DE69936337T2

DE69936337T2 - Verfahren zur entwicklung von einem hiv impfstoff

Info

Publication number: DE69936337T2
Application number: DE69936337T
Authority: DE
Inventors: Adan Sugar Land Rios
Original assignee: Adan Sugar Land Rios
Current assignee: PHOTOLMMUNE BIOTECHNOLOGY,INC., HOUSTON, TEX., US
Priority date: 1998-02-13
Filing date: 1999-02-12
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2019-02-13
Also published as: EP1056838A1; US20030129200A1; CA2323011C; ATE365206T1; US6653130B2; AU3293799A; EP1056838B1; AU764938B2; WO1999041360A1; DE69936337D1; US6383806B1; CA2323011A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf die Gebiete der Krankheitsbehandlung und -prävention. Im Besonderen betrifft sie HIV-Partikel mit inaktivierter reverser Transkriptase und den Einsatz derartiger Partikel zur Auslösung einer wirksamen immunologischen Antwort auf HIV. Diese Immunantwort verschafft Schutz gegen einen HIV-Angriff und/oder hilft dem HIV-infizierten Individuum, die Replikation des Virus zu kontrollieren.
Weltweit werden Infektionen mit dem Humanimmundefizienz-Virus 1 (HIV-1) sowohl in entwickelten als auch in sich entwickelnden Ländern verzeichnet. Infektionen mit HIV-2 treten vorherrschend in Westafrika, Portugal und Brasilien auf. Schätzungen zufolge wurden seit 1990 zwischen 800000 und 1,3 Millionen Individuen in den Vereinigten Staaten mit HIV infiziert. Ein erhebliches Hindernis bei der Entwicklung eines Impfstoffs gegen HIV besteht darin, dass der Mechanismus der Immunität gegen eine HIV-Infektion schlecht verstanden wird. Nicht alle der infizierten Individuen entwickeln das erworbene Immundefektsyndrom (AIDS/Acquired Immunodeficiency Syndrome). In der Tat lassen jüngste Berichte vermuten, dass es bestimmte Individuen gibt, die gegen eine Infektion mit HIV-1 resistent sind.
Die HIV-Viren gehören zur Familie der Retroviridae und werden insbesondere der Unterfamilie der Lentivirinae zugeordnet. Wie bei fast allen anderen Viren beinhalten die Replikationszyklen der Familienmitglieder der Retroviridae, die gemeinhin als Retroviren bekannt sind, das Anhaften an spezifische Zellrezeptoren, das Eindringen in Zellen, die Synthese von Proteinen und Nukleinsäuren, die Anhäufung von Nachkommenvirenpartikeln (Virionen) und die Freisetzung von Nachkommenviren aus den Zellen. Einen einzigartigen Aspekt der Retrovirusreplikation stellt die Wandlung des einzelsträngigen RNA-Genoms zu einem doppelsträngigen DNA-Molekül dar, das sich vor der Synthese viraler Proteine und Nukleinsäuren in das Genom der Wirtszelle integrieren muss.
Retrovirusvirionen sind umhüllt und enthalten zwei Kopien des Genoms. Für die Wandlung der genomischen RNA zu DNA sorgt die reverse Transkriptase (RT) des viralen Proteins. Dieses Protein ist an das RNA-Genom innerhalb des Virions gebunden, und es wird angenommen, dass die enzymatische Wandlung des Genoms zu DNA nach dem viralen Eindringen in die Wirtszelle stattfindet. Allerdings lassen neueste Anhaltspunkte vermuten, dass der Wandlungsprozess in den Virionpartikeln selbst beginnen kann, was als endogene reverse Transkription bekannt ist, und dass ERT bei einer Steigerung der Infektivität des Virus bei sexueller Übertragung von Bedeutung sein kann (Zhang, u.a., 1993, 1996).
Aufgrund dessen, dass reverse Transkription im viralen Replikationszyklus notwendig ist, werden Verbindungen, welche die RT-Aktivität stören, als therapeutische Mittel gegen HIV eingesetzt. Viele dieser Verbindungen, einschließlich 3'-azido-2', 3'-Dideoxythymidin (AZT), sind Nukleosidanaloge, die bei Aktivierung durch Kinasen der Wirtszelle, kompetitive Inhibitoren reverser Transkriptase darstellen (Furman, u.a., 1986). Weitere anti-RT-Verbindungen sind Nicht-Nukleosid-Inhibitoren (NNI), also hydrophobe Verbindungen, die keine zelluläre Modifikation zur antiviralen Aktivität benötigen. Zu den Beispielen für derartige Verbindungen zählen Nevirapin (Grob, u.a., 1992; Merluzzi, u.a., 1990), die Pyridinone (Carroll, u.a., 1993; Goldmau, u.a., 1991) und die Carboxanilide (Bader, u.a., 1991; Balzarini, u. a., 1995, 1996). Bezüglich des Nevirapinanalogs 9-Azido-5,6-dihydro-11-ethyl-6-methyl-11H-pyrido[2,3-b][1,5]benzodiazepin-5-on (9-AN) und des Carboxanilidanalogs N-[4-chloro-3-(3-methyl-2-butenyloxy)phenyl]-2-methyl-3-furancarbothiamid (UC781^TM) wurde nachgewiesen, dass sie stark wirksame Inhibitoren von RT sind. In Bezug auf 9-AN erwies es sich zur RT-Hemmung als besonders wirkungsvoll, ein Gemisch aus dieser Verbindung und RT ultravioletter Strahlung auszusetzen. Aus der Reihe der Carboxanilidverbindungen wurde UC781^TM für besonders effizient befunden (Barnard, u.a., 1997). Das Hinzufügen einer photoreaktiven Markierung zu UC781^TM sollte dessen Fähigkeit zur Inaktivierung von HIV-RT weiter steigern, wenn ein Gemisch aus UC781^TM und RT ultravioletter Strahlung ausgesetzt würde. Die Bestrahlung eines Gemischs, das sich aus einem photomarkierten NNI der RT und aus RT zusammensetzt, stellt einen Typ der Photoinaktivierung dar.
Die Bindungsaffinität und die inhibitorische Wirkung von UC781^TM sind so hoch, dass die Verbindung in der Lage war, die HIV-Infektivität im Anschluss an kurzes Aussetzen des isolierten Virus gegenüber UC781^TM zu eliminieren, ohne dass eine Photoinaktivierung erforderlich war (Borkow, u.a., 1997). Des Weiteren wurde dargelegt, dass diese Verbindung ERT in HIV-Virionen hemmt und dass sie bei Verabreichung an HIV-infizierte Zellen die Produktion nichtinfektiöser naszenter Viren bewirkte (Borkow, u.a., 1997). Deshalb scheint UC781^TM ein besonders starker Inaktivator von HIV zu sein. Obwohl UC781^TM zur Verwendung in retroviralen Formulierungen vorgeschlagen wurde (Borkow, u.a., 1997), ist sein Einsatz als Photoinaktivator von HIV zum Zweck der Herstellung eines Impfstoffes dem Stand der Technik nicht entnehmbar.
Die Immunantwort auf HIV besteht aus einer initialen zellvermittelten Immunantwort, gefolgt von der anschließenden Entwicklung neutralisierender Antikörper. Innerhalb von Wochen nach der Infektion sinken Virustiter im Blut in Übereinstimmung mit der Induktion zellulärer und humoraler anti-HIV-Immunantworten. Der Rückgang der Virämie steht in guter Korrelation mit dem Auftreten anti-HIV-Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Klasse-1-restringierter CD8⁺ cytotoxischer T-Zellen (Haynes, u.a., 1996). Neueste Anhaltspunkte zeigen eine starke Korrelation von anti-HIV-CD4⁺-T-Zellen-Antworten und reduzierten viralen Lasten (Rosenberg, u.a., 1997). Deshalb kann die Präsentation von HIV-Antigenen im Kontext von MHC-Klasse-II-Molekülen gegenüber CD4⁺-T-Zellen den Schlüsselaspekt für die Kontrolle der HIV-Infektion darstellen.
Rosenberg, u.a. (1997) suggeriert, dass bei einer HIV-1-Infektion HIV-spezifische CD4⁺-Zellen selektiv eliminiert werden können. Dies kann bedingt sein durch die Aktivierung dieser Zellen während hochgradiger Virämie, wobei deren Anfälligkeit für eine Infektion erhöht wird (Weissman, u.a., 1996; Stanley, u.a., 1996) oder durch aktivierungsinduzierten Zelltod während der primären Infektion (Abbas, 1996). Nichtsdestoweniger können, bei Stärkung der Antwort virusspezifischer CD4⁺-T-Zellen ohne Infektion oder Zerstörung, die antwortenden Zellen ein wirksames Mittel zur Kontrolle viraler Lasten darstellen. Deshalb können einige vorhandene HIV-Impfstoffe unwirksam sein, weil sie keine Präsentation von HIV-Peptiden im Kontext von MHC-Klasse-II durch Antigene aufweisende Zellen verschaffen.
Aus historischer Sicht haben sich virale Impfstoffe als äußerst erfolgreich bei der Prävention einer Infektion durch ein bestimmtes Virus erwiesen. Deshalb herrschte zu jenem Zeitpunkt, als HIV zum ersten Mal isoliert wurde, großer Optimismus, dass die Entwicklung eines HIV-Impfstoffs schnell erfolgen würde. Allerdings ließ dieser Optimismus rasch nach, weil eine Anzahl unvorhergesehener Probleme auftrat. Eine Erörterung der Probleme, die für einen Impfstoff gegen HIV zu überwinden sind, ist in Stott und Schild (1996) dargelegt und hierin durch Bezugnahme eingegliedert.
Erstens handelt es sich bei HIV um ein Retrovirus; somit wird während seines Wachstumszyklus provirale DNA in das Wirtsgenom integriert. In dieser Form ist das Virus gegen die Immunantwort des Wirts effizient geschützt, und dieses Merkmal des Virus weist darauf hin, dass eine wirksame Schutzimpfung idealerweise die initiale Interaktion zwischen Virus und Zelle im Anschluss an die Übertragung verhindern muss. Nur wenige, falls überhaupt irgendwelche, der gegenwärtig verfügbaren viralen Impfstoffe, die gegen andere Infektionen erfolgreich sind, erzielen diese Stufe des Schutzes. Zweitens visiert HIV spezifisch T-Helfer-Lymphocyten an, die eine wesentliche Komponente der Immunantwort bilden, und zerstört diese. Drittens ist das Virus zu äußerst schneller antigener Variation fähig, was ihm ermöglicht, den Immunantworten zu entkommen. Viertens kommt die Mehrheit der Infektionen auf sexuellem Weg via die genitalen oder rektalen Schleimhäute zustande, und allgemeiner Auffassung zufolge sind auf diesem Weg eintretende Infektionen nur schwer durch Impfung zu verhindern. Schließlich kann die Infektion durch virusinfizierte Zellen übertragen werden, in welche die provirale DNA integriert ist und in welchen virale Antigene nicht ausgedrückt werden. Eine solche Zelle würde durch Immunreaktionen auf virale Proteine nicht erkannt werden und somit unerkannt bleiben. Nur wenige Daten sind verfügbar, die angeben, wie bedeutsam diese Übertragungsweise in der Gesamtepidemiologie von HIV-1 ist. Nichtsdestoweniger stellt diese einen potentiellen Weg dar, und zwar einen, von dem einige Fachleute annehmen, dass er sich nicht durch eine Schutzimpfung blockieren lässt (Sabin, 1992).
