EP1846029A2 - Impf-adjuvanzien pam3cys, poly(i:c), imiquimod, loxoribine, r-848 und cpg-dna zusammen mit mhc i oder mhc ii epitopen - Google Patents

Impf-adjuvanzien pam3cys, poly(i:c), imiquimod, loxoribine, r-848 und cpg-dna zusammen mit mhc i oder mhc ii epitopen

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Publication number
EP1846029A2
EP1846029A2 EP05797932A EP05797932A EP1846029A2 EP 1846029 A2 EP1846029 A2 EP 1846029A2 EP 05797932 A EP05797932 A EP 05797932A EP 05797932 A EP05797932 A EP 05797932A EP 1846029 A2 EP1846029 A2 EP 1846029A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
pharmaceutical preparation
mammal
administration
toll
cells
Prior art date
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Ceased
Application number
EP05797932A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hansjörg Schild
Tobias Warger
Markus Radsak
Gerd Rechtsteiner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Original Assignee
Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
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Filing date
Publication date
Application filed by Johannes Gutenberg Universitaet Mainz filed Critical Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical preparation comprising at least one Toll-like receptor ligand and at least one peptide.
  • the invention also relates to the use of such a pharmaceutical preparation and also relates to a vaccination method.
  • the adaptive immune system plays an important role in the immune defense against certain microorganisms, for example viruses, certain fungi and bacteria, as well as in the detection and rejection of malignant (degenerate) cells (tumor cells). This will be sick, d. H. Virus-infected or malignant cells specifically recognized and eliminated by so-called cytotoxic T cells (CTL).
  • CTL cytotoxic T cells
  • a necessary prerequisite for recognition of the diseased cells by the cytotoxic T cells is the interaction of the T cell receptor (T cell receptor) of the cytotoxic T cells with a major histocompatibility complex I (major histocompatibility complex I; MHC I).
  • MHC class I molecules protein fragments (peptides consisting of 8 to 10 amino acids, so-called MHC class I ligands) are presented on the cell surface. These are then specifically recognized by a T cell receptor (TCR). MHC class I ligands are generated in each cell by enzymatic degradation and presented on the cell surface (so-called self-peptides). Virus-specific or tumor-specific self-peptides are also presented on virus-infected cells or malignant cells. Such cells can thus be recognized and destroyed by cytotoxic T cells (CTL) with a virus-specific or tumor-specific T cell receptor.
  • CTL cytotoxic T cells
  • CTL cytotoxic T cells
  • STL cytotoxic T cells
  • T cell receptor MHC I self-peptides
  • CTL In order to prevent the damage of healthy cells, which also present self-peptides, by cytotoxic T cells (CTL), in addition to the specific interaction between T cell receptor and MHC I self-peptide, CTL must be supplemented by additional co-potentials. stimulatory signals are first activated, so that they can then recognize and destroy their target cells (virus-infected cells or tumor cells). Without prior activation, a cytotoxic T cell (CTL) can not recognize and destroy the target cell via its specific self-peptides, despite its specific T cell receptor specific for a particular (eg virally infected or malignant) cell.
  • CTL cytotoxic T cell
  • cytotoxic T cells which have specific receptors for self-peptides presented on cells are incorrectly activated, for example in the context of an infection, this can lead to reactions of cytotoxic T cells against cells of healthy tissue.
  • the regulation of the activation of cytotoxic T cells is thus of central importance for whether a specific immune response is initiated or not.
  • Antigen-presenting cells are specialized cells which very efficiently take up and present antigens (for example viruses or bacteria). Examples are dendritic cells (DC) or the Langerhans cells in the skin. In the presence of danger signals, DCs mature, leading to an upregulation of co-stimulatory signals In this situation, the recognition of antigens leads to the activation of cytotoxic T cells (CTL) and to the initiation the immune response.
  • CTL cytotoxic T cells
  • TLR toll-like receptors
  • Dendritic cells can be of a different nature, for example from activated T-helper cells or also directly from pathogens. If the "danger signals" of pathogens stem from pathogens, for example Recognition of certain conserved structures of viruses, bacteria or fungi, through which Toll-like receptors take place.
  • TLRs Toll-like receptors
  • LPS lipopolysaccharides
  • WO-A 01 / 015,698 and WO-A 045,494 disclose the recognition of various viral structures which occur in connection with human and animal diseases of viral origin by TLR7, ie the substance imiquimod ⁇ 1- (2-methylpropyl) 1 H-imidazo [4,5-c] chi-nolin-4-amine ⁇ .
  • Tumor immunology encompasses a wide field of biological phenomena which include the interaction of malignant degenerate cells with the innate and adaptive immune system.
  • T cells play a central role, as they can specifically recognize and eliminate tumor cells. Since most of the tumor-associated proteins are intracellular, T cells are apparently the most suitable tool to elicit a tumor-specific immune response. Namely, antibodies can not enter the cell, and innate immune cells lack the high specificity of T cells.
  • cytotoxic T cells which eliminate only diseased cells but spare healthy ones, is an attractive target.
  • Adotevi and WH Fridman Synthetic and natural non-live vectors: rational for their clinical development in Cancer Vaccine protocols; Vaccine, December 19, 2002: 20 (Suppl. 4), A 32-39 ";” R. Edelmann; Adjuvants for the Future, in: MM Levine, GC Woodrow, JB Kaper, GS Cobon (ed.), New Generation Vacines, Volume 2, New York, Marcel Dekker (1997), 173-192) "; and "S. Agrawal, ER Kandimalla; Modulation of Toll-like Receptor 9 responses by synthetic immunostimulatory motifs of DNA; Ann. NY Acad. Be. 2003 (Dec.): 1002, 30 - 42.
  • T cells Due to the importance of T cells for the elimination of intracellular pathogens and tumor cells, recent immunization strategies attempt to address T cells, in particular cytotoxic T cells, which would also open up the possibilities of therapeutic vaccinations. All previous vaccination strategies have in common that they function reasonably well in practice, so that, for example, cytotoxic T cells can be measurably activated in patients and their number can be increased. However, the methods are only moderately good able to generate efficient T cell responses, in particular to achieve sufficient tumor rejection. In addition, the known vaccination methods are still associated with significant side effects up to toxicity ["E. Tartour et al., Loc. Cit. ", And” R. Edelmann, loc. Cit. "]. Namely, it is known from animal models that immunizations with CpG-DNA have side effects which considerably limit the use of this adjuvant. In addition, especially the DC-based methods are associated with an effort that can not be transferred into everyday hospital practice or everyday practice.
  • the object of the invention was to contribute to a significantly improved generation of cytotoxic T cells by an efficient activation, without causing the disadvantages of the prior art occur.
  • activation of Toll-like receptors should efficiently achieve the activation of antigen-presenting cells.
  • Another object of the invention was to show a way to non-invasive Auslö ⁇ solution of a systemic, T-cell-mediated immune response.
  • Yet another object of the invention was to provide an inexpensive vaccine concept for the generation of cytotoxic T cells that is inexpensive and requires only little technical effort.
  • Yet another object of the invention was to provide preparations for novel immunological-based preventive and therapeutic methods against a broad spectrum of diseases, including diseases or tumors induced by viruses or bacteria.
  • topically administrable preparations which have the necessary T-cell receptor-specific peptides tid-signal substances together with a ligand for a toll-like receptor, non-invasively capable of triggering a systemic T-cell-mediated immune response by generating specific cytotoxic T cells in the Location are.
  • This demonstrates a simpler, faster, and more efficient way to induce immune responses to any T cell antigen.
  • the invention thus relates to a pharmaceutical preparation which comprises at least one Toll-like receptor ligand, at least one peptide and optionally one or more substance (s) from the group carriers, excipients and additives.
  • Preferred embodiments of the pharmaceutical preparation result from the subclaims 2 to 10.
  • the invention also relates to the use of a pharmaceutical preparation as described in detail hereinafter for the prophylaxis and / or therapy of diseases induced by viruses and / or bacteria and / or fungi in a mammal or for the production of a medicament for prophylaxis and / or therapy of diseases induced by viruses and / or bacteria and / or fungi in a mammal.
  • the invention also relates to the use of a pharmaceutical preparation as described in detail below for the prophylaxis and / or treatment of diseases caused by excessive cell proliferation in a mammal or for the production of a medicament for the prophylaxis and / or treatment of excessive cell proliferation. Proliferation-related diseases in a mammal.
  • the invention also relates to methods for the prophylaxis and / or therapy of diseases induced by viruses and / or bacteria and / or fungi in a mammal or for the prophylaxis and / or treatment of diseases caused by excessive cell proliferation, which involve the administration of a pharmaceutically preparation according to the following detailed description to the mammal in an effective for the prophylaxis and / or treatment of said diseases concentration of the pharmacologically active Kom ⁇ components.
  • the invention also relates to a method for the prophylactic and / or therapeutic activation of the adaptive immune system of a mammal, which comprises administering to the mammal a pharmaceutical preparation as described in detail below for prophylactic and / or therapeutic activation of the mammalian subject
  • a method for the prophylactic and / or therapeutic activation of cytotoxic T cells of the immune system of a mammal which comprises administering a pharmaceutical preparation as described in detail below to the mammal in a mammalian immune system for the prophylactic and / or therapeutic activation of the cytotoxic T cells effective concentration of the pharmacologically effective men components comprises.
  • compositions according to the invention comprise as an essential component at least one Toll-like receptor ligand (TLR ligand).
  • TLR ligands in the present description and in the claims mean those compounds of natural and / or synthetic origin which are recognized by at least one Toll-like receptor and which promote the immune response Signals are useful.
  • the Toll-like receptor ligand (s) which can be used according to the invention can be natural or synthetic or synthetically modified natural compound (s).
  • the Toll-like receptor ligand (s) may be synthetic substances.
  • the previously known Toll-like receptor ligands are divided into groups of the compounds recognized by the respective Toll-like receptors TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, etc.
  • Toll-like receptors So far 11 Toll-like receptors (up to TLR11) are known.
  • the ligands are commonly referred to as TLR1 ligands, TLR2 ligands, TLR3 ligands, TLR4 ligands, etc., to TLR11 ligands.
  • TLR1 ligands TLR1 ligands
  • TLR2 ligands TLR2 ligands
  • TLR3 ligands TLR3 ligands
  • TLR4 ligands etc.
  • the invention relates to a pharmi ⁇ cal preparation in which the at least one Toll-like receptor ligand is selected from TLR2 ligand, TLR3 ligand, TLR7 ligand, TLR8 ligand and TLR9 ligand.
  • a TLR7 ligand is used according to the invention.
  • the pharmaceutical preparation comprises at least one, more preferably exactly one Toll-like receptor ligand selected from the group consisting of compounds of natural and / or synthetic origin, which is derived from at least one Toll-like Re ⁇ zeptor be recognized and for triggering one or more the immune response promotional signals (s) are useful.
  • the term "natural and / or synthetic origin” is understood to mean that the compounds suitable as ligands of at least one toll-like receptor are either a compound also naturally occurring as a toll-like receptor ligand or an artificially synthesized compound Ligand, however, any suitable compound or a naturally occurring but synthetically modifying compound is (for example-but not exclusively-one of the compounds as described in the document WO-A 00/040228), or a naturally occurring as Toll-like receptor ligand as described above, which modifies chemically For example, it has been substituted or otherwise derivatized.
  • the at least one Toll-like receptor ligand is selected from the group consisting of Pam3Cys, poly (I: C), imiquimod, loxoline, R-848 and CpG DNA.
  • the Toll-like receptor ligand is imiquimod.
  • the compound known per se under the name "imiquimod” has the chemical name 1 - (2-methylpropyl) -1H-imidazo [4,5-c] quinolin-4-amine.
  • the pharmaceutical preparation comprises at least one peptide.
  • Suitable peptides are synthetic and / or natural peptides. According to the invention, “synthetic and / or natural” is understood to mean that the peptide is either a naturally occurring peptide or an artificially synthesized peptide which is nevertheless suitable according to the invention or a naturally occurring but synthetically modified peptide
  • synthetic and / or natural is understood to mean that the peptide is either a naturally occurring peptide or an artificially synthesized peptide which is nevertheless suitable according to the invention or a naturally occurring but synthetically modified peptide
  • it is also possible to use two or more peptides The use of a single peptide is preferred according to the invention because of the specificity of the signal triggering.
  • the at least one peptide is selected from major histocompatibility complex class I ligand, major histocompatibility complex class II ligand and other peptides containing these ligands.
  • Such peptides are furthermore preferably antigens for recognition by cytotoxic T cells and are even more preferably peptides of viral or bacterial origin or tumor antigens. specific peptides or tumor-associated peptides. These can be presented by MHC class 1 molecules as well as MHC class II molecules.
  • the pharmaceutical preparations according to the invention may optionally also contain one or more substances from the group of carriers, auxiliaries and additives.
  • these include, by way of example, without limiting the invention to this, one or more substances from the group Group hydrophilic and lipophilic Lö ⁇ sungsstoff, solubilizing agents, emulsifiers, viscosity adjusting agents, pH adjusting agents, chelating agents, preservatives, means for providing a basis for topical application (ointment and / or Cream bases), means for increasing the Penetrations ⁇ assets of the skin, etc ..
  • auxiliaries and additives isostearic acid, benzyl alcohol, cetyl alcohol, stearyl alcohol, white petrolatum, polysorbate 80 R , sorbitan stearate, glycerol, methyl 4-hydroxybenzoate, propyl 4-hydroxybenzoate, xanthan gum, purified water.
