DE69633919T2

DE69633919T2 - Mehrzweckvakzine gegen umhüllte viren

Info

Publication number: DE69633919T2
Application number: DE69633919T
Authority: DE
Inventors: L. Donald MORTON
Original assignee: John Wayne Cancer Institute
Current assignee: John Wayne Cancer Institute
Priority date: 1995-04-24
Filing date: 1996-04-24
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2016-04-25
Also published as: US6168787B1; EP0830140B1; AU708327B2; CA2219339A1; DE69633919D1; EP0830140A1; WO1996033734A1; JPH11509521A; US20030185806A1; AU5573196A; ATE283065T1

Description

Das Gebiet der Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren für die Induktion von Immunreaktionen gegen umhüllte Viren in Säugetieren. In besonderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung Impfstoffe, die Haupt- und geringfügige Histokompatibilitätskomplex-Antigene umfassen, Blutgruppen-Antigene und andere Zelloberflächen-Antigene, die signifikante genetische Polymorphismen in Säugetierpopulationen aufweisen, und wobei die Antigene von umhüllten Viren aufgenommen werden können, wenn sie aus der Zellmembran absprossen und daher als Target für einen Immunangriff dienen können.
A. Umhüllte Viren
Eukaryotische Viren sind eine große und mannigfaltige Gruppe infektiöser Agenzien, die an erster Stelle für die Erkrankungen, die sie verursachen, bekannt sind. Diese Agenzien können durch eine Anzahl von Kriterien klassifiziert werden, inklusive der Genomstruktur, der Art der Replikation und der Wirtsspezifität. Eine andere Weise, eukaryotische Viren zu gruppieren, besteht in der Struktur des Viruspartikels. „Nicht-umhüllte" virale Partikel bestehen aus einem Proteincapsid, welches das virale Genom umgibt und schützt. Das Capsid besteht aus viralen strukturellen Produkten, die durch das Virusgenom kodiert und innerhalb der Wirtszelle synthetisiert werden. „Umhüllte" Viren besitzen ebenfalls eine Capsidstruktur, die das genetische Material des Virus umgibt, allerdings besitzen sie zusätzlich eine Lipid-Doppelschicht-„Hülle", die das Capsid umgibt. Die Hülle entsteht, sobald das Capsid durch eine der Zellmembranen des Wirts knospt, üblicherweise die Plasmamembran, aber manchmal durch die Kernmembran, den Golgi-Apparat oder das endoplasmatische Retikulum.
Umhüllte Virusfamilien sind z. B. Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Retroviridae, Herpesviridae, Poxviridae und Iridoviridae. Diese und andere Viren sind für Erkrankungen, wie Enzephalitis, Darminfektionen, immunsuppressive Erkrankungen, Erkrankungen des Atemtrakts, Hepatitis und Pockeninfektionen, verantwortlich.
Der Aufbau der Membran eines umhüllten Virus variiert in Abhängigkeit vom Ort in der Wirtszelle, von dem das Virus seine Hülle erhalten hat. Im Allgemeinen umfasst die Hülle eine Lipiddoppelschicht, die das Viruscapsid oder Nukleoprotein vollständig umgibt. Zusätzlich zu verschiedenen Lipiden, beinhaltet die Hülle integrale und Transmembranproteine. Viele Transmembranproteine besitzen an sie angebrachte Zuckerreste und werden als Glykoproteine bezeichnet. Viral kodierte Transmembranproteine spielen wichtige Rollen im Infektionsprozess, indem sie als Targetliganden, als Enzyme und als Membranfusionsaktivatoren agieren. Da Wirtszellen ebenfalls viele Membran-gebundene Proteine exprimieren, können umhüllte Viruspartikel sowohl Wirtszellproteine als auch Proteine, die viral kodiert sind, enthalten. In manchen Fällen kann das Virus Gene von normalen zellulären Komponenten der Wirtszelle aufnehmen, die für seine Vermehrung in anderen Wirten nützlich sind.
Es wurden beachtliche Anstrengungen unternommen, um geeignete Impfstoffe zu entwickeln, die vor Infektionen durch krankmachende umhüllte Viren schützen sollen. Obwohl einige Impfstoffe sich als erfolgreich herausgestellt haben, haben viele andere die in sie gesteckten Erwartungen nicht erfüllt. Das Versagen der Impfstoffe wird häufig einem oder mehreren der folgenden Gründe zugeschrieben:

1. Umhüllte Viren sind für ein Phänomen, das „antigenische Drift" genannt wird, bekannt. Wenn eine antigenische Drift auftritt, mutieren virale Antigene, und ihr antigenisches Profil wird verändert. Wenn die Drift stark genug ist, ist die gegen das ursprüngliche antigenische Profil generierte Immunantwort nicht länger in der Lage, die mutierten Formen zu erkennen, und diese können daher den schützenden Immunmechanismen innerhalb des immunisierten Wirts entkommen.
2. Eine andere Art des „Variations"-Problems betrifft Viren mit multiplen Stämmen, beispielsweise Rhinovirus, die mehr als 50 unterschiedliche antigenische Stämme besitzen können. Daher ist es nicht praktikabel, Impfstoffe gegen alle diese Virenstämme zu entwickeln. Noch ein weiteres Beispiel der antigenischen Variation zeigen Influenzaviren, die häufig saisonale Variationen in den vorherrschenden Stämmen aufweisen. Daher ist es nötig, besondere Influenza-Impfstoffe jährlich neu zu entwerfen, in Abhängigkeit vom vorherrschenden Influenzavirusstamm, der die Population in dem entsprechenden Jahr infiziert.
3. Leider kann die zellvermittelte Immunität oder humorale Antikörper, die gegen die virusabhängige Hülle oder gegen nukleäre Proteinantigene induziert werden, kurzlebig sein. Daher sind die meisten zur Zeit erhältlichen Impfstoffe nur eine kurze Zeit nach der Immunisierung in der Lage, Immunität zu induzieren. Daher ist es häufig vonnöten, mehrfach zu immunisieren, um einen fortdauernden Schutz zu erreichen, insbesondere wenn das Antigen das inaktivierte Virus oder ein Untereinheit-Impfstoff ist.
4. Ein Problem vieler viraler Impfstoffe besteht in der Kosten-Nutzen-Analyse hinsichtlich der Auswahl eines „Lebend"- oder eines „Tot"-Impfstoffs. Im Allgemeinen resultiert die Immunisierung mit lebenden, abgeschwächten Viren in einer viel stärkeren Immunantwort als mit abgetöteten Viren. In einigen Fällen, z. B. beim Schutz gegen Pocken, kann nach einer Immunisierung mit lebendem Kuhpockenvirus, das eine kreuzreaktive Immunität gegen Pocken induziert, ein lebenslanger Schutz bestehen. Während der diesem Phänomen zugrunde liegende Mechanismus noch nicht vollständig verstanden ist, erscheint es wahrscheinlich, dass die begrenzte Replikation abgeschwächter Viren eine potentere Sammlung von Antigenen bereitstellt, welche das Immunsystem stimuliert. Leider ist es schwierig, Virusstämme mit einer ausreichenden Abschwächung herzustellen. Ferner besteht immer das Risiko, dass das abgeschwächte Virus nach der Immunisierung zu einer pathogenen Form revertieren wird, wodurch es eine voll ausgewachsene Infektion und Erkrankung verursacht.

Wegen vieler oben dargestellter Probleme im Hinblick auf virale Impfstoffe, sind bislang wirkungsvolle Impfstoffe nur gegen eine kleine Minderheit vieler Viren entwickelt worden, die in der Lage sind, die menschliche Bevölkerung zu infizieren. Bemühungen wurden hauptsächlich auf Impfstoffe gegen Viren gerichtet, die potenziell tödliche Erkrankungen, z. B. Pocken, verursachen. Folglich gibt es nur eine kleine Anzahl wirkungsvoller Impfstoffe, die gegen die große Anzahl umhüllter Viren, die Erkrankungen in Menschen und anderen Säugern verursachen, entwickelt wurden. Obwohl es einige wenige Erfolge gab, z. B. Impfstoffe gegen Pocken, Masern, Mumps, das Katzenleukämievirus und das Hundestaupevirus, bleiben Menschen und andere Säugetierarten größtenteils ungeschützt gegen die große Mehrheit umhüllter Viren.
B. HIV- und MHC-Antigene
Auf Grund der vernichtenden Folgen einer Infektion und der schnell ansteigenden Anzahl infizierter Individuen, wurden große Anstrengungen auf die Herstellung eines Impfstoffs gegen die Infektion mit humanem Immundefizienzvirus (HIV) gerichtet. Wegen der Gefahr, die in der Verwendung lebender Retroviren liegt, verwenden diese Impfstoffe hauptsächlich virale Untereinheiten, beispielsweise das Oberflächenglykoprotein gp120/160, und entsprechende dagegen gerichtete Antikörper. In den meisten Fällen waren die Ergebnisse enttäuschend.
Bei der Arbeit mit HIV-Impfstoffen stellt sich eine große Anzahl einzigartiger Probleme dar. Beispielsweise ist die in HIV-Antigenen gesehene antigenische Drift in anderen Systemen unerreicht. Darüber hinaus stellte sich die angebliche Identifizierung des CD4-Moleküls als ein Rezeptor als eine problematische Komplikation heraus, während sie gleichzeitig einen großen Schritt für das Verständnis des viralen Lebenszyklus darstellte. Interaktionen zwischen Wirtsmolekülen und CD4, sowie zwischen Wirtsmolekülen und gp120/160, scheinen die Wirkung von anti-gp120/160-basierten Impfstoffen zu behindern.
Ein weiterer Nachteil bei der Verwendung spezifischer Immunisierung gegen HIV liegt darin, dass eine der wichtigsten Verfahren zum Nachweis der Infektion im Vorhandensein serologischer Reaktivität mit HIV in Serum der Individuen besteht, was anzeigt, dass eine Infektion mit HIV stattgefunden hat. Infolgedessen wird eine Immunisierung mit HIV oder seinen antigenischen Untereinheiten ähnliche Antikörper induzieren, was es schwierig macht, eine Infektion von dem Schutz zu unterscheiden.
Ein Forschungsgebiet, das als Antwort auf diese und andere Probleme entstanden ist, betrifft die Verwendung von Haupt-Histokompatibilitätsantigen (MHC). Das allgemeine Prinzip, das hinter dieser Arbeit steht, besteht darin, dass ein infizierendes HIV-Partikel, entweder als freies umhülltes Virus oder als Virus-infizierte Zellen mit MHC-Antigenen assoziiert sind, die sich möglicherweise von jenen des Empfängers unterscheiden. Die gesamte Literatur ist, gelinde gesagt, verwirrt hinsichtlich der Frage, wie solch eine Immunreaktion funktionieren könnte, wenn sie in der Tat überhaupt funktionieren würde.
WO-A-94 11016 offenbart einen bestrahlten Leukozyt mit verstärkter MHC-Expression. WO-A-93 14126 offenbart ein MHC Klasse-II-Antigen in einem Impfstoff.
Z. B. diskutieren Clerici et al., J. Immunol., 144(9): 3266–3271 (1990) die Verwendung einer alloantigenen Immunisierung, um in HIV-Patienten die markierenden T-Helfer-Funktionen zu unterstützen. Clerici beobachtete, wie auch andere, dass trotz der Unfähigkeit der T-Zellen von AIDS-Patienten, sich an Antigene zu „erinnern", diese Zellen gegenüber Alloantigenen reaktiv blieben. Clerici fand heraus, dass man, wenn die Alloantigen-Reaktion immer noch vorhanden war, T-Zellen von HIV⁺-Individuen „beibringen" konnte, sich an Influenza-Antigene zu erinnern, wenn sie mit einem Influenza-Antigen in Kombination mit einem Alloantigen geprimed und mit dem Influenza-Antigen alleine stimuliert wurden. Die Fähigkeit des Alloantigens alleine, die Erinnerung an das Influenza-Antigen durch T-Zellen in AIDS-Patienten zu stimulieren, war vernachlässigbar, was einen Beitrag des Influenza-Antigens in Form eines Stimulus als auch eines Targets nahe legt.
