它还可使免疫应答定向于特定的方向。
名词“共给药”被用于意指这样给予抗原和免疫调节剂，以致可激发必要的免疫应答。因此尽管可在同一时刻和相同的部位给予抗原和免疫调节剂，但是，在与给予免疫调节剂不同的时间和/或不同的部位给予抗原可能更有益。例如，第一步可将抗原和免疫调节剂在一起同时给药，然后在第二步可通过只给予抗原来加强免疫应答。
名词“抗原决定因子”在此被用于意指抗原上可被抗体或T-细胞受体识别的位点。优选地它是由蛋白质抗原产生的，或者作为蛋白质抗原一部分的短肽，但是还打算用此名词包括糖肽和碳水化合物抗原决定因子。此名词还包括可刺激识别整个有机体的应答的氨基酸的修饰序列或碳水化合物。
有许多已知的方法可用于对某一给定的感染性病原体鉴别抗原决定因子。
例如，可通过在感染的或恢复期病人，在感染的或恢复期动物提高的免疫应答，或者通过在体外监测对含有抗原的制备物的免疫应答来鉴别潜在的保护性抗原。例如，
i)可针对感染性病原体的全细胞裂解物，或被该病原体感染细胞的裂解物，筛选来自感染的或恢复期病人的、或者感染的或恢复期动物的血清样品，借助于标准的蛋白质印迹技术检测被此免疫血清识别的那些抗原；
ii)可针对来自感染性病原体的部分或高度纯化的抗原，或者被该病原体感染细胞的裂解物，筛选来自感染的或恢复期病人的、或者感染的或恢复期动物的血清样品，借助于标准的ELISA技术其中将部分或高度纯化的抗原用于包被微滴定板的孔池，或者借助于免疫印迹技术检测被此免疫血清识别的那些抗原；
iii)可针对从编码一种或几种所需抗原的重组表达系统获得的全细胞裂解物，筛选来自感染的或恢复期病人的、或者感染的或恢复期动物的血清样品，并应用标准的ELASA技术或蛋白质印迹技术检测那些被此免疫血清识别的抗原。
iv)可针对包含来自所需感染性病原体克隆基因的表达文库，筛选来自感染的或恢复期病人的，或者感染的或恢复期动物的血清样品，应用菌落印迹免疫检测技术鉴别表达抗原或其片段并被此免疫血清识别的那些克隆；或者
v)可在有来源于感染性病原体，或被该病原体感染细胞的裂解物，或者编码一种或几种抗原的重组表达系统的部分或高度纯化的抗原存在下，体外培养来自感染的或恢复期病人血液的PBLs，或者来自感染的或恢复期动物的PBL，淋巴结细胞，脾细胞，或固有膜细胞，以便检测抗原特异性T-细胞增殖反应。
另一种方式是，有可能检测对病原体在体内存活是必不可少的基因产物，例如通过以下技术：由Holden建立的特征标记的诱变技术，或由Mekalanos建立的IVET(体内表达技术)检测在体内被特异性诱导的基因产物，或者由Falkow建立的差示荧光诱导法鉴定可能是保护性抗原的一些基因。应用这些方法，可按上面描述的筛选基因产物。可将此基因克隆进入表达载体，并回收抗原用于同调节糖鞘脂类相关活性的作用剂一起掺入疫苗制剂中。
有许多已知的方法可用于对给定的感染性病原体分离抗原。
例如，通过应用能够回收抗原的方法，可以从感染性病原体中，或者从被此病原体感染的细胞中，提取含有一种或几种潜在的保护性抗原的病原体表面成分。这可能包括应用细胞破裂技术裂解细胞，例如超声波处理和/或去污剂提取法。离心法，超滤法或沉淀法可被用于收集抗原制备物。在Richarde等，(1998)，传染病杂志，177，1451-7中描述的含有HSV-1糖蛋白的抗原制剂可作为这种方法的例证。
还可通过多种方法提取感染性病原体的，或来自被该病原体感染细胞的抗原，这些方法包括但不局限于尿素提取，碱或酸提取，或者去污剂提取，然后使之经受层析分离。可将在空隙或洗脱峰中回收的，含有一种或几种潜在的保护性抗原的材料用于疫苗制剂中。
