DE60216958T2

DE60216958T2 - Eine den gp41-zwischenzustand imitierende struktur bildendes polypeptid-antigen

Info

Publication number: DE60216958T2
Application number: DE60216958T
Authority: DE
Inventors: Michel Chevalier; Raphaelle El Habib; Tino Krell; Regis Sodoyer
Original assignee: Sanofi Pasteur Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur Inc
Priority date: 2001-10-05
Filing date: 2002-09-18
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2022-09-19
Also published as: CA2462710C; CY1106017T1; CA2462710A1; DE60216958D1; ES2275926T3; EP1442124B1; ATE348888T1; DK1442124T3; US20030138445A1; EP1442124A1; PT1442124E; US6821723B2; WO2003042388A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein antigenisches Polypeptidderivat des gp41-Proteins sowie seine Verwendung zur Immunisierung gegen die mit HIV zusammenhängenden Infektionen. Diese Arbeiten wurden von der ANRS mit finanziert.
Die Entwicklung eines Immunisierungsverfahrens gegen HIV ist heute eine der Prioritäten der wissenschaftlichen Forschung.
Die Haupthindernisse, die in der großen genetischen Variabilität des Virus und in der schwachen Exposition viraler neutralisierender Epitope gegenüber dem Immunsystem bestehen, verlangsamen die Bildung einer neutralisierenden Immunität beträchtlich.
Das HIV-Hüllglycoprotein, das erforderlich ist, um dem Virus seinen infektiösen Charakter zu verleihen, stellt das Ziel von neutralisierenden Antikörpern dar. Diese Merkmale haben letzteres zu einem Gegenstand intensiver Untersuchungen gemacht.
Das Hüllglycoprotein (env) des Humanimmundefizienzvirus-1 (HIV-1) wird ausgehend von dem Vorläufer gp 160 synthetisiert, der unter der Einwirkung einer Protease die Untereinheiten gp 120 und gp41 ergibt.
Die Fixierung von gp120/gp41 an den Zellrezeptoren löst eine Konformationsänderung des gp41 von einem latenten Zustand (nicht fusionsfähig) zu einem fusionsaktiven Zustand (fusionsfähig) aus. Zwischen diesen beiden Zuständen existiert ein Übergangszustand, der "intermediär" genannt wird, wobei sich das gp41 als Membranprotein gleichzeitig in den Virus- und in den Zellmembranen präsentiert (Weissenhorn et al. Nature (1997), 387 (6631), 426–30).
Die Verwendung des gp41 zu Impfzwecken in seiner fusionsfähigen Konformation ist in WO 00/40616 beschrieben. Nach dieser Anmeldung können in diesem letzteren Fall die N-Helices allein oder in Kombination mit den C-Helices zur Reproduktion der fusionsfähigen Konformation von gp41 verwendet werden.
Andererseits ließ sich durch Bindungsexperimente feststellen, dass der nicht fusionsfähige latente Zustand durch die Unzugänglichkeit von großen Teilen der Ectodomäne des gp41 gekennzeichnet ist. gp120 wechselwirkt in der Tat so, dass die Epitope maskiert werden. Zudem wurde gezeigt, dass die Hemmung der Änderung der Struktur des intermediären Zustands in den fusionsfähigen Zustand durch Peptide, die als Konkurrenten verwendet werden, die virale Infektion beeinflussen könnten (Weissenhorn W. et al, Molecular Membrane Biology, 1999, 16, 3–9).
Die Anmelderin schlägt ein neues antigenisches Polypeptid vor, das zur therapeutischen und prophylaktischen Immunisierung gegen die mit HIV zusammenhängenden Infektionen geeignet ist. Tatsächlich hat die Anmelderin zum ersten Mal gezeigt, dass ein Polypeptid, das den intermediären Zustand von gp41 imitiert, in der Lage ist, Antikörper auszulösen, die die primären Isolate von HIV neutralisieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft demnach ein Polypeptid, das eine Sequenz der Formel I umfasst: [N-S1]n-C-[S2-N]m wobei:
N die Sequenz der Aminosäuren 30 bis 77 von gp41 darstellt,
C die Sequenz der Aminosäuren 117 bis 154 von gp41 darstellt,
S1 und S2 unabhängig voneinander entweder fehlen oder eine solche Sequenz von Aminosäuren darstellen, dass die Sequenz der Formel I eine α-Helix-Konformation einnimmt, wie durch die Software SOPMA unter den folgenden Bedingungen bestimmt:

• Anzahl der konformationellen Zustände = 4
• Ähnlichkeitsgrenze = 8 und
• Größe des Fensters = 70 n = 0 oder 1; m = 0 oder 1 und m + n = 1 oder 2.