Eine andere Untersuchung, die ihr Augenmerk auf die Wirkungen zellulärer Antigene (Xenoantigene) auf Reaktionen auf Immundefizienzviren legte, wurde durch Stott (1991) vorgelegt. Stott und seine Kollegen beobachteten, dass mit nicht-infizierten humanen Zellen immunisierte Makaken gegenüber einer Infektion durch den Affen-Immundefizienzvirus (SIV), der sich in diesen Zellen vermehrte, resistent waren. Makaken waren nicht resistent gegenüber einer Infektion durch SIV, der in Affenzellen vermehrt wurde. Wenn das angreifende Virus HIV war, waren die immunisierten Makaken nicht-resistent, was eine Verbindung des Schutzes mit der Natur des viralen Antigens nahe legt. Stott fand auch heraus, dass die Anti-MHC-Reaktion gegen Klasse II-Determinanten in humanen Zellen gerichtet ist, aber es ist unklar, ob es sich bei diesen um Spezies-spezifische oder xenogenisch antigenische Determinanten der Klasse II handelt, die von den in humanen Zellen vermehrten Viren aufgenommen wurden, oder um wirkliche kreuzreaktive allotypische Antigene, die auch im Affen vorhanden sind.
Kion und Hoffmann (1991) zeigten ein ähnliches Phänomen in alloimmunisierten Mäusen. Wenn sie mit Zellen eines anderen Mausstamms immunisiert wurden, stellten die Mäuse Antikörper gegen gp120 und p24 von HIV her. Zusätzlich dazu stellte ein autoimmuner Mausstamm Antikörper gegen gp120 her. Sowohl in den alloimmunen als auch in den autoimmunen Mäusen wurden Antikörper gegen Anti-MHC-Antikörper (MHC-Bild) gefunden. Die Autoren schlossen daraus, dass die Anwesenheit beider Arten von Antikörpern die „Annahme einer Synergie zwischen Immunreaktion auf allogenische Zellen und HIV-antigenischen Stimuli stützt".
Langlois et al. (1992) waren in der Lage, in Makaken Reaktionen gegen humane zelluläre Determinanten auszulösen, indem sie in humanen Zellen vermehrtes SIV verwendeten. Cranage et al. (1992) berichteten ebenfalls, dass human-spezifische Reaktionen auftreten, wenn Makaken mit in humanen Zellen vermehrtem SIV immunisiert werden. Während zunächst berichtet wurde, dass die Hauptreaktion gegen Klasse I-Antigene auftrat, waren spätere Untersuchungen nicht in der Lage eine Korrelation zwischen Klasse I-Titern und Schutz zu finden. Cranage et al. (1993) berichteten, dass mit in humanen Zellen vermehrtem SIV geimpfte Makaken eine Klasse II-spezifische Reaktion ausbildeten, die in Kontrolltieren nicht gesehen wurde. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass infizierte Makaken Antikörper besaßen, die spezifisch für Rhesus-MHC sind, was die Möglichkeit aufwirft, dass SIV Rhesus-MHC imitiert oder die Erkennung der Selbst-MHC der Makaken verändert.
Kiprov et al. (1994) zogen einen Vorteil aus ihren früheren, nicht-verwandten Untersuchungen hinsichtlich der Alloimmunisierung, um einen Blick auf die anti-zelluläre/Anti-HIV-Reaktion zu werfen. Eine Gruppe von Frauen wurde vorher mit peripheren Blutlymphozyten ihrer Ehemänner immunisiert, um einen spontanen Abort zu verhindern. Zwölf von vierzehn immunisierten Frauen entwickelten Antilymphozyt-Antikörper (ALAs). Bei zwei von diesen wurde herausgefunden, dass sie HIV-1 in vitro in einer Komplement-abhängigen Art und Weise neutralisieren, und eine von diesen auf einem relativ hohen Titer. Da die Zugabe von Anti-HIV-Seren in einer additiven Neutralisierung resultierte, legte Kiprov nahe, dass die Testseren auf nicht-virale Target-Antigene gerichtet waren. Allerdings konnten die Autoren die Abwesenheit neutralisierender Aktivität in den anderen ALA+-Individuen nicht erklären, und der Mechanismus für die hohen Titer der neutralisierenden Antikörper in dieser einen Patientin bleibt unerklärt, da nachfolgend gezeigt worden ist, dass sie nicht mit MHC Klasse I- oder II-Antigenen verwandt sind.
Daher bleibt es unklar, ob MHC das Immunsystem in einer unspezifischen Art und Weise stimuliert oder Immunreaktionen gegen virale Targets spezifisch verstärkt. Es ist auch unklar, ob xeno- oder alloimmune Effekte auf SIV/HIV in irgendeiner Art und Weise dem MHC-ähnlichen Charakter von gp120 zugeschrieben werden können und daher auf das entsprechende virale Antigen beschränkt sind. Daher bleibt die Rolle, die von der Alloimmunität in der antiviralen Verteidigung gespielt wird, unklar trotz beträchtlicher Spekulationen und einiger interessanter Ergebnisse mit einem SIV-Modell.
Auf Grund all der vorhergehend genannten Gründe besteht ein großes Bedürfnis nach effizienteren viralen Impfstoffen gegen umhüllte Viren. Wenn man alle möglichen antigenischen Stämme und die Frequenz der antigenischen Drift verschiedener Viren, die verschiedene Säugetierarten befallen können, in Betracht zieht, ist es mit den gegenwärtigen Methoden unmöglich, sich einen universellen viralen Impfstoff vorzustellen, der als sein Target die viralen Antigene besitzt. Andererseits könnte ein Impfstoff, der als sein Target zelluläre Membranantigene besitzt, die durch Gene exprimiert werden, welche die genetische Diversität unter den Tierarten kontrollieren, pluripotent sein. Die umhüllten Viren müssen genetisch kontrollierte Antigene aus der Zellmembran aufnehmen, da sie aus der Wirtszelle abknospen, welche ein viel stabileres und praktischeres Ziel für die Einführung einer schützenden Immunität gegen Membranviren darstellt. Die Alloantigene, welche die umhüllten Viren aufnehmen, während sie aus der Wirtszellmembran abknospen, stellen ein mögliches Target in der Entwicklung eines pluripotenten viralen Impfstoffs dar, der gegen die Mehrzahl dieser Viren schützt.
Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die geeignet ist für die Verabreichung an einen Patienten und die eine schützende Immunität gegen die Infektion durch ein umhülltes Virus induziert.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die für die Verabreichung an einen Patienten geeignet ist und die eine schützende Immunität gegen eine Infektion durch das humane Immundefizienzvirus induziert.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Immunisierung eines Patienten mit einer Zusammensetzung bereitzustellen, die eine schützende Immunität gegenüber der Infektion durch ein umhülltes Virus, beispielsweise Rhinovirus oder Influenzavirus, zu induzieren.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Immunisierung eines Patienten mit einer Zusammensetzung bereitzustellen, die eine schützende Immunität gegenüber der Infektion durch das humane Immundefizienzvirus zu induzieren.
Um diese Aufgaben zu lösen, wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die intakte Zellen umfasst, wobei die Zellen Haupt-Histokompatibilitätsantigene exprimieren, mit wenigstens vier bekannten Allotypen einer gegebenen Säugetierart.
Ebenfalls wird eine beanspruchte Zusammensetzung bereitgestellt, wobei die Allotypen jeweils in 80% oder mehr der Individuen vorhanden sind. Weiterhin wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, wobei jede gegebene Zelle nur einen einzelnen Allotyp exprimiert.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, wobei wenigstens eine Zelle wenigstens zwei Allotypen exprimiert. Es wird auch eine Zusammensetzung bereitgestellt, wobei die Antigene Klasse I-Antigene sind, und es wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, wobei die Antigene Klasse II-Antigene sind.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, wobei die Antigene sowohl Klasse I- als auch Klasse II-Antigene sind oder andere Alloantigene, die durch polymorphe Gene kodiert werden. Weiterhin wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, wobei die Vielzahl für alle bekannten Allotypen der Säugetierspezies repräsentativ ist. Weitere Ausführungsformen beinhalten eine Zusammensetzung, die weiterhin wenigstens ein rekombinantes Haupt- oder geringfügiges allotypisches Antigen der Säugetierspezies umfasst. Und in einer weiteren Ausführungsformen wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, wobei das rekombinante Antigen in einem Wirt hergestellt wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Pilzen, Insektenzellen und Säugetierzellen.
In einer weiteren Ausführungsform schließen die Allotypen der Zusammensetzung wenigstens einen der folgenden humanen Allotypen ein:
HLAA₁, A₂, A₃, A₁₁, A₂₄, A₂₉, A₃₂,
B₇, B₈, B₁₃, B₃₅, B₃₈, B₄₄, B₅₅, B₆₀, B₆₂,
CW₁, CW₂, CW₄, CW₅, CW₆, CW₇, CW₉, CW₁₀, CW₁₁,
DR₁, DR₃, DR₄, DR₇, DR₈, DR₁₁, DR₁₂, DR₁₃, DR₁₅,
AB0-Blutgruppen.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, wobei die Zellen weiterhin ein Antigen eines umhüllten Virus exprimieren. In weiteren Ausführungsformen ist das Virus ein Herpesvirus und/oder ein Retrovirus. Und in weiteren Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung intakte Zellen, die weiterhin ein Cytokin exprimieren. Das Cytokin kann IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, γ-Interferon oder GMCSF sein. Weitere Ausführungsformen stellen intakte Zellen bereit, die weiterhin ein co-stimulatorisches Molekül exprimieren. Das co-stimulatorische Molekül kann B-7 sein.
In einer weiteren Ausführungsform sind die Zellen der Zusammensetzung wachstumsunfähig gemacht worden; dies kann durch letale Bestrahlung erreicht werden. Die Zusammensetzung kann weiterhin einen pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff umfassen.
In einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, um eine Immunantwort in einem gegebenen Säugetier zu erzeugen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Bereitstellung einer Zusammensetzung, umfassend
(i) intakte Zellen, wobei die Zellen Haupt-Histokompatibilitätsantigene mit mindestens vier Allotypen aus der Spezies des gegebenen Säugers exprimieren; und
(ii) einen pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff;
(b) Verabreichung der Zusammensetzung einem gegebenen Säugetier.

In einer weiteren alternativen Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, um eine Immunreaktion in einem gegebenen Säugetier gegen ein umhülltes Virus hervorzurufen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Identifizieren eines gegebenen Säugers mit einem Risiko der Infektion mit dem Virus;
(b) Bereitstellung einer Zusammensetzung, umfassend
(i) intakte Zellen, wobei die Zellen Haupt-Histokompatibilitätsantigene mit einer Vielzahl von Allotypen aus der Spezies des gegebenen Säugers exprimieren;
(ii) einen pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff,
(b) Verabreichen der Zusammensetzung an den gegebenen Säuger in einer Menge, die effektiv ist, um die Immunantwort hervorzurufen.

In einer weiteren alternativen Ausführungsform wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die intakte, nicht-bösartige Zellen umfasst, wobei die Zellen Haupt-Histokompatibilitätsantigene mit einer Vielzahl von Allotypen einer gegebenen Säugerspezies exprimieren.
Andere Aufgaben, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung offensichtlich werden. Allerdings soll klar gestellt werden, dass die detaillierte Beschreibung und die spezifischen Beispiele nur zum Zweck der Verdeutlichung gegeben sind, wobei sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung bezeichnen, da verschiedenste Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Bereichs und des Rahmens der Erfindung den Fachleuten auf Grund dieser detaillierten Beschreibung offensichtlich werden.
1 listet die Buchstabenbeschreibungen der in 3 dargestellten Allotypen auf.
2 listet die in 3 dargestellten ethnischen Herkunft-Codes auf.
3A–K stellt eine Liste von HLA- Allotypen und ihre Verteilungsfrequenz in den ethnischen Gruppen bereit.
Ein Säuger muss für jede in ihm befindliche Zelle entscheiden, ob diese Zelle „selbst" oder „nicht-selbst" ist. Wenn sie „selbst" ist, möchte der Säuger keine Immunreaktion in Gang setzen. Wenn sie „nicht-selbst" ist, möchte der Säuger (der Wirt in diesem Fall) üblicherweise reagieren und die Zelle eliminieren. Ferner unterscheidet ein Wirt zwischen zwei Teilmengen von Nicht-selbst-Zellen – Zellen, die der Wirt bereits zuvor gesehen hat, und Zellen, die für den Wirt neu sind. Es haben sich biologische Mechanismen entwickelt, die eine schnelle und substantiellere Reaktion auf Zellen erlauben, mit denen der Wirt bereits zuvor in Kontakt gekommen ist.