Zu den Arten von HIV-Impfstoffen zählen Impfstoffe mit inaktivierten Viren, Lebendimpfstoffe mit attenuierten Viren, Virus-Untereinheiten-Impfstoffe, Impfstoffe mit synthetischen Partikeln und Impfstoffe mit nackter DNA; diese Impfstoffe sind in Stott und Schild (1996), Schultz (1996) und Johnston (1997) erörtert. Mehrere dieser Impfstoffe werden bereits in Versuchen am Menschen getestet.
Der erste Hinweis darauf, dass eine Impfung gegen Immundefizienzviren realisierbar ist, stammt aus frühen Versuchen, in denen die Verwendung einfacher inaktivierter Viren die Entstehung der Krankheit verhinderte, wenn Tiere diesen nach ihrer Impfung ausgesetzt wurden (Desrosiers, u.a., 1989; Sutjipto, u.a., 1990). Diese Ergebnisse wurden durch Murphey-Corb, u.a. (1989) bestätigt und erweitert, der nachgewiesen hat, dass die meisten Tiere, die mit einem Formalin-inaktivierten Virus immunisiert wurden, gegen eine Infektion mit SIV geschützt waren. Ahnliche Resultate wurden anschließend durch mehrere Laboratorien erzielt, welche virusinfizierte Zellen (Stott, u.a., 1990) oder ein teilweise gereinigtes Virus benutzt haben, die bzw. das durch Aldehyde (Putkonen, u.a., 1991, 1992; Johnson, u.a., 1992a; Le Grand, u.a., 1992),_-Propiolacton (Stoff, u.a., 1990), Detergens (Osterhaus, u.a., 1992) oder Psoralin und UV-Licht (Carlson, u.a., 1990) inaktiviert war(en). Mehrere unterschiedliche Isolate von SIV oder daraus abgeleitete infektiöse molekulare Klone wurden zur Herstellung des Impfstoffs und zum Angriff auf die Viren eingesetzt. Auch eine breite Vielfalt von Adjuvanzien wurde verwendet. Geimpfte Makaken waren jederzeit gegen eine Infektion durch intravenöse Herausforderung mit zwischen 10–50 MID₅₀ (Affen-Infektionsdosen 50%) geschützt. Das Infektionsvirus konnte nicht aus dem Blut oder den Geweben der geschützten Tiere zurückgewonnen werden, selbst wenn diese über längere Zeiträume von über einem Jahr beobachtet wurden. Noch beeindruckender war, dass der Nachweis proviraler DNA in den Lymphozyten geschützter Tiere fehlschlug, was darauf hinwies, dass das angreifende Virus nicht integriert worden war (Stoff, u.a., 1990; Johnson, u.a., 1992a). Somit war es eindeutig, dass die Impfstoffe mit inaktivierten Viren eine starke Schutzantwort bei den Makaken ausgelöst hatten. Der durch das inaktivierte SIV herbeigeführte Schutz bei Makaken wurde unglücklicherweise bei mit inaktiviertem HIV geimpften und mit HIV-1 herausgeforderten Schimpansen nicht reproduziert (Warren und Dotshahi, 1993).
Verfahren zur Photoinaktivierung von HIV sind aus dem Stand der Technik bekannt und Gegenstand mindestens dreier Patente. US-Patent 5,041,078 beschreibt den Einsatz von Sapphyrinen bei der photodynamischen Inaktivierung von Viren, einschließlich HIV. Die US-Patente 5,516,629 und 5,593,823 erläutern die Anwendung von Psoralenen und ultraviolettem Licht zur Inaktivierung von HIV. Psoralene sind natürlich vorkommende Verbindungen, die in Asien und Afrika seit Tausenden von Jahren therapeutisch genutzt werden. Ein Psoralen bindet an Nukleinsäuredoppelhelices durch Interkalation zwischen Basenpaare. Es wurde gezeigt, dass nach Absorption von UVA-Photonen Psoralen in erregtem Zustand mit einer Thymin- oder Uracil-Doppelbindung reagiert und sich kovalent an beide Stränge einer Nukleinsäurehelix haftet. Die Crosslinking-Reaktion ist spezifisch für eine Thymin (DNA) oder Uracil (RNA) -Base und schreitet nur dann voran, wenn das Psoralen an einer Stelle interkaliert wird, welche Thymin oder Uracil enthält. Das Anfangsphotoaddukt kann ein zweites UVA-Photon absorbieren und mit einem zweiten Thymin oder Uracil auf dem gegenüberliegenden Strang der Doppelhelix reagieren, damit ein Crosslinking der beiden Stränge der Doppelhelix erfolgt.
Lethaler Schaden an einer Zelle oder einem Virus tritt auf, wenn ein Psoralen, das in einen Nukleinsäure-Duplex an Stellen, die zwei Thymine (oder Uracile) auf gegenüberliegenden Strängen enthalten, interkaliert wird, sequentiell 2 UVA-Photonen absorbiert. Dies stellt ein effizientes Verfahren dar, weil zwei Ereignisse mit geringer Wahrscheinlichkeit erforderlich sind, nämlich die Lokalisierung des Psoralens an Stellen mit zwei vorhandenen Thyminen (oder Uracilen) und dessen sequentielles Absorbieren von 2 UVA Photonen.
Auch Versuche, Viren mithilfe von Photosensibilisatoren und Licht zu inaktivieren, wurden entwickelt, wobei einige Photosensibilisatoren eingesetzt wurden, bei denen es sich nicht um Psoralen handelt. Typischerweise sind die verwendeten Photosensibilisatoren Farbstoffe. Zu den Beispielen dafür zählen Dihematoporphyrinether (DHE), Merocyanin 540 (MC540) und Methylen-Blue.
Carlson, u.a. (1990) hat nachgewiesen, dass ein Impfstoff mit Psoralen-inaktiviertem ganzem SIV (die Entsprechung beim Affen zu HIV) gegen Low-Challenge-Dosen von SIV schützen und einen frühen Tod bei jenen Affen verhindern kann, die infiziert werden, was darauf hindeutet, dass inaktiviertes HIV ein wirksamer Impfstoff beim Menschen sein kann. Da jedoch die Photoinaktivierung mithilfe von Psoralenen von zwei seltenen Ereignissen abhängt, ist ein effizienteres Verfahren zur Inaktivierung vorzuziehen, damit die Wahrscheinlichkeit eines Lebendvirus in einer Probe verringert wird. Ferner verändern diese Verfahren die antigene Konformation von HIV und beeinträchtigen die Produktion einer wirkungsvollen immunologischen Antwort.
Aufgrund früherer Erfolge bei der Prävention viraler Krankheiten mithilfe von Untereinheiten-Impfstoffen, attenuierten viralen Lebendimpfstoffen und inaktivierten viralen Impfstoffen war die wissenschaftliche Gemeinschaft anfänglich optimistisch, dass ein Impfstoff entwickelt würde, der die Ausbreitung von HIV verhindert. Jedoch schwand der frühe Optimismus bald infolge der wiederholten Misserfolge bei der Entwicklung eines wirksamen Impfstoffes.
Untereinheiten-Impfstoffe sind zwar äußerst sicher, aber hinsichtlich der Palette von Antigenen begrenzt, die dem Immunsystem präsentiert werden, da nur eines oder ein paar der viralen Proteine in dem Impfstoff benutzt wird bzw. werden. Dies kann die Wahrscheinlichkeit sog. Crossprotection zwischen HIV-Clades einschränken. Überdies erfordert die Herstellung von Untereinheiten-Impfstoffen die molekulare Manipulation der viralen Proteine in Cloning- oder Expressionsvektoren, was unter Umständen zu längerer Produktionsdauer und erhöhten Produktionskosten führt.
Attenuierte HIV-Lebendimpfstoffe können ebenfalls molekulare Manipulationen bei ihrer Herstellung erfordern, obwohl spontane attenuierte Viren natürlich auftreten können. Bei attenuierten HIV-Impfstoffen sind Deletionen in der nef-Region des Virus enthalten. Mutanten-nef-SIV-Impfstoffe zeigten sich anfänglich bei Primaten vielversprechend, jedoch wurde rasch nachgewiesen, dass diese Impfstoffe in der Lage waren, bei neugeborenen Tieren eine Erkrankung zu verursachen. Darüber hinaus deuten neueste Beweise darauf hin, dass diese Impfstoffe bei erwachsenen Affen die AIDS-Erkrankung verursachen können (Cohen, 1997). Deshalb macht der Mangel an einem einwandfreiem Verständnis von HIV und seiner Pathogenese die Verwendung attenuierter Viren zu einem risikoreichen Unterfangen.
Inaktivierte virale Impfstoffe verschaffen eine größere Zahl an Antigenen, die dem Immunsystem präsentiert werden, und deshalb einen höheren Grad an Schutz vor HIV; zudem ist die Wahrscheinlichkeit größer, dass der Schutz HIV-Clades übergreift. Des Weiteren verlangen die inaktivierten viralen Impfstoffe keine molekulare Manipulation von HIV und können im Wesentlichen an jedem Stamm vorgenommen werden. Da sich die Inaktivierung des Virus in vitro und in Tiermodellen schnell nachweisen lässt, können die inaktivierten HIV-Impfstoffe zeitgerecht getestet werden, um die Effizienz der Inaktivierung zu bestimmen. Dagegen kann bei attenuierten Viren die Bestimmung der Impfstoffeffizienz Jahre in Anspruch nehmen.
Zwecks sicherer Verabreichung von Impfstoffen an den Menschen sind bei deren Herstellung effiziente Verfahren zur Inaktivierung von HIV erforderlich. Die bekannten Verfahren zur Inaktivierung umfassen den Gebrauch von Aldehyden, _-Propiolacton, Psoralen und UV-Licht, u.a., einschließlich Detergenzien. Viele dieser Verfahren verändern die Konformation des Virus, wodurch sich auch die Spezifität der Immunantwort auf den Virus ändert. Zwar verändert die Photoinaktivierung von HIV mithilfe von Psoralen und UV-Licht die Konformation des Virus nicht, aber sie stellt ein uneffizientes Inaktivierungsverfahren dar. Deshalb wären wirkungsvollere Inaktivierungsverfahren, welche die Konformation des Virus nicht beeinflussen, ideal für den Einsatz bei Herstellung eines HIV-Impfstoffs.
Dem Stand der Technik sind keine HIV-Impfstoffe entnehmbar, die mittels eines effizienten Verfahrens zur Inaktivierung von HIV erzeugt werden, ohne dass eine Deformation des viralen Partikels verursacht wird. Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung wird mithilfe effizienter Inaktivierungsverfahren hergestellt, welche die Konformation des Virus nicht im gleichen Ausmaß verändern wie andere Inaktivierungsverfahren. Deshalb mimt der Impfstoff der vorliegenden Erfindung zwar infektiöse HIV-Partikel, verursacht aber keine Infektion (d.h. Etablierung einer Beibehaltung von HIV innerhalb des Empfängerwirts bedingt durch die Eingliederung von HIV in das Genom von Zellen innerhalb besagten Wirts).
Die Verwendung eines Azido-Dipyridodiazepinons und eines Azido-Thiocarboxanilids (Azido-UC781^TM), also azido-markierter Verbindungen, die nachweislich RT binden und inaktivieren, erlaubt die Erzeugung nichtinfektiöser HIV-Partikel durch Inaktivieren der HIV-RT, indem infektiöse Partikel einer der beiden Verbindungen ausgesetzt und im Anschluss daran mit ultraviolettem Licht bestrahlt werden. Die effiziente Inaktivierung von HIV-RT durch die hierin erläuterten Verfahren ermöglicht die Produktion nichtinfektiöser HIV-Partikel. Diese nichtinfektiösen HIV-Partikel besitzen die Fähigkeit, eine wirksame zellvermittelte und antikörpervermittelte Immunantwort auszulösen, die gegen eine HIV-Infektion schützt. Die inaktivierten HIV-Partikel der vorliegenden Erfindung bewahren die antigene Zusammensetzung infektiöser Wildtyp-HIV-Partikel und erleichtern dadurch die dendritische zellvermittelte Verarbeitung und die Präsentation von Antigenen, die aus HIV-Partikeln abgeleitet sind, gegenüber T-Zellen.