Vorzugsweise umfasst das Polypeptid, wie vorstehend definiert, eine Sequenz der Formel I, wobei m + n = 1.
Vorzugsweise fehlt S1 oder stellt die Aminosäuren-Sequenz D, DQ, DQQ, DQQL oder DNNMT dar, und S2 fehlt oder stellt die Aminosäuren-Sequenz W, WA, WAS, WASL oder WASLW dar.
Die Aminosäuresequenzen S1 und S2 werden unter Anwendung des Einbuchstabencodes definiert, wobei D Asparaginsäure darstellt, Q Glutamin darstellt, etc....
Nach einer besonderen Ausführungsform umfasst das Polypeptid eine Sequenz der Formel I, wie vorstehend definiert, wobei N die SEQ ID NO: 26 darstellt und C die SEQ ID NO: 27 darstellt.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus SEQ ID NO: 28 und SEQ ID NO: 31.
Nach einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid eine zusätzliche Sequenz der Formel (G)a-S-(H)b, wobei G einen Glycinrest darstellt, H einen Histidinrest darstellt, S ein Serinrest ist, a größer oder gleich 4 ist und b größer oder gleich 6 ist. Die Sequenz ist über eine Amidbindung mit dem NH2-Terminus oder dem COOH-Terminus des erfindungsgemäßen Polypeptids verknüpft.
Nach einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Konjugat, umfassend ein erfindungsgemäßes Polypeptid, das mit einem Trägerprotein oder einem Trägerpeptid konjugiert ist.
Nach einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder ein erfindungsgemäßes Konjugat codiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Expressionsvektor, der die DNA-Sequenz umfasst, sowie eine Wirtszelle, die den Vektor enthält.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine pharmazeutische Zubereitung, umfassend mindestens ein Polypeptid, wie vorstehend definiert, oder mindestens ein Konjugat, wie vorstehend definiert, oder mindestens einen Expressionsvektor, wie vorstehend definiert, ein pharmazeutisch verträgliches Exzipiens und gegebenenfalls ein Adjuvans.
Nach einer besonderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zubereitung, wie vorstehend definiert, die oral verabreichbar ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach auch das Polypeptid, wie vorstehend definiert, zu seiner Verwendung als Medikament und insbesondere zu seiner Verwendung zur Immunisierung des menschlichen Körpers gegen die mit HIV zusammenhängenden Infektionen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren für ein Polypeptid, wie vorstehend definiert, umfassend die Expression des Polypeptids ausgehend von einer Wirtszelle, wie vorstehend definiert.
Die Erfindung ist in der folgenden Beschreibung ausführlicher beschrieben.
Das Phänomen der Konformationsänderung von gp41, das der Fusion der Zell- und der Virusmembranen vorangeht, ist in der 1 erläutert. Die Fixierung von gp120 an den Rezeptor und den Corezeptor des Virus ruft eine erste Modifikation hervor, die die Auffaltung des Fusionspeptids und seine Verankerung in der Zellmembran zur Folge hat. Zu diesem Zeitpunkt bildet sich ein vorübergehender Zustand, wobei zwischen den N- und C-Helices keine Wechselwirkung vorliegt. Das zweite in der 1 erläuterte Ereignis ist die erneute Faltung von gp41, die der Annahme einer thermodynamisch stabileren Konformation des Moleküls entspricht. Die während dieser erneuten Faltung freigesetzte Energie gestattet die Annäherung und Fusion der zellulären und viralen Membranlipide.
Die Anmelderin hat überraschend gefunden, dass das erfindungsgemäße Polypeptid spezifische IgG-Antikörper induziert, die die primären HIV-Isolate neutralisieren. Die Induktion von Antikörpern, die die primären Isolate neutralisieren, kann durch den Neutralisationstest bestimmt werden, wie in dem Artikel von C. Moog et al. (AIDS Research an human retroviruses, Bd. 13(1), 13.27, 1997) beschrieben, worauf im Hinblick auf eine vollständige Beschreibung des Letzteren verwiesen werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird davon ausgegangen, dass neutralisierende Antikörper durch das nach der Technik von C. Moog getestete Antigen induziert wurden, wenn das um mindestens 1/4 verdünnte Serum in Gegenwart von HIV eine Reduktion des Virustiters um den Faktor 10 im Vergleich zu HIV allein auslöst, wobei der Virustiter durch die Menge von im Kulturüberstand produziertem p24 bewertet wurde.
Die Induktion von Antikörpern, die die primären Isolate neutralisieren, kann auch durch den Neutralisationstest von D. Montefiori, wie beschrieben in J. Infect. Dis. 1996, 173:60–67, bestimmt werden. In diesem Test wird der neutralisierende Titer durch die Reduktion in % von p24-Antigen ausgedrückt, das in den Kulturüberständen produziert wird, wenn das Virus in Gegenwart von um 1/4 verdünntem Serum inkubiert wird, im Vergleich zu dem Virus ohne Serum. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird davon ausgegangen, dass neutralisierende Antikörper induziert wurden, wenn die Reduktion des Gehalts an produziertem p24 mit einem um 1/4 verdünnten Serum mindestens 80 % erreicht. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird davon ausgegangen, dass die durch das erfindungsgemäße Polypeptid induzierten Antikörper neutralisiert werden, wenn eine neutralisierende Aktivität für ein in mindestens einem der beiden vorstehenden Tests bestimmtes Isolat nachgewiesen wird.
Die Induktion von Antikörpern, die den HIV-1-Laborstamm MN neutralisieren, kann unter Verwendung der Zelllinie MT-2 nach dem Verfahren von D. Montefiori, beschrieben in: DC Montefiori et al. J. Clin Microbiol. 1988, 26:231–5), abgeschätzt werden. Bei diesem Verfahren wird der neutralisiserende Titer als reziproker Wert der Verdünnung des Serums (arithmetischer Wert) ausgedrückt, der mindestens 50 % von Zellen vor der cytopathogenen Wirkung des HIV-Virus schützt.
Diese Eigenschaft macht das erfindungsgemäße Polypeptid zu einem für den Menschen interessanten Impfstoffkandidat.
Das erfindungsgemäße Polypeptid hat die Besonderheit, unter physiologischen Bedingungen eine Konformation anzunehmen, die als "offen" bezeichnet werden kann, im Gegensatz zu der "geschlossenen" Konformation des gp41 in der fusionsfähigen Form, wobei die N- und C-Domänen zueinander in antiparalleler Orientierung gepaart sind (vergleiche 1).
In der Tat ist die offene Konformation des erfindungsgemäßen Polypeptids durch die Tatsache gekennzeichnet, dass die C-Sequenz gegenüber der N-Sequenz nicht antiparallel gepaart ist, wie in der fusionsfähigen Form dargestellt. Das erfindungsgemäße Polypeptid liegt vorzugsweise in trimerer Form vor, wobei die N- und C-Sequenzen jeweils zueinander in einer parallelen Orientierung gepaart sind.
Überraschenderweise hat die Anmelderin auch festgestellt, dass das erfindungsgemäße Polypeptid seine "offene" Konformation in einem stark sauren Medium konserviert. Diese Eigenschaft macht aus dem erfindungsgemäßen Polypeptid ein oral verabreichbares Impf-Antigen. Die Anmelderin hat in der Tat gezeigt, dass die Ectodomäne des Proteins gp41 bei pH 2,5 äußerst hitzestabil ist. Die Messung von Tm (Temperatur, bei der 50 % der vorhandenen Proteine denaturiert sind) für gp41 in 50 mM Natriumformiat durch DSC (Differentialscanningcalorimetrie) ergibt einen Wert von 110 °C, wobei der Anfang des Denaturierungsphänomens bei etwa 100 °C bei pH = 2,5 auftritt. Die Hitzestabilität des Proteins gp41 bei neutralem pH wurde von Weissenhorn et al. (EMBO, 1996, 7, 1507–1514) bewertet. Die bei neutralem pH von diesen Autoren gemessene Tm beträgt 78 °C, was anzeigt, dass dieses Protein überraschenderweise bei saurem pH stabiler ist als bei neutralem pH. Diese Ergebnisse wurden durch eine Zirkulardichroismusanalyse bestätigt, deren Ziel es ist, den Prozentgehalt an α-Helix in dem Protein zu berechnen.
Ebenso hat die Anmelderin gezeigt, dass das erfindungsgemäße Polypeptid die gleiche Besonderheit aufweist. Diese spezielle Eigenschaft macht aus dem erfindungsgemäßen Polypeptid ein Impf-Antigen der Wahl für eine orale Verabreichung.
Diese offene Konformation wird durch direkte Verknüpfung der N- und C-Sequenzen, wie vorstehend definiert, erhalten. In einem solchen Fall fehlen S1 und S2, und die letzte Aminosäure der N-Sequenz ist direkt über eine Amidbindung mit der ersten Aminosäure der C-Sequenz verknüpft oder umgekehrt (Bsp.: AA33-77-AA117-154). Diese offene Konformation wird auch erhalten, wenn die N- und C-Sequenzen, wie vorstehend definiert, miteinander über eine S1- oder S2-Sequenz verknüpft sind, derart, dass die resultierende Sequenz der Formel I eine α-Helix-Konformation einnimmt, wie durch die SOPMA-Software unter den folgenden Bedingungen bestimmt: Anzahl der konformationellen Zustände = 4; Ähnlichkeitsgrenze = 8 und Größe des Fensters = 70.
Die erfindungsgemäße offene Konformation ist in der Tat durch das Fehlen einer flexiblen Region zwischen den N- und C-Sequenzen gekennzeichnet. Die SOPMA-Software, die auf der Seite: http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html (Geourjon C und Deléage G. SOPMA, Casios (1995), 11, 681–684) verfügbar ist, gestattet einen leichten Nachweis, wenn die S1- oder S2-Sequenz im Polypeptid der Formel I eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete α-Helix-Konformation annehmen.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform gilt m + n = 1 und wenn S 1 fehlt, stellt S2 W, WA, WAS; WASL oder WASLW dar, und wenn S2 fehlt, stellt S1 D, DQ, DQQ, DQQL oder DNNMT dar.
Ferner entsprechen nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform in dem Polypeptid, wie vorstehend definiert, die Sequenzen AA30-AA77 bzw. AA117-AA154 den Sequenzen SEQ ID NO: 26 bzw. SEQ ID NO: 27.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus SEQ ID NO: 28 und SEQ ID NO: 31.
Die Sequenzen AA30-AA77 und AA117-AA154, die von gp41 stammen, sind unter Bezugnahme auf die Nummerierung der Sequenz des gp41-Proteins nummeriert, wie im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 25 angegeben. Die Sequenz SEQ ID NO: 25 entspricht einem verkürzten gp41-LAI-Protein, wobei die erste Aminosäure A die Nummer 1 trägt.
Die erfindungsgemäßen Sequenzen AA30-AA77 und AA117-AA154 können von dem gp41-Gesamtprotein des HIV stammen, einschließlich der Stämme HIV-1 und HIV-2, einschließlich der Laborstämme und der primären Isolate. Vorzugsweise stammen die erfindungsgemäßen N- und C-Sequenzen von einem HIV-1-Stamm und insbesondere von einem HIV-I-LAI-Stamm.
Von einer großen gp41-Proteinanzahl sind die Nucleotid- und Peptidsequenzen bekannt und beispielsweise im Internet auf der Seite http://hiv-web.lanl.gov/ sowie in den entsprechenden Kompendien von Los Alamos zugänglich. Es ist klar, dass jede Sequenz, wobei eine oder mehrere konservative Mutationen, die weder die Immunogenizität noch die offene Konformation wesentlich ändern, eingebracht wurde, ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen ist.
Die erfindungsgemäße offene Konformation ist durch eine bestimmte Anzahl von durch die DSC-Technik und die Circulardichroismustechnik messbaren Parameter gekennzeichnet. Diese Techniken sind ausführlich in den folgenden Artikeln von A. Cooper et al., Phil Trans. R. Soc. Lon. A (1993) 345, 23–25, und von V.V. Plotnikov et al. Analytical Biochemistry 250, 237–244, (1997) und S.M. Kelly und N.C. Price (1997) Biochim. Biophys. Acta. 1338, 161–185 beschrieben.
Die DSC misst die thermodynamischen Parameter der Denaturierung der Proteine. Die Denaturierung der Proteine ist ein endothermes Ereignis, das durch das Messen der Absorption der Wärme durch das Protein als Funktion der Temperatur bewertbar ist. Die beiden erhaltenen Hauptparameter sind:

– Tm oder Halbdenaturierungspunkt (d.h. Temperatur, bei der 50 % des Proteins in nativer Form und 50 % in denaturierter Form vorliegen) und
– ΔH oder Enthalpieänderung während der Denaturierung (d.h. die zur Denaturierung des Proteins notwendige Wärme).

