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Die
vorliegende Erfindung beschäftigt
sich mit neuen retroviralen Immunogenen, die retrovirale Regulationsprotein
einsetzen, deren essentielle biologische Eigenschaften zuvor derart
inaktiviert wurden, dass ihre immunogenen Eigenschaften bewahrt
oder vergrößert werden,
einem Verfahren zu ihrer Herstellung und den sie enthaltenden pharmazeutischen
Zusammensetzungen. Diese neuen ”inaktivierten” Immungene
können eingesetzt
werden, um beim Menschen eine aktive Immunisierung zu induzieren,
die im Stande ist, den Störungseffekten
vorzubeugen oder diese zu korrigieren, so dass die nativen Proteine,
von denen sie herrühren, zur
Produktion beitragen können.
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Ebenso
beschäftigt
sich die vorliegende Erfindung mit neuen Antikörpern, erhalten durch Verwendung dieser ”inaktivierten” Immunogene,
den Verfahren zu ihrer Herstellung und den sie enthaltenden pharmazeutischen
Zusammensetzungen im Hinblick auf eine passive Immunisierung.
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Das
Tat-Molekül
ist ein Regulationsprotein von HIV, das man nicht im viralen Teilchen
findet, das aber durch das 1-HIV-Genom codiert wird. Im Inneren
der infizierten Zellen spielt dieses durch provirale DNA codierte
Protein eine Rolle als Transaktivator von viralen oder zellulären Genen.
Dieses genetische Regulationsprotein kann sich indessen auch im äußeren Teil
der Zellen im extrazellulären
Blutkreislauf befinden, abgeschieden innerhalb der Überreste
von abgestorbenen Zellen, im nativen oder fragmentären Zustand,
oder durch Sekretionsprozesse. Seine Gegenwart im Blutkreislauf
erklärt
die Anwesenheit detektierbarer Anti-Tat-Antikörper bei bestimmten seropositiven
Subjekten. Diese extrazelluläre
Umgebung von Tat ermöglicht ihnen
das terminale Segment C, der Träger
der RGD-Reste, die
durch die zelluläre
Oberfläche
der Integrine und die Basenregion des Moleküls (Reste 45 bis 70) wiedererkannt
werden, wie die bakteriellen Toxine zu wirken, nämlich auf nicht-infizierte
Zellen verschiedener Gewebe einzuwirken. So wirkt das Tat-Zirkulationsprotein wie
ein echtes virales Toxin, kann auf Endothelialzellen schädliche Wirkungen
ausüben
und kann in Assoziation mit dem Wachstumsfaktor BFGF zur Neoan giongenese
des die Aids-Krankheit charakterisierenden Kaposi-Sarkoms beitragen.
Das Tat-Zirkulationsprotein kann auch die Immunsuppression verschlimmern,
die sich bei Aids allmählich
einstellt, entweder durch direkte immunsuppressive Wirkung auf die
T-Zellen, oder indem es
die α-Interferon-Produktion
durch die antigen auftretenden Zellen, bezeichnet als APC (Makrophagen
oder dentritische Zellen), stört.
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Das
erworbene Immunschwäche-Syndrom
(Aids) wird klinisch definiert durch opportunistische Erkrankungen
aufgrund einer Immunsuppression oder durch das Kaposi-Sarkom. Die
erworbene Immunsuppression, die allmählich im Laufe einer HIV-Infektion
auftritt, äußert sich
biologisch durch den Verlust der immunologischen Reaktivität der T-Zellen
(Cytostase und Verringerung der IL2-Produktion) nach der Stimulation
in erster Linie durch Gedächtnisantigene,
dann durch Alloantigene und schließlich durch Mitogene (PHA).
Diese Immunsuppression ist mit der Überproduktion der α- und γ-Interferone
verbunden.
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Die
cytopathogenen Mechanismen, die die Immunsuppression induzieren,
sind komplex und greifen in verschiedene Faktoren viralen Ursprungs
ein, indem sie entweder direkt auf die Immunitätszellen, T-Lymphozyten und
APC oder indirekt über
das Netz der Cytokine wirken. Somit kann das Umhüllungsprotein gp120, das vom
1-HIV-Teilchen getragen wird und dessen extrazelluläre Gegenwart
durch die virale Ladung im Serum gemessen wird, direkt die Anergie
der T-Zellen vom Phenotyp CD4 induzieren. Die Regulationsproteine
von HIV, insbesondere das Tat in seiner extrazellulären Konfiguration
des viralen Zirkulationstoxins, scheinen ebenfalls eine direkte
Immunsuppression der T-Zellen oder andere pathogene Effekte zu induzieren,
beispielsweise mit der Folge, dass in vitro die aktivierten T-Zellen
durch ein Gedächtnisantigen
oder Anti-CD3-Antikörper
in Gegenwart des Tat-Moleküls nicht
mehr proliferieren. Außerdem
scheint das Tat-Zirkulationsprotein die Überproduktion durch die APC
von α-Interferon,
cytostatischem und apoptogenem Cytokin, das in der Lage ist, die
bei der Aids-Erkrankung beobachtete Immunsuppression und Apoptose
zu verstärken,
zu erleichtern. Tatsächlich
scheint die α-Interferon-Sekretion
durch die Makrophagen in Gegenwart von Tat durch eine Retroregulation
(feedback), die im Normalzustand diese α-Interferon-Produktion (refraktäre Periode)
kontrolliert, nicht mehr aufzuhören.
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Das
Kaposi-Sarkom äußert sich
klinisch durch das Auftreten von vaskulären Knötchen, die eine von Endothelialzellen
ausgebildete Neoangiogenese darstellen. Diese durch entzündliche
Prozesse aktivierten Zellen verursachen die Produktion von Cytokinen
(γ-Interferon,
1-IL und 6-IL), erzeugen BFGF (Basic Fibroblastic Growth Factor)
und vermehren sich. Die Proliferation der in vitro aktivierten Endothelialzellen
wird durch die Gegenwart im Milieu des Tat-Proteins verstärkt. Die
Anti-Tat-Antikörper
blockieren in vitro die proliferativen Effekte des Tat-Proteins.
Die Wirkung von Tat auf die Endothelialzellen, die auf ihrer Oberfläche Adhesin
aus der Familie der Integrine tragen, erklärt sich durch die Gegenwart
der RGD-Sequenz, die durch diese Moleküle wiedererkannt wird.
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Die
Neoangiogenese, die in vivo das Kaposi-Sarkom umfaßt, würde daher
das Tat-Regulationsprotein in
seiner extrazellulären
Konfiguration begünstigen,
das dank seines C-terminalen
Fragments, das die RGD-Sequenz enthält, durch die Integrine der
Endothelialzellen wiedererkannt werden könnte. Zudem kann das Tat auch
durch seine an K- und R-Resten
reiche Basenregion wirken und ist folglich in der Lage, sich an Heparinsulfat
aus der extrazellulären
Matrix, das den Wachstumsfaktor BFGF konzentriert, zu binden. Somit wird
die durch die Wachstumsfaktoren induzierte Proliferation der Endothelialzellen
durch die Gegenwart von Tat erhöht
und die Neoangiogenese hervorgerufen. Dieser Effekt auf das Wachstum
der Endothelialzellen wird in vitro durch die Wirkung des Anti-Tat-Antikörpers verringert.
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Es
scheint daher wünschenswert,
die schädigende
Aktivität
der Regulationsproteine der Retroviren, insbesondere des in den
extrazellulären
Milieus zirkulierenden Tat, (Blut, Lymphe, Bindegewebsmilieus ...)
zu blockieren, die wirkliche virale Toxine darstellen.
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Hinsichtlich
der HIV-Viren hat man bis heute Impfungsversuche mit Strukturproteinen
oder Fragmenten von Strukturproteinen dieser Viren durchgeführt, aber
niemals mit Regulationsproteinen oder Fragmenten von Regulationsproteinen
dieser Viren.