  • the amounts of the essential components contained in the pharmaceutical preparation according to the invention which is prophylactically and / or therapeutically effective in a specific situation depends on various factors, such as For example, the activity of the specific combination of at least one a Toll-like receptor ligand and at least one (synthetic) peptide, the route of administration, the frequency of administration, the specific formulation, the disease state to be treated and the constitution of the mammal or patient to be treated. Experts with expertise in this technical field can conveniently determine effective amounts in the individual case on the basis of some orienting experiments and the information contained in the present description.
  • prophylactically and / or therapeutically effective amount in the present description and in the claims means the amount of the combination of the two essential components (optionally several compounds of the two respective components Toll-like receptor ligand or synthetic Peptide) which is sufficient to induce a prophylactic effect and / or a therapeutic effect, for example a prophylactic and / or therapeutic effect in the prophylaxis and / or therapy of a particular disease, for example an inflammatory disease or disease caused by viruses or bacteria or the like or in the prophylaxis and / or therapy of a disease or tumor disease caused by excessive cell proliferation
  • a prophylactically and / or therapeutically effective amount is also an amount sufficient to provide the adaptive immune system of a mammal prophylactic and / o to therapeutically activate, or an amount which is sufficient to prophylactically and / or therapeutically activate cytotoxic T cells of the immune system of a mammal.
  • Preference according to the invention is given to pharmaceutical preparations which comprise at least one Toll-like receptor ligand in an amount of from 0.1 to 10% by weight; at least one peptide in an amount of 0.01 to 30% by weight; and one or more substance (s) from the group carriers, excipients and additives in a total amount of 0.1 to 99.9 wt .-%, each based on the total weight of the pharmaceutical preparation.
  • compositions according to the invention which include: at least one Toll-like receptor ligand in an amount of 1 to 10 wt .-%; at least one peptide in an amount of 0.1 to 5 wt%; and one or more substance (s) from the group carriers, excipients and additives in a total amount of 0.5 to 99 wt .-%, each based on the total weight of the pharmaceutical preparation.
  • a particular exemplary pharmaceutical preparation which does not limit the invention comprises at least one Toll-like receptor ligand in an amount of 1 to 5% by weight; at least one peptide in an amount of 0.2 to 2% by weight; and one or more substance (s) from the group carriers, excipients and additives in a total amount of 93 to 99 wt .-%, each based on the total weight of the pharmaceutical preparation.
  • the pharmaceutical preparation according to the invention comprises the at least one toll-like receptor ligand and the at least one peptide in a formulation for joint administration and action.
  • the two essential components are contained in a common formulation, ie they are administered together and can then jointly develop a prophylactic and / or therapeutic effect. In addition to the simple administration, this also permits precise dosing of the two components.
  • Conceivable examples of such pharmaceutical preparations according to the invention are - without the invention being limited thereto - solutions or suspensions for intraperitoneal administration, creams or ointments for a topical one , z.
  • a particularly preferred embodiment of such a pharmaceutical preparation according to the invention is a formulation suitable for topical administration.
  • a particularly illustrative, but not limiting example of such a preparation is an ointment, cream, solution or suspension for topical, ie epidermal, administration, for example for topical administration of the preparation to the skin of the mammal.
  • a commercially available cream is used which contains 5% of the Toll-like receptor ligand imiquimod in a conventional cream base (Aldara R , company 3M).
  • a particularly preferred example of a pharmaceutical preparation according to the present invention is one for the topical administration of a component and for the non-topical, preferably the subcutaneous or intradermal administration of one other component suitable for the joint action.
  • This embodiment has the advantage that the respective components can be administered by the respective administration route, which guarantees their best possible joint action in the mammal to be treated.
  • a still further preferred embodiment of the invention is a pharmaceutical preparation in a topical administration least Toll-like receptor ligand and a non-topical, preferably subcutaneous or intradermal administration of at least one peptide with the aim ( and the result) of the common action suitable formulation.
  • the at least one, more preferably the Toll-like receptor ligand is formulated in the form of a cream which can be administered epidermally, while the at least one peptide is formulated in the form of a solution or suspension, which are administered subcutaneously or intradermally can.
  • the invention also relates to uses of a pharmaceutical preparation as described in detail above. Such uses are in the fields
  • Prophylaxis and / or therapy of viruses and / or bacteria and / or fungus-induced diseases of a mammal Prophylaxis and / or therapy of viruses and / or bacteria and / or fungus-induced diseases of a mammal;
  • Prophylaxis and therapy of diseases caused by excessive cell proliferation such as tumor diseases of a mammal;
  • a medicament for the prophylaxis and therapy of diseases caused by exzensive cell proliferation such as tumor diseases of a mammal.
  • the use according to the invention of the pharmaceutical preparation is particularly advantageous in the prophylaxis and / or treatment of inflammatory diseases, more preferably in the prophylaxis and / or treatment of diseases caused by viral or microbial pathogens, while according to the invention a use of the pharmaceutical preparations in diseases caused by exz zessive cell proliferation and especially in tumor diseases is particularly preferred.
  • any mammals can be treated. Examples are mice, rats, guinea pigs, cats, dogs, monkeys and humans. In particularly preferred embodiments of the use of the pharmaceutical preparations according to the invention, the treated mammal is a human.
  • the pharmaceutical preparation is used by topical application of the pharmaceutical preparation, more preferably by way of epidermal administration, that is to say the application of the pharmaceutical preparation to the skin of the mammal.
  • an epidermal pharmaceutical preparation comprises both at least one Toll-like receptor ligand and at least one peptide in one phase for joint action on the body through the skin of the mammal. It has been found according to the invention surprisingly that in this way a rapid absorption of the active ingredients through the skin can be achieved and subsequently generates an efficient specific immune response of the cytotoxic T cells and thus a reliable detection and elimination of diseased cells from the Mammalian body can be initiated.
  • Another, likewise preferred use of the pharmaceutical preparation according to the invention is carried out by means of the separate topical application of one component and non-topical, preferably subcutaneous or tradermal, application of another component with the aim and result of a joint effect. This is even more preferably done by means of the topical application of a component to the skin of the mammal and the subcutaneous or intradermal application of another component which takes place immediately before or after or simultaneously with the topical application, wherein surprisingly a common action occurs.
  • a formulation comprising at least one toll-like receptor ligand is administered topically (eg epidermally) and comprises at least one peptide such as an MHC class I ligand Formulation shortly before or after the topical application of the other Kom ⁇ component or substantially simultaneously with this non-topically, for example, subcutaneously or intradermally, is applied, (wherein the reverse order can be selected), a common effect of the two Components Toll-like receptor ligand and MHC class I ligand in so far as - as in the common administration of both components in a preparation in the same application route - in the skin antigen-presenting cells bind and present the MHC class I ligand and simultaneously stimulated by the Toll-like receptor ligand to mediate latorischer signals are stimulated.
  • the invention also relates to a method for the prophylaxis and / or therapy of diseases induced by viruses and / or bacteria and / or fungi in a mammal, which comprises administering to the mammal, in a prophylactic manner, a pharmaceutical preparation according to the above detailed description and / or therapy of said diseases comprises effective concentration of the pharmacologically active components.
  • the invention also relates to a method for the prophylaxis and / or therapy of diseases caused by excessive cell proliferation (in particular tumor diseases) in a mammal, which comprises administering to the mammal a pharmaceutical preparation according to the above detailed description a concentration of the pharmacologically active components effective for the prophylaxis and / or therapy of said diseases.
  • the invention furthermore relates to a method for the prophylactic and / or therapeutic activation of the adaptive immune system of a mammal, which comprises administering a pharmaceutical preparation according to the detailed description to the mammal in a prophylactic and / or therapeutic activation of the immune system of the mammal effectively comprises concentration of the pharmacologically active components.
  • the invention also relates to a method for the prophylactic and / or therapeutic activation of cytotoxic T cells of the immune system of a mammal, which comprises administering a pharmaceutical preparation according to the above detailed description to the mammal in a prophylactic and / or therapeutic activation of the cytotoxic T cells comprises effective concentration of the pharmacologically active components.
  • prophylactic refers to a treatment or effect of a treatment of the mammalian body of preventive character, that is, with the aim of achieving a treatment Illness does not come to the outbreak. This excludes the cases in which a treatment is taken preventively in order to prevent the onset of the disease for the first time, such as also the cases in which a treatment is followed by a preventive measure in order to prevent a re-entry of a disease after previously successful therapy and healing for the umpteenth time.
  • therapy refers to a treatment or effect of a treatment of the mammalian body in the case of an already outbreak of a disease for the latter and / or complete cessation, adjusting a healthy state of the body of the mammal.
  • a prophylactic activation of the adaptive immune system or a prophylactic activation of cytotoxic T cells is understood as an activation intended to prevent the development of a disease, while the corresponding therapeutic activation is the rapid and / or complete termination of an already outbreak of the disease serves.
  • the present invention preferably relates to the therapeutic component, i. H. the rapid reaction to a currently occurring disease state involving the mammalian immune system.
  • the treatment involves the administration of a pharmaceutical preparation according to the invention as described in detail above to a mammal as an essential step, optionally after or before other steps of the method, the same Prophylaxis and / or therapy goal.
  • the administration can be effected by any desired route, without the invention being restricted to a particular route.
  • an intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous or intradermal, topical (eg epidermal), oral, intranasal, etc. administration are possible.
  • preference is given to a method in which the administration of the pharmaceutical preparation takes place by a topical route, more preferably wherein the pharmaceutical preparation is applied to the skin of the mammal, in particular of man. This route of administration opens up the possibility of generating an efficient specific immune response with activation of the cytotoxic T cells in a simple manner that is surprising for the person skilled in the art.
  • Another, likewise preferred embodiment of the invention relates to a method in which the administration of a part of the pharmaceutical preparation with at least one component is carried out by topical route and the administration of at least one other part of the pharmaceutical preparation with another component to non- topical, preferably by subcutaneous or intradermal route to the target and with the result ei ⁇ ner joint effect.
  • This can even more preferably take place in the manner that the administration of a part of the pharmaceutical preparation with at least one component is carried out by application to the skin of the mammal and the administration of another part of the pharmaceutical preparation with at least one other component
  • Subcutaneous or intradermal administration to the mammal is carried out immediately or before or after or simultaneously with the application to the skin, with the aim and with the result of joint action.
  • the components in particular which of the essential components of the pharmaceutical preparation according to the invention is administered topically and which of the essential components of the pharmaceutical preparation according to the invention are administered non-topically, for example (but not limited) subcutaneously or intradermally, since activation of the adaptive immune system can be achieved with the method according to the invention on independent routes of administration of the individual components of the preparation.
  • the administration of a part of the preparation which at least one Toll-like receptor ligand is carried out by topical application to the skin and the administration of another part of the preparation comprising at least one peptide is carried out by means of subcutaneous or intradermal administration.
  • the procedure of the invention the two application steps are performed either simultaneously or immediately sequentially, since the goal is the joint effect of both components, which is surprisingly achieved in practice, even if the routes of administration are different.
  • the order is not restricted according to the invention, but it is preferred if the topical (epidermal) administration of the Toll-like receptor ligand takes place immediately after the non-topical (for example subcutaneous or intradermal) administration of the peptide, for example of the MHC class I ligands.
  • the immunization of the mammal or the human patient achieved by the application of the components of the pharmaceutical preparation in common or in succession is optionally repeated several times, it being possible to choose any time interval between the treatments, but preferably a time of at least 24 h ⁇ two applications is located. This has the advantage that the efficiency of the treatment is significantly increased and at the same time side effects are minimized.
  • the amounts of the pharmaceutical preparation which are administered according to the invention are freely selectable by the person skilled in the art and are not subject to any restrictions. However, it has been found to be practical to use the pharmaceutical preparations, given as a single-dose dose, in an amount ranging from 0.1 to 100 mg of the preparation per kg of body weight of the mammal to be treated, more preferably in an amount in the range of 0.1 to 10 mg of the preparation per kg of body weight of the mammal to be treated and even more preferably in an amount in the range of 0.1 to 1 mg of the preparation per kg of body weight of sunu ⁇ gers to be treated. It is also possible according to the invention to specify the amounts as amounts of preparation per surface of the body of the mammal to be treated.
  • the amounts are then in preferred embodiments of the invention 0.1 to 500 mg of the preparation per 50 to 250 cm 2 body surface of the mammal to be behan ⁇ , more preferably 0.1 to 100 mg of preparation per 10 to 50 cm 2 body surface, even more preferably 0.1 to 5 mg of preparation per 4 to 10 cm 2 body surface of the mammal to be treated.
  • the treatment may - as stated above - be repeated one or more times with the same or slightly different amounts from the aforementioned amounts.
  • mice which codes for a specific T-cell receptor which has a specific MHC class I ligand (SGPSNTPPEI, abbreviated SGP) from the adenovirus type 5 in the context of MHC class I (FIG. H2-D b ) detects.
  • SGPSNTPPEI specific MHC class I ligand
  • the cytotoxic T cells (CTL) from these animals were only then activated when b with this MHC class I ligand SGP in the context of H2 D come into contact.
  • CTL cytotoxic T cells
  • the non-activated (“naive") CTL from transgenic donor mice were injected intravenously (iv) into syngeneic recipient mice which differ in the lymphocyte marker allele ( CD45.1 on transgenic cells or CD45.2 on cells of the recipient mice.)