按另一种方法，可将编码一种或几种潜在的保护性抗原的基因克隆进入适合于产生抗原的多种表达载体。这些载体可包括细菌或真核生物表达系统，例如大肠杆菌，芽孢杆菌属种，弧菌属种，酿酒酵母，哺乳动物和昆虫细胞系。可借助于常规的提取，分离和/或层析步骤回收抗原。
在此使用的名词“CtxB”，“EtxB”和“VtxB”包括此种分子的天然和重组的形式。特别优选的是重组的形式。通过如下方法可产生此种分子的重组形式：将编码形成该蛋白质的特异性多肽链(或几种链)的一种或几种基因插入适合的载体，然后用于转染适合的宿主。例如，可将编码一种多肽链，并由此多肽链可装配EtxB的基因插入例如质粒pMM68，然后用这种质粒转染宿主细胞如弧菌sp.60。用本来已知的方法纯化和分离出这种蛋白质。借助于已知的方法可从野生型基因产生表达活性突变型CtxB，EtxB或VtxB蛋白的突变型基因。
名词“CtxB”，“EtxB”和“VtxB”还包括突变型分子和其它一些合成的分子(含有CtxB，EtxB或VtxB部分的)，这些分子保持有结合GM1或Gb3的能力，或者模拟对GM1或Gb3结合作用的能力。
保持有GM1结合活性、不同于EtxB和CtxB的作用剂，以及保持有Gb3结合活性、不同于VtxB的作用剂包括结合GM1或Gb3的抗体。
为了产生这种抗体，可通过注射GM1或Gb3或者它们的任何一种衍生物或同源物，免疫包括山羊、兔、大白鼠等的多种宿主。取决于宿主的种类，可使用不同的佐剂增强免疫应答。这些佐剂包括，但不局限于，福氏佐剂，矿物凝胶如氢氧化铝，以及表面活性物质如溶血卵磷脂，pluronic多元醇，聚阴离子，肽，油乳剂，匙孔血兰蛋白和二硝基苯酚。BCE(卡介苗)和短小棒状杆菌是可能用于人的佐剂。
人单克隆抗体对本发明可能是优选的。可应用任何一种提供通过在培养中的连续细胞系产生抗体分子的技术制备单克隆抗体。这些技术包括，但不局限于，最初由Koehler和Milsteim(1975，自然256：495-497)描述的杂交瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术(Kosber等(1983)今日免疫学4：72；Cote等UP83)国家科学院学报80：2026-2030)，以及EBV-杂交瘤技术(Cole等(1985)，单克隆抗体和癌症治疗，Alan Rliss公司PP77-96)。此外，还可以应用为产生“嵌合抗体”，将小鼠抗体基因拼接于人抗体基因而获得具有适当抗原特异性和生物活性分子建立的技术(Morrison等(1984)国家科学院学报81：6551-6855；Neuberger等(1984)自然312：604-608；Jakeda等(1985)自然314：452-454)。按另一种方式，也可以使为了产生单链抗体所描述的技术(美国专利NO4.946.779)。改造后用来产生特异性单链抗体的靶标相互作用成分。
如在Orlandi等(1989，国家科学院学报86：3833-3877)，以及Winter G和Milstein C(1991，自然349：293-299)中所公开的，还可通过体内诱导在淋巴细胞群内产生，或者通过筛选重组免疫球蛋白文库或一批高度特异性的结合剂来制备抗体。
还可产生包含对GM1或Gb3特异性结合位点的抗体片段。例如，这种片段包括，但不局限于，可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab’)2片段，以及可以通过还原F(ab’)2片段的二硫桥而产生的Fab片段。另外，还可构建Fab表达文库，以便能够快速和简便地鉴别具有所需特异性的单克隆Fab片段(Huse WD等(1989)科学256：1275-1281)。