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Nun
hat man erstaunlicherweise gefunden, dass genau wie bei bakteriellen
Toxinen (Tetanus, Diphterie oder Botulinus), deren toxische Aktivität durch
spezifische Antikörper
neutralisiert wird, die schädigenden Effekte
der viralen Regulationsproteine und insbesondere von Tat, einem
echten Toxin von HIV, in seiner extrazellulären Konfiguration – die sich
auf die Immunsuppression der T-Zellen durch Störung der Produktion von α-Interferon
durch die APC oder durch Neoangiogenese, die das Kaposi-Sarkom umfaßt, auswirken – in Gegenwart
spezifischer Anti-Tat-Antikörper
beseitigt werden, wie nachfolgend im experimentellen Teil zu sehen ist.
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Dieses
trifft gleichermaßen
auf die anderen Regulationsproteine von Viren, wie 1-HIV, 2-HIV und 1-HTLV oder
2-HTLV zu. Es wäre
daher wünschenswert,
für den
Mensch verabreichbare Immungene bereitzustellen, die in der Lage
sind, derartige Antikörper
zu produzieren, und außerdem,
sowohl zu heilenden als auch vorbeugenden Zwecken, solche Antikörper bereitzustellen.
Tatsächlich
können
die als Immungene eingesetzten Verbindungen aus dem Stand der Technik
für den
Menschen toxisch sein (siehe z. B.
WO-A-91 18 454 ), insbesondere jene, die die
basischen Regionen tragen. Es handelt sich um nicht-modifizierte Fragmente
von ”nativem” Tat, Nef
oder Ref, im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung, die auf der Inaktivierung
dieser Proteine oder Fragmente von Proteinen basiert.
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Die
WO-A-93 22 349 beschreibt
natürliche
IgM-Antikörper
von niedriger Affinität,
die normalerweise im Serum eines nicht mit 1-HIV infizierten Individuums
vorhanden sind, und die die Epitope auf den Protaminen SP80 und
Tat wiedererkennen und regt an, sie ausgehend von den seronegativen
Seren der Subjekte oder dem Überstand
geklonter B CD5+-Zellen
zu reinigen, um sie in Therapie einzusetzen.
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Das
Journal of Virology, 1990, 64: 962–5 beschreibt monoklonale Antikörper, produziert
von gegen das Tat-Protein mit Adjuvans von Freund immunisierten
Mäusen.
Bestimmte dieser monoklonalen Antikörper können die Transaktivierungswirkung
des Tat-Proteins auf LTR, einen 1-HIV-Promotor, inhibieren.
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Das
Journal of Cell Biology, 1990, 111: 1275–81 und die
WO-A-91/15224 beschreiben
die Fixierung von Tat-Protein auf monozytären, lymphozytären oder
muskulären
Zellen, dank des RGD-Rests in der Sequenz. Die Tat-Rezeptoren auf
den Zellen können
Integrine sein. Die PCT-Anmeldung schlägt die Verwendung von für die Bindungsstellen
von Tat-Integrin-spezifischen
Peptiden oder Antikörpern
vor, um die RGD-Integrin-Wechselwirkung
zu blockieren und den extrazellulären Effekt von Tat zu begrenzen.
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Im
Gegensatz zu obigem Artikel und Patent gibt die
WO-A-92 14 755 einen Tat-Bereich
an, der an die Integrine bindet und der nicht von der RGD-Sequenz
abhängt
und schlägt
vor, bei der Therapie Inhibitoren der Tat-Integrin-Bindung einzusetzen,
die entweder von Integrinen oder Tat abstammende Peptidfragmente
oder Antikörper
sind und die gegen die Tat-Integrin-Bindungsstellen gerichtet sind.
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In
Cell, 1988, 55: 1189–93
ist die Penetration von extrazellulärem Tat-Protein in die Zellen
beschrieben, um die Transkription des 1-HIV-Promoters zu transaktivieren
(CAT Assay). Es wird außerdem
der Verlust dieser Transaktivatorwirkung der Transkription beschrieben,
wenn man ein durch Carboxymethylierung behandeltes Tat-Molekül einsetzt.
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Das
Journal of Virology, 1994, 68: 3343–53, beschreibt die Produktion
durch Synthese von nativem Tat-Protein oder Fragmenten mit ihren
Transaktivatoreigenschaften auf LTR von 1-HIV, indem man als Marker das
Gen von β-Galactosidase
einsetzt. Die durch Addition von Acetamidomethylgruppierungen modifizierten Formen
von Tat wurden ebenfalls in diesem Transaktivatorsystem getestet.
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Aus
diesem Grund bezieht sich das vorliegende Schutzrecht auf pharmazeutische
Zusammensetzungen, umfassend eine dem Menschen verabreichbare detoxifizierte
immunogene Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass die immunogene
Verbindung von einem Regulationsprotein eines 1-HIV-, 2-HIV-Virus
oder einem seiner Peptidfragmente durch Behandlung mit einem chemischen
Mittel oder durch Kopplung mit einem Trägerprotein, aktiviert durch
eine Vorbehandlung mit einem Aldehyd, abgeleitet ist, was die Wiedererkennung durch
Antikörper,
die gegen das native Regulationsprotein gerichtet sind, und die Aufrechterhaltung
von ausreichenden immunogenen Eigenschaften ermöglicht, um Antikörper zu
erzeugen, die das native Protein neutralisieren oder blockieren,
während
mindestens 50% der toxischen biologischen Eigenschaften des nativen Proteins
verlorengehen, wobei das Regulationsprotein das Protein Tat ist.
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Das
vorliegende Schutzrecht bezieht sich auch auf die immunogenen Verbindungen,
wie sie oben definiert sind, zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren
für den
menschlichen oder tierischen Körper,
d. h. die Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus den
immunogenen Verbindungen, wie sie oben definiert sind, aufgebaut
sind.
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Das
vorliegende Schutzrecht bezieht sich insbesondere auf immunogene
Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, wie in den folgenden Ansprüchen definiert
sind.
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Diese
Verbindungen werden in Analogie zu bakteriellen Toxoiden, wie das
Tetanus-Toxoid,
nachfolgend als ”Toxoide” bezeichnet.
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Tatsächlich sind
sie, wie die klassischen bakteriellen Toxoide ohne eigene Toxizität, aber
sind währenddessen
in der Lage durch Verabreichung an ein Subjekt eine Immunisierung
hervorzurufen.
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Die
unten genannte chemische Behandlung kann durch eine physikalische
Behandlung, wie z. B. eine Bestrahlung und insbesondere eine UV-Bestrahlung,
vervollständigt
werden, mit dem Ziel, die verbliebene Toxizität der erfindungsgemäßen immunogenen
Verbindungen zu verringern.
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Die
obigen Toxoide können
z. B. ausgehend von einem Peptid mit einer Sequenz, die mit der
Peptidsequenz eines Regulationsproteins, Tat, identisch oder dieser ähnlich ist,
hergestellt werden, und sie können z.
B. durch herkömmliche
Peptid-Synthese auf Harz oder durch Gentechnik erhalten werden.
All diese Verfahren sind im Stand der Technik wohlbekannt.
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Um
zu überprüfen, ob
das erfindungsgemäß modifizierte
Regulationsprotein oder sein erfindungsgemäß modifiziertes Fragment durch
die gegen das native Regulationsprotein gerichteten Antikörper gut
erkannt wird, kann man z. B. immunologisch nach Elisa die Gegenwart
von spezifischen Antikörpern überprüfen, die Bildung
von Antigen-Antikörper-Komplexen, wie nachfolgend
im experimentellen Teil zu sehen.
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Um
zu bestimmen, ob die immunogenen Eigenschaften des Regulationsproteins
Tat ausreichend erhalten bleiben, um Antikörper zu erzeugen, die das native
Protein neutralisieren, kann man beispielsweise Säugetiere
(Hasen, Ratten, Mäuse)
mit einer erfindungsgemäßen immunogenen
Verbindung immunisieren und überprüfen, ob
die erzeugten Antikörper
die toxische Aktivität
des Regulationsproteins neutralisieren, wie man es für das Tat
im experimentellen Teil sieht.