Diese beiden Parameter sind exakte Marker für die Konformation eines Proteins.
Eine Analyse durch DSC ist in Beispiel 5 unter Bezugnahme auf die 2 ausführlich erläutert.
Was die Zirkulardichroismustechnik betrifft, so gestattet sie die Bewertung der Sekundärstruktur des Proteins. Das Signal einer α-Helix ist durch Minima bei 208 nm und 222 nm gekennzeichnet. Der Wert des Signals bei 222 nm wird zur Bestimmung des prozentualen Gehalts an α-Helix in einem Protein angewandt. Das Signal einer Schleife ist durch ein Maximum bei etwa 205 nm gekennzeichnet. Durch diese Technik lässt sich beweisen, dass das erfindungsgemäße Protein keine Schleife enthält, die normalerweise in der fusionsfähigen Form vorhanden ist, und dass es fast, ja sogar ganz ausschließlich aus einer α-Helix besteht.
Eine Analyse durch Zirkulardichroismus ist in Beispiel 6 unter Bezugnahme auf 3 ausführlich erläutert.
Obwohl das erfindungsgemäße Polypeptid eine offene Konformation aufweist, die stabil ist, kann diese Konformation durch Addition von Cysteinresten an die Enden des Polypeptids verstärkt werden. Zu diesem Zweck können zwei zusätzliche Cysteinreste an den N-Terminus oder C-Terminus, vorzugsweise an den N-Terminus des erfindungsgemäßen Polypeptids, addiert werden, um das Trimer kovalent in einer offenen Konformation zu fixieren.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann durch jede klassische chemische Synthesetechnik oder durch Gentechnik erhalten werden.
Wenn ein Polypeptid durch chemische Synthese hergestellt wird, kann das erfindungsgemäße Polypeptid in der Form einer einzigen Sequenz oder in Form von mehreren Sequenzen, die anschließend miteinander verknüpft werden, synthetisiert werden. Die chemische Synthese kann in fester Phase oder in Lösung durchgeführt werden, wobei diese beiden Synthesetechniken dem Fachmann gut bekannt sind. Diese Techniken sind insbesondere von Atherton und Shepard in "solid phase peptide synthesis" (IRL press Oxford, 1989) und von Houben-Weyl in "Methoden der organischen Chemie", herausgegeben von E. Wunsch, Bd., 15-I und II, Thieme, Stuttgart, 1974, sowie in den folgenden Artikeln, deren Gesamtheit hier als Bezugnahme mit eingeschlossen ist: Dawson PE et al. (Synthesis of proteins by native chemical ligation Science 1994; 266 (5186):776–9); Kochendoerfer GG et al. (Chemical protein synthesis. Curr Opin Chem Biol 1999; 3(6):665–71); und Dawson PE et al. Synthesis of native proteins by chemical ligation, Annu Rev Biochem 2000; 69:923–60, beschrieben.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann auch durch gentechnische Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, hergestellt werden. Wenn das erfindungsgemäße Polypeptid gentechnisch hergestellt wird, schließt es am NH₂-terminalen Ende der Sequenz der Formel I einen zusätzlichen Methioninrest ein, entsprechend der Translation des ersten Startkodons, und kann am N- und C-Terminus auch einige zusätzliche Aminosäuren einschließen. Diese Techniken sind in Molecular Cloning: a molecular manual de Maniatis et al, Cold Spring Harbor, 1989 ausführlich beschrieben. Klassischerweise kann die DNA, die das erfindungsgemäße Polypeptid codiert, durch die PCR-Technik hergestellt werden, wobei die N- und C-Sequenzen als Erstes unabhängig voneinander amplifiziert und dann als Zweites gepaart und erneut amplifiziert werden. Anschließend wird die so erhaltene DNA-Sequenz in einen Expressionsvektor inseriert. Der Expressionsvektor, der die Sequenz von Interesse einschließt, wird anschließend zur Transformation einer Wirtszelle, die die Expression der Sequenz von Interesse ermöglicht, verwendet. Das produzierte Polypeptid wird sodann aus dem Kulturmedium durch klassische, dem Fachmann gut bekannte Techniken isoliert, wie Ethanolfällung oder Ammonsulfatfällung, Säure-Extraktion, Anionen/Kationen-Austauscherchromatographie, Chromatographie auf Phosphocellulose, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Chromatographie über Hydroxylapatit und Chromatographie über Lectin. Vorzugsweise wird bei der Reinigung die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) angewandt.
Je nach verwendetem Expressionssystem (sezerniertes Protein oder nicht) und je nach Reinigungsverfahren kann sich das gereinigte Polypeptid in verschiedenen Formen präsentieren. Es kann in denaturierter oder nicht denaturierter Form, monomer oder multimer vorliegen. Wenn es sich in denaturierter Form befindet, ist es möglich, ihm seine erfindungsgemäße offene Konfiguration unter Anwendung des in den nachstehend angegebenen Beispielen beschriebenen Verfahrens zu verleihen. Um multimere Formen, und insbesondere trimere Formen zu erhalten, müssen die gereinigten Polypeptidmoleküle in ein Medium übergeführt werden, in dem sich die Moleküle ausgezeichnet lösen lassen, und das ihr Vorliegen im wesentlichen ohne Wechselwirkung untereinander und vorzugsweise ohne Sekundärstruktur erlaubt. Hierzu können Detergentien, wie Natriumdodecylsulfat, N-Laurylsarcosin, Guanidiniumchlorid, Harnstoff, Natriumthiocyanat oder chaotrope Mittel, verwendet werden. Die gewünschten Bedingungen können durch Verwendung von organischen Lösungsmitteln oder Säuren begünstigt werden. Ist diese erste Bedingung erfüllt, wird die Probe in eine Dialysezelle eingebracht, um einen Teil der verwendeten Detergentien oder chaotropen Mitteln zu beseitigen, derart, dass die Wechselwirkungen zwischen den Polypeptidmonomeren unter Bewahrung einer ausreichenden Löslichkeit für die Moleküle begünstigt werden. In einem zweiten Schritt, wobei die Bildung von Trimeren begünstigt ist, wird die Probe in einem physiologischen Medium vollständig dialysiert, das das Polypeptid in Lösung oder Suspension hält. Somit werden Trimere des erfindungsgemäßen Polypeptids erhalten. Eine solche Technik ist ausführlich in der Anmeldung WO 00/08167 beschrieben.
Zur Durchführung der Synthese des Polypeptids kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung jeder klassischerweise zur Expression eines rekombinanten Proteins verwendete Expressionsvektor verwendet werden. Der Begriff umfasst demnach auch alle Expressionsvektoren die "lebend" genannt werden, wie die Viren und Bakterien, sowie die Expressionsvektoren vom Plasmidtyp.
Vorzugsweise werden Vektoren verwendet, wobei die DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen Polypeptids unter der Abhängigkeit eines starken Promotors vorliegt, der induzierbar oder nicht induzierbar ist. Als Beispiel für einen verwendbaren Promotor kann der T7 RNA-Polymerase-Promotor genannt werden.
Die Expressionsvektoren umfassen vorzugsweise mindestens einen Selektionsmarker. Solche Marker umfassen beispielsweise das Gen der Dihydrofolatreduktase oder das Neomycin-Resistenzgen für die Kultur von eukariotischen Zellen und die Kanamycin-, Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenzgene für die Kultur von E. von und anderen Bakterien.
Als im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbarer Expressionsvektor können die Plasmide pET28 (Novagen) oder pBAD (Invitrogen) beispielsweise die viralen Vektoren wie: Baculovirus, Pockenvirus, insbesondere die Pockenviren, die in den Patentschriften US 5,942,235 , US 5,756,103 und US 5,990,091 , die insgesamt hier durch Bezugnahme mit eingeschlossen sind, die rekombinanten Viren des Impfstoffs, insbesondere die rekombinanten Viren, die in den Patentschriften EP 83286 , US 5,494,807 und US 5,762,938 beschrieben sind, in denen die DNA-Sequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, kloniert werden, zitiert werden.
Um die Expression und Reinigung des Polypeptids zu begünstigen, kann letzteres in modifizierter Form exprimiert werden, wie ein Fusionsprotein, und kann nicht nur Sekretionssignale, sondern auch zusätzliche heterologe funktionelle Regionen einschließen. Beispielsweise kann eine Region von zusätzlichen Aminosäuren, insbesondere von geladenen Aminosäuren, an den N-Terminus des Polypeptids addiert werden, um die Stabilität und Haltung in der Wirtszelle zu verbessern.
Für die Expression des Polypeptids kann jede klassischerweise verwendete Wirtszelle in Kombination mit den vorstehend beschriebenen Expressionsvektoren verwendet werden.
Als nicht einschränkendes Beispiel können die Zellen von E. coli, BL21 (λDE3), HB 101, Top 10, CAG 1139, Bacillus, die eukariotischen Zellen, wie CHO oder Vero, zitiert werden.
Vorzugsweise wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung das System Expressionsvektor/lebende Zelle: pET(Cer/BL21LamdaDE3 oder BL211amdaDE3(RIL) verwendet.
Je nach zur Expression des Polypeptids verwendeter Wirtszelle können die erfindungsgemäßen Polypeptide glycosyliert oder nicht glycosyliert sein. Ferner können die erfindungsgemäßen Polypeptide auch einen zusätzlichen Methioninrest am N-Terminus einschließen. Zusätzliche Aminosäuren am N- und C-Terminus können auch von Rekombinationsprozessen herrühren.
Nach der Reinigung kann das erfindungsgemäße Polypeptid zweckmäßigerweise mit 2,2,2-Trifluroethanol (TFE) vermischt werden. Hierzu wird das Polypeptid vorzugsweise in einen Säurepuffer, wie Natriumformiat, bei einem pH von 2,5, verbracht. Das so gebildete Gemisch enthält 10–50 Vol.-% TFE, vorzugsweise 15–30 Vol. % TFE. Das TFE besitzt die Wirkung des An stiegs des Helikalitätsgehalts des Polypeptids, um ihn auf einen Wert von nahe oder gleich 100 % anzuheben.
Neben TFE können auch andere organische Lösungsmittel oder Detergentien verwendet werden. Als Beispiels können genannt werden: Isopropanol oder Lysophospholipid. Die geeigneten Mengen dieser Verbindungen können leicht vom Fachmann bestimmt werden.
Da diese Verbindungen im Allgemeinen toxisch und in der Folge nicht an den Menschen verabreichbar sind, ist es notwendig, sie vor der Verabreichung zu beseitigen. Die Anmelderin hat bewiesen, dass diese Lösungsmittel oder Detergentien durch Zugabe eines Trägers, der das Polypeptid adsorbiert, leicht beseitigt werden können. Der bei der Erfindung verwendete Träger entspricht einem pharmazeutisch verträglichen Träger, der an den Menschen verabreicht werden kann. Als Beispiel für einen im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeigneten Träger können Hydroxid-, Phosphat- oder Aluminiumhydroxylphosphatgele zitiert werden, die klassischerweise als Adjuvans in den Impfstoffen verwendet werden. Der Träger wird in großem Überschuss bezüglich des Polypeptids verwendet, um eine vollkommene Adsorption von letzterem zu erhalten.