Die Anwendung dieser Methodologie auf verschiedene HIV-Stämme kann die Herstellung eines polyvalenten Impfstoffs ermöglichen (NIIPAV bzw. nicht infektiöses immunogenes polyvalentes AIDS-Vakzin). Die inaktivierten HIV-Partikel der vorliegenden Erfindung exponieren, nach Bindung an CD4-Rezeptoren, Epitope, die breite immunogene Antworten auslösen können, die in der Lage sind, die Infektivität diverser HIV-Typen aus verschiedenen Clades zu hemmen. So kann das Exponieren des Immunsystems gegenüber einem einzelnen Typ inaktivierter Partikel der vorliegenden Erfindung vor einer Infektion durch viele HIV-Typen schützen.
Bei der Erfindung handelt es sich um ein nichtinfektiöses HIV-Partikel mit der Fähigkeit, eine wirksame Immunantwort zum Schutz gegen Infektion durch HIV auszulösen, umfassend irreversibel inaktivierte reverse Transkriptase; wobei die reverse Transkriptase inaktiviert worden ist via Binden der reversen Transkriptase mit einer oder mehreren Verbindungen mit einer Azido-Photoaffinitätsmarkierung, welche Verbindung die reverse Transkriptase bindet, und via Bestrahlen der HIV-Partikel, welche die reverse Transkriptase umfassen, die durch die eine oder mehreren Verbindungen mit einer Photoaffinitätsmarkierung gebunden ist, mit UV-Licht, um die reverse Transkriptase irreversibel zu photoinaktivieren.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, die das oben erwähnte HIV-Partikel umfasst, in dem die RT inaktiviert ist. Weiterhin kann die Zusammensetzung einen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff umfassen. Die vorliegende Erfindung berücksichtigt, dass das HIV-Partikel jeglichen Typs, Untertyps oder Isotyps von HIV sein kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das HIV-Partikel ein Wildtyp-HIV-Partikel. In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem HIV-Partikel um HIV-1. Das HIV-1-Partikel kann Gruppe M oder Gruppe 0 angehören. In verschiedenen Ausführungsformen kann das Gruppe M angehörende HIV-1 von Clade A, Clade B, Clade C, Clade D, Clade E, Clade F, Clade G, Clade H oder Clade I sein. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich beim Partikel aus Gruppe M um ein Partikel von Clade B.
Die Inaktivierung der RT erfolgt durch eine oder mehrere Verbindungen, welche die RT binden, und durch anschließendes Bestrahlen der gebundenen RT mit UV-Licht. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das UV-Licht von einer GE 275 W Sonnenlampe ausgestrahlt. Allerdings wird berücksichtigt, dass sich jedes beliebiges Licht, das die Reaktion der Verbindung mit RT bewirkt, einsetzen lässt. Im Wesentlichen kann jede beliebige azido-markierte Verbindung verwendet werden, die an HIV-RT bindet und in das HIV-Partikel eindringen kann, um sich mit der RT zu verbinden. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der azido-markierten Verbindung um Azido-Dipyridodiazepinon oder Azido-UC781^TM. In anderen Ausführungsformen ist die azido-markierte Verbindung das Azidoderivativ von 9-AN, UC38, UC84, UC10, UC82, UC040, HBY 097, Calanolid A oder U-88204E.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, das eine Immunantwort in einem Lebewesen auslöst, indem eine Zusammensetzung verabreicht wird, die einen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff und ein HIV-Partikel umfasst, in dem die RT inaktiviert ist, wie oben definiert. Die Immunantwort kann eine humorale Antwort, eine zelluläre Antwort oder sowohl eine humorale als auch eine zelluläre Antwort darstellen. Bei der zellulären Antwort kann es sich um eine CD8⁺-T-Zellen-Antwort, eine CD4⁺-T-Zellen-Antwort oder um sowohl eine CD8⁺-T-Zellen- als auch eine CD4⁺-T-Zellen-Antwort handeln.
Beim Lebewesen, in dem die Immunantwort ausgelöst wird, kann es sich um einen Säuger handeln. Bei bevorzugten Ausführungsformen kann der Säuger ein Mensch, eine PBL-SCID-Maus oder eine SCID-hu-Maus sein. Das Lebewesen, in dem die Immunantwort ausgelöst wird, kann entweder HIV-positiv oder HIV-negativ sein.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, das den Ausbruch von AIDS in einem infektiösen HIV ausgesetzten Lebewesen dadurch verzögert, dass in das Lebewesen eine Inokulation aus einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff und einem HIV-Partikel eingebracht wird, in dem die RT inaktiviert ist, wie oben definiert. Bei dem Lebewesen kann es sich um einen Säuger handeln, und in bevorzugten Ausführungsformen ist der Säuger ein Mensch, eine PBL-SCID-Maus oder eine SCID-hu-Maus. Zum Zeitpunkt der Einbringung der Inokulation kann das Lebewesen entweder HIV-negativ oder HIV-positiv sein.
Einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung eines HIV-Partikels dar, der eine inaktivierte RT enthält, wie oben definiert; dieses Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen einer Verbindung, die zur Inaktivierung der RT in der Lage ist, mit einem HIV-Partikel, so dass die Verbindung an die RT bindet, und daraufhin das Bestrahlen des HIV-Partikels. In einer Ausführungsform handelt es sich beim HIV-Partikel um HIV-1. Das HIV-1-Partikel kann Gruppe M oder Gruppe 0 angehören. In verschiedenen Ausführungsformen kann das der Gruppe M angehörende HIV-1 von Clade A, Clade B, Clade C, Clade D, Clade E, Clade F, Clade G, Clade H oder Clade I sein. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Partikel aus Gruppe M ein Clade B zugehöriges Partikel.
Im Wesentlichen kann jede beliebige azido-markierte Verbindung verwendet werden, die an HIV-RT bindet und in das HIV-Partikel eindringen kann, um sich mit der RT zu verbinden. In bevorzugten Ausführungsformen ist die azido-markierte Verbindung Azido-Dipyridodiazepinon oder Azido-UC781^TM. In anderen Ausführungsformen handelt es sich bei der azido-markierten Verbindung um das Azido-Derivat von 9-AN, UC38, UC84, UC10, UC82, UC040, HBY 097, Calanolid A oder U-88204E.
Einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung dar, welches das Erzeugen eines HIV-Partikels umfasst, das eine inaktivierte RT enthält, wie oben definiert; dieses Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen einer Verbindung, die zur Inaktivierung von RT in der Lage ist, mit einem HIV-Partikel, so dass die Verbindung an die RT bindet, das Bestrahlen des HIV-Partikels und daraufhin das Kombinieren des HIV-Partikels mit der inaktivierten RT mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff.
Die folgende Zeichnung bildet einen Teil der vorliegenden Spezifikation und ist einbezogen, um bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung weiter zu veranschaulichen. Die Erfindung erschließt sich besserem Verständnis mit Blick auf diese Zeichnung in Kombination mit der detaillierten Beschreibung spezifischer Ausführungsformen, die hierin dargelegt sind.
1. Vereinfachter phylogenetischer Baum von HIV-1. Gruppe M bezeichnet die Hauptgruppe von HIV-1; Gruppe 0 bezieht sich auf Outliers bzw. Outgroup. Sequenzdaten aus der env-Gen-C2V3-Region selektiver Isolate der Untertypen A bis H wurden mit dem Konstrukt des phylogenetischen Baums verglichen. Ein neunter Untertyp, nämlich I, wurde jüngst verzeichnet, ist aber nicht aufgeführt, weil das Isolat mittels eines anderen Segments des env-Gens charakterisiert wurde. Die horizontalen Zweiglängen stellen annähernde relative genetische Distanzen dar (Aus: Hu D. J., Dondero TJ, Rayfield MA, u.a.: The emerging genetic diversity of HIV: The importance of global surveillance for diagnostics, research, and prevention. JAMA 275:210, 1996).
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Impfstoff, der ein RT-inaktiviertes HIV umfasst, wie oben definiert, damit eine schützende Immunantwort in einem Lebewesen ausgelöst wird. Die vorliegende Erfindung nutzt Verfahren zur Inaktivierung von RT. Ferner ist der Einsatz dieser Inaktivierungsverfahren zum Zwecke der Herstellung eines Impfstoffes neuartig.
Es gibt gut beschriebene Verfahren zur Isolation und Kultivierung von HIV. Von Wichtigkeit ist es, hinsichtlich der Aufgaben dieser Erfindung die Tatsache präsent zu behalten, dass mittels einer Methodologie, welche die HIV reverse Transkriptase inaktiviert, nichtinfektiöse Partikel von HIV erhalten werden, die in der Lage sind, eine effizient schützende Immunantwort auszulösen. Obwohl es sinnvoll ist, das Verfahren anhand spezifischer HIV-Stämme und spezifischer Zelltypen für die Kultur zu beschreiben und die erzeugten Partikel auf das Fehlen der Infektiosität hin zu untersuchen, sollte nicht vergessen werden, dass dieses Verfahren auf verschiedene HIV-Stämme anwendbar ist, einschließlich Labor- und Primärisolaten.
Tatsächlich ist es angesichts der Vielfalt bei der geographischen Verteilung der verschiedenen HIV-Stämme sinnvoll, viele HIV-Stämme bei dieser Methodologie zu verwenden. Gerade die kombinierte Verwendung verschiedener Stämme inaktivierter HIV-Partikel ist das, was dieser potentiellen Impfstoffpräparation ihre polyvalenten Charakteristiken verleiht. So war der Erfinder bei der Beschreibung dieses Verfahrens zur Erzeugung der Impfstoffpartikel und bei deren Untersuchung im Hinblick auf Sicherheit und Wirksamkeit bestrebt, die allgemeinen Prinzipien der Methodologie zwecks deren anschließender Anwendung zu etablieren. Es sollte verstanden werden, dass der Inaktivator der HIV reversen Transkriptase, der in der Initialstudie eingesetzt wird, mit anderen Inaktivatoren in Parallelstudien verglichen werden kann, was die Möglichkeit eröffnet, den wirksamsten davon auszuwählen.
Die genetische Diversität von HIV ist bedingt durch die extrem hohe Replikationsrate in infizierten Individuen, die hohe Mutationsrate, die von der fehleranfälligen reversen Transkriptase verursacht wird, die substantielle Viruslast und die Selektion innerhalb infizierter Individuen. (Doolittle, 1989; Ho, u.a., 1995; Piatek, u.a., 1993). Die Diversität ist derart groß, dass gewöhnlich eng verwandte, aber nicht identische HIV-Stämme, auch bekannt als Quasispezien, in einem einzigen, infizierten Individuum präsent sind. Diese Quasispezien können im Lauf der Zeit zunehmend divergieren, wobei sich die Veränderungen tendenziell innerhalb des env-Gens vollziehen, insbesondere in der V3-Region (Hwang, u.a., 1992). Obgleich Veränderungen auch in gag, pol und in akzessorischen Genen auftreten können, sind diese der Tendenz nach weniger substantiell.