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Um
zu bestimmen, ob das modifizierte Regulationsprotein Tat mindestens
50% seiner toxischen biologischen Eigenschaften verloren hat, kann
man den Effekt des Regulationsproteins, wie des inaktivierten Tat, auf
die Immunsuppression der T-Zellen oder auf die α-Interferon-Produktion durch die aktivierten
mononukleierten Zellen im peripheren Blut oder auch auf die durch
das Regulationsprotein induzierte Neoangiogenese untersuchen.
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Die
Inaktivierung des Tat-Regulationsproteins wird beispielsweise durch
den ”Tat
Rescue Assay” unter Verwendung
eines nicht-infektiösen,
Tat defizitären
HIV-Mutanten, auf einer zellulären
1-HLM-Linie, dessen Replikation vom exogenen Zusatz von nativem
Tat abhängt,
kultiviert.
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Die
immunogene Verbindung ist abgeleitet von dem Regulationsprotein
Tat der 1-HIV-, 2-HIV-Viren.
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Ebenfalls
kann man insbesondere die externen Regionen an den basischen Regionen
von Tat angeben, d. h. außerhalb
der Regionen 49 bis 57 von Tat, oder überlappend mit diesen Regionen über höchstens 4
Aminosäuren,
bevorzugt höchstens
2 Aminosäuren,
insbesondere des Peptids HQVSLSKQPTSQPRGD.
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Unter ”abgeleitet” oder ”abzuleiten” von einem
Regulationsprotein Tat eines 1-HIV-, 2-HIV-Virus versteht man, dass
die immunogene Verbindung insgesamt oder aus einem Fragment des
Regulationsproteins aufgebaut sein kann, und eine oder mehrere Modifikationen
in den Aminosäuren
dieses Proteins oder Fragments, wie Deletionen, Substitutionen,
Additionen oder Funktionalisierungen, wie Aminosäureacylierungen, in dem Umfang
trägt,
dass diese Modifikationen im oben präzisierten Rahmen bleiben (Fehlen
von Toxizität,
immunologische Charakteristika). Beispielsweise modifiziert im allgemeinen
der Ersatz eines Leucin-Restes durch einen Isoleucin-Rest derartige
Eigenschaften nicht. Die Modifikationen sollten allgemein weniger
als 30% der Aminosäuren
betreffen, bevorzugt weniger als 20% und insbesondere weniger als
10% auf den Homologiesegmenten am Regulationsprotein, mindestens
8 Aminosäuren,
insbesondere mindestens 12 Aminosäuren. Ein Fragment kann z.
B. 8 bis 60 Aminosäuren
tragen, bevorzugt 12 bis 40 Aminosäuren und insbesondere 25 bis
40 Aminosäuren.
Man kann beispielsweise die Reste 65 bis 80 am C-Terminus des Tat von 1-HIV nennen.
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Unter
den bevorzugten Bedingungen tragen die immunogenen Verbindungen
der Erfindung mindestens 50% des gesamten Regulationsproteins, bevorzugt
mindestens 70%, insbesondere mindestens 90%, und ganz besonders
bevorzugt das gesamte oder fast das gesamte Protein.
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Im
allgemeinen kann man hinsichtlich der Modifikationen, der Homologie
oder der Ähnlichkeit
zwischen modifiziertem Immunogen und dem Protein oder einem Teil
des nativen Proteins genauso wie den Dimensionen der immunogenen
Verbindung und den Einzelheiten der Verwendung oder der Kopplung
der erfindungsgemäßen immunogenen
Verbindung an ein immunogenes Protein, wie das Tetanus-Toxoid, auf
die
WO-A-86/06 414 oder
die
EP-A-0 220 273 oder
auch die
PCT/US 86/00831 verweisen, Äquivalente,
deren Offenbarung hier durch Bezugnahme miteinbezogen wird.
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Die
erfindungsgemäßen immunogenen
Verbindungen können
wie folgt eingesetzt werden: Man verabreicht einem Patienten eine
erfindungsgemäße immunogene
Verbindung, z. B. auf subkutanem oder intramuskulärem Weg,
in einer ausreichenden Menge, um im therapeutischen Plan wirksam
zu sein, an eine Person, die einer derartigen Behandlung bedarf.
Die verabreichte Dosis kann z. B. von 100 bis 1000 μg auf subkutanem
Weg gehen, einmal pro Monat, während
3 Monaten, dann periodisch als Funktion des Gehalts der im Serum
induzierten Antikörper,
z. B. alle 2 bis 6 Monate.
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Eine
erfindungsgemäße Zusammensetzung
kann durch jeden herkömmlichen,
beim Einsatz auf dem Gebiet der Impfstoffe üblichen Weg verabreicht werden,
insbesondere auf subkutanem Weg, intramuskulärem Weg, intravenösem Weg
oder oralem Weg. Die Verabreichung kann in einer Einzeldosis oder
wiederholt einmal oder mehrmals nach einem bestimmten Zeitintervall
erfolgen.
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Daher
bezieht sich das vorliegende Schutzrecht ebenfalls auf eine heilende
oder vorbeugende, pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet,
dass sie als aktiven Bestandteil eine immunogene Verbindung, wie
sie oben definiert ist, umfaßt.
Die immunogene Verbindung kann allein oder in Mischung mit einem
pharmazeutischen akzeptablen Träger,
wie einem Adjuvans, konditioniert werden.
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Die
Erfindung bezieht sich auch auf Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet,
dass sie aus den oben definierten immunogenen Verbindungen aufgebaut
sind, nämlich
den obigen immunogenen Verbindungen und ihre Verwendung in einem
therapeutischen Behandlungsverfahren für den menschlichen oder tierischen
Körper,
genauso wie die Verwendung einer solchen immunogenen Verbindung
für die
Herstellung eines heilenden oder vorbeugenden Arzneimittels, bestimmt
für die
Behandlung oder die Vorbeugung schädigender Effekte des obigen
Regulationsproteins Tat. In der Tat haben die erfindungsgemäßen Verbindungen
ihre toxischen Eigenschaften verloren und können daher dem Menschen verabreicht
werden, wie nachfolgend im experimentellen Teil gezeigt.
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Die
Verabreichung der erfindungsgemäßen immunogenen
Verbindungen entspricht einer aktiven Immuntherapie. Es kann ebenfalls
von Interesse sein, eine passive Immuntherapie vorzunehmen, d. h.,
einem Patienten direkt die Antikörper
zu geben, die er benötigt,
um die schädigenden
Effekte des Regulationsproteins Tat der 1-HIV-, 2-HIV-Viren zu neutralisieren.
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Diese
Anti-Regulationsprotein-Antikörper
können
auf klassische Weise erhalten werden und beispielsweise nach Immunisierung
eines Säugers,
Mensch oder Tier mit einer immunogenen Verbindung, wie sie oben definiert
ist, durch Klonierung von Human-B-Lymphozyten, transformiert durch den
Epstein-Barr-Virus, dann Wiedergewinnung der Antikörper, die
erwartungsgemäß von den
transformierten B-Lymphozyten sekretiert werden und schließlich genetische
Rekombination, ausgehend von einer Phagen-Bibliothek.
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Daher
beschreibt das vorliegende Schutzrecht auch Verfahren zur Herstellung
von Anti-Regulationsprotein-Antikörpern eines
1-HIV-, 2-HIV-Virus und insbesondere von Anti-Tat-Toxoidantikörpern, nämlich ein Herstellungsverfahren
für obigen
Antikörper,
dadurch gekennzeichnet, dass man einen Säuger mit einer oben definierten
immunogenen Verbindung immunisiert.
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Das
vorliegende Schutzrecht beschreibt auch einen Anti-Regulationsprotein-Antikörper eines
1-HIV-, 2-HIV-Virus und insbesondere polyklonale oder monoklonale
Antikörper,
erhalten ausgehend von immunisierten Menschen oder Säugern, indem
man die oben beschriebenen Verfahren durchführt, mit Ausnahme eines Anti-Tat-Antikörpers.