  • the activation or expansion of the specific (CD45.1-positive) CTL can be followed.
  • mice The following mice were used:
  • an imiquimod-containing cream (Aldara R 5%, company 3M) was used.
  • the peptide SGPSNTPPEI from the E1A protein of adenovirus type 5 was synthesized by PD Dr. med. Stefan Stevanovic, Institute of Cell Biology, Dept. Immunology, University of Tübingen.
  • mice were killed; the spleen was removed, treated with 5 ml of phosphate buffered saline solution (PBS) and crushed with the punch of a 5 ml syringe in a 70 ⁇ m nylon mesh over a 50 ml tube.
  • the cells were rinsed into the tube with an additional 5 ml of PBS and centrifuged off (1500 rpm, 3 min).
  • the cell pellet was resuspended in 5 ml of ice-cold ACK buffer (150 mM NH 4 Cl, 1 mM KHCO 3 , 0.1 mM EDTA, pH 7.3) and incubated for 5 min at RT.
  • the cells were spun down and washed once with PBS.
  • the cells were counted using a Neubauer counting chamber and resuspended at 12 x 10 6 cells per ml in PBS.
  • spleen suspension 250 ⁇ l of the spleen suspension (equivalent to 3 ⁇ 10 6 cells) were drawn into a 1 ml syringe and stored on ice until injection. The recipient mice were clamped in a holder and the cell suspension was injected intravenously into the tail vein.
  • mice were shaved under anesthesia (Metofane, Janssen-Cilag company) so that a bald spot of about 10 cm 2 was formed.
  • anesthesia Metalofane, Janssen-Cilag company
  • the mice were bled with 50 mg of TLR7 ligand ("imiquimod") cream (Aldera R , company 3M) and the synthetic peptide SGP (stock solution: 10 ⁇ g / ml in DMSO)
  • the immunization was repeated after 24 h.
  • mice were shaved under anesthesia (Metofane, Janssen-Cilag company) so that a bald spot of about 10 cm 2 was formed.
  • anesthesia Metalofane, Janssen-Cilag company
  • the mice were first injected under anesthetic with peptide (diluted from the DMSO stock solution to 250 ⁇ l in PBS) intradermally.
  • the back of the mice was creamed with 50 mg of TLR7 ligand ("imiquimod") cream (Aldera R , company 3M)
  • the application of the cream was repeated after 24 h.
  • CTL cytotoxic T cells
  • mice were bled from the tail vein 4 days after the last immunization, and the blood sample was analyzed by flow cytometry.
  • the erythrocytes were lysed in ACK buffer.
  • the remaining cells were taken up in FACS buffer (0.5% bovine serum albumin (BSA), 2 mM EDTA, sodium azide in PBS) and washed once in FACS buffer.
  • BSA bovine serum albumin
  • the specific cytotoxic functionality of the activated cells was determined by means of a so-called / n-wVo killer assay 6 days after the last immunization.
  • spleen cells from syngeneic mice labeled with CFSE (5,6-carboxyfluorescein diacetate-succinimidyl ester, Molecular Probes) were used as target cells for the cytotoxic T cells (CTLs).
  • CTLs cytotoxic T cells
  • the labeled with 3 uM CFSE cells were treated with the artificial SGP-peptide loaded (10 uM peptide; 40 x 10 6 cells per ml medium ISC; 1 h; 37 0 C), and that the wur ⁇ then washed twice with medium and washed twice washed with PBS.
  • the 0.3 ⁇ M CFSE-labeled cells were incubated only in ISC medium and also washed.
  • the cells were mixed at a 1: 1 ratio and 15 x 10 6 cells in 300 ⁇ l each of PBS iv were injected into the mice. After 18 hours, the mice were sacrificed and the spleen cells were removed and analyzed by flow cytometry.
  • the preparation of the spleen cells was carried out as described above. After ACK lysis, the cells were resuspended in 10 ml PBS, counted and adjusted to 2 x 10 7 cells per ml. The cell suspension was mixed with an adequate Volu ⁇ men a 6 uM and 0.6 uM CFSE solution mixed (in PBS) and incubated for 4 min at 37 0 C. The reaction was then stopped by adding twice the volume of ISC medium supplemented with 10% fetal calf serum (FCS). The cells were washed twice with FCS-free medium and counted.
  • FCS fetal calf serum
  • TCR transgenic cytotoxic T cells were administered i.v. injected into congenucent recipient mice and immunized with their specific MHC class I ligand. The results are shown in Figure 1 ( Figure 1: Proliferation (A) and functionality (B) of transcutaneously activated transgenic cytotoxic T cells).
  • the proportion of transgenic CD8 + cells in the total population of CD8 + cells was determined by flow cytometry in blood or spleen.
  • the lymphocytes were stained with the antibodies anti-CD8 APC-Cy7-conjugated, anti-CD45.1 PE-conjugated (commercially available from Becton-Dickinson Pharmingen, Hamburg).
  • the fluorescence in the FL-2 channel (PE) of the CD8 + lymphocytes can be seen in each case.
  • the proportion of CD45.1 + cells is given in percent in the respective histograms. In all mice, the proportion of transgenic CD8 + cells was determined before the immunization and 4 days after immunization in the spleen (A).
  • an in vivo WVO killer assay was performed 6 days after immunization.
  • syngeneic spleen cells labeled with high CFSE concentration were loaded with peptide, mixed 1: 1 with non-peptide, weaker CFSE-labeled cells and transferred iv into the mice.
  • the spleens of the mice were removed and the number of CFSE-labeled cell populations was compared.
  • a decrease in the number of peptide-loaded cells indicated a specific lysis of the activated CTLs.
  • the fluorescence of the spleen cells in the FL-1 channel (CFSE) is shown in each case. The lysis was calculated on the number of unloaded cells and is expressed as a percentage (B).
  • the peptide is administered alone (without additives, adjuvants), only a marginal increase in transgenic cells takes place.
  • These activated CTL can also be detected as a lymphoid organ on day 6 in the spleen. This indicates that a systemic activation of the CTL has taken place, which shows that in addition to the specific peptide, an adjuvant (CFA, imiquimod) is additionally required for the activation of the TCR transgenic CTL.
  • CFA Toll-like receptor ligand
  • Group # 2 50 ⁇ g peptide (id) + imiquimod cream (ed)
  • Group # 3 50 ⁇ g peptide (id)
  • Group # 4 100 ⁇ g peptide + imiquimod cream (ed)
  • Group # 5 20 ⁇ g peptide + imiquimod cream (ed)
  • transgenic CTLs were transferred to recipient mice and these were compared to the TLR Treated ligands (imiquimod) containing preparation which contained or did not contain the peptide. As shown in FIG.
  • FIG. 2 shows the functionality of transcutaneously activated transgenic cytotoxic T cells.
  • a ⁇ -wVo killer assay was performed 6 days after immunization.
  • syngeneic spleen cells labeled with high CFSE concentration were loaded with peptide, mixed with non-peptide, weaker CFSE-labeled cells in a ratio of 1: 1 and transferred iv into the mice.
  • the spleens of the mice were removed and the cell number of the two labeled CFSE-labeled cell populations was compared.
  • a decrease in the number of peptide-loaded cells indicates specific lysis of the activated CTLs.
  • the fluorescence of the spleen cells in the FL1 channel (CFSE) can be seen in each case.
  • the Specific lysis was calculated on the number of unloaded cells and is expressed as a percentage.
  • the pharmaceutical preparations according to the invention and their use, as well as the processes according to the invention, show that it is possible to activate antigen-specific cytotoxic T cells, which are then also functional.
  • Prerequisites for the functionality are on the one hand the presence of APC in the skin, which can present an MHC class I ligand, and on the other hand knowledge of the exact structure of the MHC molecules and the antigen to be immunized against.
  • no injections are required, which considerably simplifies the process and makes pharmaceutical preparations considerably more cost-effective for its use.
  • the present invention thus relates to a pharmaceutical preparation which comprises at least one toll-like receptor ligand, at least one peptide and optionally one or more substance (s) from the group carriers, excipients and additives.
  • the invention relates to a pharmi ⁇ cal preparation according to the above definition, wherein the at least one Toll-like receptor ligand is selected from the group consisting of TLR2 ligand, TLR3 ligand, TLR7 ligand, TLR8 ligand and TLR9 ligand, preferably in which the at least one Toll-like receptor ligand is a TLR7 ligand.
  • a further preferred embodiment of the invention relates to a pharmaceutical preparation according to the preceding definition, wherein the at least one Toll-like receptor ligand is selected from the group consisting of compounds of natural and / or synthetic origin, which is derived from at least one like receptors are recognized and for triggering one or more of the immune response-promoting signals (s) are useful, preferably wherein the at least one Toll-like receptor ligand is selected from the group consisting of Pam3Cys, poly (I: C), imiquimod, loxoribine, R-848 and CpG DNA, more preferably wherein the Toll-like receptor ligand Imiquimod is.
  • a further preferred embodiment of the invention relates to a pharmaceutical preparation according to one of the above definitions, wherein the at least one peptide is selected from Major histocompatibility complex class I ligand, major histocompatibility complex class II ligand and other peptides containing these ligands ,
  • a further preferred embodiment of the invention relates to a pharmaceutical preparation according to one of the above definitions which has at least one Toll-like receptor ligand in an amount of from 0.1 to 10% by weight; at least one peptide in an amount of 0.01 to 30% by weight; and one or more substance (s) from the group carriers, excipients and additives in a total amount of 0.1 to 99.9 wt .-%, each based on the total weight of the pharmaceutical preparation comprises.
  • a further preferred embodiment of the invention relates to a pharmaceutical preparation according to one of the above definitions, which comprises at least one synthetic Toll-like receptor ligand and the at least one synthetic peptide in a formulation for common administration and action.
  • a further preferred embodiment of the invention relates to a pharmaceutical preparation according to one of the above definitions, which comprises the at least one synthetic Toll-like receptor ligand and the at least one synthetic peptide in separate formulations for separate administration and joint action.
  • a further preferred embodiment of the invention relates to a pharmaceutical preparation according to one of the above definitions in a formulation suitable for topical administration.
  • a further preferred embodiment of the invention relates to a pharmaceutical preparation according to one of the above definitions in a for the topical administration of a component and for the non-topical, preferably the subcutaneous or intradermal administration of another component with the aim of the common Effect appropriate formulation.
  • a further preferred embodiment of the invention relates to a pharmaceutical preparation as defined above in a topical administration of at least one Toll-like receptor ligand and a non-topical, preferably subcutaneous or intradermal administration of at least one synthetic peptide with the Aim of the common action suitable formulation.
  • the present invention also relates to the use of a pharmaceutical preparation according to one of the above definitions for the prophylaxis and / or treatment of diseases induced by viruses and / or bacteria and / or fungi in a mammal.
  • the present invention also relates to the use of a pharmaceutical preparation according to one of the above definitions for the prophylaxis and / or treatment of diseases caused by excessive cell proliferation in a mammal.
  • the present invention further relates to the use of a pharmaceutical preparation according to one of the above definitions for the production of a medicament for the prophylaxis and / or therapy of diseases induced by viruses and / or bacteria and / or fungi in a mammal.
  • the present invention further relates to the use of a pharmaceutical preparation according to one of the above definitions for the production of a medicament for the prophylaxis and / or therapy of diseases caused by excessive cell proliferation in a mammal.
  • a preferred embodiment of the invention relates to the use of any of the above definitions, wherein the mammal is a human.
  • a further preferred embodiment of the invention relates to the use according to one of the above definitions by way of topical application of the pharmaceutical preparation, preferably by way of the application of the pharmaceutical preparation to the skin of the mammal.
  • a further preferred embodiment of the invention relates to the use according to one of the above definitions by way of the separate topical application of one component and non-topical, preferably subcutaneous or intradermal, application of another component with the aim of a joint action, preferably by way of topical application of a component to the skin of the mammal and the subcutaneous or intradermal administration of another component which takes place temporally immediately before or after or simultaneously with the topical application.
  • a further preferred embodiment of the invention relates to the use according to the above definition by means of the separate topical application of a formulation comprising at least one Toll-like receptor ligand and subcutaneous or intradermal administration of a formulation comprising at least one synthetic peptide Aim of the common effect.
  • the present invention also relates to a method for the prophylaxis and / or therapy of diseases induced by viruses and / or bacteria and / or fungi. in a mammal comprising the administration of a pharmaceutical preparation according to one of the above definitions to the mammal in a concentration of the pharmacologically active components effective for the prophylaxis and / or therapy of said diseases.
  • the present invention also relates to a method for the prophylaxis and / or treatment of diseases caused by excessive cell proliferation in a mammal, which comprises administering to the mammal a pharmaceutical preparation according to one of the above definitions in a prophylaxis and / or therapy said diseases comprises effective concentration of the pharmacologically active components.
  • the present invention also relates to a method for the prophylactic and / or therapeutic activation of the adaptive immune system of a mammal, which comprises administering to the mammal a pharmaceutical preparation according to any of the above definitions for prophylactic and / or therapeutic activation of the immune system of the mammal effective concentration of the pharmacologically active components.
  • the present invention further relates to a method for the prophylactic and / or therapeutic activation of cytotoxic T cells of the immune system of a mammal, which comprises administering a pharmaceutical preparation according to one of the above definitions to the mammal in a prophylactic and / or therapeutic Activation of the cytotoxic T cells effective concentration of pharmacologically active components um ⁇ sums
  • a preferred embodiment of the invention relates to a method according to one of the above definitions, wherein the mammal is a human.