Wenn sich signifikante Veränderungen häufen und in einer großen Gruppe von Individuen erkennbar sind, wird der Stamm gemeinhin als eine neue Familie oder ein neuer Clade von HIV angesehen. Phylogenetische Studien über HIV haben gezeigt, dass zwei HIV-Hauptfamilien vorhanden sind, nämlich HIV-1 und HIV-2. Innerhalb der Familie von HIV-1 gibt es zwei antigene Hauptgruppen, die als Gruppe M (major) und Gruppe O (outlier) bekannt sind. Jede dieser beiden Gruppen besitzt ihrerseits verschiedene Untertypen oder Clades, deren Analyse zur Schlussfolgerung führt, dass beide ihren Uhrsprung wahrscheinlich in zwei primordialen viralen Vorfahren haben. Gruppe M ist weltweit für den Großteil der HIV-Infektionen verantwortlich, wohingegen Gruppe O selten vorgefunden wird und auf Kamerun, Gabun und Frankreich begrenzt ist. In Gruppe M gibt es wenigstens neun Untertypen oder Clades, und unter diesen neun ist Untertyp B in der westlichen Hemisphäre prävalent, während die Untertypen A, C und D in Afrika vorherrschen. In Asien häufig vorgefundene Untertypen sind E, C und B, wobei Untertyp E eine hohe Prävalenz in Südostasien zeigt. In Indien ist C der prävalente Untertyp. Ein phylogenetischer Baum, der auf den Sequenzdaten aus der env-Gen-C2V2-Region selektierter Isolate der verschiedenen Untertypen beruht, ist in 1 veranschaulicht. Die geographische Verteilung der verschiedenen Clades ist in Tabelle 1 aufgeführt (Hardy, 1996). TABELLE 1 Weltweite geographische Verteilung der HIV-1-Untertypen und des HIV-2

HIV-1-Untertypen
Gruppe M
	A	B	C	D	E	F	G	H	I	O	HIV-2
Afrika	+	+	+	+	+	+	+	+		+	+
Mittlerer Osten									+
Europa	+	+	+	+		+	+	+		+	+
Asien		+	+		+
Indien	+	+	+								+
Australien		+
Nordamerika		+									+
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Ein Impfstoff, der einen Clade umfasst, kann für den Schutz vor Infektion durch einen oder mehrere Clades sorgen. Ein sehr wichtiges Konzept beim Herangehen an das, was die sehr schwere Herausforderung antigener Variation zu sein scheint, ist das Verständnis des Konzepts entscheidender antigener Konsistenz. Mit entscheidender antigener Konsistenz ist gemeint, dass eine entscheidende Anzahl von Epitopen vorhanden ist, die konsistent in HIV vorzufinden sind. Obwohl anerkannt wird, dass signifikante antigene Veränderungen in der Konfiguration der Hüllproteine vorhanden sind, weisen die internen Proteine eine geringere Sequenzvariation auf. Jüngst wurde nachgewiesen, dass Epitope von entscheidender immunologischer Wichtigkeit exponiert oder erzeugt werden, während HIV beginnt, mit Zellmembranen zu verschmelzen. Der Verschmelzungsprozess resultiert in einer konformationellen Veränderung des Hüllglykoproteins, was zu der Exponierung zuvor verborgener Epitope oder der De-Novo-Formation von Epitopen führt. Die jüngste Verwendung dieser durch Verschmelzung exponierten Epitope hat zur Präparation von Antikörpern geführt, die in der Lage sind, die Infektivität vieler primärer HIV-Isolate, einschließlich vieler genetischer Untertypen, zu hemmen (Montefiori und Moore, 1999; LaCasse, u.a., 1999). Der umfassende immunologische Schutz, der von den durch Verschmelzung exponierten Epitope ausgelöst wird, kann eine Erklärung für die Beobachtung liefern, dass mit HIV-1 infizierte Menschen so gut wie nie mehr als einen Untertyp des Virus aufweisen.
Diese signifikanten neuen Ergebnisse weisen darauf hin, dass sobald das Immunsystem HIV ausgesetzt ist, ohne dass es zu einer Integration von HIV in die genetische Maschinerie des Wirts kommt, die Immunantwort effizient ausfällt und auf breiter Basis steht. Die nichtinfektiösen HIV-Partikel der Erfindung mimen die antigene Struktur und Zusammensetzung der natürlichen infektiösen HIV-Partikel. So dringen diese nichtinfektiösen Partikel in suszeptiblen Zellen, einschließlich jener Zellen des Immunsystems, die für die Erzeugung der Immunantwort verantwortlich sind, in identischer Weise ein wie die infektiösen Partikel, nämlich durch Rezeptor/Corezeptor-Bindung und Verschmelzung. Das rezeptorvermittelte Eindringen des Impfstoffs in Zellen resultiert in der Exponierung der höheren immunogenen Epitope und erleichtert dadurch die Erzeugung einer umfassenden immunogenen Antwort.
Zusätzlich zu den eben beschriebenen durch Verschmelzung exponierten Epitopen können die konsistenten Regionen von env, gag und pol zusammen zu einer entscheidenden Masse von Antigenen führen, die für die Produktion einer wirksamen immunologischen Antwort auf HIV verantwortlich sind und die in der Tat in beinahe allen Typen und Untertypen von HIV vorhanden sind. Obgleich es weise ist, verschiedene Wildtypen zur Erzeugung nichtinfektiöser Partikel einzusetzen und einen polyvalenten Impfstoff zu schaffen, besteht auch die Möglichkeit, dass die Exponierung des Immunsystems gegenüber einem einzigen Typ eines inaktivierten HIV-Partikels ausreichend ist zur Erzeugung einer umfassenden Immunantwort.
Die antigene Konfiguration von HIV ist von äußerster Wichtigkeit, da bekannt ist, dass sich konformationelle Epitope in variablen Bereichen des HIV-Partikels befinden können und sich nicht anhand der Analyse der linearen Sequenzen dieser Bereiche vorhersagen lassen. Deshalb ist es von großer Bedeutung, dass dem Immunsystem bei Auslösen einer effizienten schützenden Immunantwort gegen HIV korrekte antigene Konformationen präsentiert werden.
Wesentliche Beweise deuten darauf hin, dass dendritische Zellen („DC") in epithelialen Geweben (z.B. Langerhans-Zellen) die ersten Zellen sind, die mit HIV nach mukosaler Exponierung gegenüber dem Virus infiziert werden (Cameron, u.a., 1996; Knight, 1996). Die aus Knochenmark stammenden DC stellen eine Klasse Antigen-präsentierender Zellen („APC") dar, welche epitheliale Gewebe auf Antigene hin überwachen und wirkungsvolle Stimulatoren sowohl der B- als auch der T-Lymphocyzten sind. Anders als B-Zellen können T-Zellen Antigene nicht direkt erkennen, weshalb es notwendig ist, dass Antigene verarbeitet und durch APCs präsentiert werden (Banchereau und Steinmann, 1998). intrazelluläre Verarbeitung von Antigenen zu Peptidfragmenten resultiert in einer Bindung an MHC-Klasse-I-Moleküle und in einer Antwort cytotoxischer CD8⁺-T-Zellen. Dagegen binden Antigene, die auf endocytischem Weg in DC eindringen, gewöhnlich an MHC-Klasse-II-Moleküle, und eine CD4⁺-Helfer-T-Zellen-Antwort wird ausgelöst (Banchereau und Steinmann, 1998).
Inaktivierte virale HIV-Partikel werden verarbeitet und von DC präsentiert, solange die inaktivierten HIV-Partikel in ihrer antigenen Zusammensetzung bewahrt werden und das Cytoplasma der dendritischen Zellen zugänglich für sie ist. Beide dieser Bedingungen werden von der vorliegenden Erfindung erfüllt. Dies bedeutet, dass die inaktivierten Partikeln eine erhaltene Hüllstruktur aufweisen und so durch einen Prozess der Mikropinocytose oder der Mannose-Rezeptor-vermittelten Aufnahme in das Cytoplasma der dendritischen Zellen gelangen. DC, die gegenüber den inaktivierten HIV-Partikeln exponiert waren, wandern zu den Lymphknoten, wo sie mit T-Zellen interagieren, welche MHC-Antigen-Komplexe sowohl Speicher- als auch naiven T-Zellen präsentieren (siehe Banchereau und Steinmann, 1998; Bender, u.a., 1995). Dieser Prozess führt zur Entwicklung einer wirksamen anti-HIV MHC-I-restringierten CD8⁺-T-Zellen-Antwort. Cytotoxischen CD8⁺-T-Zellen wird eine wichtige Rolle bei der Kontrolle einer HIV-Infektion zuerkannt (Musey, u.a., 1997; Oldstone, 1997).
Dendritische Zellen verfügen auch über CD4/HIV-Corezeptoren und können so durch HIV infiziert werden. Dieser infektiöse Prozess ist unabhängig von der Erfassung und Verarbeitung von HIV für die antigene Präsentation und Initiation der MHC-Klasse-I-restringierten immunologischen Antwort (Blauvelt, u.a., 1997). Aber da die inaktivierten Partikeln nicht infektiös sind, ermöglicht der Prozess des Eindringens durch einen Rezeptormechanismus die Erzeugung einer MHC-II-restringierten Antwort. So aktivieren und expandieren DC-Zellen die CD4⁺-T-Helferzellen, die ihrerseits B-Zellen-Wachstum und Antikörperproduktion herbeiführen. Diese MHC-Klasse-II-Antwort komplementiert die MHC-Klasse-I-restringierte Immunantwort dadurch, dass sie sowohl eine wirkungsvolle cytotoxische und humorale Antwort etabliert als auch ein effizientes immunologisches Gedächtnis.
Der Erfinder berücksichtigt, dass die vorliegende Erfindung aus inaktivierten Viren aus einem oder mehreren HIV-Clades bestehen kann. In bevorzugten Ausführungsformen kann der Impfstoff aus inaktivierten Viren des Clade bzw. der Clades bestehen, bei denen die größte Wahrscheinlichkeit besteht, dass das Individuum mit ihm bzw. ihnen in Kontakt kommt. Die Daten aus Tabelle 1 können als Richtschnur zur Feststellung benutzt werden, welche Clades in verschiedenen geographischen Bereichen vorherrschen.
Da sich die vorliegende Erfindung kostengünstig und rasch herstellen lässt, kann ein Individuum mit inaktiviertem Virus oder sogar mit Zellen geimpft werden, die mit inaktiviertem HIV infiziert sind und aus jenem Individuum stammen, bei dem die Wahrscheinlichkeit am größten ist, dass es das Virus an das Individuum weitergeben wird oder bereits weitergegeben hat. Beispielsweise kann eine HIV-negative Person mit inaktiviertem HIV oder mit Zellen geimpft werden, die mit inaktivierten HIV infiziert sind und aus einem HIV-positiven Individuum stammen, mit dem das HIV-negative Individuum sexuellen Kontakt haben möchte oder bereits gehabt hat. Als Beispiel für ein solches HIV-negatives Individuum könnte jemand dienen, der mit einem HIV-positiven Bluter verheiratet ist. Zusätzlich können diese „persönlichen" Impfstoffe den Nutzen haben, dass sie auch zelluläre (nicht-virale) Oberflächenproteine aus dem Individuum aufweisen, welches das Virus weitergibt. Hinsichtlich der Immunantwort auf zelluläre, in die Viruspartikeln eingegliederte zelluläre Oberflächenproteine, welche MHC-Antigene umfassen, wurde gezeigt, dass sie Schutz vor zukünftigen Angriffen verleihen, die von in der gleichen Zelllinie gezüchteten Viren ausgehen (Stoff, u.a., 1991).