Jeder andere pharmazeutisch verträgliche und zur Adsorption des erfindungsgemäßen Polypeptids geeignete Träger kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Klassischerweise wird die erforderliche Menge an pharmazeutisch verträglichem Träger dem Polypeptid/TFE-Gemisch zugesetzt, anschließend wird das Ganze bei Umgebungstemperatur während der Dauer, die zum vollständigen absorbieren lassen des Polypeptids auf dem Träger notwendig ist, inkubiert. Die Inkubationsdauer kann von 15 min bis 3 h variieren. Das Gemisch wird anschließend ein- oder zweimal bei etwa 10000 g zentrifugiert und das Pellet wird in einer dem Menschen verabreichbaren Lösung, wie beispielsweise im Falle einer injizierbaren Zusammensetzung eine PBS-Pufferlösung oder eine physiologische Salzlösung, aufgenommen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die Konjugate, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid und ein Trägerprotein oder ein Trägerpeptid umfassen.
Das Trägerprotein (oder -peptid) verstärkt die Immunogenizität des erfindungsgemäßen Polypeptids insbesondere unter Erhöhung der Produktion von spezifischen Antikörpern. Das Trägerprotein (oder -peptid) umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Epitop(e)-T-Helfer. Unter "Epitop-T- Helfer" wird eine Kette von Aminosäuren verstanden, die im Zusammenhang mit einer oder mehreren MHC-Klasse-II-Molekülen die T-Helferlymphozyten aktiviert. Nach einer zweckmäßigen Ausführungsform verbessert das Trägerprotein (oder -peptid) das verwendet wird, die Löslichkeit in Wasser des erfindungsgemäßen Polypeptids.
Als Trägerprotein können beispielsweise die Phagen-Oberflächenproteine verwendet werden, wie das Protein pIII oder pVIII des Phagen M13, die bakteriellen Oberflächenproteine, wie die Proteine LamB, OmpC, OmpA, OmpF und PhoE von E. coli, das Protein CotC oder CotD von B. Subtilis, die Schweinebakterien, wie Schweine-P1 von Neisseria gonorrheae, Schweine-P1 oder Schweine-P2 von H-Influenza-B, Schweine-Klasse I von N, meningitidis-B, Schweine-P40 von K. pneumoniae, Lipoproteine, wie OspA von B. bugdorfi, PspA von S. pneumoniae, TBP2 von N. meningitidis-B, TraT von E. coli, sowie Haftprotein A von S. pneumoniae; die "Wärmeschockproteine", wie Hsp65 oder Hsp71 von M. tuberculosis oder bovis oder Hin 47 von H-Influenza, Typ B. Ebenfalls besonders geeignet im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind die detoxifizierten Bakterientoxine, wie Tetanusanatoxin oder Diphterieanatoxin, die B-Untereinheit des Choleratoxins, die B-Untereinheit des Choleratoxins, die B-Untereinheit des Endotoxins A von P. aeruginosa oder das Exotoxin A von S. aureus.
Als Trägerpeptid können im Rahmen der vorliegenden Erfindung beispielsweise die Peptide p24E, p24N, p24H und p24M verwendet werden, die in WO 94/29339 beschrieben sind sowie die PADRE-Peptide, wie von Del guercio et al. (Vaccine (1997); Bd. 15/4, Ss. 441–448) beschrieben verwendet werden.
Das Trägerprotein (oder -peptid) ist am N- oder C-Terminus durch jedes dem Fachmann gut bekannte Konjugationsverfahren mit dem N- oder C-Terminus des Polypeptids verknüpft. Ferner kann die Sequenz, die das Trägerprotein (oder -peptid) codiert, zweckmäßigerweise mit der Sequenz fusioniert sein, die das erfindungsgemäße Polypeptid codiert, und die resultierende Sequenz kann in Form eines Fusionsproteins durch jedes klassische Verfahren exprimiert werden. Sämtliche Verfahren der Gentechnik, die geeignet sind, um dies durchzuführen, sind bei Maniatis et al. beschrieben. Die Konjugate können durch jedes klassische Reinigungsverfahren das dem Fachmann gut bekannt ist, isoliert werden.
Gegenstand, der vorliegenden Erfindung sind auch die DNA-Sequenzen, die die Polypeptide codieren, und die erfindungsgemäßen Konjugate sowie die Expressionsvektoren, die die Sequenzen umfassen, und die durch die Vektoren transformierten Wirtszellen. Die DNA-Sequenzen, die die erfindungsgemäßen Polypeptide codieren, können unter Verwendung der Nucleotidsequenz eines gp41-Proteins als Matrix leicht durch PCR hergestellt werden.
Statt das Polypeptid oder das durch den Expressionsvektor exprimierte Konjugat zu extrahieren und zu reinigen, ist es oft leichter und manchmal zweckmäßiger, den Expressionsvektor an sich in dem erfindungsgemäßen Impfstoff zu verwenden. Demnach ist auch jeder Expressionsvektor, wie vorstehend definiert, Gegenstand der vorliegenden Erfindung. In einem solchen Beispielfall fehlt dem Expressionsvektor der Marker und entspricht vorzugsweise einem viralen Vektor, insbesondere einem Pockenvirus, wie ALVAC oder NYVAC.
Jede Wirtszelle, wie vorstehend definiert, die mit einem solchen Expressionsvektor transformiert ist, ist ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Antikörper, die gegen die Polypeptide und Konjugate, wie vorstehend beschrieben, gerichtet sind. Die Herstellung solcher Antikörper erfolgt durch die klassischen Techniken zum Erhalt von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern, die dem Fachmann gut bekannt sind.
Diese Antikörper sind besonders geeignet zur Verwendung bei einem Passivimmunisierungsschema.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch pharmazeutische Zubereitungen, die zur Induktion von neutralisierenden Anti-HIV-Antikörpern geeignet sind, die zur therapeutischen und prophylaktischen Immunisierung von mit HIV zusammenhängenden Infektionen geeignet sind. Die erfindungsgemäßen Zubereitungen umfassen mindestens ein Polypeptid, mindestens ein Konjugat oder mindestens einen Expressionsvektor, wie vorstehend definiert, ein pharmazeutisch verträgliches Exzipiens oder Verdünnungsmittel und gegebenenfalls ein Adjuvans.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Zubereitung ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Jeder pharmazeutisch verträgliche Träger, der in der Lage ist, das erfindungsgemäße Polypeptid zu adsorbieren, kann verwendet werden. Eine Beschreibung von solchen Trägern wird nachstehend bereitgestellt. In dem Fall, wobei der pharma zeutisch verträgliche Träger ein Aluminiumsalz ist, gewährleistet letzteres gleichzeitig die Träger- und Adjuvansfunktion.
Die Menge an Polypeptid, Konjugat oder Vektor in der erfindungsgemäßen Zubereitung, hängt, wie es der Fachmann einsieht, von zahlreichen Parametern ab, wie Natur des Trägerproteins, des verwendeten Vektors oder Verabreichungsweg. Eine geeignete Menge ist eine Menge, derart, dass eine humorale Immunantwort, die in der Lage ist, primäre HIV-Isolate zu neutralisieren, nach Verabreichung dieser letzteren ausgelöst wird. Die zu verabreichende Menge an Polypeptid beträgt 10 μg bis 1 mg, wobei die gewählte Menge als Funktion des Verabreichungsweges variiert. Die Menge an zu verabreichendem Konjugat wird von den vorstehend angegebenen Mengen unter Berücksichtigung des PM des Trägerproteins abgeleitet. Die zu verabreichende Menge an Expressionsvektor liegt in der Größenordnung von 10–5000 Mikrogramm im Falle eines nicht viralen Vektors und in der Größenordnung von 10⁴ bis 10⁸ TCID50 im Falle eines viralen Vektors.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen können auch ein Adjuvans enthalten. Jedes pharmazeutisch verträgliche Adjuvans oder Gemisch von Adjuvantien, die klassischerweise auf dem Gebiet der Impfstoffe verwendet werden, kann zu diesem Zweck verwendet werden. Zitiert werden können als Beispiel die Aluminiumsalze wie Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat. Klassische Hilfsmittel, wie Emollientien, Füllstoffe, Emulgatoren, Puffer, etc. können ebenfalls der erfindungsgemäßen Zubereitung zugesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können durch jedes dem Fachmann bekannte klassische Verfahren hergestellt werden. Klassischerweise werden die erfindungsgemäßen Antigene mit einem pharmazeutisch verträglichen Exzipiens oder Verdünnungsmittel, wie Wasser oder eine Phosphatpufferlösung, gemischt. Das Exzipiens oder Verdünnungsmittel wird als Funktion der gewählten galenischen Form, der Verabreichungsweise und des Verabreichungsweges, sowie als Funktion der pharmazeutischen Praxis gewählt. Die geeigneten Exzipientien oder Verdünnungsmittel sowie die Substanzanforderungen hinsichtlich der pharmazeutischen Formulierung sind ausführlich in Remington's Pharmaceutical Sciences beschrieben, das ein Standardwerk in diesem Bereich darstellt.
Die vorstehend erwähnten Zubereitungen können auf klassischem Weg, der üblicherweise im Bereich von Impfstoffen eingesetzt wird, wie parenteral (intravenös, intramuskulär, subkutan, etc.) verabreicht werden. Vorzugsweise wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung für die injizierbaren Zubereitungen eine intramuskuläre Verabreichung verwendet. Eine solche Verabreichung kann zweckmäßigerweise an den Schenkelmuskeln oder Armmuskeln durchgeführt werden. Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können zweckmäßigerweise auch oral verabreicht werden. Eine Verabreichung über die Nasen-, Vaginal- oder Rektalschleimhaut kann ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung empfohlen werden. Die Verabreichung kann durch Verabreichung einer einzigen Dosis oder von wiederholten Dosen beispielsweise vom ersten Tag bis 1 Monat, 3 Monate, 6 Monate, und bis 12 Monate, durchgeführt werden. Vorzugsweise werden die Injektionen am ersten Tag während 1–3 Monaten mit einer Auffrischung, deren Wiederkehr leicht vom behandelnden Arzt bestimmt werden kann, durchgeführt.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung kann zweckmäßigerweise nach einem Dosierungsschema verabreicht werden, das die gemeinsame Verabreichung eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors und eines erfindungsgemäßen Polypeptids umfasst, oder nach einem "Prime-Boost"-Schema, wobei der erfindungsgemäße Vektor zuerst und das Polypeptid als Auffrischungsinjektion verabreicht werden. In diesen beiden Dosierungsschemata kann der erfindungsgemäße Expressionsvektor durch jeden Expressionsvektor, der zusätzlich ein oder mehrere Antigene oder Epitope von HIV exprimiert, die von dem erfindungsgemäßen Polypeptid verschieden sind, und insbesondere durch ein Pockenvirus, vorzugsweise ALVAC oder NYVAC, ersetzt werden. Als beispielhafter Vektor können ALVAC und NYVAC, die zu diesem Zweck verwendbar sind, und die Vektoren, die in den Patentschriften US 5,942,235 , US 5,756,103 und US 5,990,091 ; EP 83286 , US 5,494,807 und US 5,762,938 beschrieben sind, genannt werden. Zweckmäßigerweise können im Rahmen der oral verabreichten Zubereitungen auch Bakterienvektoren verwendet werden, wie Lactobacillus oder Salmonella. Die Verwendung dieser Bakterienvektoren zu Immunisierungszwecken ist ausführlich im International Journal of Food Microbiology 41 (1998) 155–167 von P.H. Pouwels et al. und Cell Bd. 91, 765–775, Dezember 1997 von A. Darji et al., worauf im Hinblick auf mehr Einzelheiten verwiesen werden kann, beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Polypeptid, ein Konjugat oder einen Vektor, wie vorstehend definiert, und die pharmazeutische Zusammensetzung, die diese Verbindungen enthält, für ihre Verwendung als Medikament insbesondere zur Induktion von HIV-neutralisierendem Antikörper zur prophylaktischen und therapeutischen Immunisierung des menschlichen Körpers gegen die mit HIV zusammenhängenden Infektionen.