可通过合成化学制备肽文库或有机物文库，然后筛选它们结合GM1/Gb3的能力。可以借助于对本领域技术人员视为常规的多种方法对合成的化合物，天然产物，以及其它来源的潜在性生物活性物质进行筛选。
GM1或Gb3，或者它们的片段可以被用于通过多种筛选技术中的任何一种筛选肽或其它分子。这种分子可游离在溶液中，固定于固体支持物，安装在细胞表面，或者安置在细胞内。可测定活性的消失或者GM1或Gb3与待测作用剂之间结合复合物的形成。
测定对GM1/Gb3结合的另一种方法是通过将纯化的GM1/Gb3用于包被微量滴定板。封闭之后，将待测定的作用剂施加于此滴定板，待其相互作用之后洗滴定板，并以对该抗原特异性的抗体进行检测。随后应用基于比色或放射活性的方法(分别为ELISA或RIA)，以抗体对酶或放射性标记直接或间接的偶联物可对结合进行定量测定。
测定对GM1/Gb3结合的另一种方法是通过使GM1/Gb3的糖部分结合于适当的层析柱基质，以便能够进行标准的亲和层析。施加于此层析柱的已知化合物从稀释液中被除去可被用作结合活性的证据，或者按另一种方式，当以混合的化合物施加于此层析柱，洗脱和随后的分析将能确定此神经节苷脂结合剂的特性。在蛋白质的情况下，分析过程应包括肽测序和绘制胰消化图，随后同已有的数据库进行比较。在被洗脱的蛋白质不能以此方法鉴定的情况下，那么可以通过标准的生化分析法，例如通过激光吸收质谱分析法进行质量测定，用于对此化合物作进一步鉴定。借助于HPLC和对单一同源峰的质谱分析，可分析从GM1-亲和柱中洗脱的非蛋白质。
测定对GM1/Gb3结合能力和精确相互作用亲和性的另一种方法是通过应用如以前所报导的胞质表面共振作用(Kugiemko等(1996)生物化学35：6375-6384)。
另外，可以将噬菌体显示法用于鉴别结合GM1或Gb3的待测作用剂。
噬菌体显示法是一种利用重组噬菌体的分子筛选方案。此技术包括用一种基因转化噬菌体，此基因可编码能够与GM1/Gb3(或者它们的衍生物或同源物)反应的适合配体(在此情况下是一种待测作用剂)，或者以编码相同配体的核苷酸序列(或者它的衍生物或同源物)转化噬菌体。此转化的噬菌体(优选地是使它附着于固体支持物)可表达此适合的配体(例如此待测作用剂)，并将它显示在噬菌体的外壳上。分离出含有可识别此待测作用剂的靶标分子的实体(如细胞)，并使之扩增。然后对此成功的待测作用剂进行鉴定。噬菌体显示法优于标准的亲和配体筛选技术。此噬菌体表面以三维构型显示出待测的作用剂，更精确地类似于它的天然存在的构象。这便于为筛选目的提供更特异性、更高亲和性的结合。
用于筛选的另一种技术，可提供对GM1或Gb3具有适当结合亲和性的作用剂的高通量筛选，它是基于在WO 84/0356中详述的方法。概括地说，先在一种固体基质上如塑料细杆或其它某种表面上合成大量不同的小肽待测化合物。使此肽待测作用剂与靶标相互作用成分的片段起反应并漂洗。然后检测被结合的靶标相互作用成分，例如借助于本领域熟知的适当方法。还可以将纯化的靶标相互作用成分直接包被在微量滴管板上，用于上述的药物筛选技术。另外，也可用非中和性抗体捕捉这种肽，并把它固定化在一种固体支持物上。
在本发明的所有方面中，具有GM1-结合活性或Gb3结合活性的作用剂还能够交联GM1/Gb3受体。EtxB就是一种这样的作用剂，它能够借助于其五聚体形式交联GM1受体。