  • a further preferred embodiment of the invention relates to a method according to one of the above definitions, wherein the administration of the pharmaceutical preparation is carried out by topical route, preferably in which the pharmaceutical preparation is applied to the skin of the mammal.
  • a further preferred embodiment of the invention relates to a method according to one of the above definitions, wherein the administration of a part of the pharmaceutical preparation with one component takes place by topical route and the administration of another part of the pharmaceutical preparation with another component to non-topical, preferably by subcutaneous or intradermal routes with the aim of a common action, more preferably wherein the administration of a part of the pharmaceutical preparation with a component is carried out by application to the skin of the mammal and the administration of another part of the pharmaceutical preparation is effected with another component by subcutaneous or intradermal administration to the mammal with the aim of the common action taking place immediately before or after or simultaneously with the application to the skin.
  • the invention relates to a method according to the above definition, wherein the administration of a portion of the preparation comprising at least one Toll-like receptor ligand by topical application to the skin and the administration ei ⁇ another part of the preparation comprising at least one peptide is by subcutaneous or intradermal administration.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zubereitung, die mindestens einen Toll-like Rezeptor-Liganden und mindestens ein Peptid umfaßt. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer derartigen pharmazeutischen Zubereitung und betrifft auch ein Impfverfahren.

Description

Zubereitung zum Impfen, Impfverfahren und Verwendung einer Impf-Zubereitung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zubereitung, die min¬ destens einen Toll-like Rezeptor-Liganden und mindestens ein Peptid umfaßt. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer derartigen pharmazeutischen Zubereitung und betrifft auch ein Impfverfahren.
Das adaptive Immunsystem spielt eine wichtige Rolle in der Immunabwehr ge¬ gen bestimmte Mikroorganismen, beispielsweise Viren, bestimmte Pilze und Bakterien, sowie bei der Erkennung und Abstoßung von malignen (entarteten) Zellen (Tumor-Zellen). Dabei werden kranke, d. h. Virus-infizierte oder maligne Zellen durch sog. zytotoxische T-Zellen (cytotoxic T cells; CTL; Killerzellen) spezifisch erkannt und eliminiert. Notwendige Voraussetzung für eine Erken¬ nung der kranken Zellen durch die zytotoxischen T-Zellen ist die Interaktion des T-Zell-Rezeptors (T cell receptor; TCR) der zytotoxischen T-Zellen mit einem Haupt-Histokompatibiiitätskomplex Klasse I (major histocompatibility complex I; MHC I). Durch MHC Klasse I-Moleküle werden Eiweiß-Fragmente (aus 8 bis 10 Aminosäuren bestehende Peptide; sog. MHC Klasse I-Liganden) auf der Zell¬ oberfläche präsentiert. Diese werden dann von einem T-Zell-Rezeptor (TCR) spezifisch erkannt. MHC Klasse I-Liganden werden in jeder Zelle durch enzy- matischen Abbau generiert und auf der Zelloberfläche präsentiert (sog. Selbst- Peptide). Auch auf Virus-infizierten Zellen oder malignen Zellen werden Virus¬ spezifische bzw. Tumor-spezifische Selbst-Peptide präsentiert. Derartige Zellen können so von zytotoxischen T-Zellen (CTL) mit einem Virus-spezifi-schen bzw. Tumor-spezifischen T-Zell-Rezeptor erkannt und zerstört werden.
Um die Beschädigung von gesunden Zellen, die auch Selbst-Peptide präsentie¬ ren, durch zytotoxische T-Zellen (CTL) zu verhindern, müssen CTL neben der spezifischen Wechselwirkung zwischen T-Zell-Rezeptor und MHC I-Selbst- Peptid durch zusätzliche ko-stimulatorische Signale zunächst aktiviert werden, damit sie anschließend ihre Zielzellen (Virus-infizierte Zellen oder Tumor- Zellen) erkennen und zerstören können. Ohne vorherige Aktivierung kann eine zytotoxische T-ZeIIe (CTL) trotz ihres für eine bestimmte (beispielsweise Virus¬ infizierte oder maligne) Zielzelle spezifischen T-Zell-Rezeptors die Zielzelle über deren spezifische Selbstpeptide nicht erkennen und zerstören. Wenn anderer¬ seits zytotoxische T-Zellen, die für auf Zellen präsentierte Selbst-Peptide spezi¬ fische Rezeptoren aufweisen, fälschlicherweise aktiviert werden, beispielsweise im Rahmen eines Infekts, kann dies zu Reaktionen zytotoxischer T-Zellen ge¬ gen Zellen von gesundem Gewebe führen. Die Regulation der Aktivierung zyto¬ toxischer T-Zellen ist damit von zentraler Bedeutung dafür, ob eine spezifische Immunantwort initiiert wird oder nicht.
Bei der Aktivierung zytotoxischer T-Zellen unter Initiierung einer spezifischen Immunantwort spielen die sog. professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (antigen-presenting cells; APC) eine besondere Rolle. Antigen-präsentierende Zellen sind spezialisierte Zellen, die sehr effizient Antigene (beispielsweise Vi¬ ren oder Bakterien) aufnehmen und präsentieren. Beispiele sind Dendritische Zellen (dendritic cells; DC) oder die Langerhans-Zellen in der Haut. In Gegen¬ wart von Gefahr-Signalen („danger Signals") reifen DCs. Dies führt zu einer Hochregulation ko-stimulatorischer Signale. In dieser Situation führt die Erken¬ nung von Antigenen zur Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen (CTL) und zur Initiierung der Immunantwort.
Für die Entstehung einer effizienten T-Zell-Antwort ist also die aktivierende Wechselwirkung zwischen den zytotoxischen T-Zellen und professionellen Anti- gen-präsentieren-den Zellen erforderlich, und die spezifische Aktivierung der T- Zellen erfolgt aufgrund des Empfangs zweier unterschiedlicher Signale, nämlich der spezifischen Erkennung des Antigens aufgrund geeigneter Rezeptoren und ko-stimulatorischer Signale, die durch die Rezeptoren und Botenstoffe der Anti¬ gen-präsentierenden Zellen (APC) vermittelt werden. Die APC geben diese ko- stimulatorischen Signale jedoch nur im aktivierten Zustand weiter. Die Aktivie- rung der APC kann durch Stimulierung von sog. Toll-like Rezeptoren (toll-like receptors; TLR) erreicht werden.
„Danger Signals", die eine Reifung Dendritischer Zellen zur Folge haben, kön¬ nen unterschiedlicher Natur sein. Sie können beispielsweise von aktivierten T- Helfer-Zellen stammen oder auch direkt von Krankheitserregern. Stammen die „Danger Signals" von Krankheitserregern, kann beispielsweise eine Erkennung von bestimmten konservierten Strukturen von Viren, Bakterien oder Pilzen, durch die Toll-like Rezeptoren stattfinden.
Insgesamt sind bisher 11 verschiedene Toll-like Rezeptoren (TLR) bekannt, und für viele von diesen sind natürliche und synthetische Liganden beschrieben [,,S. Akira, K. Takeda; Toll-like receptor signalling; Nat. Rev. Immunol. 2004: 4, 499 - 511"]. Beispielsweise werden Zellwand-Bestandteile von gram-negativen Bak¬ terien (Lipopolysaccharide; LPS) von TLR4 erkannt; die genomische dsRNSs von bestimmten Viren werden durch TLR3 erkannt. Weiter beschreiben die Druckschriften WO-A 00/040,228, WO-A 01/015,698 und WO-A 045,494 die Erkennung verschiedener viraler Strukturen, die in Verbindung mit menschli¬ chen und tierischen Erkrankungen viralen Ursprungs auftreten, durch TLR7, d. h. die Substanz Imiquimod {1-(2-methylpropyl-)1 H-imidazo[4,5-c]chi-nolin-4- amin}.
Trotz wesentlicher Fortschritte im Verständnis über die oben aufgezeigten grundlegenden Funktionsweise der adaptiven Immunantwort und verbesserten Kenntnissen über die antigenen Strukturen, die auf erkrankten (z. B. Virus¬ infizierten) Zellen oder Tumor-Zellen existieren und von spezifischen Zeil- Rezeptoren erkannt werden, gelingt es bisher nur unzureichend, durch thera¬ peutische Maßnahmen das adaptive Immunsystem mit dem Ziel zu aktivieren, erkrankte Zellen oder Tumor-Zellen spezifisch zu eliminieren. Impfungen sind ein seit langem bekannter Weg zur Aktivierung des Immunsys¬ tems. Bisher können Impfungen im wesentlichen nur prophylaktisch eingesetzt werden, da die Verabreichung eines Impfstoffs zur Produktion protektiver Anti¬ körper führt (B-Zell-Antwort). Die Immunisierung dauert längere Zeit, regelmä¬ ßig mehrere Wochen, so daß der therapeutische Einsatz von Impfungen (d. h. die schnelle Aktivierung des Immunsystems zur Therapie akut auftretender Zu¬ stände) weitgehend ausscheidet. Es ist daher von großem Interesse, Impf- Strategien zu entwickeln, bei denen ein Eingriff in die Kaskade der Aktivierung von T-Zellen möglich wird und dadurch eine T-Zell-Antwort generiert wird. Diese könnte im Einzelfall nicht nur prophylaktisch, sondern auch therapeutisch von Nutzen sein.
Die Tumor-Immunologie umfaßt ein weites Feld biologischer Phänomene, die die Interaktion von maligne entarteten Zellen mit dem angeborenen und adapti¬ ven Immunsystem umfassen. Unter den verschiedenen Arten von Immunzellen spielen T-Zellen eine zentrale Rolle, da sie spezifisch Tumor-Zellen erkennen und eliminieren können. Da die meisten Tumor-assoziierten Proteine intrazellu¬ lär vorkommen, sind offenbar T-Zellen das am besten geeignete Werkzeug, um eine Tumor-spezifische Immunantwort hervorzurufen. Antikörper können näm¬ lich nicht in die Zelle eindringen, und angeborenen Immunzellen fehlt die hoch¬ gradige Spezifität von T-Zellen. Für die Vorbeugung und Behandlung von Infek¬ tionen, speziell Virus-bedingten Infektionen, und Tumor-Erkrankungen stellt da¬ her die oben beschriebene Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen, die nur kranke Zellen eliminieren, gesunde jedoch verschonen, ein attraktives Ziel dar.
Für die meisten klassischen Impf-Strategien ist es notwendig, mehrere Schritte der Immunisierung durchzuführen, um eine ausreichende Immunität zu errei¬ chen. Die Immunität resultiert in der Regel aus der Produktion protektiver Anti¬ körper gegen das im Rahmen der Impfung verabreichte Antigen. Bisherige Strategien zur Induktion von T-Zellen durch Impfung benutzen Zube¬ reitungen, die das entsprechende Antigen in Verbindung mit Hilfsmitteln/Adju- vantien wie Aluminium-haltigen Substanzen oder Virus-ähnlichen Partikeln (vi- rus-like particles; VLP), inkomplettem Freund'schem Adjuvans bzw. ähnlichen ÖI-in-Wasser-Gemischen oder CpG-DNS enthalten. Die Zubereitungen werden mittels Injektion subkutan oder intradermal appliziert. Dies ist beispielsweise offenbart in den Druckschriften „E. Tartour, F. Benchetrit, N. Haicheur, O. Ado- tevi und W. H. Fridman; Synthetic and natural non-live vectors: rationale for their clinical development in Cancer Vaccine protocols; Vaccine, 19. Dezember 2002: 20 (Suppl. 4), A 32 - 39"; „R. Edelmann; Adjuvants for the future; in: M. M. Le- vine, G. C. Woodrow, J.B. Kaper, G. S. Cobon (Hrsg.), New Generation Vac- cines, Band 2, New York, Marcel Dekker (1997), 173 - 192)"; und „S. Agrawal, E. R. Kandimalla; Modulation of Toll-like Receptor 9 responses through synthetic immunostimulatory motifs of DNA; Ann. N. Y. Acad. Sei. 2003 (Dez.): 1002, 30 - 42". Weiter wurde auch versucht, T-Zell-Antworten mit Hilfe von Dendritischen Zellen zu initiieren, deren Vorläufer-Zellen zuvor aus Blut gewonnen und in vitro ausdifferenziert wurden [„T.G. Berger, E. S. Schultz; Dendritic cell-based immu- notherapy; Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2003: 276, 163 - 197"], oder Dendri¬ tische Zellen als Adjuvans zu verwenden, indem diese mit MHC Klasse I- Liganden, Tumor-assoziierten Proteinen oder Tumorzell-Lysaten beladen und Patienten injiziert wurden [,,G. Schuler, B. Schuler-Thumer, R.M. Steinmann; The use of dendritic cells in Cancer immunotherapy; Curr. Opin. Immunol. 2003: 15, 138 - 147"].