Eine Anzahl von Nicht-Nukleosid-Inhibitoren der HIV reversen Transkriptase ist beschrieben worden und umfasst Neviprin und seine Analoge, die Pyridobenzo- und Dipyridodiazepinone, die Pyridone, die Chinoxaline und die Carboxanilide. Zu spezifischen Verbindungen zählen 9-AN, UC781^TM, UC38, UC84, UC10, UC82, UC040, HBY 097, Calanolid A, U-88204E und viele andere (Barnard, u.a., 1997; Esnouf, u.a., 1997; Buckheit, u.a., 1997; Kleim, u.a., 1997; Currens, u.a., 1996; Althaus, u.a., 1993). Diese Verbindungen können zu Azido-Photoaffinitätsmarkierungen gewandelt und für die Inaktivierung von HIV-Partikeln mittels hierin erläuterter Verfahren verwendet werden. Der Erfinder berücksichtigt, dass im Wesentlichen jedwede Verbindung, welche HIV-RT bindet und hemmt, welche in der Lage ist, in das virale Partikel zu dringen und sich mit RT zu verbinden, und keine signifikanten Veränderungen in der Konformation des Viruspartikels verursacht, verwendet werden kann, um einen RT-inaktivierten Virus zwecks Auslösens einer schützenden Immunantwort in einem Individuum zu produzieren. Weiterhin berücksichtigt der Erfinder, dass das Aussetzen der mit Azido-Photoaffinitätsmarkierung behandelten Partikel gegenüber Lichtstrahlung zur irreversiblen Inaktivierung der RT, Licht mit einer Vielzahl von Wellenlängen umfassen kann. Obwohl UV-Licht, insbesondere jenes, das von einer GE 275 W Sonnenlampe ausgestrahlt wird, bevorzugt ist, wird jedes beliebige Aussetzen gegenüber Licht, das die Reaktion der Azido-Verbindung mit RT bewirkt, als nützlich bei der Herstellung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung angesehen.
Die Inaktivierung des Virus mittels Photoinaktivierung von RT, wie oben definiert, verschafft nichtinfektiöse, immunogene Partikel, die hinsichtlich Konformation und Zusammensetzung im Wesentlichen identisch mit infektiösen Partikeln sind. Deshalb berücksichtigt der Erfinder, dass in diesem Verfahren inaktivierte Partikel ideal zur Verwendung als potentieller Impfstoff gegen HIV-Krankheiten sind, einschließlich AIDS und zu AIDS in Beziehung stehender Leiden. So bietet die vorliegende Erfindung eine immunogene Zusammensetzung, die als Impfstoff gegen eine HIV-Infektion und deren Folgen, einschließlich AIDS und zu AIDS in Beziehung stehender Leiden, eingesetzt werden kann. Die immunogenen Zusammensetzungen lösen eine Immunantwort aus, die zelluläre und humorale Immunantworten produziert, die antiviral sind. Falls eine geimpfte Person von HIV herausgefordert wird, eliminieren T-Zellen der zellulären Antwort infizierte Zellen, und Antikörper der humoralen Antwort inaktivieren das Virus, indem sie an seine Oberfläche binden.
Die Impfstoffe können injizierbare flüssige Lösungen oder Emulsionen sein. Die RT-inaktivierten HIV-Partikel können mit pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffen gemischt werden, die mit den inaktivierten Viruspartikeln kompatibel sind. Unter kompatibel ist zu verstehen, dass die pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffe die konformationellen Charakteristiken der viralen Partikeln nicht verändern. Zu den Hilfsstoffen können Wasser, Salze, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder Kombinationen davon zählen. Weiterhin kann der Impfstoff Hilfssubstanzen enthalten, wie z.B. benetzende oder emulgierende Mittel, Puffermittel oder Adjuvanzien, um die Wirksamkeit der Impfstoffe zu verstärken. Bei den Adjuvanzien kann es sich handeln um Mineralsalze (z.B. AlK(SO₄)₂, AlNa(SO₄)₂, AlNH₄(SO₄), Kieselsäuren, Alaun, Al(OH)₃, Ca₃(PO₄)₂, Kaolin oder Kohlenstoff), Polynukleotide (z.B. poly-IC- oder poly-AU-Säuren), und um bestimmte natürliche Substanzen (z.B. Wachs D von Mycobacterium tuberculosis, Substanzen, die in Corynebacterium parvum, Bordetella Pertussis oder Mitgliedern des Genus Brucella zu finden sind) (PCT Anmeldung Nr. 91/09603). Aluminiumhydroxid oder Aluminiumsulphat (Alaun) werden gemeinhin als 0,05 bis 0,1 prozentige Lösung in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung verwendet. Zu weiteren Adjuvans-Verbindungen zählen QS21 oder inkomplettes Freundsches Adjuvans.
Es besteht die Möglichkeit, die Impfstoffe parenteral und durch Injektion subkutan oder intramuskulär zu verabreichen; außerdem können die Impfstoffe so formuliert und zugeführt werden, dass sie eine Immunantwort an den Schleimhautoberflächen auslösen. Die immunogene Zusammensetzung kann an eine mukosale Oberfläche auf nasalem, oralem, vaginalem oder analem Weg verabreicht werden. Der Erfinder berücksichtigt, dass die Verabreichung der immunogenen Verbindung an eine mukosale Oberfläche bevorzugt wird, bei der die größte Wahrscheinlichkeit besteht, dass sie von HIV angegriffen wird, wie z.B. die anale, vaginale oder orale Schleimhaut. Zur vaginalen oder analen Zuführung lassen sich Zäpfchen verwenden. Zäpfchen können Bindemittel oder Träger aufweisen, wie z.B. Polyalkalenglykole oder Triglyceride. Orale Formulierungen können die Form von Pillen, Kapseln, Suspensionen, Tabletten oder Pulvern besitzen und Saccharin, Zellulose oder Magnesiumcarbonat in verschiedenen pharmazeutischen Reinheitsgraden enthalten. Diese Zusammensetzungen können 10% bis 95% der RT-inaktivierten viralen Partikeln aufweisen.
Vorzugsweise werden die Impfstoffe in einer Weise und einer Menge verabreicht, dass sie therapeutisch wirksam sind. Das heißt, dass der Impfstoff so verabreicht werden sollte, dass eine Immunantwort auf die RT-inaktivierten viralen Partikeln ausgelöst wird. Die zur Verabreichung erforderlichen geeigneten Dosen sind für Fachleute auf diesem Gebiet leicht erkennbar. Zweckgemäße Methodologien für die anfängliche Verabreichung und, falls notwendig, für Booster-Dosen können ebenfalls variabel sein. Die Dosierung des Impfstoffs kann vom Verabreichungsweg abhängen und der Größe des Wirts entsprechend variieren. Für einen Fachmann auf diesem Gebiet bietet sich die Möglichkeit, Einzelheiten bezüglich der praktischen Anwendung und des Gebrauchs der vorliegenden Erfindung dem HIV Experimental Vaccine Directory der American Foundation for AIDS Research, Band 1, Nr. 2, Juni 1998, zu entnehmen, der hierbei durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingegliedert ist.
Obwohl die immunogenen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung an Individuen verabreichbar sind, die nicht mit HIV infiziert, also HIV-negativ sind, können sie auch Individuen verabreicht werden, die mit dem Virus infiziert sind im Bemühen, die Immunantwort gegenüber dem Virus zu verändern. Bei dieser Veränderung kann es sich um eine Stimulation von anti-HIV CD4⁺- bzw. CD8⁺-T-Zellen oder um eine Erhöhung der Antikörperproduktion handeln, oder die Veränderung kann den Typ der Antwort auf das Virus (d.h. T_H1 vs. T_H2) betreffen. Gleichwohl wird diese Veränderung, falls sie sich als effizient erweist, die Mortalität und Morbidität senken, die mit der HIV-Infektion einhergehen. Mit anderen Worten kann die immunogene Verbindung die Schwere der Krankheit mindern und das Leben des Patienten verlängern.
Wo die klinische Anwendung eines Impfstoffs gemäß der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird, ist es notwendig, den Komplex als eine pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen, die sich für die beabsichtigte Anwendung eignet. Gewöhnlich zieht dies die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach sich, die im Wesentlichen sowohl von Pyrogenen als auch von allen anderen Unreinheiten frei ist, die für Menschen oder Tiere schädlich sein könnten. Allgemein wird auch der Wunsch nach Verwendung geeigneter Salze und Puffer bestehen, um den Komplex stabil zu machen und seine Aufnahme durch die Zielzellen zu ermöglichen.
Wässrige Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen eine wirksame Menge des inaktivierten Virus, und zwar gelöst oder dispergiert in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder wässrigen Medium. Solche Zusammensetzungen werden auch als Inokula bezeichnet. Die Begriffe „pharmazeutisch" oder „pharmazeutisch anwendbar" nehmen Bezug auf molekulare Gebilde und Zusammensetzungen, die keine nachteilige, allergische oder andere bedauerliche Reaktion hervorrufen, wenn sie, je nach Verwendungszweck, einem Mensch oder einem Tier verabreicht werden. Hierin sind unter einem „pharmazeutisch annehmbarem Träger" beliebige Lösungsmittel, Dispergierungsmedien, Beschichtungsmittel, antibakterielle und antimykotische Mittel, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel und dergleichen zu verstehen. Der Gebrauch solcher Media und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist aus dem Stand der Technik wohlbekannt. Nur dann wenn ein herkömmliches Medium bzw. Agens mit dem aktiven Inhaltsstoff kompatibel ist, wird sein Gebrauch in den therapeutischen Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Zusätzliche aktive Inhaltsstoffe können ebenfalls in die Zusammensetzungen einbezogen werden.
Lösungen für die aktiven Verbindungen, wie freie Basen und pharmazeutisch annehmbare Salzlösungen, können in Wasser hergestellt werden, das passend mit einem Surfaktant, etwa Hydroxypropylcellulose, gemischt wird. Dispersionen können auch in Glycerin, flüssigen Polyethylenglykolen, Gemischen daraus und in Ölen vorbereitet werden. Unter den üblichen Bedingungen für Lagerung und Anwendung enthalten diese Präparationen ein Konservierungsmittel, um dem Wachstum von Mikroorganismen vorzubeugen.
Die inaktivierten Viren und die inaktivierte Viren produzierenden Zellen der vorliegenden Erfindung können klassische pharmazeutische Präparationen umfassen. Die Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt über jeden beliebigen üblichen Weg, solange das Zielgewebe über diesen zugänglich ist. Dazu zählen der orale, nasale, bukkale, rektale, vaginale oder topische Weg. Alternativ dazu kann die Verabreichung durch orthotopische, intradermale, intraokulare, subkutane, intramuskuläre, intraperitonale oder intravenöse Injektion vorgenommen werden. Derartige Zusammensetzungen würden normalerweise als pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen verabreicht, die physiologisch annehmbare Träger, Puffer oder sonstige Bestandteile enthalten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden vorteilhaft in Form injizierbarer Zusammensetzungen entweder als flüssige Lösung oder als Suspension verabreicht; feste Formen, geeignet zur Lösung oder auch zur Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion können ebenfalls hergestellt werden. Außerdem bietet sich die Möglichkeit zum Emulgieren dieser Präparationen. Eine typische Zusammensetzung für einen solchen Zweck umfasst einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Beispielsweise kann die Zusammensetzung 10 mg, 25 mg, 50 mg oder bis zu etwa 100 mg Humanes Serum Albumin pro Milliliter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung enthalten. Zu weiteren pharmazeutisch annehmbaren Trägern zählen wässrige Lösungen, nicht toxische Hilfsstoffe, einschließlich Salzen, Konservierungsstoffen, Puffern und dergleichen. Beispiele für nicht wässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöl und injizierbare organische Ester, wie z.B. Ethyloleat. Zu den wässrigen Trägern gehören Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Kochsalzlösungen, parenterale Vehikel, wie z.B. Natriumchlorid, Ringer's Dextrose, etc.. Intravenöse Vehikel schließen Fluid- und Nähr-Nachfülllösungen ein. Zu den Konservierungsstoffen gehören antimikrobielle Agenzien, Antioxidanzien, Chelatbildner und inerte Gase. Der pH-Wert und die exakte Konzentration dieser verschiedenen Komponenten der pharmazeutischen Zusammensetzung werden wohlbekannten Parametern entsprechend angepasst.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können eine Ergänzung aus einer oder mehreren Verbindungen aufweisen, die in der Lage sind, der Replikation von HIV vorzubeugen, einschließlich jener Verbindung, die zur Inaktivierung des Virus eingesetzt wird. Diese Verbindungen können, nicht ausschließlich, Nukleosid-Analog-Inhibitoren von HIV RT (z.B. AZT), Nicht-Nukleosid-Inhibitoren von HIV-RT (z.B. UC781TM) oder HIV-Protease-Inhibitoren umfassen.