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Diese
spezifischen Antikörper
können
herrühren
von:
- 1. entweder dem Subjekt selbst, induziert
durch eine aktive Immunisierung (Impfung) mit einem biologisch inaktivierten
aber immunogenen Regulationsprotein, insbesondere Tat. Eine solche
immunogene Verbindung, beispielsweise im Falle von Tat, wird aufgrund
der Analogie zu bakteriellen Toxoiden als Tat-Toxoid bezeichnet,
- 2. oder von einem fremden allo- oder xenogenen Organismus, einem
Subjekt durch passive Immunisierung (Serotherapie) verabreicht.
Die allogenen Antikörper
(beim Menschen) können
bei den freiwillig nicht infizierten Subjekten nach der aktiven
Immunisierung (Impfung) mit einem immunogenen Protein oder seinen erfindungsgemäßen Derivaten,
insbesondere dem Tat (erfindungsgemäßes Tat-Toxoid oder erfindungsgemäße Peptidfragmente
von Tat), hervorgerufen werden. Diese passiv verabreichten Antikörper, seien
sie allogen (menschlich) oder xenogen (tierisch), können komplette
monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Fragmente F(ab')2 oder
F(ab) des Antikörpers
sein.
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Unter ”Anti-Regulations-Antikörper” versteht
man monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Fragmente F(ab')2 oder
F(ab) dieser Antikörper
oder auch Anti-Regulationsprotein-Antikörper, erhalten
durch Gentechnik, ausgehend von einer Phagen-Bibliothek.
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Die
allogenen Antikörper
menschlichen Ursprungs sind:
- – entweder
polyklonal – diese
können
bei freiwillig mit einer erfindungsgemäßen immunogenen Verbindung immunisierten
seronegativen Subjekten erhalten werden, insbesondere dem Tat-Toxoid
oder Peptidfragmente von Tat;
- – oder
monoklonal, ausgehend von spezifischen Klonen der durch den EBV-Virus
dieser immunisierten Individuen transformierten B-Zellen (spezifische
B EBV-Linien).
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Die
xenogenen Antikörper
stammen von mit einer erfindungsgemäßen immunogenen Verbindung,
Tat oder seine Derivate (Tat-Toxoid, erfindungsgemäß detoxifizierte
Peptidfragmente von Tat), hyperimmunisierten Tieren und sind
- – entweder
polyklonal, herrührend
von hyperimmunisierten Tieren,
- – oder
monoklonal, erhalten nach Hybridisierung gemäß der Technik von Kohler und
Milstein von Milzzellen oder Adenozyten mit einer myelomatösen Linie,
Typ x63, insbesondere x63AG3. In diesem Fall bevorzugt man Pferde-
oder Kaninchen-Antikörper.
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Das
vorliegende Schutzrecht beschreibt auch ein Verfahren zur Herstellung
von Anti-Regulationsprotein-Antikörpern eines
1-HIV-, 2-HIV-Virus, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Säuger, Mensch
oder Tier, mit einer oben definierten immunogenen Verbindung immunisiert.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung
monoklonaler Anti-Regulationsprotein-Antikörper eines 1-HIV-, 2-HIV-Virus,
dadurch gekennzeichnet, dass man B-Zellen einsetzt, herrührend von
einem mit einer erfindungsgemäßen immunogenen
Verbindung immunisierten Individuum, wobei die B-Zellen durch den
EBV-Virus transformiert
wurden, und Erzeugen der spezifischen Anti-Regulationsprotein-Antikörper eines
1-HIV-, 2-HIV-Virus.
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Die
obigen EBV+-Zellen können
derart kultiviert werden, dass sie die erwarteten Antikörper erzeugen. Diese
Zellen stammen, wie man sehen wird, insbesondere von durch ein natives
Regulationsprotein oder eine erfindungsgemäße immunogene Verbindung immunisierten
Erkrankten.
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Das
vorliegende Schutzrecht beschreibt auch ein Verfahren zur Herstellung
von monoklonalen erfindungsgemäßen Antikörpern, die
gegen ein inaktiviertes oder aktiviertes Regulationsprotein eines
1-HIV-, 2-HIV-Virus gerichtet sind, dadurch gekennzeichnet, dass
man das Säugerhybridom,
insbesondere von Mäusen,
herstellt, ausgehend von Splenozyten oder Adenozyten, insbesondere
mit durch ein natives Regulationsprotein oder eine erfindungsgemäße immunogene
Verbindung immunisierten Mäusen
und Myelomzellen, bevorzugt der x63-Linie, nach den im Stand der
Technik gut bekannten Verfahren (Kohler und Milstein).
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Das
vorliegende Schutzrecht beschreibt ebenfalls ein Verfahren zum Erhalt
von Anti-Regulationsprotein-Antikörpern eines
1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus durch gentechnische Rekombination,
dadurch gekennzeichnet, dass man als Immunogen eine oben definierte
immunogene Verbindung einsetzt.
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Das
vorliegende Schutzrecht beschreibt auch die Fragmente F(ab')2 oder
F(ab) dieser Antikörper.
Diese können
beispielsweise durch enzymatische Verdauung erhalten werden.
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Das
vorliegende Erfindung beschreibt gleichermaßen ein Verfahren zur passiven
Immunisierung von mit dem HIV-Virus kontaminierten Subjekten unter
Verwendung der spezifischen Anti-Regulationsprotein-Antikörper für die Vermehrung
des HIV-Virus und insbesondere Anti-Tat, das die schädigenden
Effekte dieses Proteins in seiner extrazellulären Konfiguration neutralisiert
oder blockiert und wie angegeben hergestellt wird, oder die Fragmente
F(ab')2 oder
F(ab) dieser Antikörper.
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Das
vorliegende Schutzrecht beschreibt ebenfalls ein aktives Anti-HIV-
oder Aids-Immunisierungsverfahren
unter Verwendung einer oben beschriebenen immunogenen Verbindung,
assoziiert an ein konstitutives Protein (oder Struktur-Protein)
eines HIV-Virus, insbesondere das Umhüllungsglykoprotein gp120 oder
gp160, oder ein modifiziertes oder nicht modifiziertes Peptidfragment
von diesen oder einen inaktivierten HIV-Virus oder einen von seiner
genomischen RNA, z. B. durch alkalische Hydrolyse, depletierten
HIV-Virus.
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Das
vorliegende Schutzrecht beschreibt auch ein aktives Anti-HIV oder
Aids-Immunisierungsverfahren
unter Verwendung einer oben beschriebenen immunogenen Verbindung,
assoziiert an ein oder mehrere Immungene auf Basis von inaktivierten
Cytokinen und speziell α-Interferon, β-TGF oder
TNF. In der Tat, wie man im nachfolgenden experimentellen Teil sieht,
stellt eine Kombination der Effekte der erfindungsgemäßen Antikörper gegenüber den
Regulationsproteinen und den Anti-α-Interferon-Antikörpern im
Speziellen vollständig
die durch HIV induzierte Immunsuppression wieder her.
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Daher
bezieht sich das vorliegende Schutzrecht ebenfalls auf eine Zusammensetzung,
umfassend zwei immunogene Verbindungen, nämlich eine oben beschriebene
immunogene Verbindung und eine immunogene Verbindung, die in der
Lage ist, gegen ein Cytokin, wie α-Interferon
oder α-TNF,
Antikörper
zu induzieren, wie beispielsweise in der
WO-A-91 18 454 beschrieben,
und ebenfalls auf eine Zusammensetzung, umfassend einen gegen ein
Cytokin gerichteten Antikörper,
insbesondere α-Interferon,
und einen der obigen, gegen ein Regulationsprotein gerichteten Antikörper.
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Das
vorliegende Schutzrecht beschreibt auch ein aktives Immunisierungsverfahren,
dadurch gekennzeichnet, dass man als Immunogen eine oben definierte
immunogene Verbindung einsetzt, assoziiert an ein mineralisches, ölhaltiges
oder synthetisches Immunitätsadjuvans,
oder auch eine immunogene Verbindung, wie sie oben definiert ist,
gekoppelt oder assoziiert an ein Protein, das die Immunogenität erhöht.