有多种方法可用于鉴定这样一种作用剂，它对由GM1/Gb3结合介导的细胞内信号传输过程具有影响，但它本身不结合GM1或Gb3。例如，如果显示出一种作用剂可上调B细胞上的CD25或MHC11类，或者上调CD25或促进CD8+T细胞凋亡，或者上调单核细胞分泌IL-10，但是显示出这种作用剂不结合GM1或Gb3(例如借助于上述的一种结合测定法)，那末可以得出结论，此作用剂能够模拟GM1/Gb3结合作用。
现在将参照附图和下面的实施例对本发明进行说明。
这些实施例参考如下附图：
图1：显示在以HSV-1糖蛋白/rEtxB免疫接种的小鼠，对血清(MS)中总Ig和IgA以及眼洗出物中IgA的刺激作用。
图2：显示在以HSV-1/rEtxB免疫接种的小鼠，MLN(肠系膜淋巴结)或CLN(颈淋巴结)淋巴细胞的T细胞增殖作用。
图3：显示小鼠以HSV-1即在1-20μg EtxB存在时作鼻内免疫接种，来自此小鼠MLN和CLN细胞的T细胞增殖作用。
图4：显示以不同量rEtxB或rCtxB作佐剂对小鼠以10天的间隔给予三次HSV-1糖蛋白之后抗-HSV-1血清Ig的水平。
图5：显示在以HSV-1/rEtxB免疫接种的小鼠，其病毒流出，临床病症和潜伏期的减轻。
图6：显示在以HSV-1感染之后，或者在有EtxB或CtxB作免疫调节剂时以HSV-1Gp免疫接种之后MS中Ig同种型的分布。
图7：显示在以rEtxB或rCtxB作免疫调节剂鼻内给予HVS-1Gp之后Ig亚类的分布。
图8：显示在给予HSV-1糖蛋白之后，不同剂量rEtxB或rCtxB的致免疫作用和对眼洗出物中HSV-1特异性IgA水平的影响。
图9：显示以HSV-1或假糖蛋白(gp)单独，或者存在佐剂时对小鼠给药之后，血清的免疫球蛋白应答。
图10：显示以HSV-1或假糖蛋白单独或者存在佐剂时对小鼠鼻内免疫接种之后，眼洗出物中的粘膜IgA。
图11：显示以HSV-1或假糖蛋白(gp)单独或者存在佐剂时对小鼠鼻内免疫接种之后，阴道洗出物中的粘膜IgA。
图12：显示以存在不同剂量rEtxB作佐剂的HSV-1糖蛋白免疫接种的小鼠，其血清中HSV-1特异性免疫球蛋白的水平。
图13：显示以存在不同浓度rEtxB的HSV-1糖蛋白免疫接种的小鼠，其眼洗出物中IgA的水平。
图14：显示以存在不同浓度rEtxB的HSV-1糖蛋白免疫接种的小鼠，其阴道洗出物中IgA的水平。
图15：显示在以Ctx/CtxB或rEtxB鼻内免疫接种，或者以HSV-1眼内感染之后，血清抗体对HSV-1应答的IgG亚类分布。
图16：显示通过眼划痕以HSV-1感染的、或者通过鼻内给予HSV-1免疫接种的小鼠，在取自这些小鼠的淋巴结细胞培养物中细胞因子的产生。
图17：显示存在rEtxB作免疫调节剂时以HSV-1混合物或假糖蛋白鼻内免疫接种的小鼠抗眼HSV-1感染的保护作用水平。
实施例1：可以将rEtxB同HSV-1Gp一起用于免疫接种。
以含有10μg或20μg rEtxB的10μg HSV-1糖蛋白(Gp)鼻内免疫接种小鼠3次。对照小鼠未作处理，或者给予从HIV-未感染组织培养细胞中获得的假病毒糖蛋白制备物(mock)。抗体水平被表示为感染后水平的百分数。HSV-1糖蛋白/rEtxB刺激了血清中总Ig和IgA，以及眼洗出物中IgA的产生(图1)。本发明者还发现，低至0.1μg的rEtxB剂量也可有效地刺激这种应答。
来自免疫接种小鼠颈淋巴结(它靠近疫苗接种部位)和肠系膜淋巴结(它远离疫苗接种部位)的T-淋巴细胞，当在体外与HSV-1共培养时显示出增殖作用，但是当在体外与假HSV-1Gp共培养或没有抗原时不显示出增殖作用(图2)。
来自以HSV-1Gp和不同剂量EtxB免疫接种小鼠的MLN和CLN的T-淋巴细胞应答于HSV-1Gp的增殖作用被显示在图3中。