Daher ist es unwahrscheinlich, dass eine signifikante Immunreaktion gegen das infektiöse Agens auftritt, bevor eine Infektion der Wirtszellen auftritt, wenn ein Virus oder eine Virus-infizierte Zelle einem Wirt zum ersten Mal ausgesetzt wird. Im Gegensatz dazu kann ein Wirts-Immunsystem, das „geprimed" wurde, d. h. gegenüber einem bestimmten Virus oder viralem Antigen sensibilisiert wurde, eine schnelle und signifikante Immunreaktion aufbauen, die eine Infektion verhindern oder begrenzen wird. Dies ist das Grundprinzip der Impfstoffe, die entworfen werden, um das Immunsystem des Wirts gegenüber einem oder mehreren Antigenen eines gegebenen Virus zu sensibilisieren. Im Folgenden ist eine detaillierte Erklärung der Immunreaktion gegeben, wie sie der vorliegenden Erfindung entspricht.
A. Immunität gegenüber Viren auf Grund der Erkennung von Antigen und Alloantigen durch Antikörper und T-Zellen
Haupt- und geringfügige Histokompatibilitätskomplex (MHC)-Glykoproteine wurden viele Jahre lang intensiv untersucht, ohne dass die Forscher ein gutes Verständnis ihrer Funktion gewonnen haben. Diese Zelloberflächen-Antigene, die einen hohen Grad von genetischem Polymorphismus in menschlichen und anderen Säugetierpopulationen aufweisen, wurden untersucht, indem Alloantikörper verwendet wurden, die durch Gewebeimmunisierungen zwischen Individuen derselben Spezies gewonnen wurden. Da sie auch ohne eine spezifizierte Funktion auch Hauptziele einer spezifisch immunologischen Abstoßung von transplantierten Geweben und Organen waren, wurden sie „Transplantations-Antigene" genannt.
Eine Transplantatabstoßung involviert T-Lymphozyten (T-Zellen) und B-Lymphozyten (B-Zellen) des Empfänger, welche auf antigenische Determinanten reagieren, die durch strukturelle Unterschiede in den MHC-Molekülen des Spenders und Empfängers verursacht werden. Solche Determinanten werden alloantigenische Determinanten oder „Allodeterminanten" genannt, und die reagierenden T-Zellen werden als „alloreaktiv" bezeichnet. In den 70er Jahren entdeckten Zellimmunologen die physiologische Funktion von MHC-Molekülen, indem sie zeigten, dass sie bei der Stimulation von T-Zellreaktionen auf alle Antigene behilflich sind, nicht nur auf Alloantigene. Andauernde Untersuchungen während der 80er Jahre führten zu einem mechanistischen Verständnis dieser Beziehung, was durch die Entdeckung erleichtert wurde, dass α/β und γ/δ T-Zellrezeptoren, anders als B-Zellrezeptoren (Immunoglobuline), native Proteine nicht erkennen, sondern diese vielmehr entfaltet und in kleine Fragmente zerlegt werden müssen. Diese Antigen-„Prozessierung" findet innerhalb der Zellen statt und, soweit man weiß, benötigt Enzyme und intrazelluläre Kompartimente, die im Allgemeinen für den Transport, den Umsatz, die Reifung und Prozessierung normaler zellulärer Proteine benötigt werden.
Daher besitzen MHC-Moleküle eine dreifache Funktion: (1) Peptide innerhalb der Zelle zu binden; (2) diese zur Plasmamembran zu transportieren; und (3) sie an der Zelloberfläche in einem Komplex zurückzubehalten, der mit den Rezeptoren der T-Lymphozyten interagieren kann. Der von einem T-Zellrezeptor erkannte Ligand ist daher ein Peptidkomplex, üblicherweise 8–25 Aminosäuren groß und an ein MHC-Molekül gebunden. Von den MHC-Glykoproteinen wird behauptet, dass sie das Peptid der T-Zelle „präsentieren" und sind passenderweise als „Antigen-präsentierende" Moleküle beschrieben. Townsend und Bodmer, Ann. Rev. Immunol. 7: 601–624 (1989).
Gesunde Säugetierzellen können zwei Typen von Proteinantigenen präsentieren – diejenigen aus dem Inneren der Zelle (z. B. virale Proteine, die nach einer viralen Infektion der Zelle hergestellt werden) und jene, die irgendwo anders hergestellt werden und die dann mittels Endozytose in die Zelle gelangen (z. B. bakterielle Toxine). Zwei homologe Klassen von MHC-Molekülen haben sich im Laufe der Evolution im Hinblick auf intrazelluläre Bewegung und Antigen-Präsentierung spezialisiert. Klasse I MHC-Moleküle präsentieren hauptsächlich Peptide, die von endogen hergestellten Proteinen stammen, beispielsweise von solchen, die durch eine intrazelluläre virale Infektion induziert wurden, während Klasse II MHC-Moleküle sich auf die Präsentierung von Peptiden spezialisieren, die von endozytierten Antigenen stammen. Obwohl dies meist der Fall ist, können Ausnahmen auftreten, in denen die Bedingungen der Antigen-Präsentierung durch MHC-Moleküle umgekehrt sind.
Von zwei Typen von T-Zellen wird angenommen, dass sie mit den zwei Klassen von MHC-Molekülen interagieren. CD4-Lymphozyten sind Helfer-T-Zellen, von denen angenommen wird, dass sie ihre Anweisungen von dem MHC Klasse II-Antigen erhalten, welches prozessierte Antigenpeptide in der MHC Klasse II-Furche präsentiert. Andererseits erkennen CD8-Lymphozyten (cytotoxische T-Zellen) antigenische Peptide, die an MHC Klasse I-Antigene gebunden sind. Eine Antigen-Prozessierung tritt auch in B-Zellen auf, die den Antikörper/Antigen-Komplex endozytieren und fragmentieren können. Dieser Komplex wird ausgebildet, wenn das Antigen mit dem B-Zellrezeptor reagiert, einem gegen das Antigen gerichteten membrangebundenen Immunoglobulin-Antikörper. Darüber hinaus können Makrophagen Antigen-Antikörper-Komplexe mittels des F_c-Rezeptors endozytieren, was zu einer verstärkten Prozessierung und Präsentierung gegenüber T-Zellen führt. Es ist wichtig zu betonen, dass, damit die T-Zelle ein von entweder einem Klasse I oder Klasse II MHC-Molekül präsentiertes Antigen erkennen kann, eine direkte HLA-Entsprechung zwischen dem Lymphozyten und der Antigen-präsentierenden Zelle vorliegen muss oder dass der T-Zellrezeptor der T-Zelle ein kreuzreagierendes Epitop auf dem MHC-Molekül erkennen muss. Daher kann eine cytotoxische T-Zelle der MHC Klasse I A2 üblicherweise eine Zelle, die dasselbe Antigen trägt, welches durch MHC Klasse I A1-humane Zellen prozessiert und präsentiert wurde, nicht erkennen und töten.
Es ist wichtig zu betonen, dass die zwei Arme des Immunsystems (humoral und zellvermittelt) Antigene auf unterschiedliche Weise erkennen. Ein von B-Zellen produzierter Antikörper erkennt hauptsächlich Konformations-Epitope auf der Oberfläche großer Antigenmoleküle. T-Zellen erkennen mittels ihres antigenisch-spezifischen Rezeptors lineare Peptidsequenzen, die durch die Prozessierung von Antigenen durch enzymatische Fragmentierung des nativen Proteins hergestellt wurden. Daher werden die meisten T-Zell-Epitope in Proteinen in ihrem natürlichen Zustand nicht erkannt und müssen aktiv hergestellt werden, entweder während der Proteinsynthese (d. h. bevor das Molekül in seine richtige endgültige Struktur gefaltet wurde) oder durch einen reduktiven enzymatischen Prozess, der eine Art von Proteindegradation beinhaltet. T-Zell-Epitope sind daher im Allgemeinen von der nativen Konformation (Sekundär- und Tertiärstruktur) unabhängig, und daher besitzt ihre Invariabilität der Erkennung weniger Unterscheidungskraft als B-Zell-Epitope, die von Konformationsstrukturen der Oberfläche abhängen. Allerdings setzt die Antigen-Prozessierung das Immunsystem einer Anzahl von Strukturen aus, die normalerweise innerhalb der nativen Konformation der Makromoleküle vergraben sind und daher sonst für die Immunerkennung unsichtbar sein würden. Diese doppelte Fähigkeit, sowohl interne Strukturen durch T-Zell-Rezeptoren als auch externe Konfigurationen durch B-Zell-Antikörper zu erkennen, ist in das Gesamt-Schutzschema des Immunsystems integriert.
Der zweite große Unterschied zwischen den zwei Armen des adaptiven Immunsystems besteht darin, dass die T-Zell-Erkennung nicht mit Antigenen alleine auftritt. Die zwei Moleküle, der T-Zell-Rezeptor und das Epitop, interagieren erst auf der Oberfläche einer separaten Zelle, der Antigen-prozessierenden Zelle. Ferner wird diese Zelle benötigt, um ein drittes Molekül zu exprimieren, entweder Klasse I oder Klasse II des Haupt-Histokompatibilitätskomplex-Glykoproteins. Von diesen Zelloberflächen-Glykoproteinen wurde gezeigt, dass sie direkt an T-Zell-Epitope binden. Dieser Bindungsschritt ist der essentielle Musterungsprozess, mit dem das korrekt prozessierte Antigen aus der nicht-prozessierten Mehrheit ausgewählt wird. Die Mehrheit der Indizien legt nahe, dass eine korrekte T-Zell-Erkennung nur auftreten kann, wenn das passende Antigen-Epitop innerhalb einer relativ kleinen molekularen Furche am distalen Ende eines MHC-Moleküls positioniert ist.
Daher stellen die molekularen und zellulären Mechanismen, mit denen T-Zell-Epitope aus komplexen Makromolekülen entstehen und dann durch Antigen-präsentierende Zellen auf eine Weise exprimiert werden, dass sie zusammen erkannt werden können, die Antigen-Prozessierung dar. Die Antigen-Präsentierung wird als die darauf folgende Interaktion von Antigen-präsentierender Zelle und T-Zelle in Gegenwart des Peptid-Antigens definiert. Daher stellt die Antigen-Prozessierung einen unentbehrlichen Schritt in der gesamten Abfolge der Ereignisse dar, die zur T-Zell-Stimulation führen und infolge zur Entwicklung einer effektiven immunologischen Reaktion.
B. Zwei Wege der Antigen-Prozessierung
Das Vorhandensein zweier separater Klassen von MHC-Molekülen auf der Zelloberfläche ist seit langem bekannt. Diese Aufteilung in Klassen beruht auf der Separierung reifer T-Lymphozyten in zwei unterschiedliche Gruppen. Die sich gegenseitig ausschließenden T-Zelloberflächen-Antigene CD8 und CD4 sorgen für die Spezifität hinsichtlich der MHC Klassen I bzw. II. Im Gegensatz dazu wurde gezeigt, dass Antigen-spezifische T-Zell-Rezeptoren für die Erkennung von Antigenen, die an beide Klassen von MHC gebunden sind, dieselbe Auswahl an Keimbahnelementen verwenden. Die Klasse I-assoziierten Antigene stammen vornehmlich aus internen Antigenen (beispielsweise virale Antigene), die durch die Antigen-prozessierenden Zellen endogen synthetisiert wurden, während Klasse II-assoziierte Antigene typischerweise extern sind, exogen aus der extrazellulären Umgebung mittels Endozytose aufgenommen. MHC Klasse I-Antigene können in allen kernhaltigen Zellen exprimiert werden. Daher kann das Immunsystem mittels des Klasse I-Prozessierungswegs eine ganze Reihe von intrazellulären Antigenen erkennen und auf sie reagieren, Antigene, die in ihrem nativen Zustand wahrscheinlich niemals der extrazellulären Umgebung ausgesetzt würden. Dies ist mit der Funktion von CD8⁺-T-Zellen konsistent, alle Zellen im Körper auf virale Antigene zu durchmustern, die mit Hilfe von MHC Klasse I-Molekülen präsentiert werden können, wodurch der Wirt vor einer intrazellulären viralen Infektion geschützt wird. MHC Klasse II-Antigene werden hauptsächlich auf spezialisierten Zellen innerhalb des Immunsystems gefunden, insbesondere auf B-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen. Siehe Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26: 439–473 (1991) von T. P. Levine und B. M. Chain, "The Cell Biology of Antigen Processing".