Nach einem bevorzugten Aspekt besteht der Gegenstand der vorliegenden Erfindung in der Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids zur Immunisierung des menschlichen Körpers. Demnach betrifft die vorliegende Erfindung vorzugsweise ein Verabreichungsverfahren des Polypeptids zur Auslösung einer humoralen spezifischen Immunantwort.
Die vorliegende Erfindung betrifft demnach insbesondere ein Verfahren zur Induktion von HIV-neutralisierendem Antikörper, umfassend die Verabreichung einer geeigneten Menge einer pharmazeutischen Zubereitung, wie vorstehend definiert, vorzugsweise einer Zubereitung, die ein Polypeptid der SEQ ID NO: 28 oder der SEQ ID NO: 31 einschließt.
Unter "eine spezifische humorale Antwort" wird eine Antwort verstanden, die die Produktion von Antikörpern einschließt, die spezifisch gegen das erfindungsgemäße Polypeptid gerichtet sind. Die Produktion von spezifischen Antikörpern kann leicht durch klassische, dem Fachmann gut bekannte Techniken bestimmt werden, wie ELISA, RIA, Westernblot.
Die Anmelderin hat überraschenderweise gezeigt, dass das erfindungsgemäße Polypeptid nach Verabreichung in der Lage war, Antikörper zu induzieren, die dazu geeignet waren, primäre HIV-Isolate zu neutralisieren. Demnach stellen diese Antigene wertvolle Kandidaten für die Entwicklung eines geeigneten Impfstoffs zum Schutze und/oder zur Behandlung einer großen Anzahl von Individuen, ja sogar sämtlicher Risiko-Individuen, oder von durch HIV infizierten Individuen dar.
Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, denkt die Anmelderin, dass die „offene" Konformation des erfindungsgemäßen Polypeptids die Domänen von gp41 zugänglich macht, die während des Phänomens der Fusion der viralen und zellulären Membranen nicht zugänglich sind, wie in der intermediären Konformation, die übergangsweise angenommen wird. Diese zugänglich gemachten Domänen stellen das Ziel von Antikörpern dar, die durch das erfindungsgemäße Polypeptid induziert werden, wobei letztere somit das Membranfusionsphänomen in einem vorfusionsfähigen Stadium blockieren. Die von dem erfindungsgemäßen Polypeptid eingenommene offene Konformation stellt somit die Konformation nach, die von dem intermediären Zustand angenommen wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein diagnostisches Verfahren, umfassend das in Kontakt bringen eines erfindungsgemäßen Polypeptids mit einer biologischen Probe und den Nachweis der Antikörper/Polypeptid-Komplexe die gebildet wurden. Die HIV+ Individuen enthalten in der Tat serische Anti-gp4l-Antikörper. Ein immunologischer Test (wie ein ELISA-Test, wobei das erfindungsgemäße Polypeptid an der Testplaque fixiert und sodann mit dem zu testenden Serum und den Antikörper/Polypeptidkomplexen in Kontakt gebracht wird, anschließend nachgewiesen werden) gestattet demnach die Diagnose der infizierten Individuen.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren ausführlicher beschrieben. Es zeigen:
Die 1 eine schematische Darstellung des Konformationsänderungsphänomens von gp41, das der Fusion von Zellmembranen und Virusmembranen vorangeht.
Die 2 ein Spektrum, das durch DSC-Technik erhalten wurde.
Die 3 ein Spektrum, das durch die Zirkulardichroismustechnik erhalten wurde.
Die 4 eine Plasmidkarte des pET-Cer (SEQ ID NO: 35).
Diese nachstehend beschriebenen Beispiele sind rein zur Erläuterung der Erfindung angegeben und können keinesfalls als Einschränkung des Umfangs der Erfindung betrachtet werden.
Beispiel 1: Konstruktion von DNA-Sequenzen, die die erfindungsgemäßen Polypeptide codieren
Die DNA-Sequenzen, die die Polypeptide codieren, entsprechend den Sequenzen SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32 und 33 werden nach dem folgenden Verfahren durch PCR erhalten:
Die N- und C-Sequenzen werden zuerst durch PCR ausgehend von einer Matrix amplifiziert, entsprechend einem Plasmid, das die DNA-Sequenz enthält, die die „Kernregion" von gp41 codiert (SEQ ID NO: 34), wobei die Primerpaare 5'N/3'N und 5'C/3'C, wie nachstehend in Tabelle 1 definiert, verwendet werden. Für jede der Sequenzen wird die PCR-Reaktion unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
Zunächst werden die Primer, die Matrix, das Gemisch von Nucleotiden und die Taq-Polymerase gemischt, und das Gemisch wird 2 min bei 94 °C erhitzt. Anschließend werden mit dem resultierenden Gemisch 25 PCR-Zyklen nach folgendem Schema durchgeführt: 94° 30s, 55° 30s und 68° 30s. Anschließend werden die so amplifizierten Produkte über QIAQUICK-Säulen unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen gereinigt.
Die beiden so gereinigten Produkte, die die überlappenden Sequenzen einschließen, werden gemischt und mit ihnen eine PCR-Amplifikationsreaktion unter Verwendung der 5'N- und 3'C-Primer durchgeführt, wie nachstehend in Tabelle 1 definiert. Die PCR-Reaktion wird nach folgendem Schema durchgeführt: die gereinigten N- und C-Sequenzen, die Taq-Polymerase und das Gemisch von Nucleotiden werden gemischt und den folgenden 10 Zyklen unterzogen: 94° 30s, 55° 30s, und 68° 34s. Anschließend werden die 5'N- und 3'C-Primer zugesetzt, und mit dem resultierenden Gemisch werden 20 PCR-Zyklen nach folgendem Schema durchgeführt: 94° 30s, 55° 30s und 68° 30s.
Dann werden die so amplifizierten DNA-Sequenzen über QIAQUICK-Säulen unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen gereinigt.
Beispiel 2: Klonierung der DNA-Sequenzen von Beispiel 1 in einen Expressionsvektor
Die in Beispiel 1 hergestellten DNA-Sequenzen werden durch NcoI und XhoI unter Standardbedingungen unter Verwendung von 10 Einheiten von jedem der Enzyme auf 1 μg PCR-Fragment verdaut, anschließend in einen pET-cer-Vektor nach der folgenden Vorgehensweise kloniert: Das PCR-Fragment und der durch die NcoI- und XhoI-Enzyme verdaute Vektor werden miteinander ligiert und anschließend zur Transformation eines XL1-Bakterienstammes durch Elektroporation verwendet. Der Erhalt der Konstruktion wird durch Minipräparation des Plasmids und Sequenzierung verifiziert.
Der verwendete pET-cer-Vektor wird aus dem pET28-Vektor von Novagen konstruiert. Der handelsübliche pET28c-Vektor wurde durch PCR mit Hilfe von 2 Primern amplifiziert, die auf beiden Seiten der dem Ursprung f1 entsprechenden Region angeordnet sind, derart, dass das amplifizierte Produkt der quasi Gesamtheit des Ursprungsvektors abzüglich der Region entspricht, die den Ursprung f1 umfasst. Die einzigen Restriktionsschnittstellen AscI und PacI werden jeweils durch 2 Primer eingebracht, die der Amplifikation dienten. Parallel dazu wird das cer-Fragment mit Hilfe von 2 Primern amplifiziert, wodurch sich dieses Fragment, eingerahmt von den AscI- und PacI-Stellen, erhalten lässt.
Vektor und cer-Fragment werden durch die Enzyme AscI und PacI verdaut und anschließend miteinander ligiert. Dieser Vektor umfasst insbesondere eine Expressionskassette unter der Kontrolle des T7-Promotors, ein Polylinker stromabwärts von dem T7-Promotor zur Klonierung des Gens von Interesse, das cer-Fragment, das stromabwärts von dem Polylinker angeordnet ist und durch das sich die Multimerisation der Plasmide vermindern lässt, ein Transkriptionsterminator T7-Glied und das Kanamycin-Resistenzgen.
Die positive Regulierung des Promators wird in Gegenwart der T7-RNA-Polymerase erhalten. Die Plasmidkarte des Plasmids pET-cer ist in 4 angegeben (SEQ ID NO: 35).
Beispiel 3: Herstellung des erfindungsgemäßen Polypeptids SEQ ID NO: 31
1 - Expression
Die Expression des von Beispiel 2 stammenden Plasmids, das die Sequenz einschließt, die das Polypeptid SEQ ID NO: 31 codiert, wird mit einem modifizierten E. coli-Stamm, d.h. BL21RILλDE3, durchgeführt.
Dieser Stamm ist an seltenen tRNAs angereichert (ARG, ILE, LEU), er enthält das Gen, das die T7-RNA-Polymerase codiert, welches sich unter der Kontrolle des lac UV5-Promotors befindet, der durch Zugabe von IPTG in einer Konzentration von 1 mM induzierbar ist.
Als erstes wird der Stamm durch das Plasmid nach dem Protokoll, das die folgenden Schritte einschließt, transformiert: Wiederaussäen von 3 Kolonien in 10 ml LB, angereichert mit Kanamycin in einer Konzentration von 25 μg/μl; Inkubation für 1 Nacht bei 37 °C; Wiederaussäen der Vorkultur mit 1:100 in 15 ml LB, angereichert mit Kanamycin in einer Konzentration von 25 μg/μl; Wachsen lassen bis D0600 = 0,5; Abnehmen von 1 ml zur Verifizierung der D0600; Abnehmen von 7 ml für die nicht induzierte Probe; Induzieren der 7 anderen ml mit 1 mM IPTG und 3 h Induktion bei 37 °C.
Dasselbe Protokoll wurde mit mehreren Litern von Kultur durchgeführt, um eine große Menge von Bakterien herzustellen, um das erfindungsgemäße Polypeptid zu reinigen.
2 - Reinigung
Das Zellpellet, gebildet aus von 500 ml Kulturmedium geernteten Bakterien, wird aufgetaut und in 100 ml 150 mM Tris-HCl-Puffer bei pH 8,0 in Gegenwart eines Proteaseinhibitors (Péfabloc, Interchim) in einer Konzentration von 100 μM aufgenommen. Lysozym wird in einer Konzentration von 100 μg/ml zugesetzt, und das Gemisch wird 30 min bei Umgebungstemperatur unter Rühren inkubiert. Die Zellen werden anschließend durch Ultraschall (4 Zyklen von 2 min) mit einer Energie von ungefähr 150 Watt aufgebrochen. Anschließend wird Benzonase (Dnase, Merck) mit MgCl₂, 1 mM, zugesetzt, und das Gemisch wird 20 min bei Umgebungstemperatur unter Rühren inkubiert. Nach Zentrifugation (20 min bei 10000 g) liegt das erfindungsgemäße Polypeptid in der unlöslichen Fraktion in Form von Inklusionskörpern vor. Diese werden mit Tris-HCl-Puffer, 50 mM bei pH 8,0, gewaschen und 15 min bei 10000 g zentrifugiert.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann anschließend durch eines der beiden folgenden Verfahren gereinigt werden:
Verfahren 1:
Nach Beseitigung des Überstandes wird die Solubilisierung des Zentrifugationspellets, bestehend im wesentlichen aus Inklusionskörpern, während 1 h bei Umgebungstemperatur durch schwaches Rühren in Gegenwart von 50 ml CAPS-Puffer bei pH 11,0, enthaltend 1 % N-Laurylsarcosin, durchgeführt.