对小鼠以三天的间隔，连同不同剂量的EtxB(或CtxB)一起给予HSV-1糖蛋白之后，抗-HSV-1血清Ig的产生被显示在图4中。
最后，以HSV-1和rEtxB免疫的小鼠，在以HSV-1角膜划痕感染之后显示出病毒流出减少了(图5a)，并且显示出与比照相比局部扩散(水肿和眼睑病)，对三叉神经节的扩散(带状疱疹形感染)，对中枢神经系统的扩散(脑炎)和潜伏期都减少了(图5b)。
实施例2：rCtxB和rEtxB起免疫调节剂作用
当以EtxB用作免疫调节剂，Ig同种型的分布发生偏移(图6)。取决于是rCtxB还是rEtxB被用作免疫调节剂，Ig亚类的分布有差别(图7)。
实施例3：与rCtxB相比较rEtxB是更有效的免疫调节剂。
用rEtxB/HSV-1Gp比用rCtxB/HSV-1Gp刺激之后HSV-特异性IgA的水平更高(图8)。
实施例4：(图9)
分别以如下作用剂鼻内免疫接种小鼠三次：单独的HSV-1糖蛋白；HSV-1糖蛋白的假制备物(取未感染的组织培养细胞制备的，并使它经受与用于分离和纯化HSV-1蛋白的相同处理方式)；或者同各种假定的粘膜佐剂组合的HSV-1糖蛋白。在每种情况HSV-1糖蛋白的剂量是每次免疫接种10μg，此剂量与作佐剂的10μg重组EtxB或CtxB组合，或者与0.5μg Ctx和10μg CtxB的混合物组合。最后一次免疫接种的三周之后，收集血液样品并通过ELISA检测抗-HSV-1总抗体。以105pfu HSV-1 sC16株划痕诱发的眼感染之后所激发抗体水平的百分数表示抗体的量。数据(显示在图9)表明，当抗原与全Ctx和CtxB的混合物组合时可激发最强的血清抗体应答。但是当rEtxB被用作佐剂时也可激发高水平的应答。相比之下，rCtxB是非常弱的佐剂。
实施例5：(图10)
同实施例4中所述的方法免疫接种小鼠。通过在连续的几天取眼洗出物检测眼中分泌性IgA的产生，然后合并这些样品，应用特异性抗-IgA检测抗体对样品作ELISA分析。以105pfu HSV-1SC16株划痕诱发的眼感染之后所激发抗体水平的百分数表示抗体的量。数据显然证明(图10)，存在Ctx/CtxB或EtxB时的免疫接种之后可产生高水平的分泌性抗-HSV-1抗体。与分析血清抗体应答得到的结果不同，在以Ctx/CtxB或EtxB作佐剂免疫接种的动物之间，眼内抗体的水平没有差异。与血清抗体一样，有明显的证据表明rCtxB是非常差的佐剂。
实施例6：(图11)
同实施例4中所述的方法免疫接种小鼠。通过在连续几天取来自生殖道的洗出物检测阴道中分泌性IgA的产生，然后合并这些样品，应用特异性抗-IgA检测抗体对样品作ELISA分析。以通过直线回归分析计算的终点滴定度表示抗体的量。数据清楚地证明，存在Ctx/CtxB或EtxB时的免疫接种之后，在远隔的粘膜部位可产生高水平的分泌性抗-HSV-1抗体。存在rEtxB时的免疫接种之后阴道内释放了最高水平的抗体。以Ctx/CtxB免疫接种之后释放了较低水平的抗体，而通过用rCtxBw作佐剂触发了非常少量的分泌。
实施例7：(图12)
单独或者在不断增加剂量的rEtxB作佐剂时HSV-1糖蛋白(10μg)鼻内免疫接种小鼠3次。最后一次免疫接种的三周之后采集血液，并借助于ELISA测定抗-HSV-1抗体的水平。以105pfu HSV-1SC16株划痕诱发的眼感染之后所激发抗体水平的百分数表示抗体的量。数据明显地证明，rEtxB触发对加入的异源性抗原的抗体应答的能力具有剂量依赖性现象，最大的应答发生在大约20-50μg rEtxB。进而还表明，在20μg rEtxB及其以上的剂量，由鼻内感染激发的抗-HSV-1抗体的水平相当于由活的烈性病毒感染激发的此抗体水平，或者大于此水平。