Die Sicherheit der Impfstoffpartikel kann durch deren Unfähigkeit nachgewiesen werden, eine Infektion in suszeptiblen Zellen hervorzurufen, und zwar unabhängig von der Menge an Partikeln, die als Inokulum eingesetzt werden. Überwachte Untersuchungen können durchgeführt und suszeptible Zellen erhöhten Konzentrationen dieser Partikeln ausgesetzt werden. Partikeln mit inaktivierter RT wird es nicht gelingen, suszeptible Zellen zu infizieren, während Kontrollstudien die Fähigkeit zur Hervorrufung einer Infektion in den suszeptiblen Zellen belegen. Die gleiche Methodologie wie jene, die bei Erzeugung der viralen Partikeln Einsatz fand, lässt sich anwenden, um die Inaktivierung der Viruspartikeln der vorliegenden Erfindung zu testen. Zur Überwachung der Infektivität sowohl bei den nichtinfektiösen Partikeln als auch bei den Kontrollen berücksichtigt der Erfinder die Überwachung der Produktion von RT und p24-Antigen in den Kulturüberständen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Überstände auf die Anwesenheit von Viruspartikeln getestet, und zwar durch das sensible Verfahren der HNPCR (hemi-nested Polymerase-Kettenreaktion) bzw. durch Amplifikation der 5' LTR-Sequenzen (LTR-HNPCR). Dieser Test bestätigt das Nichtvorhandensein der Infektivität bei den Impfstoffpartikeln, da eine exzellente Korrelation zwischen einem negativen Infektivitätstest und einer negativen LTR-HNPCR besteht (Yang, u.a., 1998).
Die Sicherheit der Partikeln lässt sich auch in vivo beurteilen, und zwar durch Inokulation bei bereits erläuterten Tiermodellen. Das Fehlen der Infektivität bei den inaktivierten Partikeln kann durch wiederholte Inokulation mit hohen Dosen bei Tieren, wie z.B. PBL-SCID-Mäusen, SCID-hu Mäusen oder Tierprimaten, festgestellt werden.
Als ein Weg zur Schaffung eines zusätzlichen Sicherheitsmechanismus für diesen Impfstoff kann HIV-Integrase, ein für die virale Integration erforderliches Enzym, inaktiviert werden. Es ist wichtig klarzustellen, dass keine Replikation des Virus stattfinden wird, da die reverse Transkriptase des viralen Partikels inaktiviert ist. Die inaktivierte HIV-Integrase würde ein zusätzliches Sicherheitsmerkmal darstellen. Ohne eine funktionsfähige Integrase besteht keine Möglichkeit zur Integration von HIV in das genetische Material der Zelle, was die Sicherheit des Impfstoffs zusätzlich gewährleistet. Beim Mechanismus zur Inaktivierung der Integrase handelt es sich um einen der Mechanismen zur selektiven Photomarkierung, der eine (Azido-Gruppe) Bindung an irgendeine aus mehreren Verbindungen nutzt, von denen bekannt ist, dass sie an HIV-Integrase binden. Zu diesen Verbindungen zählen: Anti-Integrase-Oligonukleotide, L-Chicoric-Säure sowie eine große Anzahl von Hydrazinderivat-Inhibitoren.
Obwohl es wichtig ist, verschiedene Verabreichungswege in Betracht zu ziehen, wird dem intramuskulären Weg der Vorzug gegeben. Weitere Möglichkeiten schließen die 1) intranasale, 2) intrarektale, 3) intravaginale, 4) orale und 5) subkutane Verabreichung ein. Die zu verwendende Dosis wird in viralen Partikeln bemessen und liegt in einem Verabreichungsbereich von einem bis 10²⁰ Partikeln. Es ist damit zu rechnen, dass sich der optimale Dosierungsbereich zwischen 10⁴ Partikeln und 10⁸ Partikeln befindet. Niedrigere Dosierungsbereiche können Dosen mit ungefähr 10, 10² oder 10³ Partikeln umfassen. Zu den Bereichen optimaler Dosierung können Dosen mit etwa 10⁴, 10⁵, 10⁸, 10⁷ oder 108 Partikeln zählen. Höhere Dosierungsbereiche können Dosen von circa 10¹⁰, 10¹², 10¹⁴, 10¹⁶, 10¹⁸ oder 10²⁰ Partikeln einschließen. Die wirkungsvolle Dosierung kann in Abhängigkeit von der Verabreichungsart variieren.
Für jede zu testende Dosierung kann der Plan aus der Verabreichung einer Dosis an den Tagen 0, 30, 60 und einer Booster-Dosis nach 180 Tagen bestehen. Alternativ dazu können Dosen allwöchentlich, alle zwei Wochen oder monatlich über Zeiträume von einem, zwei, drei, vier, fünf oder sechs Monaten verabreicht werden. Die Dosen können auch alle zwei Monate über einen ähnlichen Zeitraum hinweg gegeben werden. Periodische Booster-Shots in Intervallen von 1 – 5 Jahren können erwünscht sein, um den Schutzgrad der Immunität aufrechtzuerhalten. Weitere Verabreichungspläne können benutzt werden, und die Erfindung berücksichtigt jeden beliebigen Verabreichungsplan, aus dem eine effiziente Impfung resultiert.
Zusätzlich zur Überwachung der klinischen Sicherheit wird durch Messung der zellulären und humoralen Immunreaktion auf HIV die Wirksamkeit beurteilt. Probanden werden von Tag 0 an (Tag der ersten Inokulation) über einen Zeitraum von zwei Jahren oder länger überwacht.
Eine Reihe unterschiedlicher HIV-Infektions-Systeme mit Tiermodellen wurden benutzt (Kindt, u.a., 1992). Nichtmenschliche Primaten, etwa Schimpansen und Schweinsaffen, können mit HIV-1 infiziert werden. Obwohl CD4⁺-Zellen in diesen Systemen nicht depletiert werden, sind die Tiere nachweislich mit dem Virus infiziert und somit von Nutzen bei Bestimmung der Effizienz von HIV-Impfstoffen. Kleine Tiermodelle umfassen chimäre Modelle, welche die Transplantation menschlichen Gewebes in immunodefiziente Mäuse umfassen. Ein solches System ist die hu-PBL-SCID-Maus, die von Mosier, u.a. (1988) entwickelt wurde. Die von McCune, u.a. (1988) entwickelte SCID-hu-Maus stellt ein weiteres System dar. Von diesen beiden Mausmodellen wird der SCID-hu-Maus typischerweise der Vorzug gegeben, weil eine HIV-Infektion bei diesen Tieren jener beim Menschen ähnlicher ist. SCID-hu-Mäuse, denen menschliches Intestinum implantiert wurde, wurden als in vivo-Modell für die Übertragung von HIV über die Schleimhäute angeführt (Gibbons, u.a., 1997). Verfahren zur Konstruktion von Säugertieren mit menschlichen Immunsystemen sind in den US-Patenten 5,652,373 , 5,698,767 und 5,709,843 beschrieben.
Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung wird in die Tiere inokuliert, und später werden diese einer Dosis des infektiösen Virus ausgesetzt. Die Wirksamkeit des Impfstoffs wird mittels Verfahren bestimmt, welche Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind. Im Allgemeinen kann eine Vielzahl von Parametern, die mit einer HIV-Infektion in Verbindung stehen, getestet werden, und es lässt sich ein Vergleich zwischen geimpften und nicht geimpften Tieren vornehmen. Zu derartigen Parametern zählen Virämie, Nachweis des integrierten HIV in Blutzellen, Verlust von CD4⁺-Zellen, Produktion von HIV-Partikeln durch PBMC, etc.. Als wirksam wird der Impfstoff angesehen, wenn eine signifikante Verringerung der Anzeichen für eine HIV-Infektion bei der geimpften im Vergleich zur nicht geimpften Gruppe auftritt.
Die Fähigkeit der inaktivierten HIV-Partikel, die neutralisierenden Antikörper auszulösen, lässt sich bei Mäusen messen, wie oben erläutert (LaCasse, u.a., 1999). Die Fähigkeit der Sera, einen Bereich von HIV-Isolaten zu neutralisieren, kann mittels U87-CD4-Zellen, die entweder CCR5- oder CXCR4-Corezeptoren exprimieren, oder mittels eines Kultur-Assays mit peripheren Blutlympocyten überprüft werden (LaCasse, u.a., 1999, LaCasse, u.a., 1998; Follis, u.a., 1998).
Selbstverständlich zieht der Erfinder die Anwendung der vorliegenden Erfindung als Impfstoff gegen HIV beim Menschen in Betracht. Der Erfinder berücksichtigt, dass die Untersuchung der vorliegenden Erfindung als Impfstoff beim Menschen Standardverfahren und Richtlinien folgt, welche Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind. Ein wichtiger Aspekt der Anwendung beim Menschen besteht in der Produktion einer effizienten Immunantwort auf den Impfstoff. Obwohl verschiedene ex vivo-Untersuchungen durchgeführt werden können, wie z.B. das Messen der anti-HIV-Antikörper-Produktion und der zellulären anti-HIV-Antworten, besteht der endgültige Test in der Fähigkeit des Impfstoffs, einer Infektion mit HIV vorzubeugen oder den Ausbruch von AIDS bei Individuen, die den Impfstoff erhalten, erheblich hinauszuzögern. Die Überwachung der Wirksamkeit von HIV-Impfstoffen beim Menschen ist Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt, und der Erfinder erwägt nicht, dass die vorliegende Erfindung die Entwicklung neuer Verfahren zur Überprüfung der Wirksamkeit eines Impfstoffs gegen HIV erfordern würde.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele wurden zwecks Veranschaulichung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung einbezogen.
PHOTOAFFINITÄTSMARKIERUNGEN
Eine Verbindung, die sich zur Photoinaktivierung der reversen Transkriptase von HIV-1 einsetzen lässt, ist ein Azido-Dipyridodiazepinon, nämlich 9-Azido-5,6-dihydro-11-ethyl-6-methyl-11H-pyrido[2,3-b][1,5]benzodiazepin-5-on (9-AN). Die Herstellung von 9-AN ist in Hargrave, u.a. (1991) beschrieben und kann erfolgen durch Mischen eines äquimolaren Gemischs aus 2-Chlornikotinsäure und 4-Nitrophenylendiamin, das fünf Stunden lang bei 170 °C in Sulfolan erhitzt wird. Nach Abkühlung wird das Präzipitat gesammelt und mit heißem Ethanol gewaschen. Das erhaltene Gemisch aus 8- und 9- nitro-5,6-dihydro-11H-pyrido[2,3-b]benzodiazepiri-5-onen wird dann mit Methyliodid und Dimsylnatrium in DMSO methyliert, und das 5,6-dihydro-6-methyl-9nitro-Isomer wird durch fraktionelle Kristallisation gereinigt. Die 8-Amino-Verbindung wird durch Ethylierung mit Ethyliodid und Dimsylnatrium in DMSO gewonnen, gefolgt von einer Reduktion der Nitrogruppe mit Zinnchlorid. Daraufhin wird die 8-Amino-Verbindung durch Diazotierung mit Natriumnitrat zu Azid gewandelt, worauf eine Reaktion mit Natriumazid folgt. Damit sich ein analytisch reines Material ergibt, wird das 9-Azido-Derivat aus Diethylether kristallisiert: mp 115–118 °C; CIMS molekulares Ion H* 295; die C, H und N-Analyse und spektroskopische Charakterisierung waren konsistent mit der Struktur. Eine methanolische Lösung der Azido-Photomarkierung besitzt ein_max von 248 nm (_= 30000).