Die solubilisierte Fraktion wird anschließend bei 4 °C gegen Tris-HCl-Puffer, 50 mM bei pH 8,0, enthaltend abnehmende Detergenskonzentrationen (0,2 % Endkonzentration) dialysiert und über ein Filter einer Porosität von 0,45 μm filtriert, anschließend auf eine Hi-Trap-Säule, 1 ml (Pharmacia), aufgegeben. Diese Affinitätschromatographieträger chelatisieren Nickelatome, an die die Histidinreste des C-terminalen Endes des Polypeptids binden. Nach dem Waschen wird die Elution des Polypeptids mit Ameisensäurepuffer, 50 mM bei pH 2,5, erhalten.
Verfahren 2:
Nach Beseitigung des Überstands wird die Solubilisierung des Zentrifugationspellets, bestehend im wesentlichen aus Inklusionskörpern, während 1 h bei Umgebungstemperatur durch sanftes Rühren in Gegenwart von 30 ml Tris-HCl-Puffer, 50 mM, pH 8,0, 8 M Harnstoff duchgeführt. Nach Filtration über ein Filter einer Porosität von 0,45 μm wird die Fraktion auf eine Hi-Trap-Säule, 1 ml (Pharmacia), geladen. Nach dem Waschen wird die Elution mit Tris-HCl-Puffer, 50 mM, pH 8,0 + 8 M Harnstoff + 500 mM Imidazol durchgeführt. Die eluierte Fraktion wird anschließend gegen Ameisensäurepuffer, 50 mM bei pH 2,5, dialysiert.
Beispiel 4: Herstellung des erfindungsgemäßen Polypeptids SEQ ID NO: 30
Das Polypeptid wird unter Anwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Protokolls exprimiert, anschließend nach der nachstehend beschriebenen Vorgehensweise gereinigt.
Das Zellpellet, gebildet aus in 500 ml Kulturmedium geernteten Bakterien, wird aufgetaut und in 100 ml Tris-HCl-Puffer, 50 mM, bei pH 8,0, in Gegenwart eines Proteaseinhibitors (Péfabloc, Interchim) bei einer Konzentration von 100 μm aufgenommen. Lysozym wird mit einer Konzentration von 100 μg/ml zugesetzt, und das Gemisch wird 30 min bei Umgebungstemperatur unter Rühren inkubiert. Die Zellen werden anschließend durch Ultraschall (4 Zyklen von 2 min), mit einer Energie von ungefähr 150 Watt aufgebrochen. Anschließend wird Benzoase (DNAase, Merck) mit MgCl₂, 1 mM, zugesetzt, und das Gemisch wird 20 min bei Umgebungstemperatur unter Rühren inkubiert. Nach Zentrifugation (20 min bei 10000 g) befindet sich das erfindungsgemäße Polypeptid hauptsächlich in der löslichen Fraktion. Nach Filtration über ein Filter einer Porosität von 0,45 μm wird die Fraktion auf eine Hi-Trap-Säule, 1 ml (Pharmacia) aufgegeben. Nach dem Waschen wird die Elution mit Tris-HCl-Puffer, 50 mM, pH 8,0 + 500 mM Imidazol durchgeführt. Die eluierte Fraktion wird anschließend gegen Tris-HCl-Puffer, 50 mM, pH 8,0, dialysiert.
Das Polypeptid bei einer Konzentration von 0,4 mg/ml wird anschließend in einen Natriumformiatpuffer, 50 mM bei pH 2,5, übergeführt. Ein TFE/Polypeptid-Gemisch wird durch Zugabe von 1 Vol. TFE auf 1 Vol. Polypeptidlösung hergestellt. Das so erhaltene Gemisch wird bei Umgebungstemperatur 15 min inkubiert. 6 mg Al-Phosphat sowie 50 mM Natriumformiatpuffer werden zugesetzt, um ein Endvolumen von 0,5 ml zu erhalten.
Anschließend wird das Gemisch bei 4 °C unter Rühren während einer Dauer inkubiert, die zwischen 15 min und 3 h schwanken kann derart, dass die vollständige Adsorption des Proteins auf dem Aluminiumphosphat möglich ist. Nach dem Adsorptionsschritt wird das Gemisch 5 min bei etwa 10000 × g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, und das Pellet wird in dem Anfangsvolumen unter Zugabe der notwendigen Menge an PBS-Puffer resuspendiert. Eine zweite Zentrifugation und eine Wiederaufnahme in dem gleichen Puffer gestattet die Beseitigung der letzten Spuren von Ameisensäure und TFE. Die so erhaltene Präparation bildet die verabreichbare pharmazeutische Zubereitung.
Beispiel 5: Analyse durch DSC der erfindungsgemäßen Polypeptide
Die Analysen werden über ein Mikrokalorimeter-VP (Microcal, Northampton, Massachusetts, USA) auf folgende Weise durchgeführt:
Herstellung der Proben:
Konzentration an Polypeptid: 0,4–0,7 mg/ml, bestimmt durch das MicroBCA-Verfahren (Pierce, Rockford, Illinois, USA). Das Polypeptid wird vor der Analyse filtriert (Ausschlussgrenze 0,22 μm), 8 min in dem Thermovac (Microcal, Northampton, Massachusetts, USA) entgast und anschließend bei 24 °C thermostatisiert. Die Proben befinden sich in Na-Formiatpuffer, 50 mM, pH 2,5.
Aufzeichnung:
Nach dem Aufheizen des Gerätes, das aus 6–10 Wärmezyklen des Puffers gegen Puffer besteht, wird das Polypeptid in eine Messzelle übergeführt, wenn die Temperatur der Zelle 25 °C beträgt.
Die Parameter der Wärmezyklen sind folgende: (1) 15 min Äquilibrierung bei 5 °C; (2) Temperaturanstieg von 5 °C bis 130 °Cmit einer Geschwindigkeit von 85 °C/h; (3) 3 min Äquilibrieren bei 130 °C und (4) Abkühlen von 130 °C auf 5 °C (max. Geschwindigkeit), umfassend den Schritt der Ladung der folgenden Probe bei der Temperatur von 25 °C für die folgende Messung.
Die Analyse wird an der Ectodomäne des gp41 LAI, die aus den Aminosäuren AA25-AA157 besteht, und an den erfindungsgemäßen Polypeptiden SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO: 30 durchgeführt. Die Proteinkonzentration betrug 0,51 mg/ml für die gesamte gp41-Ectodomäne und 0,63 mg/ml für die erfindungsgemäßen Polypeptide.
Die in 2 dargestellten Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 angegeben: Tabelle 2:
Beipiel 6: Analyse durch Circulardichroismus der erfindungsgemäßen Polypeptide
Die Analysen wurden auf einem Spektralpolarimeter (Jasco, Tokyo, Japan) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Temp.: 25 °C; Kuvette: optische Weglänge: 0,1 mm; Konzentration an Polypeptid: 1–2 mg/ml. Das Polypeptid wird in die Kuvette gegeben, und das Spektrum wird mit einer Abtastgeschwindigkeit von 10 nm/min aufgenommen. Die erhaltenen Spektren werden durch die Software Spectra Analysis von Jasco ausgewertet. Das Spektrum des Puffers wird zur Korrektur des Hintergrundrauschens verwendet.
Die Analyse wurde an der gesamten gp41 LAI-Ectodomäne (d.h. AA25-157) und an dem erfindungsgemäßen Polypeptid SEQ ID NO: 31 durchgeführt.
Die in 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die gesamte Ectodomäne einen Helikalitätsgehalt von 69 % aufweist, das erfindungsgemäße Polypeptid einen Helikalitätsgehalt von 70 % und das mit TFE gemischte Polypeptid einen Helikalitätsgehalt von 100 % aufweist.
Beispiel 7: Bestimmung der durch die erfindungsgemäßen Polypeptide induzierte humorale Immunität
Die Polypeptide SEQ NO:28, NO:29, NO:31 und NO:32 wurden am Meerschweinchen, Kaninchen und am Cynomologus-Makakken nach den nachstehend beschriebenen Protokollen getestet.
Meerschweinchen: Gruppen von 5 Meerschweinchen wurden dreimal in Abständen von 3 Wochen in die Schenkel (Muskel Bizeps femoris) 20 μg Antigen pro Dosis injiziert. Bei jeder Injektion erhielten die Tiere 0,5 ml der Formulierung (0,25 ml in jeden Schenkel).
Die Seren der Tiere wurden zur Analyse der Antikörper vor der Immunisierung, anschließend 3 und 2 Wochen nach der zweiten bzw. dritten Immunisierung entnommen.
Die beiden getesteten Zusammensetzungen: Antigen + Alaun (Aluminiumphosphat, 6 mg pro Dosis) und Antigen + Alaun (Aluminiumphosphat, 6 mg pro Dosis) + TFE wurden auf folgende Weise hergestellt: Für die Hilfsformulierungen mit Aluminiuumphosphat: Das Antigen befindet sich in einem Formiatmedium, 50 mM, pH 2,5. Die Formulierungen werden durch Zugabe des Alauns zu der Antigenzusammensetzung und Inkubation unter sanftem Rühren während 30 min erhalten. Das Gemisch wird anschließend zentrifugiert (5 min bei 3000 U/min), der Überstand entnommen und so durch PBS-Puffer ersetzt, dass 500 μl/Enddosis erhalten werden. Das Resuspendieren wird mit Hilfe eines Ultraschallbades vorgenommen.
Für die Formulierung mit Aluminiumphosphat und TFE: zu dem Antigen, das in Formiatmedium, 50 mM, pH 2,5, vorliegt, wird ein Volumen von TFE (50 Vol.-% Endvolumen) zugesetzt. Das Gemisch wird etwa 15 min bei Umgebungstemperatur inkubiert, und 6 mg Aluminiumphosphat sowie Formiatpuffer werden zugesetzt, um das Volumen, entsprechend dem Injektionsvolumen, auf 0,5 ml einzustellen. Das so erhaltene Gemisch wird anschließend bei 4 °C unter Rühren während einer Dauer inkubiert, die zwischen 15 min und 3 h variieren kann um die Adsorption des Antigens an dem Aluminiumphosphat zu ermöglichen. Nach Inkubation wird das Gemisch 5 min bei etwa 10000 g zentrifugiert, und das Pellet wird in PBS-Puffer resuspendiert. Dieser Schritt wird zweimal durchgeführt, um jede TFE-Spur zu beseitigen. Das Pellet wird mit Hilfe eines Ultraschallbades in dem injizierbaren Volumen resuspendiert.
Kaninchen: Gruppen von 2 Kaninchen wurden dreimal mit dreiwöchigen Abständen in die Schenkel 40 μg Antigen pro Dosis injiziert. Bei jeder Injektion erhielten die Tiere 1 mg Formulierung.
Die Seren der Tiere wurden zur Analyse von Antikörpern vor der Immunisierung, anschließend 3 und 2 Wochen nach der zweiten bzw. dritten Immunisierung entnommen.
Die hier getestete Zusammensetzung: Antigen + Alaun (Aluminiumphosphat, 6 mg pro Dosis) wurde auf folgende Weise hergestellt: Zu dem Antigen in Formiatmedium, 50 mM, pH 2,5, wird Aluminiumphosphat gegeben, wobei das Ganze 30 min bei 4 °C unter schwachem Rühren (bewegliches Rad) inkubiert wird. Die Röhrchen, die diese Präparationen enthalten, werden anschließend zentrifugiert (5 min bei 3000 U/min), der Überstand wird abgenommen und so durch PBS-Puffer ersetzt, dass 1 ml/Enddosis erhalten wird. Die Resuspendierung erfolgt mit Hilfe eines Ultraschallbades.
Rhesus-Makakken (Macaca fascicularis): Gruppen von 2 Makakken wurden dreimal in einem Abstand von einem Monat in die Schenkel (Muskel rectus femoris) 100 μg pro Dosis Antigen, adsorbiert an 6 mg Alaun (Aluminiumphosphat), injiziert. Bei jeder Injektion erhielten die Tiere 1 ml der Formulierung.
Die Seren der Tiere wurden zur Antikörperanalyse vor Immunisierung, anschließend 4 und 2 Wochen nach der zweiten bzw. dritten Immunisierung entnommen.
Die hier getestete Zusammensetzung: Antigen + Alaun wurde nach dem für die Experimente beim Kaninchen angewandten Protokoll hergestellt.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben:
Wie die Tabelle 1 zeigt, induzieren die erfindungsgemäßen Polypeptide signifikante homogene und spezifische ELISA-Antikörpergehalte gegen die Ectodomäne des gp41 LAI-Proteins (exprimiert bei E. coli in Form eines Trimers, das eine fusionsfähige Konformation annimmt) und gegen gp160 MN/LAI-2 (Hybridglycoprotein, wobei die Untereinheit gp120 aus dem HIV-1-MN-Isolat stammt, und die Untereinheit gp41 aus dem HIV-I-LAI-Isolat stammt). Diese IgG-Antworten erreichen bereits bei der zweiten Injektion quasi ein Plateau (Tabelle 1).
Tabelle 1 – Meerschweinchentest – ELISA-Antikörper-Antworten