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Diese
Immunisierungen können
genauso heilend wie vorbeugend verwirklicht werden.
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Als
Immunogen für
sämtliche
obigen und nachfolgenden Verfahren setzt man bevorzugt ein Derivat des
Tat-Proteins ein.
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Die
vorliegende Schutzrecht beschreibt auch ein Verfahren zur Hyperimmunisierung
von Subjekten, die 1-HIV-, 2-HIV-seronegativ oder -seropositiv sind,
dadurch gekennzeichnet, dass man ein wie oben definiertes Immunogen
für die
Herstellung von hyperimmunen Humanseren, die insbesondere für die passive
Serotherapie bestimmt sind, durch Verabreichung von gereinigten
spezifischen Antikörpern
oder ihren Fragmenten F(ab')2 oder F(ab) einsetzt.
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Die
Erfindung beschreibt zudem eine pharmazeutische Zusammensetzung,
umfassend als aktiven heilenden oder vorbeugenden Bestandteil mindestens
einen Anti-Regulationsprotein-Antikörper eines
oben definierten Virus oder erhalten nach den obigen Verfahren.
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Die
Erfindung bezieht sich schließlich
auf die Verwendung einer obigen immunogenen Verbindung für die Herstellung
eines Arzneimittels, bestimmt zur Behandlung schädigender Effekte eines Regulationsproteins eines
1-HIV-, 2-HIV-Virus.
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Insgesamt
beschreibt das vorliegende Schutzrecht insbesondere die vorbeugende
oder heilende Verwendung bei seropositiven oder mit ARC/Aids durch
spezifische Antikörper
befallenen Subjekten, um die schädliche
Wirkung des Regulationsproteins Tat eines 1-HIV-, 2-HIV-Virus zu
blockieren. Diese spezifischen Antikörper können stammen von: 1. dem Subjekt
selbst, induziert durch eine aktive Immunisierung (Impfung) mit
dem biologisch inaktivierten aber immunogenen Tat, bezeichnet als
Tat-Toxoid, aufgrund der Analogie mit bakteriellen Toxoiden oder
2. einem fremden, allo- oder xenogen Organismus, dem Subjekt durch
passive Immunisierung (Serotherapie) verabreicht. Die allogenen
Antikörper
(beim Menschen) können
von freiwillig nicht-infizierten Subjekten nach der aktiven Immunisierung
(Impfung) mit einem Regulationsprotein, wie Tat oder seinen Derivaten
(erfindungsgemäßen Tat-Toxoid
oder erfindungsgemäße Tat-Peptidfragmente),
stammen. Diese passiv verabreichten Antikörper, die allogen (menschlich)
oder xenogen (tierisch) sind, können komplette
monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Fragmente F(ab')2 oder
F(ab) des Antikörpers
sein.
-
Unter
Tat-Toxoid, wie oben angegeben, versteht man ein Tat-Peptid oder
-Protein, behandelt mit einem chemischen Agens. Die Behandlung führt zum
Verlust der biologisch toxischen Eigenschaften im Molekül des Zirkulations-Tat
(Immunsuppression der T-Zellen, Induktion der α-Interferon-Produktion durch
Interferon-Produktionszellen, Neoangiogenese der Endothelialzellen,
Blockierung des antiviralen Effekts von Interferon auf die Makrophagen),
aber die Eigenschaften, die für
die Induzierung der Bildung von Antikörpern verantwortlich sind,
bleiben erhalten, wenn sie in geeigneter Art und Weise geliefert
und hergestellt, an einen ”Träger” gekoppelt
oder nicht, aggregiert oder nicht, in Gegenwart eines Adjuvans oder
nicht vorliegen.
-
Man
hat den Begriff des Tat-Toxoids auf die immunogenen Peptidfragmente
des Tat ausgedehnt, d. h. eine Peptid-Sequenz des Tat, die für die Induktion
der Bildung von Anti-Tat-Antikörpern geeignet
ist, wenn sie auf geeignete Art und Weise geliefert, an einen Träger gekoppelt
oder nicht und in Gegenwart eines Adjuvans oder nicht vorliegen.
-
Die
Erfindung bezieht sich auch auf die pharmazeutischen Zusammensetzungen.
- a) Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend
als heilendes oder vorbeugendes Mittel ein virales Toxoid oder ein
Fragment oder ein Analogon des Regulationsproteins Tat gemäß der Erfindung.
- b) Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als heilendes
oder vorbeugendes Mittel Anti-Tat-Antikörper, hergestellt ausgehend
von gegen das erfindungsgemäße Protein
oder seine Fragmente F(ab')2 oder F(ab) immunisierte Organismen.
-
Zudem
beschreibt das Schutzrecht auch einen Kit, umfassend eine pharmazeutische
Vaccinzusammensetzung, die außer
dem aktiven Bestandteil (Tat-Toxoid oder seine Derivate oder Anti-Tat-Antikörper) ein Adjuvans
und/oder ein anderes Immunogen mit antiretroviralen Eigenschaften
umfassen kann.
-
Schließlich beschreibt
das Schutzrecht eine pharmazeutische Zusammensetzung in herkömmlicher galenischer
Form. Insbesondere ist der erfindungsgemäße aktive Bestandteil in ausreichenden
Mengen vorhanden, um im Hinblick auf die Therapie mit einem Verdünnungsmittel
oder einem verträglichen
Träger
vom pharmazeutischen Gesichtspunkt aus wirksam zu sein.
-
EXPERIMENT 1: Pathogene Effekte des Tat-Zirkulationsproteins:
-
Immunsuppression der T-Zellen in Gegenwart
von Tat:
-
Die
Wirkung von Tat auf aktivierte T-Lymphozyten des peripheren Bluts
wurden untersucht. Mononukleierte Zellen (PMBC) und T-Lymphozyten
(HLA 35 DR-), durch Immunmagnetismus isoliert, wurden durch Anti-CD3-Antikörper
in Gegenwart oder bei Fehlen des Tat-Moleküls aktiviert. Nach 5 Tagen
in Kultur wurde die zelluläre
Proliferation durch Zugabe von H3-Thymidin
gemessen. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass das Tat die Proliferation
der T-Zellen HLA DR- inhibierte (85% Inhibition bei der Konzentration
von 1,5 μg
pro ml). Diese Inhibierung verschwand in Gegenwart des spezifischen
Anti-Tat-Antikörpers (Intracel,
U. K.).
-
EXPERIMENT 2: Pathogene Effekte des Tat-Zirkulationsproteins:
-
Inhibierungseffekt von Interferon auf
die Makrophagen in Gegenwart von Tat:
-
Der
Effekt von Tat auf die antivirale Wirkung des α-Interferons wurde durch einen
herkömmlichen
biologischen Test unter Verwendung des Grads der cytopathogenen
Wirkung des VSV-Virus auf die MDBK-Zellen gemessen.
-
Effekt des Tat auf exogenes
Interferon
-
Man
ließ zunehmende
Dosierungen von Tat schon bei schwachen Konzentrationen einer Dosiswirkungskurve
folgend für
Konzentrationen des Tat von 1 bis 20 μg/ml die antivirale Wirkung
des exogenen Interferons inhibieren. In einem repräsentativen
Beispiel wurde der Protektoreffekt des α-Interferons, der bis zu einer
Verdünnung
von 1/4800 (entsprechend 150 U. I.) auftrat, auf eine Verdünnung 1/300
bei Konzentrationen des Tat von 10 μg/ml reduziert. So ging bei
einer Konzentration von 10 μg/ml
Tat bei einer Verdünnung
des exogenen Interferons von 4800 der Titer des VSV-Virus von 103,8 (Interferonproben ohne Tat) auf 105,5 (Interferonproben in Gegenwart von Tat) über. In
diesen Beispielen wurde der Inhibitoreffekt des antiviralen α-Interferons
durch das Tat-Molekül
in Gegenwart spezifischer Anti-Tat-Antikörper (Intracel, U. K.) genauso
wie durch die Pferde-Antikörper,
die wir hergestellt haben (siehe nachfolgende Beispiele), unterdrückt.