Ein weiteres Molekül, das sich durch Diazotierung zur Photomarkierung machen lässt, ist ein unter dem Handelsnamen UC781^TM bekanntes Thiocarboxanilid. Entwickelt wurde UC781^TM von den Forschungslaboratorien der Uniroyal Chemical Ltd.. Bekanntermaßen handelt es sich bei UC781^TM um ein Molekül, das eine hohe Affinität zu HIV-1 reverser Transkriptase und die Charakteristiken fester Bindung aufweist. In der Tat ist es begründet, davon auszugehen, dass UC781^TM allein die HIV-1 reverse Transkriptase inaktiviert (Barnard, u.a., 1997; Borkow, u.a., 1997). Die Diazotierung dieses Moleküls und seine anschließende Aktivierung mit ultraviolettem Licht gewährleisten die Inaktivierung der HIV-1 reversen Transkriptase. Die Azido-Photoaffinitätsmarkierungen transformieren sich, nach Exponierung gegenüber ultraviolettem Licht, zu hochreaktiven Nitrenen, die in der Lage sind, sich in proximale kovalente Bindungen der Enzymstruktur der HIV-1 reversen Transkriptase einzufügen.
Struktur von UC781^TM
BEISPIEL 2 – INAKTIVIERUNG VON HIV-PARTIKELN UND HIV-INFIZIERTEN ZELLEN
Die Inaktivierung von HIV lässt sich erzielen, indem Nutzen aus Verbindungen gezogen wird, welche die HIV reverse Transkriptase mit einem hohen Grad an Spezifität binden. Mithilfe der Photomarkierungstechnik kann eine Verbindung mit hoher spezifischer Affinität für die HIV-1 reverse Transkriptase zu einer „aktiven" Moiety gemacht werden, die eine irreversible Inaktivierung der reversen Transkriptase nach Exponierung gegenüber der Strahlung ultravioletten Lichts erzeugt. Diese Inaktivierung erfüllt im Fall der Verbindungen, die bereits beschrieben sind und von denen bekannt ist, dass sie diese Wirkung haben, das Erfordernis, dass sie für die reverse Transkriptase von HIV-1 spezifisch sind. Das bedeutet, dass ihre Markierung und ihre Photoaktivierung nicht von der Veränderung irgendeiner anderen Komponente des viralen Partikels als der reversen Transkriptase von HIV-1 begleitet wird. Dies stellt ein wichtiges Element dieser Erfindung dar, weil die irreversible Inaktivierung der HIV-1 reversen Transkriptase zu nichtinfektiösen Partikeln von HIV-1 mit einer natürlichen antigenen Struktur führt, die sich wie die infektiösen Partikel von HIV-1 verhalten sollten, was ihre Fähigkeit zur Stimulierung einer effizienten Immunantwort anbelangt. Es gibt viele Verbindungen, die sich für den Zweck der Photomarkierung-Inaktivierung der HIV-1 reversen Transkriptase verwenden lassen und dazu zählen auch UC781^TM Thiocarboxanilid, UC781^TM Azido-Thiocarboxanilid und Azido-Dipyridodiazepinon.
INFEKTION VIRUSPRODUZIERENDER ZELLEN
Für den Laborgebrauch adaptierte Isolate und Isolate vom primären Wildtyp-HIV werden mithilfe etablierter Standardverfahren gezüchtet. Bei den Zellen, die für die Kultur zu verwenden sind, handelt es sich um mit Phytohemagglutinin (PHA) stimulierte periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs), weil diese sowohl durch primäre Isolate als auch durch für den Laborgebrauch adaptierte Isolate schneller infiziert werden als geclonte T-Zelllinien (MT-2 oder H9). Kurz ausgedrückt, werden aus normalen Blutspendern stammende PBMCs durch Dichtegradienten-Zentrifugation mittels Ficoll-Histopaque isoliert und mit 5 μg/ml PHA drei bis vier Tage lang stimuliert. Daraufhin werden die PHA-stimulierten PBMCs in RPMI-1640-Medium kultiviert, das 10% durch Wärme inaktiviertes FBS, 100 U Penicillin/ml, 100 μg Streptomycin/ml 2 mM L-Glutamin und 5% gereinigtes menschliches Interleukin-2 enthält.
Aliquots von 10⁷ nicht infizierten PBMCs in 10 ml Medium werden mit 2 μg/ml Polybren eine Stunde lang bei 37 °C vorbehandelt. Daraufhin werden die Zellen mittels 1.0 ml Inokulum des zellfreien Überstands des primären Isolats oder des für den Laborgebrauch adaptierten Isolats infiziert. Die infizierten PBMCs werden im Kulturmedium resuspendiert und auf die Überstand-p24-Antigen-Konzentration hin überwacht, die gewöhnlich vierzehn Tage nach der Inokulation ihren höchsten Stand erreicht. Die Kulturüberstände werden geerntet, gepoolt, durch einen 0,45-μm-Filter geklärt und aliquotiert. Die 50%-Gewebekulturinfektionsdosis wird gemäß dem von Johnson, u.a. (1990) beschriebenen Protokoll bestimmt, wobei das Nachweisverfahren für das p24-HIV-Antigen Anwendung findet.
Natürlich berücksichtigt der Erfinder, dass die Verwendung von PBMCs unter Umständen nicht realisierbar ist, falls große Virusvolumen benötigt werden. In diesem Fall wird MT-2 als Zelllinie benutzt, deren Züchtung in RPMI-1640-Medium mit 10% durch Wärme inaktiviertem Fötalem Bovinem Serum (FBS), Glutamin und Antibiotika erfolgt. Zellen werden bei 37 °C in einer Atmosphäre aus Luft mit einem CO₂-Anteil von 5% vermehrt. Bei den hierfür verwendeten Viren handelt es sich um die HIV-1-Isolate IIIB und/oder RF, die mittels eines akuten Infektionsprozesses präpariert werden. Die Infektion der MT-2-Zellen mit Viren wird in einem Masseninfektionsvorgang vorgenommen. Die geeignete Anzahl an Zellen wird mit infektiösen Viren in einer konischen Zentrifugenröhre bei geringem Gesamtvolumen von 1–2 Millilitern vermischt. Im Anschluss an eine vierstündige Inkubation werden die infizierten Zellen auf die passende Endkonzentration von 5 × 10⁴ Zellen pro Milliliter mit frischem Gewebekulturmedium gebracht. Nicht infizierte Zellen mit der gleichen Konzentration werden für die Toxizitäts- und Zellenkontrollen plattiert. Die MOI wird reguliert, damit bis zum sechsten Tag eine komplette Zelltötung in den Viruskontroll-Wells stattgefunden hat. Viruspartikel werden mittels Standardverfahren konzentriert und mithilfe von RT-Assays (Fletcher, u.a., 1995a, 1995b) und p24-Antigen-Assays quantifiziert.
INAKTIVIERUNG VON HIV-PARTIKELN
Sobald die HIV-Partikel gereinigt und quantifiziert sind, wird die 50% Gewebekulturinfektionsdosis ([TCID₅₀] = 5 × 10⁴) in Anwesenheit des Vier- bis Achtfachen der 50% inhibitorischen Konzentration (IC₅₀) des Photoaffinitätsmarkierungsmoleküls inkubiert. Im Fall von Azido-Dipyridodiazepinon beläuft sich die IC₅₀ auf 160 nM. Was Thiocarboxanilid und Azido-Thiocarboxanilid anbelangt, beläuft sich IC₅₀ auf 0,2 nM.
Inkubationen wurden in RPMI 1640 ohne FBS zwei Stunden lang bei 37 °C durchgeführt, wobei alle 15 Minuten leicht gerührt wurde. Unter Verwendung einer GE 275 W Sonnenlampe, die eine UV-Strahlungsintensität von etwa 15 μW/cm² liefert, wurden die Gemische aus viralen Partikeln und Photoaffinitätsmarkierungen über eine Zeitdauer von mindestens 50 Minuten ultraviolettem Licht ausgesetzt. Nach diesem Vorgang enthielt die Lösung HIV-1-Partikel, die eine vollständig inaktivierte reverse Transkriptase aufwiesen und somit unfähig zur Infizierung suszeptibler Zellen waren.
Die Infektivität der inaktivierten Viruspartikel wird mithilfe kontrollierter Versuche bestimmt, bei denen es trotz Aussetzung suszeptibler Zellen gegenüber erhöhten Konzentrationen dieser Partikel nicht zur Infektion der Zellen kommt, wie sowohl durch das von Yang, u.a. (1998) beschriebene sensitive hemi-nested-PCR-Verfahren als auch durch die fehlende Produktion von viralen Partikeln, reverser Transkriptase und p24 belegt. Ein solches Verfahren zur Untersuchung der Produktion von Viruspartikeln wird von Borkow, u.a. (1997) umrissen. Kurz ausgedrückt, werden 0,5 ml konzentrierter inaktivierter Virus zu 0,5 ml von Phytohemagglutinin-aktivierten mononuklearen Zellen von Nabelschnurblut (CBMC) (4 × 10⁶ Zellen) in RPMI 1640–10% FBS gegeben und zwei Stunden lang bei 37 °C unter gelegenlichtem sanften Mischen inkubiert. Das HIV-CBMC-Inkubationsgemisch wird mit der Zugabe von 10 ml RPMI 1640 diluiert, und Rest-HIV wird durch zehnminütiges Pelletieren der Zellen bei 300 × g entfernt, gefolgt von der Entfernung des Überstands und der Resuspension der Zellen in 2 ml RPMI 1640–10% FBS, enthaltend Interleukin-2 (10 U/ml). Die gesamte Probe wird in einen einzigen Well eines 24-Well-Dish plattiert. Nach viertägiger Kultivierung wird 1 ml Medium entfernt und durch 1 ml frisches Medium ersetzt. Am siebten Tag werden Kulturüberstände isoliert, und die HIV-Produktion wird durch die Messung der RT-Aktivität- und p24-Antigen-Level in diesen zellfreien Überständen beurteilt; und die Zellen werden durch das hemi-nested-PCR-Verfahren von Yang, u.a. (1998) auf Integration hin überwacht.
BEISPIEL 3 – PRODUKTION NICHTINFEKTIÖSER NASZENTER VIREN AUS UC781^TM-BEHANDELTEN HIV-INFIZIERTEN ZELLEN
Es wurde gezeigt, dass UC781^TM nicht nur das gereinigte Virus, sondern auch das naszente Virus aus HIV-infizierten Zellen inaktiviert, die in Anwesenheit der Verbindung gezüchtet werden (Borkow, u.a., 1997, hierin durch Bezugnahme eingegliedert). Die von Borkow, u.a. beschriebenen Verfahren lassen sich zur Produktion inaktivierter Viren zwecks Verwendung in der vorliegenden Erfindung einsetzen. Außerdem können die Verfahren angewandt werden, um einen Ganzzellimpfstoff zu schaffen, in dem die Zellen zwar HIV-infiziert sind, aber durch UC781^TM nichtinfektiös gemacht werden. Ein Ganzzellenimpfstoff umfasst die Injektion HIV-infizierter Zellen. Die Injektion ganzer Zellen kann eine stärkere Immunreaktion auf das Virus verschaffen. Die Verfahren von Borkow, u.a. (1997) sind nachstehend erläutert.