C. Virale Infektion und Auswirkungen auf die Immunität gegen umhüllte Viren
Ein virales Protein-Antigen kann also in unterschiedliche Peptide fragmentiert werden, die als distinkte Peptidsequenzen in der Furche verschiedener MHC-Moleküle präsentiert werden, in Abhängigkeit von der Genetik der MHC-Allelexpression des Wirts. Die Prozessierung und Präsentierung sind Schlüsselschritte in der Entwicklung einer effektiven Immunreaktion.
Die Übertragung von umhüllten Viren kann durch die Infektion mit dem freien Viruspartikel selbst stattfinden, wie sie z. B. bei der Tröpfchenübertragung von Atemwegsviren, wie Rhinoviren oder Influenzaviren, auf Grund von Husten oder Niesen der betroffenen Individuen stattfindet. Darüber hinaus kann die Übertragung durch den Transfer infizierter Zellen stattfinden, wie durch den Transfer von HIV-infizierten Lymphozyten mittels der Samenflüssigkeit. Diese Zellen können das HIV-virale Genom tragen, wobei jedoch nur wenig oder überhaupt keine freien Viruspartikel zum Zeitpunkt der Übertragung vorhanden sein können. Obwohl virale T-Zellpeptidepitope durch die MHC Klasse I-Moleküle auf der Oberfläche der infizierten Zelle exprimiert werden können, können diese viralen Peptide nicht durch die T-Zellrezeptoren eines empfangenden Wirts erkannt werden, wenn nicht zufällig eine Allotyp-Übereinstimmung zwischen den MHC Klassen I oder II des Spenders und des Empfängers vorliegt. Selbst wenn der Empfänger bereits eine lang dauernde Langzeit T-Zell-Erinnerung gegen Peptide besitzt, die mit dem infizierenden Virus assoziiert sind, wird diese Erinnerung gegen die Peptidsequenzen, die von dem MHC-Glykoprotein-Molekülen auf der Oberfläche der eintretenden Zelle oder viralen Membran präsentiert werden, unwirksam sein, weil sie durch die T-Zellen des Wirts auf Grund der nicht-übereinstimmenden MHC nicht erkannt werden können.
Die fremden viralen Proteinantigene können von MHC Klasse II-Antigen-präsentierenden Zellen des Wirts aufgenommen und CD4-Helferzellen präsentiert werden. Darüber hinaus werden die MHC-Antigene des neuen Wirts, sobald das Virus sich Eintritt in die Zellen des Wirts verschafft hat und begonnen hat zu replizieren und Proteine zu synthetisieren, diese unterschiedlichen Peptidsequenzen cyctotoxischen T-Zellen präsentieren, die anschließend eine weitere virale Proliferation inhibieren, indem sie die Virus-infizierten Zellen des neuen Wirts töten. Diese Art spezifischer viraler Immunität verhindert allerdings nicht die Übertragung der Infektion entweder durch freie virale Partikel oder infizierte Zellen, obwohl sie den Grad der viralen Replikation im neuen Wirt begrenzen kann.
Andererseits können bereits existierende, gegen die auf der Oberfläche der viralen Partikel vorliegenden Antigene gerichteten Antikörper direkt mit dem viralen Partikel reagieren und die anfängliche Infektion verhindern. Es ist unsere Hypothese, dass das Vorliegen einer bereits existierenden allotypischen Antikörper- oder T-Zell-Immunität gegen die vorherrschenden HLA-Antigene eine sofortige Erkennung der fremden Alloantigene auslösen kann, die auf der umhüllten Lipidmembran des eindringenden Virus vorliegen, was wiederum eine sofortige Erkennung des und einen sofortigen Angriff auf das fremde Virus auslösen kann, wenn der Grad der Immunität ausreichend hoch ist. Wenn ein geringer Grad an Immunität vorliegt, kann sie eine Erkennung des fremden Alloantigens auslösen, was zu einer Cytokin-Freisetzung führen würde, einer beschleunigten spezifischen Antigenprozessierung und einer Abstoßung des Virus mittels der Induktion spezifischer Immunität. Dies ist ein Beispiel eines sekundären „Helfer"- oder Zuschauer-Effekts bei der Induktion spezifischer Immunität, welche die Vermehrung des Virus im neuen Wirt bis zu einer pathogenen Konzentration inhibieren kann.
D. Viren als Gewebetransplantate: Eine mögliche Rolle in der Evolution der Allotransplantationsreaktion und Immunität gegenüber umhüllte Viren
Organe können problemlos zwischen Menschen transplantiert werden, die eineiige Zwillinge sind, oder innerhalb von Stämmen von Labor-Nagetieren, bei denen die genetische Homogenität im Wesentlichen das Problem der Diversität am Haupt-Histokompatibilitätskomplex eliminiert. Allerdings tritt in Fällen, in denen auf Grund der Diversität der HLA Klasse I-Antigene an dem A-, B- und C-Locus existieren, eine schnelle Abstoßung der transplantierten Gewebe durch den neuen Wirt statt, die auf einer starken, mächtigen und lang andauernden Allotransplantatreaktion beruht. Da eine Organtransplantation in der Natur natürlicherweise nicht vorkommt, ist es verlockend zu hypothetisieren, dass der Ursprung dieser Allotransplantatreaktion in einem evolutionären Mechanismus liegt, zum Schutz gegen „allogenische" Invasion durch externe Stoffe. Anders ausgedrückt ist MHC ein Code, der bestimmt, was Selbst und was Nicht-selbst ist; Nicht-selbst sollte angegriffen und zerstört werden. Eine Art eines natürlichen, nicht-selbst, MHC-tragenden Wirkstoffs, würden umhüllte Viren sein.
Die genetische Stabilität von eingeborenen Völkern in primitiven Stämmen ist deutlich größer als die, die man in städtischen Populationen sieht. Daher würde man eine begrenzte HLA-Diversität in eingeborenen Völkern erwarten. Wo eine virale Infektion zwischen Individuen innerhalb des Stamms auftritt, werden die Überlebenden die Fähigkeit gewinnen, auf den begrenzten Pool an MHC-Antigenen des Stammes zu reagieren, zusätzlich zu den viralen Antigenen. Letztendlich würde diese Art der begrenzten Exposition die Entwicklung von alloreaktiven T-Zellreaktionen gegen alle in diesem Stamm vorkommenden MHC-Allotypen erlauben. Diese starken alloreaktiven T-Zellreaktionen gegen eine begrenzte Anzahl von Alloantigenen würde genauso effektiv, oder vielleicht sogar noch effektiver sein, wie eine Immunität, die gegen die spezifischen viralen Epitope gerichtet ist. Zumindest profitiert diese Art der Reaktion von ihrer Universalität, d. h. sie ist nicht Virus-spezifisch. Darüber hinaus würde in den Situationen, wo zufällig eine Übereinstimmung des MHC Klasse I zwischen dem infizierenden umhüllten Virus und dem neuen Wirt bestand, die in der MHC-Furche des umhüllten Virus präsentierte Peptidsequenz von den cytotoxischen T-Zellen des neuen Wirts schneller erkannt und würde daher eine schnelle T-Zellreaktion auslösen.
Da die modernen, städtischen Populationen durch eine Migration von Individuen aus vielen verschiedenen Stämmen formiert wurden, stieg die Diversität von MHC-Antigenen in einer gegebenen Population dramatisch an. Für isolierte Stämme war es unmöglich, eine allotypische Immunität gegen eine solch große Anzahl von unterschiedlichen HLA-Typen zu entwickeln, wenn man die fehlende Exposition bedenkt. Als sie mit größeren Zivilisationen in Kontakt gebracht wurden, waren die Chancen eines infizierenden Virus oder einer Virus-infizierten Zelle, die entweder (i) denselben Allotyp wie der Empfänger aus dem kleinen Stamm trug oder (ii) einen Allotyp trug, dem der Empfänger aus dem kleinen Stamm bereits ausgesetzt war, stark reduziert. Folglich ist es nicht überraschend, wie vernichtend die viralen Epidemien waren, die auftraten, als europäische Seefahrer mit isolierten eingeborenen Völkern der Inselstaaten in Kontakt kamen.
Daher ist es, von einem evolutionären Standpunkt aus gesehen, wahrscheinlicher, dass die starke Allotransplantat-Immunreaktion, die sicherlich nicht evolviert ist, um Menschen gegen Gewebetransplantationen zu schützen, als ein Schutz gegen Infektion auf Grund von Übertragung zellulärer Antigene evolviert ist, die von der Wirtszelle durch umhüllte Viren aufgenommen wurden. Man kann das für eine Version der Transplantat-gegen-Wirt-Abstoßung (graft-versus-host rejection) der Natur halten. Eine weitere Unterstützung dieser Hypothese liegt darin, dass es nicht unüblich ist, natürlich auftretende Anti-HLA-Antikörper gegen verschiedene Orte in Männern und Frauen zu finden, die niemals einer Transplantation, einer Bluttransfusion unterzogen wurden oder schwanger waren. Es ist möglich, dass diese Antikörper durch eine Infektion mit umhüllten Viren induziert wurden, die fremde HLA-Antigene trugen.
Obwohl die Betonung in dieser Diskussion auf den MHC Klasse I-Genen lag, die durch die A-, B-, C-Loci kodiert werden, gibt es auch weniger gut charakterisierte D-, E und F-Allele und Klasse II MHC-Antigene, die aus HLA DR, DP und DQ bestehen, die möglicherweise als Targets für eine alloimmune Reaktion dienen. Darüber hinaus ist es auf Grund der genetischen Diversität in Populationen denkbar, dass andere Membranantigene, die unter einer genetischen Kontrolle stehen, wie die Blutgruppenantigene der AB0- und RH-Typen, ebenfalls als Targets für eine Alloimmunisierung gegen umhüllte Viren dienen könnten.
E. Das Grundprinzip
Da umhüllte Viren Wirtszellmembranen erhalten, wenn sie synthetisiert werden, erwartet man von den Viruspartikeln, dass sie MHC-Komponenten der Wirtszelle wie auch andere Zelloberflächenantigene enthalten, die durch verschiedene Gene, wie die AB0-Blutgruppen, kodiert werden. Intakte infizierte Zellen werden MHC-Komponenten und auch andere polymorphe Antigene tragen. MHC-Komponenten in viralen Partikeln und infizierten Zellen stellen zusätzlich zu den viralen Antigenen eine Klasse von Antigenen bereit, die das Ziel einer schützenden Immunreaktion sein könnte. Doch auch hier ist eine ungeprimte Immunreaktion gegen fremde MHC allerdings wahrscheinlich nicht in der Lage, eine Infektion zu verhindern. Daher würde es notwendig sein, das Immunsystem des Wirts zu primen, damit es auf fremde MHC-Komponenten und andere Alloantigene reagiert.
Die vorliegende Erfindung operiert unter der Voraussetzung, dass ein wirkungsvoller Impfstoff unter Verwendung von MHC-Antigenen und, vielleicht, anderen allotypischen Antigenen, insbesondere Fällen, die MHC-Antigene exprimieren, entwickelt werden kann. Man glaubt, dass durch das Primen eines Individuums, so dass es auf fremde MHC-Antigene reagiert, jedes umhüllte Viruspartikel oder jede Virus-infizierte Zelle einer schnellen und substantiellen Immunreaktion unterworfen wird, die eine Aktivierung von sowohl den Antikörper-vermittelten B-Zell- als auch T-Zell-Armen der Immunreaktion umfasst und die damit eine Infektion der Wirtszellen verhindert.