-
EXPERIMENT 3: Beleg für die durch den 1-HIV des Tat-Proteins
in seiner extrazellulären
Konfiguration infizierte Subjekte
-
Gegenwart von Anti-Tat-Antikörpern im
Serum von seropositiven Patienten:
-
- a) Es wurde bei 50 seropositiven und 15 seronegativen
Patienten eine Elisa-Studie der Anti-Tat-Antikörper im Serum unter Verwendung
des nativen Tat-Moleküls
als Antigen durchgeführt.
Sämtliche
Seren der seronegativen Patienten und 20 Seren der seropositiven
zeigten mit einer optischen Dichte unterhalb des Schwellenwerts
(cut off) (O. D. = 0,250) keine Gegenwart von Anti-Tat-Antikörpern. Von
den mit HIV infizierten 30 Patientenseren, die den Schwellenwert überschritten,
hatten 6 eine O. D. oberhalb von 0,500. Es konnte keine offensichtliche
Korrelation zwischen der Gegenwart von Anti-Tat-Antikörpern einerseits und
dem klinischen Zustand und der Zahl der CD4-Zellen pro mm3 Blut andererseits hergestellt werden.
- b) Es wurde bei seropositiven Patienten in verschiedenen Entwicklungsstadien
ihrer HIV-Infektion – asymptomatischen
Patienten, Patienten, die klinische Erscheinungsbilder von Aids-Vorstadien
(ARC) zeigten, und Patienten, bei denen Aids ausgebrochen war, eine
Elisa-Studie von Anti-Tat-Antikörpern
im Serum unter Verwendung verschiedener Tat-Peptide als Antigene
durchgeführt.
Die Resultate dieser Studien sind die folgenden:
- 1) Die Tat-Peptidsequenzen
MEPVDPRLEPWKHPG (Reste 1 bis
15 am N-Terminus)
HQVSLSKQPTSQPRGD (Reste 65 bis 80 am C-Terminus)
wurden
durch die große
Mehrheit der seropositiven Seren und keines der seronegativen Seren
(Kontrollen) erkannt. Die Reaktionen waren stark positiv, aber es
konnte in Bezug auf die Entwicklung der HIV-Infektion und die Zahl
der CD4 der Patienten keine Korrelation aufgezeigt werden.
- 2) Die anderen untersuchten Sequenzen wurden nicht merklich
durch die Seren erkannt, die von seropositiven oder Kontrollindividuen
(siehe Tabelle 1) stammten. Einzig einige wenige Seren zeigten für jede Sequenz
eine optische Dichte oberhalb des Schwellenwerts (der 2-fache Durchschnitt
der Kontrollseren).
-
TABELLE
| Infizierte
Patienten* (72 Seren) | Kontrollpatienten
(10 Seren) |
Peptidreste
des Tat Mittelwert Mittelwert | Positive
Seren** | O.
D. | Positive
Seren** | O.
D. |
1–15 | 67 | 0,43 | 0 | 0,08 |
9–20 | 0 | 0,26 | 0 | |
22–37 | 7 | 0,78 | 0 | 0,41 |
36–50 | 5 | 0,86 | 0 | 0,65 |
46–60 | 6 | 0,53 | 0 | 0,40 |
52–60 | 2 | 0,32 | 0 | 0,38 |
56–70 | 0 | 0,19 | 0 | 0,20 |
65–80 | 70 | 1,01 | 0 | 0,08 |
- * Mit HIV infizierte Patienten
befanden sich in unterschiedlichen Stadien, asymptomatische Patienten
und von ACR befallene Patienten, von Aids befallene Patienten.
- ** Die Reaktion wurde als positiv angesehen (Schwellenwert),
wenn die optische Dichte zweimal so hoch wie der Durchschnitt der
seronegativen war.
- 3) Es ist interessant
festzustellen, dass die reaktivste Sequenz (AA 65–80) diejenige
ist, die die durch die Integrine erkannten RGD-Reste enthält.
-
BEISPIEL 1: Herstellung von immunogenem
Tat-Protein (Tat-Toxoid)
-
Inaktivierung des Tat-Proteins in Gegenwart
von Formaldehyd
-
Zu
einer Tat-Lösung
(1 mg/ml) in Dinatriumphosphat, 70 mM, pH 8,0, wird Formaldehyd
bis zu einer Endkonzentration von 33 mM zugegeben.
-
Die
Mischung wird bei 37°C
während
1, 3, 5, 7 und 9 Tagen inkubiert. Am Ende jeder Inkubationsperiode
wird eine Probe genommen, und die Reaktion mit dem Formaldehyd durch
Zugabe von Glycin bis zu einer Endkonzentration von 100 mM abgebrochen.
-
Jede
Entnahme wird für
1 Nacht bei 4°C
gegen das 100-fache Volumen PBS (Phosphatsalzpuffer) dialysiert.
-
BEISPIEL 2: Herstellung von immunogenem
Tat-Protein (Tat-Toxoid)
-
Inaktivierung des Tat-Proteins
in Gegenwart von Glutaraldehyd
-
Zu
einer Tat-Lösung
(1 mg/ml) in Dinatriumphosphat, 70 mM, pH 8,2, gibt man Glutaraldehyd
bis zu einer Endkonzentration entweder von 0,026 M oder 0,0026 M.
Man läßt die Reaktion
mit Glutaraldehyd während
verschiedenen Zeitspannen, variierend von 1 Minute bis 3 Stunden,
ablaufen. Nach Verstreichen der ausgewählten Reaktionszeit bei Laboratoriumstemperatur
wird die Reaktion durch Zugabe von Glycin bis zu einer Endkonzentration
von 100 mM abgebrochen. Die verschiedenen Entnahmen werden 16 Stunden
bei 4°C
gegen das 100-fache Volumen PBS dialysiert.
-
BEISPIEL 3: Herstellung von immunogenem
Tat-Protein (Tat-Toxoid)
-
Inaktivierung und simultane Kopplung des
Tat an Tetanus-Toxin
-
Zu
einer Mischung von Tetanus-Toxin und Tat in einem molaren Verhältnis von
1 bis 15 in einem Phosphatpuffer mit 70 mM bis 100 mM (der pH-Wert
variiert von 6,8 bis 8,2) gibt man Glutaraldehyd bis zu einer Endkonzentration
zu (variierend von 0,0026 M bis 0,026 M) und läßt die Inaktivierung und Kopplungsreaktion für variable
Zeitspannen (3 bis 15 Minuten) bei Laboratoriumstemperatur ablaufen.
Die Reaktion wird durch Zugabe von Glycin bis zu einer Endkonzentration
von 100 mM abgebrochen, und die verschiedenen Entnahmen werden 16
Stunden bei 4°C
gegen das 100-fache Volumen PBS dialysiert.
-
BEISPIEL 4: Antigene und immunogene Wirkung
von Tat-Toxoiden
-
Immunogenes Tat-Toxoid bei der Maus: Antikörper nach
Elisa
-
Die
immunogene Wirkung verschiedener Zubereitungen von inaktiviertem
Tat, entweder durch Formaldehyd (Tat-Toxoid) oder durch Glutaraldehyd
(Tat-Polan) oder durch Kopplung an Tetanus-Toxin (konjugiertes Tat-Tetanus-Toxin),
d. h. die immunogenen Verbindungen der Beispiele 1 bis 3, wurden
bei der Maus bestimmt.
-
Swiss-Mäuse von
18 bis 20 g wurden mit 2 subkutanen Injektionen des Immunogens der
Beispiele 1, 2 und 3 in Gegenwart von komplettem Adjuvans von Freund
immunisiert, wobei die zweite 3 Wochen nach der ersten mit 20 μg-Zubereitung
in Emulsion und in Gegenwart des inkompletten Adjuvans von Freund
durchgeführt
wurde.
-
15
Tage nach der wiederholten Impfung wurden die Blutentnahmen auf
intrakardialem Weg durchgeführt.