Aufgrund der Bedeutung von T-Zellen für die Elimination von intrazellulären Pa- thogenen und Tumor-Zellen versuchen neuere Immunisierungs-Strategien, T- Zellen, insbesondere zytotoxische T-Zellen, anzusprechen, was auch die Mög¬ lichkeiten therapeutischer Impfungen eröffnen würde. Allen bisherigen Impfstra¬ tegien ist gemeinsam, daß sie in der Praxis leidlich funktionieren, also daß bei¬ spielsweise zytotoxische T-Zellen in Patienten meßbar aktiviert werden können und ihre Zahl erhöht werden kann. Die Verfahren sind jedoch nur mäßig gut dazu in der Lage, effiziente T-Zell-Antworten zu generieren, insbesondere eine ausreichende Tumor-Abstoßung zu erreichen. Zudem sind die bekannten Impfmethoden noch mit signifikanten Nebenwirkungen bis zur Toxizität assozi¬ iert [,,E. Tartour et al., a. a. O.", und „R. Edelmann, a. a. O."]. Aus Tiermodellen ist nämlich bekannt, daß bei Impfungen mit CpG-DNS Nebenwirkungen auftre¬ ten, die die Anwendung dieses Adjuvans erheblich beschränken. Zusätzlich sind besonders die DC-basierenden Verfahren mit einem Aufwand verbunden, der sich nicht in den Klinik-Alltag bzw. Praxis-Alltag übertragen läßt.
Aufgabe der Erfindung war, zu einer wesentlich verbesserten Generierung von zytotoxischen T-Zellen durch eine effiziente Aktivierung beizutragen, ohne daß dabei die Nachteile des Standes der Technik auftreten. Insbesondere sollte ü- ber eine Aktivierung von Toll-like Rezeptoren die Aktivierung von Antigen- präsentierenden Zellen effizient erreicht werden. Diese sorgen durch erhöhte Expression ko-stimulatorischer Signale für eine effiziente Aktivierung spezifi¬ scher zytotoxischer T-Zellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung war, einen Weg zur nicht-invasiven Auslö¬ sung einer systemischen, T-Zell-vermittelten Immunantwort aufzuzeigen.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung war, ein preiswertes und mit nur ge¬ ringem technischem Aufwand verbundenes Impf-Konzept zur Generierung von zytotoxischen T-Zellen bereitzustellen.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung war, Zubereitungen für neue präven¬ tive und therapeutische Methoden auf immunologischer Basis gegen ein breites Spektrum von Erkrankungen bereitzustellen, einschließlich durch Viren oder Bakterien ausgelöster Erkrankungen und Tumor-Erkrankungen.
Überraschend wurde erfindungsgemäß gefunden, daß topisch verabreichbare Zubereitungen, die die notwendigen, für den T-Zell-Rezeptor spezifischen Pep- tid-Signal-Substanzen zusammen mit einem Liganden für einen Toll-like Rezep¬ tor umfassen, nicht-invasiv in der Lage sind, eine systemische T-Zell-vermittelte Immunantwort auszulösen, indem sie spezifische zytotoxische T-Zellen zu ge¬ nerieren in der Lage sind. Damit wird ein einfacher, schneller und effizienter Weg aufgezeigt, Immun-Antworten gegen jedes beliebige T-Zell-Antigen zu in¬ duzieren.
Die Erfindung betrifft somit eine pharmazeutische Zubereitung, die mindestens einen Toll-like Rezeptor-Liganden, mindestens ein Peptid und gegebenenfalls eine oder mehrere Substanz(en) aus der Gruppe Träger, Hilfsstoffe und Zu¬ satzstoffe umfaßt.
Bevorzugte Ausgestaltungen der pharmazeutischen Zubereitung ergeben sich aus den Unteransprüchen 2 bis 10.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer wie nachfolgend im Detail be¬ schriebenen pharmazeutischen Zubereitung zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch Viren und/oder Bakterien und/oder Pilzen induzierte Krankheiten bei einem Säuger bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch Viren und/oder Bakterien und/oder Pilzen induzierte Krank¬ heiten bei einem Säuger.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer wie nachfolgend im Detail be¬ schriebenen pharmazeutischen Zubereitung zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch exzessive Zell-Proliferation bedingten Krankheiten bei einem Säuger bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch exzessive Zell-Proliferation bedingten Krankheiten bei einem Säuger.
Bevorzugte Ausgestaltungen der Verwendung ergeben sich aus den Unteran¬ sprüchen 15 bis 18. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch Viren und/oder Bakterien und/oder Pilze induzierten Krankheiten bei ei¬ nem Säuger bzw. zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch exzessive ZeII- Proliferation bedingten Krankheiten, die die Verabreichung einer pharmazeuti¬ schen Zubereitung entsprechend der nachfolgenden detaillierten Beschreibung an den Säuger in einer für die Prophylaxe und/oder Therapie der genannten Krankheiten wirksamen Konzentration der pharmakologisch wirksamen Kom¬ ponenten umfassen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur prophylaktischen und/oder thera¬ peutischen Aktivierung des adaptiven Immunsystems eines Säugers, das die Verabreichung einer wie nachfolgend im Detail beschriebenen pharmazeuti¬ schen Zubereitung an den Säuger in einer für die prophylaktische und/oder the¬ rapeutische Aktivierung des Immunsystems des Säugers wirksamen Konzentra¬ tion der pharmakologisch wirksamen Komponenten umfaßt, sowie ein Verfah¬ ren zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Aktivierung zytotoxischer T- Zellen des Immunsystems eines Säugers, das die Verabreichung einer wie nachfolgend im Detail beschriebenen pharmazeutischen Zubereitung an den Säuger in einer für die prophylaktische und/oder therapeutische Aktivierung der zytotoxischen T-Zellen wirksamen Konzentration der pharmakologisch wirksa¬ men Komponenten umfaßt.
Bevorzugte Ausgestaltungen des Verfahrens ergeben sich aus den Unteran¬ sprüchen 23 bis 26.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen umfassen als eine essentielle Komponente mindestens einen Toll-like Rezeptor-Liganden (TLR- Ligand). Unter Toll-like Rezeptor-Liganden werden in der vorliegenden Be¬ schreibung und in den Patentansprüchen solche Verbindungen natürlicher und/oder synthetischer Herkunft verstanden, die von mindestens einem Toll-like Rezeptor erkannt werden und zur Auslösung von die Immunantwort fördernden Signalen dienlich sind. Der/die erfindungsgemäß verwendbare(n) Toll-like Re- zeptor-Ligand(en) kann/können natürliche oder synthetische oder auch synthe¬ tisch modifizierte natürliche Verbindung(en) sein. In einer bevorzugten Ausfüh¬ rungsform der Erfindung kann der/können die Toll-like Rezeptor-Ligand(en) synthetische Substanzen sein. Die bisher bekannten Toll-like Rezeptor- Liganden werden in Gruppen der von den jeweiligen Toll-like Rezeptoren TLR1 , TLR2, TLR3, TLR4, usw., erkannten Verbindungen eingeteilt; bisher sind 11 Toll-like Rezeptoren (bis TLR11 ) bekannt. Die Liganden werden allgemein mit TLR1 -Liganden, TLR2-Liganden, TLR3-Liganden, TLR4-Liganden, usw., bis TLR11 -Liganden bezeichnet. Entscheidend ist jedoch nicht die Bezeichnung des Liganden, sondern lediglich seine charakteristische Eigenschaft, von einem Toll-like Rezeptor erkannt zu werden. Regelmäßig wird in der erfindungsgemä¬ ßen pharmazeutischen Zubereitung ein Toll-like Rezeptor-Ligand verwendet; es ist jedoch auch möglich, zwei oder mehr Toll-like Rezeptor-Liganden zu ver¬ wenden.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine pharmazeuti¬ sche Zubereitung, in der der mindestens eine Toll-like Rezeptor-Ligand gewählt ist aus TLR2-Ligand, TLR3-Ligand, TLR7-Ligand, TLR8-Ligand und TLR9- Ligand. Bevorzugt wird erfindungsgemäß ein TLR7-Ligand verwendet. In noch mehr bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfaßt die pharmazeuti¬ sche Zubereitung mindestens einen, noch weiter bevorzugt genau einen Toll- like Rezeptor-Liganden aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen natürli¬ cher und/oder synthetischer Herkunft, die von mindestens einem Toll-like Re¬ zeptor erkannt werden und zur Auslösung eines oder mehrerer die Immunant¬ wort fördernden Signale(s) dienlich sind. Unter dem Begriff „natürlicher und/oder synthetischer Herkunft" wird in diesem Zusammenhang verstanden, daß die als Ligand mindestens eines Toll-like Rezeptors geeigneten Verbindun¬ gen entweder eine auch natürlich als Toll-like Rezeptor-Ligand vorkommende Verbindung oder eine künstlich synthetisierte, als Ligand jedoch gleichwohl ge¬ eignete Verbindung oder eine natürlich vorkommende, jedoch synthetisch modi- fizierte Verbindung ist (beispielsweise - aber nicht ausschließlich - eine der Verbindungen, wie sie in der Druckschrift WO-A 00/040228 beschrieben sind), oder eine wie vorstehend beschrieben natürlich als Toll-like Rezeptor-Ligand vorkommende Verbindung, die auf chemischem Wege modifiziert, beispielswei¬ se substituiert oder sonstwie derivatisiert wurde.
Mit noch weiterem Vorteil ist der mindestens eine Toll-like Rezeptor-Ligand ge¬ wählt aus der Gruppe bestehend aus Pam3Cys, Poly-(I:C), Imiquimod, Loxori- bine, R-848 und CpG-DNA. In erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugten Zubereitungen ist der Toll-like Rezeptor-Ligand Imiquimod. Die unter der Be¬ zeichnung „Imiquimod" an sich bekannte Verbindung hat die chemische Be¬ zeichnung 1 -(2-Methylpropyl-)1 H-imidazo[4,5-c]chinolin-4-amin.
Als weitere essentielle Komponente umfaßt die pharmazeutische Zubereitung mindestens ein Peptid. Als Peptid geeignet sind synthetische und/oder natürli¬ che Peptide. Unter „synthetisch und/oder natürlich" wird erfindungsgemäß ver¬ standen, daß das Peptid entweder ein natürlich vorkommendes Peptid oder ein künstlich synthetisiertes, erfindungsgemäß jedoch gleichwohl geeignetes Peptid oder ein natürlich vorkommendes, jedoch synthetisch modifiziertes Peptid ist. Regelmäßig wird in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitung ein Peptid verwendet; es ist jedoch auch möglich, zwei oder mehr Peptide zu ver¬ wenden. Die Verwendung eines einzelnen Peptids ist wegen der Spezifität der Signal-Auslösung erfindungsgemäß bevorzugt.
In bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitung ist das mindestens eine Peptid gewählt aus Major Histocompatibili- ty Komplex Klasse I-Ligand, Major Histocompatibility Komplex Klasse Il-Ligand und weiteren, diese Liganden enthaltenden Peptiden. Solche Peptide sind wei¬ ter bevorzugt Antigene zur Erkennung durch zytotoxische T-Zellen und sind noch weiter bevorzugt Peptide viralen oder bakteriellen Ursprungs oder Tumor- spezifische Peptide oder Tumor-assoziierte Peptide. Diese können von MHC Klasse 1 -Molekülen als auch von MHC Klasse Il-Molekülen präsentiert werden.
Ohne Beschränkung rein beispielhaft genannte Peptide, die erfindungsgemäß mit besonderem Vorteil in den pharmazeutischen Zubereitungen der Erfindung verwendet werden können, ergeben sich aus der nachfolgenden Tabelle 1 , oh¬ ne daß die Erfindung auf diese beschränkt ist.
Tabelle 1
Besonders bevorzugte Peptide zur Verwendung in erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen können neben den vorgenannten essentiellen Komponenten gegebenenfalls noch eine oder meh¬ rere Substanz(en) aus der Gruppe Träger, Hilfsstoffe und Zusatzstoffe enthal¬ ten. Diese umfassen beispielhaft, ohne die Erfindung hierauf zu beschränken, eine oder mehrere Substanzen aus der Gruppe hydrophile und lipophile Lö¬ sungsmittel, solubilisierend wirkende Mittel, Emulgatoren, die Viskosität einstel¬ lende Mittel, den pH-Wert einstellende Mittel, chelatisierende Mittel, Konservie¬ rungsmittel, Mittel zur Bereitstellung einer Basis für die topische Applikation (Salben- und/oder Creme-Grundlagen), Mittel zur Erhöhung des Penetrations¬ vermögens der Haut, usw..
Rein beispielhaft und ohne die Erfindung auf diese zu beschränken, werden als Träger, Hilfs- und Zusatzstoffe genannt: Isostearinsäure, Benzylalkohol, Cety- lalkohol, Stearylalkohol, weiße Vaseline, Polysorbate 80 R, Sorbitanstearat, Glyzerin, Methyl-4-hydroxybenzoat, Propyl-4-hydroxybenzoat, Xanthangummi, gereinigtes Wasser.