In ihrer grundlegendsten Form ist die vorliegende Erfindung ein Impfstoff, der eine Vielzahl von MHC-Allotypen umfasst. Wenn der Impfstoff einen einzigen Allotyp umfasst, wird dieser Impfstoff keinerlei Immunreaktion in denjenigen Individuen stimulieren, die denselben Allotyp besitzen. Dies ist außer für eineiige Zwillinge unwahrscheinlich, wegen der großen genetischen Diversität, die bei den HLA A-, B- und C-Allotypen sowie in Klasse II-Allotypen der modernen Zivilisation vorhanden ist. Daher wird ein Impfstoff, der zumindest einen oder mehrere Allotypen repräsentiert, für jedes Individuum von einigem Vorteil sein. Die MHC-Antigene, die die verschiedenen Allotypen ausmachen, werden auf der Oberfläche intakter Zellen exprimiert oder sind Teil von Membranpräparationen, die von Zellen stammen, die MHC-Antigene exprimieren. Darüber hinaus wird der Impfstoff in einigen Ausführungsformen auch viral kodierte Antigene und/oder Hilfsstoffe enthalten. Die folgende Diskussion wird die Eigenschaften solcher Impfstoffe und ihre Verwendung weiter beschreiben.
F. MHC-Antigenprofile
Damit ein wirkungsvoller MHC-basierter Impfstoff in der Lage ist, ein Individuum gegen alle infizierenden Viruspartikel zu schützen, muss der Impfstoff das volle Spektrum an MHC-Antigenen bereitstellen. Für Menschen würde dies bedeuten, dass ein einziger Impfstoff genügend Allotypen von MHC-Antigenen beinhalten müsste, damit garantiert ist, dass wenigstens einer der auf der Virushülle vorhandenen Allotypen vom Impfstoffempfänger als fremd wahrgenommen wird. 1 stellt eine Liste von HLA-Allotypen und ihre Verteilungsfrequenz in Volksgruppen dar. Eine statistische Analyse wird geeignete Kombinationen von Antigenen ergeben, die einen maximalen Schutz gewährleisten. Diese Art von Impfstoff würde für ein gegebenes Virus nicht spezifisch sein.
Allerdings ist es in vielen Fällen unnötig, dass der Impfstoff alle möglichen MHC-Allotypen repräsentiert. Es wird eher von Vorteil sein, wenn ein Impfstoff verwendet wird, der Antigene enthält, die nur die meistverbreiteten Allotypen oder Allotypen darstellen, die regional vorherrschen. Wenn beispielsweise ein Individuum vor einem Virus geschützt würde, das von einem Großteil der Population ausgeht, indem nur ausgewählte Allotypen verwendet werden, würde solch ein Impfstoff eine beachtliche Nützlichkeit besitzen und könnte weit weniger kostenintensiv in seiner Produktion sein als ein Impfstoff mit maximaler Wirksamkeit, d. h. einer mit Antigenen, die jeden Allotyp darstellen. Solange mehr als ein Allotyp im Impfstoff repräsentiert ist, wird der Empfänger des Impfstoffs tatsächlich gegen mindestens einen anderen Allotyp als sein oder ihr eigener immunisiert werden. Wiederum würde solch ein Impfstoff ungeachtet der Natur des infizierenden Virus Schutz induzieren. Daher umfasst die vorliegende Erfindung Impfstoffe mit zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn oder mehr MHC-Allotypen.
Die erfindungsgemäß verwendeten allotypischen Antigene können beliebige der Haupt- oder geringfügigen Histokompatibilitäts-Antigene oder Blutgruppen-Antigene sein. In einer Ausführungsform werden diese Antigene in einer zellfreien Form bereitgestellt. Solche Antigene können aus geeigneten Zellquellen aufgereinigt werden oder werden vorzugsweise mittels rekombinanter Mittel nach der Klonierung des entsprechenden Gens hergestellt. Verfahren, mit denen allotypische Antigene kloniert werden können, sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt. Siehe Finney, „Molecular Cloning of PCR Products" in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, New York (1987), S. 15.7.1.
Wenn einmal die gesamte kodierende Sequenz eines allotypischen Gens bestimmt wurde, kann das Gen in ein geeignetes Expressionssystem inseriert werden. Das Gen kann in einer beliebigen Anzahl verschiedener rekombinanter DNA-Expressionssysteme exprimiert werden, um dadurch große Mengen des Polypeptidprodukts herzustellen. Beispiele von Expressionssystemen sind dem Fachmann bekannt und beinhalten Bakterien-, wie E. coli, Hefe-, wie Pichia pastoris, Bakulovirus- und Säugetier-Expressionssysteme, wie in Cos- oder CHO-Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Polypeptide in E. coli und in Bakulovirus-Expressionssystemen exprimiert. Es kann ein komplettes Gen exprimiert werden oder es können, alternativ, Fragmente des Gens hergestellt werden, die Teile des Polypeptids kodieren.
Die Gensequenz, die das Antigen kodiert, wird analysiert, um so putative Transmembransequenzen nachzuweisen. Solche Sequenzen sind typischerweise sehr hydrophob und sind unter Verwendung von Standard-Sequenzanalyse-Software, wie MacVector (IBI, New Haven, CT, USA), leicht nachzuweisen. Das Vorhandensein von Transmembransequenzen ist häufig schädlich, wenn ein rekombinantes Protein in vielen Expressionssystemen, insbesondere E. coli, synthetisiert wird, da sie zur Herstellung von unlöslichen Aggregaten führen, die schwierig in die native Konformation des Proteins zu renaturieren sind. Die Deletion der Transmembransequenzen ändert üblicherweise die Konformation der verbleibenden Proteinstruktur nicht wesentlich.
Darüber hinaus sind Transmembransequenzen nicht zugänglich, da sie per definitionem in eine Membran eingebettet sind. Antikörper gegen diese Sequenzen werden sich daher in Impfstoffen nicht als nützlich erweisen. Die Deletion von Transmembran-kodierenden Sequenzen aus den Genen, die für eine Expression verwendet werden, kann durch Standardtechniken erreicht werden. Siehe Ausubel et al., supra, Kapitel 8. Beispielsweise können günstig gelegene Restriktionsenzymschnittstellen verwendet werden, um das erwünschte Genfragment herauszuschneiden, oder es kann eine PCR-Amplifikation verwendet werden, um nur den erwünschten Teil des Gens zu amplifizieren. Wenn diese Transgene als ein Teil eines Ganzzell-Impfstoffs verwendet werden sollen, ist allerdings eine Zurückbehaltung der Transmembransequenzen erwünscht.
Das Gen oder Genfragment, das ein Antigen kodiert, kann in einen Expressionsvektor mittels Standard-Subklonierungstechniken inseriert werden. Z. B. wird ein E. coli-Expressionsvektor verwendet, der die rekombinanten Polypeptide als Fusionsproteine herstellt, was eine schnelle Affinitätsaufreinigung des Proteins erlaubt. Beispiele für solche Fusionsprotein-Expressionssysteme sind das Glutathion S-Transferase-System (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA), das Maltose-Bindungsprotein-System (NEB, Beverley, MA, USA), das FLAG-System (IBI, New Haven, CT, USA) und 6 × His-System (Qiagen, Chatsworth, CA, USA).
Einige dieser Systeme stellen rekombinante Polypeptide her, die nur eine kleine Anzahl zusätzlicher Aminosäuren tragen, von denen unwahrscheinlich ist, dass sie die antigenische Fähigkeit des rekombinanten Polypeptids beeinflussen. Beispielsweise fügen sowohl das FLAG-System als auch das 6 × His-System nur kurze Sequenzen hinzu, wobei man von beiden weiß, dass sie nur schwach antigenisch wirken, und die Faltung des Polypeptids in seine native Konformation nicht nachteilig beeinflussen. Andere Fusionssysteme produzieren Polypeptide, bei denen es wünschenswert ist, den Fusionspartner aus dem erwünschten Polypeptid herauszuschneiden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Fusionspartner mit dem rekombinanten Polypeptid durch eine Peptidsequenz verbunden, die eine spezifische Erkennungssequenz für eine Protease beinhaltet. Beispiele für geeignete Sequenzen sind solche, die von der Tobacco Etch Virus-Protease (Life Technologie, Gaithersburg, MD, USA) oder dem Faktor Xa (New England Biolabs, Beverley, MA, USA) erkannt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das verwendete Expressionssystem durch den Bakulovirus-Polyhedrinpromotor angetrieben. Das Polypeptid-kodierende Gen kann mit Standardtechniken manipuliert werden, um seine Klonierung in den Bakulovirus-Vektor zu erleichtern. Ein bevorzugter Bakulovirus-Vektor ist der pBlueBac-Vektor (Invitrogen, Sorrento, CA, USA). Der Vektor, der das Gen für das Polypeptid trägt, wird in Spodoptera frugiperda(Sf9)-Zellen mittels Standardprotokollen transfiziert, und die Zellen werden kultiviert und prozessiert, um so das rekombinante Antigen herzustellen.
Als eine Alternative zu rekombinanten Polypeptiden können synthetische Peptide, welche den Antigenen entsprechen, hergestellt werden. Solche Peptide sind wenigstens sechs Aminosäurereste lang und können bis zu ungefähr 35 Reste enthalten, was die ungefähre obere Längenbegrenzung automatisierter Peptid-Synthesemaschinen darstellt, beispielsweise solche, die von Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) erhältlich sind. Die Verwendung solcher kleinen Peptide für die Impfung bedarf üblicherweise der Konjugation der Peptide mit einem immunogenischen Trägerprotein, beispielsweise dem Hepatitis B-Oberflächenantigen. Verfahren, um diese Konjugation auszuführen, sind in der Fachwelt wohlbekannt.
G. Supplementation eines MHC-Impfstoffs mit viralen Antigenen und Adjuvantien
Allerdings besteht im Hinblick auf einen Impfstoff, der ausschließlich auf MHC-Antigenen basiert, eine bedeutsame Einschränkung. Wie oben dargelegt wurde, ist das Säugetier-Immunsystem in der Lage, Selbst- von Nicht-Selbst-Zellen zu unterscheiden, und der Mechanismus, mit dem die Selbst/Nicht-Selbst-Unterscheidung getroffen wird, schließt MHC-Antigene mit ein. Wo also ein infizierendes Virus oder eine Virus-infizierte Zelle zufällig aus einem Individuum stammt, dessen Allotyp dem neu infizierten Wirt ähnlich ist, können die MHC-Antigene auf dem infizierenden Virus oder der Virus-infizierten Zelle nicht als fremd erkannt werden und werden daher eine Immunreaktion nicht auslösen, ungeachtet der Tatsache, ob oder ob der neu infizierte Wirt nicht mit Selbst-MHC-Antigenen immunisiert wurde. Daher wird ein zusätzlicher Immunmechanismus benötigt, um Immunität gegen ein Virus und Virusinfizierte Zellen bereitzustellen, die aus Individuen mit demselben Allotyp stammen.
Ein Weg, mit dem dieses Problem gelöst werden kann, besteht in der Zugabe viraler Antigene. Wo also das infizierende Virus in einem Individuum generiert wurde, welches denselben Allotyp wie das infizierte Individuum besitzt, wird ein zusätzlicher Nicht-Selbst-Erkennungsmechanismus bereitgestellt werden. Anders als die MHC-gerichtete Reaktion würde eine Immunisierung mit viralen Antigenen in einer Immunreaktion resultieren, die für ein gegebenes Virus spezifisch wäre.
Eine Auswahl viraler Antigene für die Verwendung in der Supplementation des MHC-basierten Impfstoffs gemäß der vorliegenden Erfindung wird auf den folgenden Überlegungen beruhen. Zunächst sollten die ausgewählten Antigene allgemein und stabil in der Virushülle und der Membran infizierter Zellen für die Induktion schützender Immunität exprimiert werden. Diese Antigene werden für die Antigen-prozessierenden Zellen des Immunsystems des infizierten Individuums zugänglich sein. Zweitens ist es wünschenswert, dass die ausgewählten Antigene für den fraglichen Virus die immundominanten Arten darstellen. Drittens wird man vorziehen, dass die ausgewählten Antigene selbst keinerlei toxische oder pathogene Funktion besitzen. Viertens können stabile und immundominante Antigene, die nach einer endogenen Prozessierung vom MHC Klasse I-Komplex präsentiert werden, höchst effektiv in der Begrenzung der Virusverbreitung sein, wenn die Infektion des neuen Wirts einmal erfolgreich stattgefunden hat. Und fünftens wird es höchst nützlich sein, wenn die entsprechenden Gene für die ausgewählten Antigene kloniert sind.