Die Anti-Tat-Antikörper
wurden in den Seren mit Elisa bestimmt. Die optische Dichte wurde
bei 490 nm gemessen.
-
Die
erhaltenen Ergebnisse, in Tabelle 2 zusammengefaßt, zeigen, dass sämtliche
Tat-Zubereitungen in
verschiedenem Grad immunogen sind, außer dem Tat-TT-Konjugat, das
für eine
kurze Zeitspanne (3 Minuten) mit Glutaraldehyd behandelt wurde,
sich als toxisch erwies und die Mäuse in 24 Stunden tötete (TT
zu schwach inaktiviert). Es hat sich gezeigt, dass die Seren der
nicht-immunisierten Mäuse
unterhalb von 0,200 (O. D.) auf natives Tat als Tat-Toxoid reagierten.
Zudem zeigen diese Ergebnisse, dass natives Tat durch die Antikörper in
gleicher Art und Weise wie das Toxoid erkannt werden, was ihr antigenes Äquivalent
bestätigt und
auch die Verwendung von Tat-Toxoid zur Immunisierung rechtfertigt. TABELLE 2
Zubereitungen | Nativer
Anti-Tat-Antikörpergehalt optische
Dichte (O. D.) | Anti-Tat-Toxoid-Antikörpergehalt (3
Tage) optische Dichte (O. D.) |
Tat-Toxoid
(1 Tag) | 0,320 | 0,331 |
Tat-Toxoid
(3 Tage) | 0,465 | 0,494 |
Tat-Toxoid
(5 Tage) | 0,998 | 0,901 |
Tat-Toxoid
(9 Tage) | 0,807 | 0,780 |
Tat-Polan
(1 min, 0,026 M) | 0,718 | 0,706 |
Tat-Polan
(15 min, 0,026 M) | 1,564 | 1,452 |
Tat-Polan
(60 min, 0,0026 M) | 1,065 | 1,113 |
Tat-Polan
(3 h, 0,0026 M) | 0,194 | 0,210 |
Tat-TT-Konjugat
(3 min, 0,0026 M) | toxisch | toxisch |
Tat-TT-Konjugat
(15 min, 0,0026 M) | 1,987 | 1,897 |
Tat-TT-Konjugat
(6 min, 0,026 M) | 0,824 | 0,795 |
Tat-TT-Konjugat
(15 min, 0,026 M) | 1,642 | 1,556 |
-
BEISPIEL 5: Starke Toxizität
-
Die
Toxizität
der Tat-Toxoid- und Tat-Polan-Zubereitungen wurde durch subkutane
Injektion bei Swiss-Mäusen
von 18 bis 20 g bestimmt. Die Tat-Toxoid(7 Tage)- und Tat-Polan(15 min, 0,026
M)-Zubereitungen wurden als Dosierungen mit 100 μg pro Maus verabreicht. Die
Tiere wurden über
7 Tage beobachtet.
-
Kein
sichtbares Zeichen von Toxizität
wurde beobachtet. Das Gewicht der Tiere nahm weiter zu. Eine makroskopische
Untersuchung der Organe bei der Autopsie zeigte keinerlei Anomalien.
-
BEISPIEL 6: Anti-Tat-Antikörper
-
Anti-Tat-Antikörper wurden
wie folgt hergestellt: man isolierte die IgG-Fraktion auf einer
G-Proteinsäule,
ausgehend von mit Tat-Polan immunisierten Mäuseseren. Die Fragmente F(ab')2 wurden
ebenfalls ausgehend von der isolierten IgG-Fraktion durch Pepsin-Verdauung hergestellt.
Die immunologische Reaktivität
dieser Fraktionen wurde mit Elisa verifiziert.
-
BEISPIEL 7: Biologische Inaktivierung
von Tat-Toxoid
-
Die
1, 3, 5 und 9 Tage inaktivierten verschiedenen Tat-Toxoide von Beispiel
1 wurden in einem Aktivierungstest für die Expression des Reportergens,
Chloramphenicol-Acetyl-Transferase
(CAT), abhängig
vom ”Long
Terminal Repeat” (LTR)
des 1-HIV getestet.
-
Das
Prinzip dieses Versuchs ist das folgende: die Zellen der Hela-Linie,
enthaltend das CAT-Gen unter Kontrolle des LTR von HIV, wurden mit
den nativem Tat oder den Toxoiden für 6 Stunden in Kontakt gebracht. Nach
24 Stunden in Kultur wurden die Zellen lysiert, und die Menge des
hergestellten CAT durch einen Aktivitätstest auf CAT gemessen, der
den Prozentsatz von an Chloramphenicol angelagertem Acetyl-CoA misst. Wenn
das Tat-Molekül
aktiv ist, gibt es einen großen
Prozentsatz von acetyliertem Chloramphenicol, ansonsten ist der
Prozentsatz gering. Die Kultur dieser adherierten Zellen ergibt
sich im Standardmilieu RPMI, 10% FCS. Die zugegebene Tat-Konzentration
für eine
Dosis-Wirkung liegt
bei 1 μg
bis 10 μg
pro ml Überstand.
-
Die
hier dargestellten Ergebnisse zeigen, dass das Tat-Toxoid nach 3
Tagen absolut inaktiviert ist, mit einer schwachen Restaktivität am ersten
Tag.
Zubereitungen | Acetylierung
von Chloramphenicol (%) |
Natives
Tat | 100 |
Tat-Toxoid
(1 Tag) | 18 |
Tat-Toxoid
(3 Tage) | 3 |
Tat-Toxoid
(5 Tage) | 2 |
Tat-Toxoid
(9 Tage) | 3 |
-
BEISPIEL 8: Das Fehlen pathogener Effekte
des Tat-Toxoids
-
a) Das Fehlen der Immunsuppression von
T-Zellen in Gegenwart von Tat-Toxoid (im Gegensatz zu den Experimenten
1 und 2)
-
Der
Effekt des Tat-Toxoids (5 Tage) auf aktivierte T-Lymphozyten des
peripheren Bluts wurde untersucht. Die mononukleierten Zellen (PMBC)
und die T-Lymphozyten
(HLA 35 DR-), isoliert durch Immunmagnetismus, wurden durch die
Anti-CD3-Antikörper in Gegenwart oder bei
Fehlen der immunogenen Verbindungen von Beispiel 1 aktiviert. Nach
5 Tagen in Kultur wurde die zelluläre Proliferation durch Zugabe
von H3-Thymidin gemessen. Die Ergebnisse
zeigten, dass im Gegensatz zu nativem Tat das Tat-Toxoid die Proliferation der
T-Zellen HLA DR- nicht inhibierte. So war bei einer Dosierung von
5 μg/ml
in der Kultur in Gegenwart von Tat-Toxoid die Proliferation der
Zellen identisch mit derjenigen der Kontrolle.
-
b) Fehlen der Inhibitorwirkung des α-Interferons
auf die Makrophagen in Gegenwart von Tat-Toxoid:
-
Der
Effekt von Tat-Toxoid auf die antivirale Wirkung von α-Interferon
wurde durch einen herkömmlichen
biologischen Test gemessen, unter Verwendung des Grads der cytopathogenen
Wirkung des VSV-Virus auf die MDBK-Zellen.
-
Effekt des Tat-Toxoids auf
exogenes Interferon
-
Im
Gegensatz zu nativem Tat ermöglichen äquivalente
Dosierungen des Tat-Toxoids von Beispiel 1 die Inhibierung der antiviralen
Wirkung von exogenem Interferon nicht. In einem repräsentativen
Experiment wurde der Protektoreffekt des α-Interferons, der bis zu einer
Verdünnung
von 1/4800 (entsprechend 150 U. I.) auftrat in Gegenwart von 50 μg Tat-Toxoid beibehalten,
während
er mit nativem Tat bis auf 1/300 verringert wurde. Bei der Verdünnung 4800
von exogenem Interferon wird der Titer des VSV auf dem Niveau der
Kontrolle von 103,8 (Interferonproben mit
Tat-Toxoid) beibehalten, während
er im anderen Falle auf 105,5 (Interferonproben
in Gegenwart von Tat) übergeht.