*geometrisches Mittel ± Standardabweichung (log₁₀)
NB: sämtliche getesteten Vorimmunseren befinden sich unterhalb der Nachweisgrenze (d.h. 1,9 log₁₀ für ELISA-Anti-gp160 und 1,0 log₁₀ für die ELISA-Anti-Ectodomäne).

Die neutralisierende Aktivität der Seren nach 3 Immunisierungen wurde anschließend gegenüber dem Laborstamm HIV-1-MN auf individuellen Seren (bei DC Montefiori) bewertet. Wie die erhaltenen Ergebnisse zeigen, wurde keinerlei Neutralisation des MN-Stamms festgestellt.
Die neutralisierende Aktivität der Seren nach 3 Immunisierungen wurde ebenfalls gegenüber den primären IIIV-1-Stämmen (Laboratorien von C. Moog und D. Montefiori) bewertet. Die Analyse wurde auf individuellen Seren durchgeführt. Interessanterweise haben im Gegensatz zu dem, was für den Stamm MN beobachtet wurde, die Meerschweinchen gegen mehrere getestete Virusstämme nennenswerte neutralisierende Aktivitäten gezeigt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgezeigt. Tabelle 2: Meerschweinchentest – neutralisierende Anti-HN-1-Antikörper-Antworten

§ Lab. D. Montefiori: Ergebnisse angegeben für die Seren nach 3 Immunisierungen (arithmetischer Wert oder %)
¤ Lab. C. Moog: Ergebnisse angegeben für die Seren nach 3 Immunisierungen (arithmetischer Wert)
NT: nicht getestet
NB: sämtliche getesteten Vorimmunseren liegen unterhalb der Positivitätsschwelle (d.h. nach den Verfahren: < 20 für den HIV-1-MN-Stamm und < 80 oder < 4 für die primären Isolate).