Die Mengen der in der pharmazeutischen Zubereitung gemäß der Erfindung enthaltenen essentiellen Komponenten (mindestens ein Toll-like Rezeptor- Ligand und mindestens ein Peptid), die in einer speziellen Situation prophylak¬ tisch und/oder therapeutisch wirksam ist, hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie beispielsweise der Aktivität der speziellen Kombination aus mindestens ei- nem Toll-like Rezeptor-Ligand und mindestens einem (beispielsweise syntheti¬ schen) Peptid, dem Verabreichungsweg, der Verabreichungshäufigkeit, der speziellen Formulierung, dem zu behandelnden Krankheitszustand und der Konstitution des zu behandelnden Säugers bzw. Patienten. Fachleute mit Sachverstand in diesem technischen Bereich können effektive Mengen im Ein¬ zelfall anhand einiger orientierender Versuche und den in der vorliegenden Be¬ schreibung enthaltenen Angaben bequem bestimmen. In diesem Zusammen¬ hang bedeutet der Begriff „prophylaktisch und/oder therapeutisch wirksame Menge" in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen die Menge der Kombination der beiden essentiellen Komponenten (gegebenenfalls mehrerer Verbindungen der beiden jeweiligen Komponenten Toll-like Rezeptor- Ligand bzw. synthetisches Peptid), die ausreichend ist, eine prophylaktische Wirkung und/oder eine therapeutische Wirkung auszulösen, beispielsweise eine prophylaktische und/oder therapeutische Wirkung in der Prophylaxe und/oder Therapie einer bestimmten Krankheit, beispielsweise einer entzündlichen Krankheit bzw. durch Viren oder Bakterien o.a. hervorgerufenen Krankheit oder in der Prophylaxe und/oder Therapie einer durch eine exzessive ZeII- Proliferation bedingten Krankheit oder einer Tumor-Erkrankung. Eine prophylak¬ tisch und/oder therapeutisch wirksame Menge ist auch eine Menge, die ausrei¬ chend ist, um das adaptive Immunsystem eines Säugers prophylaktisch und/oder therapeutisch zu aktivieren, bzw. eine solche Menge, die ausreichend ist, um zytotoxische T-Zellen des Immunsystems eines Säugers prophylaktisch und/oder therapeutisch zu aktivieren.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind pharmazeutische Zubereitungen, die umfas¬ sen: mindestens einen Toll-like Rezeptor-Liganden in einer Menge von 0,1 bis 10 Gew.-%; mindestens ein Peptid in einer Menge von 0,01 bis 30 Gew.-%; und eine oder mehrere Substanz(en) aus der Gruppe Träger, Hilfsstoffe und Zu¬ satzstoffe in einer Gesamtmenge von 0,1 bis 99,9 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der pharmazeutischen Zubereitung. Besonders bevorzugt, da zu einer besonders gezielten Aktivierung des Immunsystems eines Säugers in der Lage, sind erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitungen, die um¬ fassen: mindestens einen Toll-like Rezeptor-Liganden in einer Menge von 1 bis 10 Gew.-%; mindestens ein Peptid in einer Menge von 0,1 bis 5 Gew.-%; und eine oder mehrere Substanz(en) aus der Gruppe Träger, Hilfsstoffe und Zu¬ satzstoffe in einer Gesamtmenge von 0,5 bis 99 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der pharmazeutischen Zubereitung.
Eine besondere, beispielhafte, jedoch die Erfindung nicht beschränkende pharmazeutische Zubereitung umfaßt mindestens einen Toll-like Rezeptor- Liganden in einer Menge von 1 bis 5 Gew.-%; mindestens ein Peptid in einer Menge von 0,2 bis 2 Gew.-%; und eine oder mehrere Substanz(en) aus der Gruppe Träger, Hilfsstoffe und Zusatzstoffe in einer Gesamtmenge von 93 bis 99 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der pharmazeutischen Zubereitung.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die erfindungs¬ gemäße pharmazeutische Zubereitung den mindestens einen Toll-like Rezep¬ tor-Liganden und das mindestens eine Peptid in einer Formulierung zur ge¬ meinsamen Verabreichung und Wirkung. In der Zubereitung gemäß dieser vor¬ teilhaften, da einfach zu verabreichenden Ausführungsform sind also die beiden essentiellen Komponenten in einer gemeinsamen Formulierung enthalten, wer¬ den also gemeinsam verabreicht und können dann gemeinsam eine prophylak¬ tische und/oder therapeutische Wirkung entfalten. Dies ermöglicht neben der einfachen Verabreichung auch eine genaue Dosierung der beiden Komponen¬ ten. Denkbare Beispiele für derartige pharmazeutische Zubereitungen gemäß der Erfindung sind - ohne die Erfindung hierauf zu beschränken - Lösungen oder Suspensionen für eine intraperitoneale Verabreichung, Cremes oder Sal¬ ben für eine topische, z. B. epidermale Verabreichung, Sprays für eine intrana¬ sale oder laryngeale Verabreichung oder Lösungen in Form von Tropfen für eine intraokulare Verabreichung. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform einer solchen pharmazeutischen Zubereitung gemäß der Erfindung ist eine für eine topische Verabreichung ge¬ eignete Formulierung. Ein besonders anschauliches, nicht jedoch beschrän¬ kendes Beispiel einer solchen Zubereitung ist eine Salbe, Creme, Lösung oder Suspension für eine topische, d. h. epidermale Verabreichung, beispielsweise für eine topische Verabreichung der Zubereitung auf der Haut des Säugers. In einer mit besonderem Vorteil einsetzbaren Ausführungsform der Erfindung wird eine kommerziell erhältliche Creme verwendet, die 5 % des Toll-like Rezeptor7- Liganden Imiquimod in einer üblichen Creme-Basis enthält (AldaraR, Firma 3M).
Denkbar - und von der vorliegenden Erfindung umfaßt - sind jedoch auch sol¬ che pharmazeutischen Zubereitungen, die bevorzugte Ausführungsformen dar¬ stellen, die den mindestens einen Toll-like Rezeptor-Liganden und das mindes¬ tens eine Peptid in getrennten Formulierungen zur getrennten Verabreichung und gemeinsamen Wirkung umfassen. Von dieser Ausführungsform sind so¬ wohl solche Fälle umfaßt, in denen der mindestens eine Toll-like Rezeptor- Ligand und das mindestens eine Peptid in getrennten, aber gleichartigen For¬ mulierungen (beispielsweise in beiden Fällen als Creme oder in beiden Fällen als Lösung) vorliegen, getrennt voneinander appliziert (beispielsweise topisch aufgetragen) werden, jedoch gemeinsam wirken, als auch solche Fälle, in de¬ nen der mindestens eine Toll-like Rezeptor-Ligand und das mindestens eine Peptid in getrennten, aber verschiedenartigen Formulierungen vorliegen (bei¬ spielsweise in einem Fall als Creme und im anderen Fall als Lösung), getrennt voneinander appliziert werden (beispielsweise im Fall der Creme durch topische Applikation und im Fall der Lösung durch intraperitoneale Verabreichung), je¬ doch im Ergebnis gemeinsam wirken.
Für den vorstehend zweitgenannten Fall ist eine besonders bevorzugtes Bei¬ spiel einer pharmazeutischen Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung in einer für die topische Verabreichung einer Komponente und für die nicht- topische, vorzugsweise die subkutane oder intradermale Verabreichung einer anderen Komponente mit dem Ziel der gemeinsamen Wirkung geeigneten For¬ mulierung. Diese Ausführungsform hat den Vorteil, daß die jeweiligen Kompo¬ nenten auf dem jeweiligen Verabreichungsweg appliziert werden können, der ihre bestmögliche gemeinsame Wirkung in dem zu behandelnden Säuger ga¬ rantiert. Eine noch weiter bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist eine pharmazeutische Zubereitung in einer für die topische Verabreichung mindes¬ tens eines Toll-like Rezeptor-Liganden und einer für die nicht-topische, vor¬ zugsweise die subkutane oder intradermale Verabreichung mindestens eines Peptids mit dem Ziel (und dem Ergebnis) der gemeinsamen Wirkung geeigne¬ ten Formulierung. Beispielsweise ist der mindestens eine, weiter bevorzugt der eine Toll-like Rezeptor-Ligand in Form einer Creme formuliert, die epidermal appliziert werden kann, während das mindestens eine Peptid in Form einer Lö¬ sung oder Suspension formuliert ist, die subkutan oder intradermal appliziert werden kann.
Die Erfindung betrifft auch Verwendungen einer wie vorstehend detailliert be¬ schriebenen pharmazeutischen Zubereitung. Solche Verwendungen liegen in den Bereichen
- Prophylaxe und/oder Therapie von durch Viren und/oder Bakterien und/oder Pilzen induzierten Krankheiten eines Säugers;
- Prophylaxe und Therapie von durch exzessive Zell-Proliferation bedingten Krankheiten wie Tumor-Krankheiten eines Säugers;
- Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch Viren und/oder Bakterien und/oder Pilzen induzierten Krankheiten ei¬ nes Säugers;
- Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe und Therapie von durch ex¬ zessive Zell-Proliferation bedingten Krankheiten wie Tumor-Krankheiten ei¬ nes Säugers. Die erfindungsgemäße Verwendung der pharmazeutischen Zubereitung ist be¬ sonders vorteilhaft bei der Prophylaxe und/oder Therapie entzündlicher Erkran¬ kungen, weiter bevorzugt bei der Prophylaxe und/oder Therapie von durch vira¬ le oder mikrobielle Pathogene bedingten Erkrankungen, während erfindungs¬ gemäß eine Verwendung der pharmazeutischen Zubereitungen bei durch ex¬ zessive Zellproliferation bedingten Erkrankungen und insbesondere bei Tumor- Erkrankungen besonders bevorzugt ist.
Im Rahmen der Verwendung der pharmazeutischen Zubereitung gemäß der Erfindung können beliebige Säuger behandelt werden. Beispiele sind Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Katzen, Hunde, Affen und Menschen. In besonders bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendung der pharmazeutischen Zubereitungen ist der behandelte Säuger ein Mensch.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung erfolgt die Verwendung der pharmazeutischen Zubereitung im Wege der topischen Applikation der pharma¬ zeutischen Zubereitung, noch mehr vorzugsweise im Wege der epidermalen Applikation, also der Aufbringung der pharmazeutischen Zubereitung auf die Haut des Säugers. Besonders bevorzugt umfaßt eine epidermal applizierte pharmazeutische Zubereitung sowohl mindestens einen Toll-like Rezeptor- Liganden als auch mindestens ein Peptid in einer Phase zur gemeinsamen Wir¬ kung auf den Körper durch die Haut des Säugers. Es hat sich nämlich erfin¬ dungsgemäß herausgestellt, daß überraschenderweise auf diesem Wege ein rasches Einziehen der Wirkstoffe durch die Haut erreicht werden kann und in der Folge eine effiziente spezifische Immunantwort der zytotoxischen T-Zellen generiert und damit eine zuverlässige Erkennung und Eliminierung krankhafter Zellen aus dem Säuger-Körper initiiert werden kann.
Eine andere, ebenfalls bevorzugte Verwendung der erfindungsgemäßen phar¬ mazeutischen Zubereitung erfolgt im Wege der getrennten topischen Applikati¬ on einer Komponente und nicht-topischen, vorzugsweise subkutanen oder in- tradermalen, Applikation einer anderen Komponente mit dem Ziel und Ergebnis einer gemeinsamen Wirkung. Dies geschieht noch mehr bevorzugt im Wege der topischen Applikation einer Komponente auf die Haut des Säugers und der zeitlich unmittelbar vor oder nach oder gleichzeitig mit der topischen Applikation erfolgenden subkutanen oder intradermalen Applikation einer anderen Kompo¬ nente, wobei überraschenderweise eine gemeinsame Wirkung eintritt. Wenn beispielsweise gemäß einer noch weiter bevorzugten, die Erfindung jedoch nicht beschränkenden Ausführungsform eine mindestens einen Toll-like Rezep¬ tor-Liganden umfassende Formulierung topisch (z. B. epidermal) appliziert wird und eine mindestens ein Peptid wie einen MHC Klasse I-Liganden umfassende Formulierung kurz vor oder nach der topischen Applikation der anderen Kom¬ ponente oder im wesentlichen gleichzeitig mit dieser nicht-topisch, beispiels¬ weise subkutan oder intradermal, appliziert wird, (wobei auch die umgekehrte Reihenfolge gewählt werden kann), tritt eine gemeinsame Wirkung der beiden Komponenten Toll-like Rezeptor-Ligand und MHC Klasse I-Ligand insofern ein, als - wie bei der gemeinsamen Verabreichung beider Komponenten in einer Zubereitung auf demselben Applikationsweg - in der Haut befindliche Antigen- präsentierende Zellen den MHC Klasse I-Liganden binden und präsentieren und gleichzeitig durch den Toll-like Rezeptor-Liganden zur Vermittlung ko- stimulatorischer Signale stimuliert werden. Dies führt rein praktisch dazu, daß die Antigen-präsentierenden Zellen von der Haut in die regionären Lymphkno¬ ten wandern, wo sie in Kontakt mit naiven zytotoxischen T-Zellen kommen und diese spezifisch für eine Erkennung und Eliminierung von Zellen aktivieren, die das Peptid präsentieren. Mit dieser Verwendung werden also neue Möglichkei¬ ten zur Behandlung von bisher nicht heilbaren Krankheiten einschließlich Tu¬ mor-Leiden und verschiedenen Infektionskrankheiten eröffnet.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch Viren und/oder Bakterien und/oder Pilze induzierten Krankheiten bei ei¬ nem Säuger, das die Verabreichung einer pharmazeutischen Zubereitung nach der obigen detaillierten Beschreibung an den Säuger in einer für die Prophylaxe und/oder Therapie der genannten Krankheiten wirksamen Konzentration der pharmakologisch wirksamen Komponenten umfaßt.