实施例8：(图13)
如实施例7中所述免疫接种小鼠。通过在连续的几天取泪洗出物检测眼中分泌性IgA的产生，然后合并这些样品，应用特异性抗-IgA检测抗体对样品作ELISA分析。以105pfu HSV-1SC16株划痕诱发的眼感染之后所激发抗体水平的百分数表示抗体的量，数据证明，连同20μg或更多的rEtxB一起给予HSV-1糖蛋白时，可在眼内激发最大的IgA应答。尽管如此，在此剂量IgA产生的水平仍然低于在眼病毒感染过程中触发的IgA水平。
实施例9：(图14)
如实施例7中所述免疫接种小鼠。通过在连续的几天从生殖道中取出洗出物，检测阴道中分泌性IgA的产生，然后合并这些样品，应用特异性抗-IgA检测抗体对样品作ELISA分析。以通过线性回归分析计算的终点滴定度表示抗体的量。数据表明，当20μg或更多的的rEtxB用作佐剂时，在阴道内可激发最佳的抗-HSV-1应答。
实施例10(图15)
以1015pfu HSV-1SC16株通过划痕进入角膜感染小鼠，或者以同Ctx/Ctx B或rEtxB组合的10μg HSV-1糖蛋白鼻内免疫接种小鼠3次。在最后一次接种的三周之后，取血清通过ELISA分析是否存在针对HSV-1的IgG1和IgG2a。以通过线性回归分析计算的终点滴定度表示抗体的量(图7a)。数据清楚地表明，对免疫系统呈递抗原的途径影响对HSV-1抗体应答的性质。HSV-1感染主要激活Th1相关的抗体产生，其特征是高水平补体固定的抗体同种型IgG2a。感染激发相对低水平的Th2相关的IgG同种型IgG1。当以IgG1∶IgG2a的比率表示这些数据时，免疫应答的这种模式清晰可见，如在图7b中所示。感染后此比率基本上小于1。在有Ctx/CtxB作佐剂时鼻内免疫接种触发主要释放Th2相关的IgG1。也产生了显著水平的IgG2a，表明Ctx/CtxB可导致激活Th1和Th2细胞。对二种应答的激活以及Th2的相对优势被反映在大致为3的IgG1∶IgG2a比率中。有趣的是，由rEtxB作佐剂激发的对HSV-1应答的性质几乎完全由TH2支配。产生了高水平的IgG1，仅伴有非常少量的IgG2a。这种对Th2应答性的高度偏移被反映在大约为9的IgG1∶IgG2a比率中。
实施例11：(图16)
以105pfu HSV-1SC16株通过划痕进入角膜感染小鼠，或者以同Ctx/CtxB或rEtxB组合的10μg HSV-1糖蛋白鼻内免疫接种小鼠3次。最后一次接种的三周之后，从动物中取出淋巴结，用于制备单细胞悬液，在有杀死的HSV-1或者有来自非感染组织培养细胞的假病毒制备物存在的情况下培养这种细胞。在培养的第4-7天，取出细胞样品作cELISA分析，以便揭示细胞因子的分泌。数据清楚地显示，培养中的T-细胞能够应答HSV-1，但是对假病毒制备物没有显著的应答。取自已用HSV-1感染小鼠的淋巴结细胞主要产生了Th1相关的细胞因子γ-干扰素(γ-IFN)。取自被鼻内免疫接种动物的淋巴结细胞产生了高水平的Th2相关的细胞因子IL-4和IL-10。此外，Ctx/CtxB和rEtxB都导致激活了T-细胞，在体外对HSV-1的刺激分泌了γ-IFN。这表明虽然对这些佐剂的应答主要产生Th2细胞因子，但是还存在某些Th1激活作用。这些发现同根据抗体应答的分析一致。

Claims (29)

1.一种免疫调节剂在制造用于预防或治疗感染性疾病的疫苗中的用途，其中
所述免疫调节剂选自无全毒素的EtxB或CtxB；