In anderen Situationen wird es wünschenswert sein, Adjuvantien bereitzustellen, welche die Immunreaktion auf Allotypen verstärken, die als ähnlich zum, aber doch unterschiedlich vom Selbst wahrgenommen werden. Solche Adjuvantien beinhalten alle verträglichen immunstimulatorischen Verbindungen, wie Cytokine, Toxine oder synthetische Zusammensetzungen. Beispiele für solche sind IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, γ-Interferon, GMCSP, BCG, Aluminiumhydroxid, N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thur-MDP), N-Acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (CGP 11637, bezeichnet als nor-MDP), N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmityol-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)ethylamin (CGP) 1983A, bezeichnet als MTP-PE), Lipid A, MPL und RIBI, was drei aus Bakterien extrahierte Bestandteile enthält, Monophosphoryllipid A, Trehalosedimycolat und Zellwandskelett (MPL + TDM + CWS) in einer 2% Squalen-/Tween 80-Emulsion. Die Wirksamkeit eines Adjuvans kann bestimmt werden durch Messung der Menge von Antikörpern oder cytotoxischen T-Zellen mit T-Zell-Rezeptoren, die gegen ein immunogenes Polypeptid gerichtet sind, das virale Antigene enthält, die aus der Verabreichung dieses Polypeptids in Impfstoffen resultieren, welche auch die verschiedenen Adjuvantien umfassen. In einigen Ausführungsformen wird es sich als nützlich erweisen, in eine einzelne Impfstoffpräparation sowohl virale Antigene als auch Adjuvantien zusammen mit MHC-Antigenen einzubeziehen. Wo die Adjuvantien Polypeptide sind, ist es möglich, die Gene für diese Polypeptide in einem geeigneten Expressionsvektor in eine zelluläre Version des Impfstoffs einzubeziehen.
Zusätzlich zu den Adjuvantien kann es wünschenswert sein, biologische Reaktionsmodifizierer (BRM) mit zu verabreichen, von denen gezeigt wurde, dass sie die T-Zell-Immunität hoch regulieren oder die Suppressorzell-Aktivität herunter regulieren. Solche BRMs umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Cimetidin (CIM; 1200 mg/d) (Smith/Kline, PA, USA); oder Niedrigdosis-Cyclophosphamid (CYP; 300 mg/m²) (Johnson/Mead, NJ, USA) und Cytokine, wie γ-Interferon, IL-2 oder IL-12, oder Gene, die Proteine kodieren, welche Immunhelferfunktionen ausüben, wie B-7.
H. Zelllinien
Wie oben dargestellt, besteht ein Problem bei der Verwendung von Untereinheit-Impfstoffen, die entweder rekombinante Antigene enthalten oder Antigene, die aus einer natürlichen Quelle isoliert wurden, darin, dass die Antigene ihren „nativen" Charakter verloren haben können. Üblicherweise resultiert diese Veränderung aus dem Verlust der Struktur höherer Ordnung. Auf Grund der Vielfalt der Faktoren, die die Sekundär- und Tertiärstruktur von Proteinen beeinflussen, ist es schwierig, wenn nicht sogar manchmal unmöglich, wirkungsvolle Untereinheit-Impfstoffe herzustellen. Dies kann zumindest teilweise erklären, warum lebende, abgeschwächte Impfstoffe sich im Allgemeinen als wirkungsvoller gezeigt haben bei der Generierung von Reaktionen auf einem hohen Niveau und einer lebenslangen Immunität.
Um dieses Problem anzugehen, beruht die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform auf intakten Zellen, welche die MHC-Antigene tragen sollen. Geeigneterweise können geeignete Zelllinien ausgewählt werden, die Haupt-MHC-Allotypen repräsentieren. Verschiedene Zelllinien können miteinander vermischt werden, um das notwendige MHC-Profil zu erreichen. Ungeachtet der genauen Zusammenstellung sollte aus der Verwendung intakter Zellen ein bedeutender Vorteil erwachsen, da die MHC-Antigene in ihrem nativen Milieu exprimiert und dem Wirt präsentiert werden. In der Tat sollten solche Zellen analog sein zu lebenden, abgeschwächten Impfstoffen.
Es ist vorstellbar, dass eine einzelne Zelllinie genetisch hergestellt werden kann, so dass sie multiple Allotypen exprimiert oder wenigstens multiple Allele von MHC-Antigenen. Es gehört zu den Standardfähigkeiten für Fachleute auf diesem Gebiet, Gene, die verschiedenen Allotypen verschiedener MHC-Antigene entsprechen, zu klonieren, wenn eine Sequenzhomologie dieser Moleküle und ein Wissen über ihre Gewebeverteilung vorliegt. Auf diese Weise ist es möglich, die Anzahl von Allotypen, die in einem gegebenen Impfstoff exprimiert werden, zu erhöhen, ohne die Anzahl der benötigten Zelltypen zu erhöhen. In der Tat kann es möglich sein, eine einzelne Zelle herzustellen, die eine ausreichende Anzahl von Allotypen exprimiert, und die dadurch einen bedeutenden Schutz bietet. Dies ist auch ein Weg, einen Impfstoff mit höheren Graden der MHC-Expression herzustellen oder ein allotypisches Profil bereitzustellen, das von einer leicht zu propagierenden Zelllinie nicht erhältlich ist.
In bestimmten Ausführungsformen wird es sich als nützlich herausstellen, die Zellen, die den Impfstoff umfassen, zu behandeln, so dass sie sich nicht innerhalb des geimpften Wirts vermehren. Dies kann durch eine Reihe von Mitteln erreicht werden, einschließlich Bestrahlung, Formaldehydfixierung, Erhitzen oder Einfrieren-Auftauen. Jedes andere Verfahren, mit dem die Zellen vermehrungsunfähig gemacht werden, jedoch intakt gelassen werden, wird theoretisch nützlich sein. Eine bevorzugte Ausführungsform besteht in der Bestrahlung, da sie die Fähigkeit hat, eine Vermehrung der lebenden Zellen in der immunisierten Person zu verhindern, die Zellen allerdings lebendig und fähig bleiben, sowohl alloantigenische als auch spezifisch virale Peptidsequenzen, wie T-Zellepitope, die für jede der MHC Klasse I-Allotypen geeignet sind, zu präsentieren.
Wo virale Antigene im Impfstoff beinhaltet sind, wird in Erwägung gezogen, dass eine Zelllinie mit einem oder mehreren viralen Antigenen stabil transformiert wird oder die Antigene aus verschiedenen Quellen isoliert werden können und einfach mit dem bestehenden Impfstoff gemischt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine immunisierende Zelle des Impfstoffs stabil mit einem Expressionsvektor transformiert, der einen regulatorischen Bereich umfasst, der in der Zelle funktional ist und operativ mit einem oder mehreren Genen für virale Antigene verbunden ist. Von diesen Antigenen wird angenommen, dass sie stabiler als Hüllprotein-Antigene und weniger empfänglich gegenüber antigenischer Drift sind. Wie oben dargestellt, wird dies den Schutz von Individuen erlauben, in Fällen, in denen ein infizierendes Virus oder eine Virus-infizierte Zelle denselben MHC-Allotyp trägt wie das infizierte Individuum. Ein zusätzlicher Vorteil kann auch aus der Expression von viralen Antigenen durch Zellen resultieren. In bestimmten Zellen wird das virale Antigen proteolytisch „prozessiert" und im Kontext der MHC-Moleküle der Zellen exprimiert. Diese MHC-„Präsentierung" von Antigen ist ein wichtiger Teil der Antigenerkennung, und die Verwendung lebender bestrahlter Zellen, die vorübergehend in dem immunisierten Individuum überleben und solchermaßen die Präsentierung erlauben, können in einem verbesserten Primen der Immunreaktion resultieren.
In einer weiteren Ausführungsform wird in Erwägung gezogen, dass die Zellen mit Genen, die immunstimulatorische Verbindungen, wie IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, γ-Interferon oder GMCSF, kodieren, transformiert werden. Diese Produkte können lokal auf die Verstärkung der Erkennung der Impfstoff-Zellen durch das Immunsystem einwirken. Sie können auch für eine systemischere Wirkung sorgen, die andere Aspekte der Immunreaktion verstärkt.
DNA-Sequenzen, die für die Transformation von Zellen nützlich sind, können aus Standardplasmiden in Expressionsvektoren mit Eigenschaften kloniert werden, die höhere Grade von oder eine wirkungsvollere Expression der von den DNA-Sequenzen kodierten Polypeptide erlauben. Dies würde zumindest eine eukaryotische Promotorsequenz benötigen, welche die Transkription der inserierten DNA-Sequenzen initiiert. Ein bevorzugter Expressionsvektor ist einer, in dem die Expression auf hohe Werte induzierbar ist. Dies wird durch die Hinzufügung einer regulatorischen Region erreicht, welche für eine erhöhte Transkription der stromabwärts gelegenen Sequenzen unter einer geeigneten Stimulation sorgt. Expressionsvektoren können integrativ (Retrovirus) oder episomal (bovines Papillomavirus) sein.
Expressionsvektoren werden mit jeder beliebigen Standard-DNA-Transfertechnik in Zellen transferiert. Calciumphosphat-Transformation, Protoplastenfusion, Lipofektion oder Elektroporation sind die bevorzugten Mechanismen für den Transfer des Vektors in Zellen. In den meisten Situationen wird es wünschenswert sein, ein selektierbares Markergen mit einzubauen, wenn Zellen transformiert werden. Wenn Zellen unter selektiven Bedingungen kultiviert werden, ist es bei den überlebenden Zellen viel wahrscheinlicher, dass sie das Gen von Interesse zusammen mit dem selektierbaren Marker aufgenommen und exprimiert haben. Alle oben genannten Verfahren sind in der Fachwelt wohlbekannt.
Die DNAs, die für die Transformation der Wirtszellen verwendet werden, umfassen vorzugsweise eine Sequenz, die für die Expression des kodierten Produkts in einer gegebenen Zelle optimiert wurde. Daher wird es in manchen Fällen wünschenswert sein, dass die zu exprimierende Nukleotidsequenz eine cDNA ist, während in anderen Situationen es bevorzugt sein wird, genomische Sequenzen zu verwenden. Die Codon-Degenerierung der meisten Aminosäuren bedeutet, dass andere Nukleotidsequenzen als die cDNA oder die genomischen Sequenzen für ein gegebenes Gen das erwünschte Polypeptid kodieren können.
Es ist möglich, dass die Verwendung von MHC- und viralen Antigenen zusammen sich als der beste Mechanismus für die Induktion einer schützenden Immunreaktion im Allgemeinen erweisen wird, und nicht bloß als ein Mechanismus, den Schutz von Individuen vor einem Virus oder vor Zellen, die aus Individuen mit ähnlichen Allotypen stammen, sicherzustellen. In solch einem Fall wird es bevorzugt sein, dass Zelllinien, die ein oder mehrere virale Antigene exprimieren, für jeden einzelnen Allotyp, der in dem Impfstoff erwünscht ist, hergestellt werden. Alternativ kann es möglich sein, Zellen herzustellen, die sowohl multiple Allotypen als auch virale Antigene exprimieren.
Es wird auch in Erwägung gezogen, dass Zellmembran-Präparationen als Impfstoff-Substanz verwendet werden können. Da viele MHC-Moleküle membrangebunden sind, könnte die Verwendung von Membranpräparationen als eine alternative Quelle von MHC-Antigen verwendet werden, die dem Individuum verabreicht wird, und man würde auch nicht erwarten, dass dies die Struktur höherer Ordnung solcher Membran-gebundener Moleküle substantiell ändern würde. Ferner können die MHC-Moleküle auch mittels rekombinanter genmanipulatorischer Techniken hergestellt werden, da viele der MHC-Antigene kloniert sind.
Theoretisch kann jeder beliebige Zelltyp verwendet werden. Bevorzugte Eigenschaften für Zellen beinhalten die Fähigkeit, gut in Gewebekultur zu wachsen, eine große Menge von MHC Klasse I und II-Antigenen aufzuweisen, leicht mit Genen für virale Antigene transduzierbar zu sein und gegenüber Bestrahlung empfindlich zu sein, die sie unfähig machen wird, längere Zeit im neuen Wirt zu wachsen. Sie müssen frei von exogenen sekundären Viren sein.