Weiter betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder The¬ rapie von durch exzessive Zell-Proliferation bedingten Krankheiten (insbeson¬ dere Tumor-Erkrankungen) bei einem Säuger, das die Verabreichung einer pharmazeutischen Zubereitung nach der obigen detaillierten Beschreibung an den Säuger in einer für die Prophylaxe und/oder Therapie der genannten Krankheiten wirksamen Konzentration der pharmakologisch wirksamen Kom¬ ponenten umfaßt.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Aktivierung des adaptiven Immunsystems eines Säu¬ gers, das die Verabreichung einer pharmazeutischen Zubereitung nach der obi¬ gen detaillierten Beschreibung an den Säuger in einer für die prophylaktische und/oder therapeutische Aktivierung des Immunsystems des Säugers wirksa¬ men Konzentration der pharmakologisch wirksamen Komponenten umfaßt.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur prophylaktischen und/oder thera¬ peutischen Aktivierung zytotoxischer T-Zellen des Immunsystems eines Säu¬ gers, das die Verabreichung einer pharmazeutischen Zubereitung nach der obi¬ gen detaillierten Beschreibung an den Säuger in einer für die prophylaktische und/oder therapeutische Aktivierung der zytotoxischen T-Zellen wirksamen Konzentration der pharmakologisch wirksamen Komponenten umfaßt.
Der Begriff „Prophylaxe" oder „prophylaktisch", wie er in der vorliegenden Be¬ schreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezeichnet eine Be¬ handlung oder Wirkung einer Behandlung des Säuger-Körpers mit vorbeugen¬ dem Charakter, also mit dem Ziel, eine Krankheit nicht zum Ausbruch kommen zu lassen. Dies schließt die Fälle, in denen eine Behandlung vorbeugend ver¬ folgt wird, um ein Eintreten der Krankheit zum ersten Mal zu verhindern, wie auch die Fälle ein, in denen eine Behandlung vorbeugend verfolgt wird, um ei¬ nen Wiedereintritt einer Krankheit nach vorher bereits erfolgter Therapie und Heilung zum wiederholten Mal zu verhindern. Der Begriff „Therapie" oder „the¬ rapeutisch", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprü¬ chen verwendet wird, bezeichnet eine Behandlung oder Wirkung einer Behand¬ lung des Säuger-Körpers bei bereits ausgebrochener Erkrankung zu deren schneller und/oder vollständiger Beendigung unter Einstellen eines gesunden Zustande des Körpers des Säugers.
Entsprechend versteht sich eine prophylaktische Aktivierung des adaptiven Im¬ munsystems bzw. eine prophylaktische Aktivierung zytotoxischer T-Zellen als eine Aktivierung, die dem Entstehen einer Krankheit vorbeugen soll, während die entsprechende therapeutische Aktivierung der schnellen und/oder vollstän¬ digen Beendigung einer bereits ausgebrochenen Erkrankung dient. Insbeson¬ dere im Rahmen der Aktivierung des adaptiven Immunsystems und der Aktivie¬ rung der zytotoxischen T-Zellen im Körper eines Säugers, vorzugsweise eines Menschen, gilt die vorliegende Erfindung bevorzugt der therapeutischen Kom¬ ponente, d. h. der schnellen Reaktion auf einen aktuell auftretenden Krank¬ heitszustand unter Einschaltung des Säuger-Immunsystems.
Die Behandlung - gleich ob prophylaktisch oder therapeutisch oder beides - schließt die Verabreichung einer pharmazeutischen Zubereitung gemäß der Erfindung, wie sie oben im Detail beschrieben wurde, an einen Säuger als es¬ sentiellen Schritt ein, gegebenenfalls nach oder vor anderen Verfahrensschrit¬ ten, die demselben Prophylaxe- und/oder Therapie-Ziel dienen. Die Verabrei¬ chung kann auf jedem beliebigen Weg erfolgen, ohne daß die Erfindung auf einen bestimmten Weg beschränkt ist. Infrage kommen also beispielsweise ei¬ ne intraperitoneale, intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder intradermale, topische (z. B. epidermale), orale, intranasale, usw. Verabreichung. Erfindungs¬ gemäß bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem die die Verabreichung der pharma¬ zeutischen Zubereitung auf topischem Weg erfolgt, noch mehr vorzugsweise worin die pharmazeutische Zubereitung auf die Haut des Säugers, insbesonde¬ re des Menschen, aufgetragen wird. Dieser Verabreichungsweg eröffnet in ein¬ facher, für den Fachmann überraschender weise die Möglichkeit, eine effiziente spezifische Immunantwort unter Aktivierung der zytotoxischen T-Zellen zu ge¬ nerieren.
Eine andere, ebenfalls bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem die Verabreichung eines Teils der pharmazeutischen Zube¬ reitung mit mindestens einer Komponente auf topischem Wege erfolgt und die Verabreichung mindestens eines anderen Teils der pharmazeutischen Zuberei¬ tung mit einer anderen Komponente auf nicht-topischem, vorzugsweise auf subkutanem oder intradermalem Wege mit dem Ziel und mit dem Ergebnis ei¬ ner gemeinsamen Wirkung erfolgt. Dies kann noch weiter bevorzugt in der Wei¬ se geschehen, daß die Verabreichung eines Teils der pharmazeutischen Zube¬ reitung mit mindestens einer Komponente durch Auftragen auf die Haut des Säugers erfolgt und die Verabreichung eines anderen Teils der pharmazeuti¬ schen Zubereitung mit mindestens einer anderen Komponente durch unmittel¬ bar vor oder nach dem oder gleichzeitig mit dem Auftrag auf die Haut erfolgen¬ de subkutane oder intradermale Verabreichung an den Säuger mit dem Ziel und mit dem Ergebnis der gemeinsamen Wirkung bewirkt wird.
Dabei unterliegt es erfindungsgemäß keiner Beschränkung, welche der Kom¬ ponenten, insbesondere welche der essentiellen Komponenten der erfindungs¬ gemäßen pharmazeutischen Zubereitung topisch und welche der essentiellen Komponenten der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitung nicht- topisch, beispielsweise (aber nicht beschränkend) subkutan oder intradermal verabreicht wird, da mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auf unabhängigen Wegen der Verabreichung der einzelnen Komponenten der Zubereitung eine Aktivierung des adaptiven Immunsystems erreicht werden kann. Es entspricht jedoch einer mit besonderem Vorteil angewendeten Verfahrensweise, wenn erfindungsgemäß die Verabreichung eines Teils der Zubereitung, die mindes- tens einen Toll-like Rezeptor-Liganden umfaßt, im Wege der topischen Auftra¬ gung auf die Haut erfolgt und die Verabreichung eines anderen Teils der Zube¬ reitung, die mindestens ein Peptid umfaßt, im Wege des subkutanen oder intra¬ dermalen Verabreichung erfolgt. Auch in diesem Fall der erfindungsgemäßen Vorgehensweise werden die beiden Applikationsschritte entweder gleichzeitig oder unmittelbar aufeinander folgend durchgeführt, da das Ziel die gemeinsame Wirkung beider Komponenten ist, die in der Praxis überraschenderweise auch dann erreicht wird, wenn die Verabreichungswege unterschiedlich sind. Die Reihenfolge ist erfindungsgemäß nicht beschränkend vorgegeben, doch ist es bevorzugt, wenn die topische (epidermale) Applikation des Toll-like Rezeptor- Liganden unmittelbar nach der nicht-topischen (beispielsweise subkutanen oder intradermalen) Applikation des Peptids erfolgt, beispielsweise des MHC Klasse I-Liganden.
Die durch die gemeinsame bzw. unmittelbar aufeinanderfolgende Applikation der Komponenten der pharmazeutischen Zubereitung erreichte Immunisierung des Säugers bzw. des menschlichen Patienten wird gegebenenfalls mehrfach wiederholt, wobei ein beliebiger Zeitabstand zwischen den Behandlungen ge¬ wählt werden kann, vorzugsweise jedoch eine Zeit von mindestens 24 h zwi¬ schen zwei Applikationen liegt. Dies hat den Vorteil, daß die Effizienz der Be¬ handlung deutlich verstärkt wird und gleichzeitig Nebenwirkungen minimiert werden.
Die erfindungsgemäß verabreichten Mengen der pharmazeutischen Zuberei¬ tung sind vom Fachmann frei wählbar und unterliegen keinen Beschränkungen. Es hat sich jedoch als praktisch sinnvoll herausgestellt, die pharmazeutischen Zubereitungen, angegeben als Dosis für die einmalige Behandlung, in einer Menge im Bereich von 0,1 bis 100 mg der Zubereitung pro kg Körpergewicht des zu behandelnden Säugers zu verwenden, weiter bevorzugt in einer Menge im Bereich von 0,1 bis 10 mg der Zubereitung pro kg Körpergewicht des zu be¬ handelnden Säugers und noch weiter bevorzugt in einer Menge im Bereich von 0,1 bis 1 mg der Zubereitung pro kg Körpergewicht des zu behandelnden Säu¬ gers. Es ist erfindungsgemäß auch möglich, die Mengen als Mengen der Zube¬ reitung pro Oberfläche des Körpers des zu behandelnden Säugers anzugeben. Die Mengen sind dann in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung 0,1 bis 500 mg der Zubereitung pro 50 bis 250 cm2 Körperoberfläche des zu behan¬ delnden Säugers, weiter bevorzugt 0,1 bis 100 mg Zubereitung pro 10 bis 50 cm2 Körperoberfläche, noch mehr bevorzugt 0,1 bis 5 mg Zubereitung pro 4 bis 10 cm2 Körperoberfläche des zu behandelnden Säugers.
Die Behandlung kann - wie oben angegeben - mit denselben oder geringfügig von den vorgenannten Mengen abweichenden Mengen einmal oder mehrfach wiederholt werden.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert. Die Bei¬ spiele dienen jedoch nur der beispielhaften Darstellung der Erfindung und nicht deren Beschränkung.
Beispiele
Zum Nachweis der erfolgreichen Durchführung der erfindungsgemäßen Verfah¬ rensweise und der Brauchbarkeit der pharmazeutischen Zubereitungen der vor¬ liegenden Erfindung wurde ein TCR-transgenes Maus-Modell genutzt. In die¬ sem wurde Mäusen ein definiertes Transgen eingeführt das für einen bestimm¬ ten T-Zell-Rezeptor kodiert, der einen bestimmten MHC Klasse I-Liganden (SGPSNTPPEI; abgekürzt: SGP) aus dem Adenovirus Typ 5 im Kontext von MHC Klasse I (H2-Db)erkennt. Wie von den Erfindern bereits früher charakteri¬ siert [„M. Hofmann, M. Radsak, G. Rechtsteiner, K. Wiemann, M. Gründer, U. Bien-Gräter, R. Offringa, R.E. M. Toes, H. G. Rammensee, H. Schild; T cell avidi- ty determines the level of CTL activation; Eur. J. Immunol. 2004: 34, 1798- 1806"], wurden die zytotoxischen T-Zellen (CTL) aus diesen Tieren nur dann aktiviert, wenn sie mit diesem MHC Klasse I-Liganden SGP im Kontext von H2- Db in Kontakt kommen. Um die Aktivierung dieser CTL im Empfängertier verfol¬ gen zu können, wurden die nicht-aktivierten („naiven") CTL aus transgenen Spender-Mäusen intravenös (i.v.) in syngene Empfänger-Mäuse injiziert, die sich im Allel eines Lymphozyten-Markers unterscheiden (CD45.1 auf transge¬ nen Zellen bzw. CD45.2 auf Zellen der Empfänger-Mäuse). So kann nach der Impfbehandlung die Aktivierung bzw. Expansion der spezifischen (CD45.1- positiven) CTL verfolgt werden.
Tiere und Materialien
Folgende Mäuse wurden verwendet:
- ST35 - C57BL/6 (TCR-transgener Maus-Stamm, der das Peptid SGPSNTPPEI (abgekürzt: SGP) auf Db erkennt; RAG2"'"; CD45.1 ; eigene Zucht);
- Empfänger-Tiere: C57BL/6; Herkunft: ZVTE Uni Mainz.
Für transkutane Immunisierungen wurde eine Imiquimod-haltige Creme (Alda- raR 5 %, Firma 3M) verwendet.
Das Peptid SGPSNTPPEI aus dem E1A-Protein von Adenovirus Typ 5 wurde synthetisch hergestellt von PD Dr. Stefan Stevanovic, Institut für Zellbiologie, Abt. Immunologie, Universität Tübingen.
Es wurden folgende monoklonale Antikörper verwendet: Anti-CD8 APC-Cy7- konjugiert, Anti-CD45.1 PE-konjugiert (kommerziell erhältlich von Firma Becton- Dickinson Pharmingen, Hamburg). Präparation von Milzzellen
Mäuse wurden getötet; es wurde die Milz entnommen, mit 5 ml Phosphat¬ gepufferter Kochsalz-Lösung (PBS) versetzt und mit dem Stempel einer 5 ml- Spritze in einem 70 μm-Nylonsieb über einem 50 ml-Röhrchen zerdrückt. Die Zellen wurden mit weiteren 5 ml PBS ins Röhrchen gespült und abzentrifugiert (1500 Upm, 3 min). Zur Entfernung von Erythrozyten wurde das Zellpellet in 5 ml eiskaltem ACK-Puffer (150 mM NH4CI; 1 mM KHCO3; 0,1 mM EDTA; pH 7,3) resuspendiert und für 5 min bei RT inkubiert. Die Zellen wurden abzentrifugiert und einmal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit Hilfe einer Neubauer- Zählkammer gezählt und zu 12 x 106 Zellen pro ml in PBS resuspendiert.