所述疫苗还包含一种抗原或一种抗原决定因子，并且免疫调节剂和抗原或抗原决定因子是分开的部分；并且
所述感染性疾病是由感染性病原体引起的，并且所述感染性病原体选自HSV-1，HSV-2，EBV，VZV，CMV，HHV-6，HHV-7和HHV-8；副流感病毒；呼吸合胞体病毒；肝炎病毒；脑膜炎奈瑟氏菌，B型流感嗜血杆菌，嗜肺军团菌，结核分支杆菌；淋病奈瑟氏菌，HIV-1，HIV-2和沙眼衣原体；致肠病的、产肠毒素的、肠侵入性的、致肠出血性的和肠聚生性大肠杆菌，轮状病毒，肠炎沙门氏菌，伤寒沙门氏菌，幽门螺杆菌，蜡状芽孢杆菌，空肠弯曲杆菌和霍乱弧菌；金黄色葡萄球菌，化脓链球菌和变异链球菌；疟原虫，锥体虫属种，冈氏弓形虫，杜氏利什曼原虫和盘尾丝虫属种。
2.权利要求1的用途，其中的免疫调节剂是无全毒素的EtxB。
3.权利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原体引起的，并且此感染性病原体选自HSV-1，HSV-2，EBV，VZV，CMV，HHV-6，HHV-7和HHV-8。
4.权利要求3的用途，其中的感染性病原体选自HSV-1，HSV-2，CMV或EBV。
5.权利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原体引起的，并且此感染性病原体是副流感病毒。
6.权利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原体引起的，并且此感染性病原体是呼吸合胞体病毒。
7.权利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原体引起的，并且此感染性病原体是肝炎病毒。
8.权利要求7的用途，其中的感染性病原体选自甲型，乙型，丙型和丁型肝炎病毒。
9.权利要求8的用途，其中的感染性病原体是甲型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。
10.权利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是脑膜炎。
11.权利要求10的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原体引起的，并且此感染性病原体选自脑膜炎奈瑟氏菌和B型流感嗜血杆菌。
12.权利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是肺炎或呼吸道感染。
13.权利要求12的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原体引起的，并且此感染性病原体选自嗜肺军团菌和结核分支杆菌。
14.权利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是性传播疾病。
15.权利要求14的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原体引起的，并且此感染性病原体选自淋病奈瑟氏菌，HIV-1，HIV-2和沙眼衣原体。
16.权利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是胃肠道疾病。
17.权利要求16的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原体引起的，并且此感染性病原体选自致肠病的、产肠毒素的、肠侵入性的、致肠出血性的和肠聚生性大肠杆菌，轮状病毒，肠炎沙门氏菌，伤寒沙门氏菌，幽门螺杆菌，蜡状芽孢杆菌，空肠弯曲杆菌和霍乱弧菌。