Tabelle 3: Testkaninchen – ELISA-Antikörper-Antworten
Tabelle 4: Makakkentest – ELISA-Antikörper-Antworten

NB: Die getesteten Vorimmunseren erwiesen sich als unterhalb der Positivschwelle (1,0 log₁₀)

Die vorstehend angegebenen Ergebnisse zeigen eindeutig, dass das erfindungsgemäße Polypeptid in der Lage ist, spezifische signifikante ELISA-Antikörpergehalte bei sämtlichen getesteten Tierspezies auszulösen. Diese IgG-Antworten stiegen zwischen der zweiten und der dritten Injektion schwach an.
Diese Antikörper, die die Eigenschaft haben, die primären Isolate zu neutralisieren, machen das erfindungsgemäße Polypeptid zu einem wertvollen Kandidaten für eine Immunisierung beim Menschen.

Claims

Polypeptid, umfassend eine Sequenz der Formel I [N-S1]n-C-[S2-N]m wobei N die Sequenz der Aminosäuren 30–77 des gp41-Proteins des HIV-1-Virus darstellt, C die Sequenz der Aminosäuren 117–154 des gp41-Proteins des HIV-1-Virus darstellt, S1 fehlt oder die Sequenz der Aminosäuren D, DQ, DQQ, DQQL oder DNNMT darstellt, S2 fehlt oder die Sequenz der Aminosäuren W, WA, WAS, WASL oder WASLW darstellt und n = 0 oder 1 bedeutet; m = 0 oder 1 bedeutet und m + n = 1 oder 2 bedeutet.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei m + n = 1 bedeutet.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei N SEQ ID NO: 26 darstellt und C SEQ ID NO: 27 darstellt.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 28 und SEQ ID NO: 31.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend eine zusätzliche Sequenz der Formel (G)a-S-(H)b, wobei G einen Glycinrest darstellt, H einen Histidinrest darstellt, a größer oder gleich 4 ist und b größer oder gleich 6 ist, wobei die Sequenz über eine Amidbindung mit dem NH₂- oder COOH-Terminus des Polypeptids verknüpft ist.
Konjugat, umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das mit einem Trägerprotein oder einem Trägerpeptid konjugiert ist.
DNA-Sequenz, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein Konjugat nach Anspruch 6 codiert.
Expressionsvektor der die DNA-Sequenz nach Anspruch 7 umfasst.
Wirtszelle, die den Vektor nach Anspruch 8 enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend die Expression des Polypeptids ausgehend von einer Wirtszelle, wie in Anspruch 9 definiert.
Pharmazeutische Zubereitung, umfassend mindestens ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder mindestens ein Konjugat nach Anspruch 6 oder mindestens einen Expressionsvektor nach Anspruch 8, ein pharmazeutisch verträgliches Exzipiens und gegebenenfalls ein Adjuvans.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 11, die oral verabreichbar ist.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 11 oder 12, die weiterhin einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für seine Verwendung als Medikament.
Polypeptid nach Anspruch 14 zur Immunisierung des menschlichen Körpers gegen die mit HIV verbundenen Infektionen.