-
BEISPIEL 9: Protektorrolle der Anti-Tat-Toxoid-Antikörper gegenüber den
Effekten des nativen Tat
-
Anti-Tat-Toxoid-Antikörper des
Experiments 1 (Behandlung mit Formaldehyd für 3 Tage) wurden bei hyperimmunisierten
Pferden hergestellt. Ausgehend von diesen Antikörpern wurden die Fragmente
F(ab')2 nach
dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren hergestellt.
-
Die
Antikörper,
wie die Fragmente F(ab')2, inhibieren die verschiedenen biologischen
Aktivitäten
des nativen Tat in den verschiedenen Tests: Transaktivierung des
LTR von HIV (CAT-Versuch) (siehe Beispiel 7), Immunsuppression (siehe
Experiment 1), Inhibitoreffekt des exogenen α-Interferons in Kultur (siehe
Experiment 2). Die Experimente 1, 2 und Beispiel 7 wurden mit nativem
Tat und mit oder ohne Vorinkubierung dieses nativen Tat für 1 Stunde
bei 37°C
mit den Antikörpern
oder Fragmenten F(ab')2 bei einer Dosierung von 40 μg Antikörper für 1 μg natives
Tat wiederholt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Antikörper die
Wirkung des nativen Tat inhibieren.
-
BEISPIEL 10: Systematische Verbesserung
der zellulären
Proliferation dank der Kombination Anti-Tat-Antikörper und
Anti-α-Interferon-Antikörper: Zusammenwirken
der Anti-Tat-Antikörper
und des Anti-α-Interferons
-
Man
hat beobachtet, dass PBLs (mononukleierte Zellen des peripheren
Bluts) von Patienten ohne in vitro-Infizierung mit 1-HIV und 6 Tage-Kultivieren
eine immunexpressive Aktivität
auslösten.
-
Wenn
man solche 6 Tage-infizierte Zellen (oder nicht infizierte Zellen)
zufügt,
die im Verhältnis
1:5 mit durch das Staphylococcus Enterotoxin B-Protein (SEB) aktivierten,
autologen Zellen bestrahlt, beobachtet man in der Tat nach 4 Tagen,
dass die Proliferation der autologen Zellen im Vergleich zu den
Kontrollen (nicht infizierten Zellen) um 80% vermindert wird.
-
Wenn
man in diesem Modell zu der Kultur der in vitro infizierten Zellen α-Interferon-Antikörper zugibt, verlieren
diese Zellen demnach bei 50% der Patienten ihre Suppressorwirkung.
Bei 20% der Fälle
verlieren die suppressiven Zellen 60% ihrer Suppressorwirkung und
bei 30% wird dieser Suppressoreffekt signifikant aufrechterhalten.
-
Wenn
man zu den Anti-α-Interferon-Antikörpern Anti-Tat-Antikörper zugibt
(monoklonal, wie sie in Experiment 1 beschrieben sind, oder polyklonal
vom Pferd nach Beispiel 9), verlieren in 100% der Fälle die
in vitro-infizierten Zellen ihre Suppressorwirkung.
-
Diese
Experimente zeigen die zusammenhängende
toxische Rolle von Tat und α-Interferon
bei der Immunsuppression, hervorgerufen durch 1-HIV, und dass eine
Assoziation von Anti-Interferon- und Anti-Tat-Antikörper eine
normale Immunität
wiederherstellt.
-
Die
folgenden Beispiele sind nicht Teil der Erfindung.
-
BEISPIEL 12: Herstellung des immunogenen
Nef-Proteins (Nef-Toxoid)
-
Inaktivierung des Nef-Proteins in Gegenwart
von Formaldehyd
-
Zu
einer Lösung
von Nef-Protein (1 g/ml) in Dinatriumphosphat, 70 mM, pH 8,0, gibt
man Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 33 mM zu.
-
Die
Mischung wird bei 37°C
während
1, 3, 5, 7 und 9 Tagen inkubiert. Am Ende jeder Inkubationsperiode
wird eine Probe genommen, und die Reaktion mit Formaldehyd durch
die Zugabe von Glycin bis zu einer Endkonzentration von 100 mM abgebrochen.
-
Jede
Entnahme wird für
1 Nacht bei 4°C
gegen das 100-fache Volumen PBS (Phosphatsalzpuffer) dialysiert,
und das Nef-Toxoid isoliert.
-
BEISPIEL 13: Herstellung des immunogenen
Nef-Proteins (Nef-Polan)
-
Inaktivierung des Nef-Proteins in Gegenwart
von Glutaraldehyd
-
Zu
einer Nef-Lösung
(1 mg/ml) in Dinatriumphosphat, 70 mM, pH 8,2, gibt man Glutaraldehyd
bis zu einer Endkonzentration entweder von 0,026 M oder von 0,0026
M zu. Man läßt die Reaktion
mit Glutaraldehyd für
verschiedene Zeitspannen, variierend von 1 min bis 3 h, ablaufen.
Nach Verstreichen der ausgewählten Reaktionszeit
bei Laboratoriumstemperatur wird die Reaktion durch Zugabe von Glycin
bis zu einer Endkonzentration von 100 mM abgebrochen. Die verschiedenen
Entnahmen werden 16 Stunden bei 4°C
gegen das 100-fache Volumen von PBS dialysiert und das Nef-Polan
wird isoliert.
-
BEISPIEL 14: Immunogene und antigene Wirkungen
der Nef-Toxoide
-
Immunogenes Nef-Toxoid bei der Maus: Antikörper nach
Elisa
-
Die
immunogene Wirkung verschiedener Zubereitungen von entweder mit
Formaldehyd (Nef-Toxoid) oder mit Glutaraldehyd (Nef-Polan) inaktiviertem
Nef, d. h. die immunogenen Verbindungen der Beispiele 12 und 13,
wurden bei der Maus bestimmt.
-
Swiss-Mäuse von
18 bis 20 g wurden durch zwei subkutane Injektionen mit dem Immunogen
der Beispiele 12 und 13 in Gegenwart des Adjuvans von Freund immunisiert.
Die zweite wurde 3 Wochen nach der ersten mit 20 μm einer Zubereitung
in Emulsion in Gegenwart des inkompletten Adjuvans von Freund durchgeführt.
-
15
Tage nach der wiederholten Injektion wurden die Blutabnahmen auf
intrakardialem Weg durchgeführt.
Die Anti-Nef-Antikörper
wurden in den Seren mit Elisa bestimmt. Die optische Dichte wurde
bei 490 nm gemessen.
-
Der
erhaltenen Ergebnisse, in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst,
zeigen, dass sämtliche Nef-Zubereitungen
in verschiedenem Grad immunogen sind. Es ist darauf hinzuweisen,
dass die nicht-immunisierten Mausseren in diesen Elisa-Versuchen
ein Reaktionsniveau unterhalb von 0,2 (in O. D.) ergaben.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass das native Nef-Protein durch die Antikörper in
derselben Art und Weise wie das Toxoid erkannt wird, was ihre antigene Äquivalenz
bestätigt
und auch die Verwendung von Nef-Toxoid zur Immunisierung rechtfertigt.
Zubereitungen | nativer
Anti-Nef-Antikörpergehalt optische
Dichte (O. D.) | Anti-Nef-Toxoid-Antikörpergehalt (3
Tage) optische Dichte (O. D.) |
Nef-Toxoid
(1 Tag) | 0,56 | 0,5 |
Nef-Toxoid
(3 Tage) | 0,78 | 0,8 |
Nef-Toxoid
(5 Tage) | 0,99 | 1,01 |
Nef-Toxoid
(9 Tage) | 0,65 | 0,75 |
Nef-Polan
(1 min) 0,026 M | 1,12 | 0,98 |
Nef-Polan
(15 min) 0,026 M | 1,69 | 1,56 |
Nef-Polan
(60 min) 0,0026 M | 1,31 | 1,41 |
Nef-Polan
(3 h) 0,0026 M | 0,35 | 0,41 |
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