INKUBATION CHRONISCH HIV-1-INFIZIERTER H9-ZELLEN MIT UC781^TM
Chronisch infizierte H9-Zellen (5 × 10⁵ Zellen) werden mit 10 μM UC781^TM bei einem Gesamtvolumen von 1 ml RPMI 1640–10% FBS achtzehn Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Dann werden die Zellen durch zehnminütiges Zentrifugieren bei 300 × g von den Kulturüberständen getrennt. Die pelletierten H9-Zellen werden durch Suspension in 10 ml RPMI 1640 gewaschen, gefolgt von zehnminütigem Zentrifugieren bei 300 × g. Das Zellpellet wird in 4 ml RPMI 1640–10% FBS resuspendiert und in Cokultur-Untersuchungen zur Bestimmung der Infektivität benutzt (Borkow, u.a., 1997).
INKUBATION PERIPHERER BLUTLYMPHOCYTEN MIT UC781^TM
Zellen peripherer Blutlymphocyten (PBL) (2 × 10⁶ Zellen), die aus Blut HIV-1-infizierter Patienten isoliert sind, werden mit Medium und 10 μM UC781^TM bei einem Gesamtvolumen von 1 ml zwei Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Überschüssiges Wirkungsmittel kann durch Pelletieren der Zellen durch zehnminütiges Zentrifugieren bei 300 × g und Entfernung des Mediums entfernt werden. Das Zellpellet wird durch Suspension in 10 ml Medium gewaschen, woraufhin eine Zentrifugierung folgt. Dieser Schritt des Waschens wird zweimal wiederholt. Das endgültige Zellpellet wird in 1 ml Medium oder einer anderen isotonischen Lösung resuspendiert. Um zu gewährleisten, dass die Zellen nichtinfektiös sind, werden sie mit 1 ml aktivierter CBMC (2 × 10⁶ Zellen) co-kultiviert. Das Kulturmedium wird alle zwei Tage gewechselt, und frische aktivierte CBMC (2 × 10⁶ Zellen) werden einmal pro Woche hinzugegeben. Die Überwachung der HIV-1-Produktion erfolgt durch Messung der p24-Antigen-Levels in zellfreien Kulturüberständen. Die Integration des Virus wird durch das hemi-nested-PCR-Verfahren von Yang, u.a. (1998) getestet.
BEISPIEL 3 – KLINISCHE STUDIE ÜBER HIV-IMPSTOFF
Dieses Beispiel beschreibt ein Protokoll zwecks Erleichterung einer klinischen Studie über einen HIV-Impfstoff. Die verschiedenen Elemente der Durchführung einer klinischen Studie, einschließlich der Behandlung und Überwachung von Patienten, sind Fachleuten auf diesem Gebiet angesichts der vorliegenden Offenbarung wohl bekannt. Im Allgemeinen sollte die klinische Studie über den aus inaktivierten viralen Partikeln bestehenden Impfstoff darin bestehen, dass derartige virale Partikel, die durch die Photomarkierung reverser Transkriptase erzeugt werden, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, menschlichen Probanten verabreicht werden, um die Sicherheit und die zelluläre, antikörperbezogene, humorale und weitere klinische Antworten zu beurteilen. Die folgenden Informationen werden als allgemeine Richtlinie zur Verwendung bei klinischen Untersuchungen über HIV-Impfstoffe dargelegt. Informationen, welche den Aufbau klinischer Untersuchungen betreffen, können auch dem HIV Experimental Vaccine Directory der American Foundation for AIDS Research, Band 1, Nr. 2, Juni 1998, entnommen werden.
Geeignete Probanden:

Erwachsene Männer und Frauen, die HIV-seronegativ sind.

Einschlusskriterien für die Probanden:

Patientenalter: 18 Jahre – 60 Jahre.

Kriterien hinsichtlich der Fortpflanzung:

Negativer Schwangerschaftstest. Abstinenz oder wirksames Verfahren zur Geburtenkontrolle/Kontrazeption während der Untersuchungen.

Einschlusskriterien:
Die Probanden müssen gesund sein nach den Maßstäben einer normalen ärztlichen Untersuchung und gemäß normalen Laborwerten, wie sie von der WHO für Teilnehmer an klinischen Untersuchungen definiert sind. Des Weiteren müssen Probanden in der Lage sein, eine Einverständniserklärung zu verstehen und zu unterschreiben. Probanden müssen außerdem ein normales Blutbild aufweisen, und zwar sowohl bezüglich Leukozyten, Lymphozyten, Granulozyten und Blutplättchen als auch bezüglich Hämoglobin und Hämatokriten. Die folgenden Parameter müssen bei den Probanden ebenfalls normal sein: Harnuntersuchung, BUN, Kreatinin, Bilirubin, SGOT, SGPT, alkalische Phosphatase, Calcium, Glucose, CPK, CD4⁺-Zellzahl und das Immunglobulin-Profil von normalem Serum.
Ausschlusskriterien:
Im Folgenden sind Ausschlusskriterien aufgeführt: HIV-Seropositivität; aktiver Alkohol- oder Drogenmissbrauch; Unfähigkeit zur Abgabe einer Einverständniserklärung; medikamentöse Behandlung, welche die Immunfunktion beeinflussen kann, ausgenommen eine geringe Dosis NSAIDS von nicht verschreibungspflichtiger Stärke, Aspirin oder Acetaminophen für akute Leiden, wie z.B. Kopfschmerzen oder Trauma; jegliches Befinden, das nach Meinung des leitenden Forschers den Abschluss der Studien oder die Beurteilung der Ergebnisse beeinträchtigen könnte.
Randomisierung
Die Studie wird doppeltblind randomisiert. Beim Placebo wird es sich um die Impfstofflösung ohne die inaktivierten viralen Partikel handeln. Probanden wird auf Zufallsbasis einer der oben beschriebenen Impfstoffwege zugeteilt.
Dosierungsbereich
Dosierungen von 10⁴, 10⁶ und 10⁸ Partikeln werden zwecks klinischer Sicherheit und Immunogenität untersucht. Andere Dosen im Bereich von 10 bis 10²⁰ Partikeln können ebenfalls untersucht werden.
Verabreichung
Für jede zu testende Dosis kann der Plan die Verabreichung einer Dosis an den Tagen 0, 30, 60 und einer Booster-Dosis an Tag 180 vorsehen. Die Verabreichung wird intramuskulär vorgenommen. Zu den zusätzlichen Möglichkeiten können der subkutane, orale, intrarektale, intravaginale, intranasale/intramuskuläre, intrarektale/intramuskuläre, intranasale/subkutane und der intrarektale/subkutane Verabreichungsweg zählen.
Anzahl der Probanden je Verabreichungsweg:
Je Verabreichungsweg gibt es pro Dosierungsstufe 12 Probanden. Von diesen zwölf Probanden erhalten acht den Impfstoff und vier eine Lösung ohne inaktivierte virale Partikeln.
Dauer der Untersuchungen:
Zwei Jahre.
Endpunkte:
Der Endpunkt für klinische Sicherheit ist kein Beleg für die Veränderung der klinischen, immunologischen oder laboratorischen Parameter. Der Endpunkt für immunologische Effizienz ist die Serokonversion mit Produktion einer wirksamen zellulären, humoralen und antikörperbezogenen Antwort gegen HIV. Die wirksame immunologische zelluläre Antwort kann untersucht werden, indem Antworten cytotoxischer T-Lymphocyten gegen verschiedene Clades von HIV verwendet werden. Die humorale Antwort lässt sich dadurch beurteilen, dass die Erzeugung von IFN-Gamma-Freisetzung mittels eines modifizierten Elispot-Assays gemessen wird. Mittels Durchführung von Neutralisierungsuntersuchungen gegen verschiedene HIV-Clades kann die Antikörperproduktion bewertet werden.

Claims

Nichtinfektiöses HIV-Partikel mit der Fähigkeit, eine wirksame Immunantwort zum Schutz vor einer Infektion durch HIV hervorzurufen, das eine irreversibel inaktivierte reverse Transkriptase umfasst, wobei die reverse Transkriptase über die Bindung der reversen Transkriptase mit einer oder mehreren, eine Azido-Photoaffinitätsmarkierung aufweisenden Verbindungen, die die reverse Transkriptase binden, inaktiviert wurde und wobei die HIV-Partikel, die die durch die eine oder mehreren, eine Photoaffinitätsmarkierung aufweisenden Verbindungen gebundene reverse Transkriptase umfassen, mit UV-Licht bestrahlt werden, um die reverse Transkriptase irreversibel durch Licht zu inaktivieren.
HIV-Partikel nach Anspruch 1, das ferner als in einem pharmazeutisch verwendbaren Träger enthalten definiert ist.
HIV-Partikel nach einem der Ansprüche 1 und 2, wobei das HIV-Partikel HIV-1 ist.
HIV-Partikel nach Anspruch 3, wobei das HIV-1 zur Gruppe M oder zur Gruppe O gehört.
HIV-Partikel nach Anspruch 4, wobei die Gruppe M aus der aus Klade A, Klade B, Klade C, Klade D, Klade E, Klade F, Klade G, Klade H und Klade I bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
HIV-Partikel nach Anspruch 5, wobei die azidomarkierte Verbindung eine Azidodipyridodiazepinone oder Azido-UC781^TM ist.
Verfahren zur Herstellung eines HIV-Partikels nach einem der Ansprüche 1 bis 6 mit einer inaktiven reversen Transkriptase, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) man erhält ein reverse Transkriptase umfassendes HIV-Partikel; b) man erhält eine oder mehrere Verbindungen, die reverse Transkriptase inaktivieren können und eine Azido-Photoaffinitätsmarkierung aufweisen, wobei die Verbindung die reverse Transkriptase bindet; c) das HIV-Partikel wird mit der Verbindung so in Kontakt gebracht, dass die Verbindung die reverse Transkriptase bindet; d) das HIV-Partikel wird mit UV-Licht bestrahlt.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung mit einem HIV-Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) man erhält ein nach dem Verfahren von Anspruch 7 hergestelltes HIV-Partikel; und b) das Partikel wird in einen pharmazeutisch verwendbaren Träger eingebracht.
HIV-Partikel mit irreversibel inaktivierter reverser Transkriptase nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung beim Impfen.
Verwendung eines HIV-Partikels mit irreversibel inaktivierter reverser Transkriptase nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Medikaments zur Impfung gegen eine HIV-Infektion.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Medikament ferner definiert ist als Medikament zum Hervorrufen einer Immunantwort bei einem Tier.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Immunantwort eine zelluläre Antwort ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 11 und 12, wobei die Immunantwort eine humorale Antwort ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die zelluläre Antwort CD8+ T-Zellen und/oder CD4+ T-Zellen umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei das Tier ein Mensch ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 15, die ferner definiert ist als Verwendung eines irreversibel inaktivierte reverse Transkriptase nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfassenden HIV-Partikels zur Herstellung eines Medikaments zur Impfung eines HIV-negativen Tieres gegen eine HIV-Infektion.
Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 15, die ferner definiert ist als Verwendung eines irreversibel inaktivierte reverse Transkriptase nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfassenden HIV-Partikels zur Herstellung eines Medikaments für ein HIV-positives Tier.
Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 16, die ferner definiert ist als Verwendung eines irreversibel inaktivierte reverse Transkriptase nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfassenden HIV-Partikels zur Herstellung eines Medikaments zum Verzögern des Beginns von AIDS bei einem infektiösem HIV ausgesetzten Tier.