Als ein allgemeiner Vorschlag werden Zellen so ausgewählt, dass die repräsentativen HLA-Typen der Zielpopulation in den Zellen vorhanden sein werden. Zellen können durch Punktierungsbiopsien aus Patienten in der Zielpopulation gewonnen und mittels Standardprotokollen typisiert werden. Alternativ können bösartige Zellen aus Biopsien von Patienten innerhalb der Zielpopulation auf Grund ihres besseren Wachstums in Kultur verwendet werden. Eine weitere mögliche Quelle für normale oder bösartige Zellen ist eine Hinterlegungsstelle für Zellen wie die American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA).
Die ausgewählten Zelllinien werden auf Sekundärinfektionen mit viralen Pathogenen mittels Standardassays (Immunocytochemie, Elektronenmikroskopie, etc.) durchmustert. Zellen werden unter Verwendung von Standardtechniken kultiviert, die an die einzelnen Zelllinien angepasst sind. Wenn eine ausreichende Anzahl von Zellen verfügbar ist, werden die Zellen mit etwa 10.000 bis 15.000 rad bestrahlt um die Zellen zu inaktivieren, was ihre Replikation nach der Verabreichung verhindert. Eine passende Anzahl von Zellen ist zwischen 8 und 10 Millionen pro Verabreichung.
Die 1 bis 3 stellen Listen von HLA-Allotypen und ihrer Verteilungsfrequenz in Volksgruppen bereit. Es ist eine Frage von Routineexperimenten, die nötigen Allotypen zu identifizieren und geeignete Zelllinien auszuwählen, welche die richtigen Antigene bereitstellen. Schätzungsweise werden für die meisten Populationen nicht mehr als drei oder vier Zelllinien nötig sein, um einen Impfstoff bereitzustellen, der 100% der HLA-Antigene der Zielpopulation umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßer Impfstoff ganze Melanomzellen, die bestrahlt wurden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beinhalten die Melanomzellen drei humane Melanom-Zelllinien (M-10VACC, M-24VACC und M-101VACC), die nach einer sorgfältigen Untersuchung auf die hohe Expression bestimmter MHC-Antigene aus einer Reihe von Melanom-Zelllinien ausgewählt wurden, und die kultiviert und für die Verabreichung wie in Hoon et al. (1990) präpariert wurden.
I. Verabreichungsverfahren
Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Impfstoff-Zusammensetzungen wird über jeden üblichen Weg stattfinden, einschließlich oral, nasal, bukkal, rektal, vaginal oder topisch. Alternativ wird die Verabreichung mittels intradermaler, subkutaner, intramuskulärer, intraperitonealer oder intravenöser Injektion stattfinden. Impfstoff-Zusammensetzungen werden normalerweise als pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen verabreicht, die physiologisch verträgliche Träger, Puffer oder andere Hilfsstoffe enthalten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden vorteilhafterweise in Form von injizierbaren Zusammensetzungen entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen verabreicht; feste Formen, die vor der Injektion für die Lösung oder Suspension in Flüssigkeit geeignet sind, können ebenfalls zubereitet werden. Diese Zubereitungen können auch emulgiert werden. Eine übliche Zusammensetzung für einen solchen Zweck umfasst einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Z. B. kann die Zusammensetzung etwa 100 mg humanes Serumalbumin pro Milliliter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung enthalten. Andere pharmazeutisch verträgliche Träger beinhalten wässrige Lösungen, nichttoxische Hilfsstoffe, einschließlich Salzen, Konservierungsstoffen, Puffern und ähnliches, können auch verwendet werden. Beispiele für nicht-wässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöl und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat. Wässrige Träger beinhalten Wasser, Alkohol/wässrige Lösungen, Kochsalzlösungen, parenterale Vehikel, wie Natriumchlorid, Ringer-Dextrose, etc. Intravenöse Vehikel beinhalten Fluid und Nährstoffergänzer. Konservierungsstoffe beinhalten antimikrobielle Wirkstoffe, Antioxidantien, chelierende Wirkstoffe und inerte Gase. Der pH und die exakte Konzentration der verschiedenen Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzung werden gemäß wohlbekannter Parameter eingestellt.
Zusätzliche Formulierungen, die für eine orale Verabreichung geeignet sind. Orale Formulierungen beinhalten solch typische Hilfsstoffe, wie pharmazeutische Präparationsgrade von Mannitol, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat und Ähnliches. Die Zusammensetzungen liegen in Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Retard-Formulierungen oder Pulvern vor.
Der Ausdruck „Einheitsdosis" bezeichnet physikalisch eigenständige Einheiten, die für die Verwendung bei Menschen geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge der Impfstoff-Zusammensetzung beinhaltet, die so berechnet ist, dass sie die erwünschte Immunreaktion bei ihrer Verabreichung hervorruft, d. h. der geeignete Träger, Verabreichungsweg und das Behandlungsschema. Die zu verabreichende Menge, sowohl in Bezug auf die Anzahl der Behandlungen als auch in Bezug auf die Einheitsdosis, hängt vom zu behandelnden Individuum, dem Vermögen des Immunsystems des Individuums zu reagieren und vom erwünschten Schutz ab. Genaue Mengen der Impfstoff-Zusammensetzung hängen ebenfalls von der Einschätzung des Arztes ab und sind für jedes Individuum spezifisch. Geeignete Dosisbereiche liegen in der Größenordnung von 0,001 bis 10 mg des aktiven Bestandteils. Geeignete Behandlungsschemata für die erste Verabreichung sowie für Wiederholungsimpfungen variieren ebenfalls, bestehen jedoch typischerweise in einer Immunisierung am Tag 0, 14, 28 und alle 6 bis 12 Monate danach.
J. Ein Muster-Impfstoff
Ein Modell-Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Melanomzell-Impfstoff, auch als „MCV" bezeichnet. Dieser Impfstoff besteht aus drei Melanomzelllinien, von denen bekannt ist, dass sie wirkungsvolle Konzentrationen von MHC-Antigenen enthalten, die in der Lage sind, Reaktionen gegen eine Vielzahl von HLA-Allotypen zu induzieren, welche einen großen Anteil der humanen MHC Klasse I-Gene repräsentieren. Darüber hinaus enthält das MCV sechs Melanom-assoziierte Antigene, hierin auch als „MAA" bezeichnet. Von diesen MAAs, die drei Ganglioside (GD2, GM2 und O-Acetyl-GD3) und drei Proteinantigene (ein Lipoprotein M-TAA, M-fötales Antigen und M-Harnantigen) enthalten, wurde gezeigt, dass sie in Melanompatienten immunogen sind. Diese Antigene befinden sich auf der Zelloberfläche, und von Antikörpern, die gegen sie gerichtet sind, wurde gezeigt, dass sie in vitro mit dem Komplement Melanomzellen binden und sie töten. Morton et al., Prolongation of Survival in Metastatic Melanoma After Active Specific Immunotherapy With a New Polyvalent Melanoma Vaccine, Annals of Surgery, 216: 463–482 (1992). Die Immunisierung von Patienten mit MCV, der diese Antigene enthält, induziert spezifische Immunreaktionen auf die MAA.
Um den Nutzen von MCV in Patienten mit fortgeschrittenem metastatischem Melanom zu bewerten, wurde eine Phase II-Versuchsreihe unternommen. Patienten, die diesen Impfstoff erhalten haben, haben signifikant länger überlebt als Patienten, die zuvor mit anderen Therapieschemata von Immunotherapie oder Chemotherapie behandelt wurden. Der Impfstoff wurde Patienten mit Melanom verabreicht, das auf regional abgegrenzte Haut- und subkutane Stellen (AJCC-Stadium IIIA) sowie auf entfernte Stellen (AJCC-Stadium IV) metastasisch ist. Verglichen mit vorhergehenden Versuchen, war der neue Impfstoff bedeutend wirkungsvoller bei der Hervorrufung spezifischer humoraler und Zell-vermittelter Immunreaktionen. Die Patienten, die mit dem neuen polyvalenten MCV behandelt wurden und die hohe Konzentrationen an humoralen Antikörper- und/oder Zell-vermittelten Immun-Reaktionen entwickelten, wiesen im Vergleich zu nicht-reagierenden Patienten ein verlängertes Überleben auf.
J. Beispiele
Beispiel 1: Melanomzell-Impfstoff
Das aktive spezifische Immuntherapieprotokoll beinhaltet die Immunisierung von Individuen mit bestrahlten Ganzzell-MCV. MCV besteht aus drei humanen Melanomzelllinien (M-10VACC, M-24VACC und M-101 VACC), die nach einer sorgfältigen Untersuchung auf die hohe Expression von Melanom-assoziierten Antigenen aus einer Reihe von Melanomzelllinien ausgewählt wurden, und die kultiviert und für die Verabreichung wie in Hoon et al. (1990) präpariert wurden.
Die HLA-Typen der drei Zelllinien im MCV sind in Tabelle V dargestellt. Es ist anzumerken, dass die kreuzreagierenden Allele für den A-Locus wahrscheinlich in 120% der kaukasischen Bevölkerung und die für den B-Locus in 70% der Bevölkerung vorhanden sind.
Ein unabhängiges Labor untersuchte das MCV auf virale (HIV, Hepatitis), bakterielle und pilzliche infektiöse Organismen. Gleiche Mengen jeder Linie wurden zu insgesamt 24 × 10⁶ Zellen in serumfreiem Medium zusammengefasst, das 10% Dimethylsulfoxid enthält, und in flüssigem Stickstoff kryo-konserviert. Nach der Kryo-Konservierung wurden die Zellen mit 100 Gy bestrahlt.
TABELLE V HLA-Typen von MCV
Vor der Behandlung wurde MCV aufgetaut und dreimal in RPMI 1640-Medium gewaschen. MCV wurde intradermal in die Achsel- und Leistengegend injiziert, wobei das folgende Verabreichungsschema eingehalten wurde: zuerst 2-wöchentlich dreimal, anschließend monatlich ein Jahr lang. Bei den ersten beiden Behandlungen wurde MCV mit dem Stamm BCG (8 × 10⁶ Organismen) gemischt. Nach einem Jahr wurde der Immunisierungszeitraum auf viermal alle 3 Monate, anschließend alle 6 Monate erhöht. Anschließende klinische und Laboruntersuchungen wurden monatlich wiederholt.
Die Antikörperreaktion auf Oberflächenantigene der Melanomzellen nach der MCV-Immunisierung wurde durch einen indirekten Membran-Immunfluoreszenz(IMIF)-Assay, wie in Morton et al., Surgery 64: 233–240 (1968); Jones et al., J. Nat'l Cancer Inst. 66: 249–254 (1981) beschrieben, bewertet.
Die verzögerte Haut-Hypersensitivität (Delayed Cutaneous Hypersensitivity, DCH) wurde mittels intradermaler Hauttests mit MCV vor und während der Therapie gemessen. Ein Zehntel der vereinigten MCV (2,4 × 10⁶ Zellen) wurde an einer weiter entfernt gelegenen Stelle am Unterarm verabreicht. Nach 48 Stunden wurde der durchschnittliche Durchmesser der Induration als DCH-Reaktion verzeichnet. Um die Absolutwerte der DCH aus Woche 0 bis Woche 4 und bis Woche 16 zu vergleichen, wurde der t-Test nach Student verwendet.
Die allgemeine Immunkompetenz wurde mittels Sensibilisierung gegenüber und Reizung mit DNCB sowie der Reaktion auf übliche Hauttest-Antigene, wie Mumps und Candida, bewertet. Die Reaktionen auf gereinigtes Protein-Derivat-Antigen (PPD), gegen welches der Patient als Ergebnis der Immunisierung mit BCG im Impfstoff sensibilisiert wird, dienen als zusätzliche Kontrollen. Die gemischte Lymphozyten-Tumorzellreaktion (MLTR) wurde verwendet, um die in vitro-Reaktion auf die Immunisierung zu bewerten. PBLs aus den Wochen 0, 4 und 16 wurden isoliert und kryo-konserviert. Untersuchungen wurden mit den kryo-konservierten Lymphozyten ausgeführt, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen. Serielle Blutungs-PBL wurden gleichzeitig aufgetaut, gewaschen und in Kulturmedium (RPMI 1640 mit 10% humanem AB-Serum (hitzeinaktiviert) (Irvine Scientific, CA, USA)) resuspendiert.