18.权利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是表面感染。
19.权利要求18的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原体引起的，并且此感染性病原体选自金黄色葡萄球菌，化脓链球菌和变异链球菌。
20.权利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是寄生虫疾病。
21.权利要求20的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原体引起的，并且此感染性病原体选自疟原虫，锥体虫属种，冈氏弓形虫，杜氏利什曼原虫和盘尾丝虫属种。
22.权利要求1或2的用途，其中在感染性疾病的治疗或预防中，免疫调节剂上调粘膜表面抗体的产生。
23.权利要求1或2的用途，其中在感染性疾病的治疗或预防中，免疫调节剂延长抗原呈递并给予哺乳动物对象保持的免疫记忆。
24.一种用于针对感染性疾病的疫苗组合物，该感染性疾病是由感染性病原体引起的，其中
该疫苗组合物包含该感染性病原体的一种抗原决定因子和一种选自无全毒素的EtxB或CtxB的免疫调节剂，
抗原决定因子和免疫调节剂是分开的部分；并且
所述感染性病原体选自HSV-1，HSV-2，EBV，VZV，CMV，HHV-6，HHV-7和HHV-8；副流感病毒；呼吸合胞体病毒；肝炎病毒；脑膜炎奈瑟氏菌，B型流感嗜血杆菌，嗜肺军团菌，结核分支杆菌；淋病奈瑟氏菌，HIV-1，HIV-2和沙眼衣原体；致肠病的、产肠毒素的、肠侵入性的、致肠出血性的和肠聚生性大肠杆菌，轮状病毒，肠炎沙门氏菌，伤寒沙门氏菌，幽门螺杆菌，蜡状芽孢杆菌，空肠弯曲杆菌和霍乱弧菌；金黄色葡萄球菌，化脓链球菌和变异链球菌；疟原虫，锥体虫属种，冈氏弓形虫，杜氏利什曼原虫和盘尾丝虫属种。
25.权利要求24的疫苗组合物，其中的感染性疾病是HSV-1感染，并且其中的抗原决定因子是HSV-1的抗原决定因子。
26.权利要求25的疫苗组合物，其中的感染性疾病是EBV相关疾病，并且其中的抗原决定因子是EBV抗原的抗原决定因子。
27.权利要求24、25或26中任何一项的疫苗组合物，其中的免疫调节剂是无全毒素的EtxB。
28.权利要求27的疫苗组合物，其中该抗原决定因子作为抗原的部分存在于疫苗中。
29.一种用于哺乳动物对象针对感染性疾病疫苗接种的试剂盒，该感染性疾病是由感染性病原体引起的，该试剂盒包含：
用于共同给予哺乳动物对象的
(i)该感染性病原体的抗原决定因子；和
(ii)无全毒素的EtxB或CtxB，
其中(i)和(ii)是分开的部分；并且所述感染性病原体选自HSV-1，HSV-2，EBV，VZV，CMV，HHV-6，HHV-7和HHV-8；副流感病毒；呼吸合胞体病毒；肝炎病毒；脑膜炎奈瑟氏菌，B型流感嗜血杆菌，嗜肺军团菌，结核分支杆菌；淋病奈瑟氏菌，HIV-1，HIV-2和沙眼衣原体；致肠病的、产肠毒素的、肠侵入性的、致肠出血性的和肠聚生性大肠杆菌，轮状病毒，肠炎沙门氏菌，伤寒沙门氏菌，幽门螺杆菌，蜡状芽孢杆菌，空肠弯曲杆菌和霍乱弧菌；金黄色葡萄球菌，化脓链球菌和变异链球菌；疟原虫，锥体虫属种，冈氏弓形虫，杜氏利什曼原虫和盘尾丝虫属种。
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