MCV wird, wenn es alleine verabreicht wird, im Wesentlichen ohne signifikante Toxizität vertragen, wenn es bis zu 5 Jahre lang in 3-Monats-Abständen verabreicht wird. Ein Großteil der Patienten bemerkt schwache Erytheme und Juckreiz an den behandelten Stellen. Dies ist vorübergehend und verbleibt nur 2–3 Tage. Etwa 15% der Patienten berichten von geringem Fieber von < 99°F (37,2°C) für 12 bis 24 Stunden. Ein ähnlich großer Anteil der Patienten berichtet von schwacher Müdigkeit ein bis zwei Tage nach der Behandlung mit MCV alleine. Von Muskel- und Gelenkschmerzen wird selten berichtet. Wenn es mit BCG gemischt wird, werden an den Injektionsstellen häufig Ulzerationen gesehen.
Beispiel 2: Induktion von Antikörpern, die mit Influenza A und B reaktiv sind
Wir haben die kodierten Seren von Patienten, die mit diesem MCV immunisiert wurden, auf Antikörper getestet, die in einem ELISA-Blindversuch mit Influenza A und Influenza B reaktiv sind, wobei als eine Kontrolle aus dem Zeitraum vor der Immunisierung stammende Seren verwendet wurden. Die Daten sind in Tabelle I zusammengefasst. Wir haben herausgefunden, dass 81% der Patienten nach der Immunisierung mit MCV eine im ELISA erhöhte serologische Reaktivität auf Influenza A von mindestens 0,5 Antigen-Einheiten und 38% eine ähnlich erhöhte serologische Aktivität auf Influenza B zeigten. Man glaubt, dass diese erhöhte Aktivität einen Sekundäreffekt auf die kreuzreagierenden zellulären Antigene in MCV darstellt.
TABELLE I Induktion von Antikörpern, die gegen Influenza A und B reaktiv sind
Beispiel 3: Induktion cytotoxischer Antikörper, die mit Zelloberflächen-Antigenen auf der Oberfläche peripherer Blutlymphozyten reaktiv sind, die einer Gruppe von 106 normalen Spendern entnommen wurden
Die Seren von 10 der 16 immunisierten Patienten bildeten genügend hohe Titer von Antikörpern, um gegenüber allogenen Lymphozyten aus wenigstens 20% der Testpopulation der 116 normalen Lymphozyten-Spender Cytotoxizität zu induzieren (Tabelle II), wenn sie mit einem Standard-Terasaki-Assay auf cytotoxische Antikörper getestet wurden. Sechs der 16 Individuen oder 38% bildeten Antikörper, die gegen > 50% der normalen Spender-Lymphozytpopulation cytotoxisch waren. Die Frequenz von cytotoxischen Antikörpern variierte von 20% bis 97% gegen Lymphozyten der Individuen in der Testgruppe.
Daher wird insgesamt klar, dass die Immunisierung mit MCV erfolgreich Antikörper induzierte, die im ELISA mit zellulären Antigenen reaktiv waren, die auf Influenza A- und B-Viren vorhanden sind, und die in der Lage sind, die Lyse von allogenischen Lymphozyten in 63% der immunisierten Individuen zu induzieren. Dieselben Antikörper, die in Gegenwart von Komplement in der Lage waren, die Lyse von Lymphozyten zu verursachen, würden auch in der Lage sein, die Lyse der viralen Membranen von umhüllten Viren zu verursachen, welche dieselben MHC-Alloantigene beinhalten.
TABELLE II Induktion cytotoxischer Antikörper, die mit peripheren Blutlymphozyten reaktiv sind, die einer Gruppe von 116 normalen Spendern entnommen wurden
Beispiel 4: Verhütung von Infektionen der oberen Atemwege und von Bronchial"erkältungen" bei Patienten, die den Melanom-Impfstoff erhalten
Um zu bestimmen, ob diese immunologischen Reaktionen in vitro irgendeine in vivo-Bedeutung hinsichtlich der Verhütung von Infektionen mit umhüllten Viren besitzen, wurde ein Fragebogen vorbereitet, der von 53 Melanom-Patienten ausgefüllt werden sollte, die eine oder mehrere nacheinander folgende Infektionen der oberen Atemwege oder Bronchial"erkältungen" pro Jahr entwickeln und welche die Immuntherapie mit dem Melanomzell-Impfstoff seit 9 Monaten oder länger erhalten (ein Zeitraum, der nötig ist, um adäquat gegen MHC-Alloantigene zu sensibilisieren) (Tabelle III). Wir wollten beurteilen, ob diese Immunisierung das Auftreten von Infektionen der oberen Atemwege oder Bronchialerkältungen während der Immuntherapie im Vergleich mit ihrem üblichen Auftreten von Infektionen vor der Immuntherapie beeinflusste. Es wurde herausgefunden, dass diese Patienten vor der Immuntherapie durchschnittlich 1,74 Atemwegsinfektionen pro Jahr aufwiesen, im Vergleich zu 1,11 nach der Immuntherapie. Achtundzwanzig (53%) dieser Individuen berichteten über keine Veränderung bei ihrem Auftreten solch einer Erkrankung, während 4/53 (8%) einen Anstieg der Häufigkeit von „Erkältungen" berichteten. Allerdings berichteten 21 von den 53 oder ungefähr 40% von den Individuen, insbesondere die, die 2 oder mehr Atemwegserkrankungen pro Jahr hatten, von einer Verringerung der Frequenz und Ernsthaftigkeit solcher Erkrankungen, die üblicherweise von umhüllten Viren, wie Rhinoviren, Influenza, Parainfluenzaviren, verursacht werden. Einige Individuen, insbesondere diejenigen, die vor der Immuntherapie drei oder mehr virale Infektionen pro Jahr hatten, zeigten eine dramatische Reduktion der Häufigkeit von Erkältungen und Grippeattacken.
TABELLE III Teilmenge der Individuen mit drei oder mehr Erkältungen/Grippen pro Jahr
Von den 12 Patienten, die das so häufige Auftreten von Erkältungen berichteten, berichteten 10 (83%) von einer Abnahme des Auftretens von Erkältungen, eine Person berichtete von keinen Änderungen und nur eine berichtete von einem Anstieg der Anzahl an Erkältungen. In der Gruppe, die eine Abnahme von Erkältungen und Grippe feststellte, betrug die durchschnittliche Anzahl von Erkältungen vor der Immuntherapie 4; die durchschnittliche Anzahl von Attacken, die nach der Immuntherapie auftraten, betrug 1. Siehe Tabelle IV.
TABELLE IV ZUSAMMENFASSUNG ALLER IMMUNISIERTER INDIVIDUEN
LITERATURHINWEISE
Die folgenden Literaturhinweise stellen beispielhafte prozedurale oder weitere Details bereit, welche die hierin dargestellten ergänzen.

Ausubel et al. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Chapter 8. John Wiley & Sons (1990)
Cranage, M. et al. Symposium for Nonhuman Primate Models in AIDS (PUERTO RICO), Nov. 17–20, 1992, 10 pabstract no. 113
Cranage, M. et al. Symposium for Nonhuman Primate Models in AIDS (UNITED STATES), Sept. 19–22, 1993, 11 pabstract no. 27
Finney. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Chapter 15. John Wiley & Sons, New York (1987)
Hoon et al. Cancer Research 50: 5358–5364 (1990)
Jones et al. J. Nat'l Cancer Inst. 66: 249–254 (1981)
Kion, Tracy A. and Geoffrey W. Hoffmann. Science, 253: 1138–1140 (1991)
Kiprov, D. D., et al. Science, 263: 737–738 (1994)
Langlois, Alphonse J., et al. Science, 255: 292–293 (1992)
Levine, T. P. and B. M. Chain. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 26: 439–473 (1991)
Morton et al. Surgery, 64: 233–240 (1968)
Morton et al. Annals of Surgery, 216: 463–482 (1992) Stott, E. J. Nature, 353: 393 (1991)
Townsend and Bodmer. Ann. Rev. Immunol. 7: 601–624 (1989)

Claims

Zusammensetzung umfassend intakte Zellen, wobei die Zellen Haupt-Histokompatibilitätsantigene mit mindestens vier herkömmlichen Allotypen einer gegebenen Säugetierspezies exprimieren.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Allotypen in 80% oder mehr von Individuen vorhanden sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei jede gegebene Zelle nur einen einzelnen Allotyp exprimiert.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei mindestens eine Zelle mindestens zwei Allotypen exprimiert.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Antigene Klasse I-Antigene sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Antigene Klasse II-Antigene sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Antigene sowohl Klasse I als auch Klasse II-Antigene oder andere durch polymorphe Gene kodierte Alloantigene sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Vielzahl für alle bekannten Allotypen der Säugetierspezies repräsentativ ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Allotypen mindestens einen der folgenden menschlichen Allotypen einschließen: 55 344 HLAA₁, A₂, A₃, A₁₁, A₂₄, A₂₉, A₃₂,B₇, B₈, B₁₃, B₃₅, B₃₈, B₄₄, B₅₅, B₆₀, B₆₂, CW₁, CW₂, CW₄, CW₅, CW₆, CW₇, CW₉, CW₁₀, CW₁₁, DR₁, DR₃, DR₄, DR₇, DR₈, DR₁₁, DR₁₂, DR₁₃, DR₁₅, AB0-Blutgruppen.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zellen weiterhin ein Antigen von einem umhüllten Virus exprimieren.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei der Virus ein Herpesvirus ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei der Virus ein Retrovirus ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die intakten Zellen weiterhin ein Cytokin exprimieren.
Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei das Cytokin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12; γ-Interferon und GMCSF.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die intakten Zellen weiterhin ein co-stimulatorisches Molekül exprimieren.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei das co-stimulatorische Molekül B-7 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zellen wachstumsunfähig gemacht worden sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei die Zellen letal bestrahlt werden.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, weiterhin umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff.
Zusammensetzung, umfassend (i) intakte Zellen, wobei die Zellen Haupt-Histokompatibilitätsantigene mit mindestens vier Allotypen aus der Spezies des gegebenen Säugers exprimieren; und (ii) einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff, zur Verwendung in einem Verfahren zur Erzeugung einer Immunantwort in einem gegebenen Säuger, wobei das Verfahren umfaßt: (a) zur Verfügung stellen der Zusammensetzung, (b) Verabreichen der Zusammensetzung an den gegebenen Säuger.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei die intakten Zellen weiterhin ein Antigen von einem umhüllten Virus exprimieren.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei Schritt (a) gefolgt wird von einer letalen Bestrahlung der Zellen, und Schritt (b) nach einer letalen Bestrahlung der Zellen erfolgt.
Zusammensetzung, umfassend: (i) intakte Zellen, wobei die Zellen Haupt-Histokompatibilitätsantigenen einer Vielzahl von Allotypen von der Spezies des gegebenen Säugers exprimieren; (ii) einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff. zur Verwendung in einem Verfahren zur Hervorrufung einer Immunantwort in einem gegebenen Säuger gegen einen umhüllten Virus, wobei das Verfahren umfaßt: (a) Identifizieren eines gegebenen Säugers mit einem Risiko der Infektion mit dem Virus; (b) zur Verfügung stellen der Zusammensetzung, (c) Verabreichen der Zusammensetzung an den gegebenen Säuger in einer Menge, die effektiv ist, um die Immunantwort hervorzurufen.
Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei Schritt (a) gefolgt wird von einer Bestrahlung der Zellen, und Schritt (b) nach einer Bestrahlung der Zellen erfolgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei die intakten Zellen weiterhin ein Antigen von einem umhüllten Virus exprimieren.
Zusammensetzung, umfassend intakte nicht-maligne Zellen, wobei die Zellen Haupt-Histokompatibilitätsantigene mit einer Vielzahl von Allotypen von einer gegebenen Säugetierspezies exprimieren.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, weiterhin umfassend mindestens ein rekombinantes Haupt- oder geringfügiges allotypisches Antigen der Spezies.
Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei das rekombinante Antigen in einem Wirt hergestellt wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Pilzen, Insektenzellen und Säugetierzellen.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei der Virus ein Togavirus ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei der Virus ein Rhabdovirus ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei der Virus ein Flavivirus ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei der Virus ein Coronavirus ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei der Virus ein Filovirus ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei der Virus ein Paramyxovirus ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei der Virus ein Orthomyxovirus ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei der Virus ein Bunyavirus ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei der Virus ein Arenavirus ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei der Virus ein Pockenvirus ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei der Virus ein Iridovirus ist.