Adoptiver Transfer
250 μl der Milz-Suspension (entspricht 3 x 106 Zellen) wurden in eine 1 ml- Spritze eingezogen und bis zur Injektion auf Eis gelagert. Die Empfänger- Mäuse wurden in eine Halterung eingespannt, und die Zeil-Suspension wurde intravenös in die Schwanzvene injiziert.
Transkutane Immunisierung
Den adoptiv transferierten Mäusen wurde unter Narkose (Metofane, Firma Janssen-Cilag) der Rücken rasiert, so daß eine ca. 10 cm2 große kahle Stelle entstand. Zur Immunisierung wurde den Mäusen der Rücken mit einer Mi¬ schung aus 50 mg TLR7-Liganden- („Imiquimod"-) Creme (AlderaR, Firma 3M) und dem synthetischen Peptid SGP (Stammlösung: 10 μg/ml in DMSO) einge¬ cremt. Die Immunisierung wurde nach 24 h wiederholt. Intradermale Applikation von Peptid und transkutane Aktivierung Antigen prä¬ sentierender Zellen
Den adoptiv transferierten Mäusen wurde unter Narkose (Metofane, Firma Janssen-Cilag) der Rücken rasiert, so daß eine ca. 10 cm2 große kahle Stelle entstand. Zur Immunisierung wurde den Mäusen unter Narkose zunächst Pep¬ tid (aus der DMSO-Stammlösung zu 250 μl in PBS verdünnt) intradermal inji¬ ziert. Kurze Zeit später wurde der Rücken der Mäuse mit 50 mg TLR7- Liganden- („Imiquimod"-) Creme (AlderaR, Firma 3M) eingecremt. Die Applikati¬ on der Creme wurde nach 24 h wiederholt.
Analyse der Zahl zytotoxischer T-Zellen (CTL) im Blut
Um die Proliferation der adoptiv transferierten Zellen zu messen, wurde den Mäusen 4 Tage nach der letzten Immunisierung Blut aus der Schwanzvene entnommen, und die Blutprobe wurde durchflußzytometrisch analysiert. Hierzu wurden zunächst die Erythrozyten in ACK-Puffer lysiert. Die verbleibenden Zel¬ len wurden in FACS-Puffer (0,5 % Rinderserumalbumin (BSA), 2 mM EDTA, Natriumazid in PBS) aufgenommen und einmal in FACS-Puffer gewaschen. Zur durchflußzytometrischen Analyse der Zellen wurden diese mit fluoreszenzmar¬ kierten Antikörpern (Anti-CD8 APC-Cy7-konjugiert, Anti-CD45.1 PE-konjugiert (kommerziell erhältlich von Firma Becton-Dickinson Pharmingen, Hamburg)) angefärbt, und zwar für 30 min in 50 μl FACS-Puffer auf Eis in 96-well- Rundbodenplatten. Die Zellen wurden zweimal mit FACS-Puffer gewaschen und in eine FACS-Canto-Durchflußzytometer (Firma Becton-Dickinson Phar¬ mingen, Hamburg) analysiert. Die CD8-positiven Blutlymphozyten wurden auf den Anteil der CD54.1 -positiven Zellen hin untersucht. /π-wVo-Killer-Assav
Die spezifische zytotoxische Funktionalität der aktivierten Zellen wurde mittels eines sog. /n-wVo-Killer-Assays 6 Tage nach der letzten Immunisierung be¬ stimmt. Hierzu wurden mit CFSE (5,6-Carboxyfluoresceindiacetat-succinimidyl- ester; Firma Molecular Probes) markierte Milz-Zellen aus syngenen Mäusen als Zielzellen für die zytotoxischen T-Zellen (CTLs) verwendet. Die Hälfte der Zel¬ len wurde mit 3 μM CFSE gefärbt, die andere Hälfte mit 0,3 μM CFSE. Die mit 3 μM CFSE markierten Zellen wurden mit dem künstlichen SGP-Peptid beladen (10 μM Peptid; 40 x 106 Zellen pro ml ISC-Medium; 1 h; 37 0C), und diese wur¬ den anschließend zweimal mit Medium und zweimal mit PBS gewaschen. Die mit 0,3 μM CFSE markierten Zellen wurden nur in ISC-Medium inkubiert und ebenfalls gewaschen. Die Zellen wurden im Verhältnis 1 : 1 gemischt, und es wurden jeweils 15 x 106 Zellen in 300 μl PBS i.v. den Mäusen injiziert. Nach 18 h wurden die Mäuse getötet, und es wurden die Milzzellen entnommen und durchflußzytometrisch analysiert. In einem FACS-Canto-Durchflußzytometer wurden die CFSE-positiven Zellen ausgezählt. Die spezifische Lyse ergibt sich aus dem Verhältnis der Zellzahlen der stark mit CFSE markierten, mit Peptid beladenen und den schwach mit CFSE markierten, nicht mit Peptid beladenen beladenen Zellen. Da die beiden Zellpopulationen im Verhältnis 1 : 1 eingesetzt worden waren, entspricht die Zahl nicht mit Peptid beladenen Zellen der ur¬ sprünglichen Anzahl der mit Peptid beladenen Zellen. Die spezifische Lyse er¬ rechnet sich damit wie folgt:
Spezifische Lyse [%] =
(Anzahl Zellen ohne Peptid - Anzahl Zellen mit Peptid) (Anzahl Zellen ohne Peptid) CFSE-Markierunq
Die Präparation der Milzzellen erfolgte wie oben beschrieben. Nach der ACK- Lyse wurden die Zellen in 10 ml PBS resuspendiert, gezählt und aud 2 x 107 Zellen pro ml eingestellt. Die Zellsuspension wurde mit einem adäquaten Volu¬ men einer 6 μM bzw. 0,6 μM CFSE-Lösung (in PBS) gemischt und für 4 min bei 37 0C inkubiert. Die Reaktion wurde danach durch Zugabe des doppelten Vo¬ lumens an mit 10 % fetalem Kälberserum (FCS) supplementiertem ISC-Medium gestoppt. Die Zellen wurden zweimal mit FCS-freiem Medium gewaschen und gezählt.
Ergebnisse
Um das funktionelle Prinzip der transkutanen Immunisierung im Test zu bele¬ gen, wurden TCR-transgene zytotoxische T-Zellen (CTL) i.v. in kongene Emp¬ fänger-Mäuse injiziert und diese mit ihrem spezifischen MHC Klasse I-Liganden immunisiert. Die Ergebnisse sind in Figur 1 gezeigt (Abbildung 1 : Proliferation (A) und Funktionalität (B) transkutan aktivierter transgener zytotoxischer T- Zellen).
Der Anteil transgener CD8+-Zellen an der Gesamtpopulation CD8+-Zellen wurde in Blut bzw. Milz durchflußzytometrisch bestimmt. Hierzu wurden die Lymphozy¬ ten mit den Antikörpern Anti-CD8 APC-Cy7-konjugiert, Anti-CD45.1 PE- konjugiert (kommerziell erhältlich von Firma Becton-Dickinson Pharmingen, Hamburg) angefärbt. Zu sehen ist jeweils die Fluoreszenz im FL-2-Kanal (PE) des CD8+-Lymphozyten. Der Anteil der CD45.1+-Zellen ist in den jeweiligen Hi¬ stogrammen in Prozent angegeben. Bei allen Mäusen wurde der Anteil der transgenen CD8+-Zellen vor der Immunisierung und 4 Tage nach der Immuni¬ sierung in der Milz bestimmt (A). Um die Funktionalität der aktivierten Zellen zu bestimmen, wurde 6 Tage nach der Immunisierung ein /n-wVo-Killer-Assay durchgeführt. Hierzu wurden mit ho¬ her CFSE-Konzentration markierte, syngene Milz-Zellen mit Peptid beladen, mit nicht mit Peptid beladenen, schwächer CFSE-markierten Zellen 1 : 1 gemischt und i.v. in die Mäuse transferiert. Nach 18 h wurden die Milzen der Mäuse ent¬ nommen, und es wurde die Anzahl der beiden CFSE-markierten Zellpopulatio¬ nen verglichen. Ein Rückgang der Anzahl der mit Peptid beladenen Zellen zeig¬ te eine spezifische Lyse der aktivierten CTLs an. Zu sehen ist jeweils die Fluo¬ reszenz der Milz-Zellen im FL-1 -Kanal (CFSE). Die Lyse wurde auf die Anzahl der unbeladenen Zellen berechnet und ist in Prozent angegeben (B).
Wie aus Figur 1 deutlich wird, hatten alle Tiere vor der Immunisierung in etwa den gleichen Anteil transgener CTL im Blut (< 0,6 % der CD8+ CTL, Figur 1A, linke Reihe). Nach Immunisierung nach einem klassischen Protokoll (Peptid mit komplettem Freund'schem Adjuvans, CFA) erhöht sich der Anteil der transge- nen CTL der Tiere auf ca. 10 % an Tag 4. Im Vergleich dazu ist ein deutlich hö¬ herer Anteil von spezifischen CTL nach intradermaler (i.d.) Peptid-Applikation und epidermaler Applikation von Toll-like Rezeptor-Ligand (Imiquimod; AldaraR- Creme) (44,7 %) oder epidermaler Applikation von Peptid + Imiquimod (bis 39,8 %) zu beobachten. Wird dagegen das Peptid allein (ohne Zusatzstoffe, Adju- vantien) appliziert, findet nur eine marginale Vermehrung transgener Zellen statt. Diese aktivierten CTL lassen sich auch an Tag 6 in der Milz als lymphoi- dem Organ nachweisen. Dies deutet darauf hin, daß eine systemische Aktivie¬ rung der CTL stattgefunden hat, was zeigt, daß für die Aktivierung der TCR- transgenen CTL neben dem spezifischen Peptid zusätzlich noch ein Adjuvans (CFA, Imiquimod) erforderlich ist. Die Ergebnisse zeigen daß die lokale Applika¬ tion eines Toll-like Rezeptor-Liganden wie Imiquimod der klassischen Immuni¬ sierung mit CFA überlegen ist, was die Expansion der spezifischen zytotoxi¬ schen T-Zellen angeht. In Figur 1 B ist gezeigt, daß die Expansion der transgenen CTL auch mit einer funktionellen Aktivität einhergeht. Transferierte Zielzellen, die mit Peptid mar¬ kiert wurden, wurden spezifisch zerstört, während unmarkierte Zellen nicht zer¬ stört wurden (spezifische Lyse). Die Effizienz der spezifischen Lyse ist abhän¬ gig von der vorherigen Aktivierung der transgenen CTL. Wie dargestellt, zeigt die Gruppe „Maus 1", die mit CFA immunisiert wurde, nur eine spezifische Lyse von ca. 17 %, während optimal aktivierte CTL einen Anteil von ca. 60 % spezi¬ fisch lysieren. Wird nur mit Peptid immunisiert (Gruppe „Maus 3"), führt dies nicht zu einer funktionellen Aktivierung der CTL.
Die Ergebisse sind auch der nachfolgenden Tabelle 2 zu entnehmen.
Tabelle 2 Ergebnisse der Immunisierungs-Tests
Anmerkungen:
Die Werte der speziellen Lyse wurden mittels eines /n-wVo-Killer-Assays be¬ stimmt. Behandlung: Gruppe Nr. 1 : 50 μg Peptid + CFA (s.c.)
Gruppe Nr. 2: 50 μg Peptid (i.d.) + Imiquimod-Creme (e.d.) Gruppe Nr. 3: 50 μg Peptid (i.d.) Gruppe Nr. 4: 100 μg Peptid + Imiquimod-Creme (e.d.) Gruppe Nr. 5: 20 μg Peptid + Imiquimod-Creme (e.d.)
Um zu zeigen, daß die Aktivierung von CTL von der Gegenwart des spezifi¬ schen Peptids und der zusätzlichen Aktivierung durch den TLR-Liganden (Imi- quimod) abhängig ist, wurden transgene CTL in Empfänger-Mäuse übertragen, und diese Wurden mit der den TLR-Liganden (Imiquimod) enthaltenden Zube¬ reitung behandelt, die das Peptid enthielt bzw. nicht enthielt. Wie in Figur 2 („Funktionalität transkutan aktivierter transgener zytotoxischer T-Zellen") darge¬ stellt, zeigt nur die Gruppe von Mäusen, die mit der das Peptid und den TLR- Liganden gemeinsam enthaltenden Zubereitung behandelt wurden, eine spezi¬ fische Reaktion, während die Tiere, die nicht behandelt wurden bzw. mit Zube¬ reitungen behandelt wurden, die jeden der Wirkstoffe allein enthielten, keine spezifische Reaktion zeigten. Dieser Versuch zeigt, daß beide Komponenten zwingend erforderlich sind, damit durch transkutane Impfung eine Aktivierung der zytotoxischen T-Zellen erreicht werden kann.
Figur 2 zeigt die Funktionalität transkutan aktivierter transgener zytotoxischer T-Zellen. Um die Funktionalität der aktivierten Zellen zu bestimmen, wurde 6 Tage nach der Immunisierung ein /π-wVo-Killer-Assay durchgeführt. Hierzu wurden mit hoher CFSE-Konzentration markierte syngene Milz-Zellen mit Pep¬ tid beladen, mit nicht mit Peptid beladenen, schwächer CFSE-markierten Zellen im Verhältnis 1 : 1 gemischt und i.v. in die Mäuse transferiert. Nach 18 h wur¬ den die Milzen der Mäuse entnommen und die Zellzahl der beiden markierten CFSE-markierten Zellpopulationen verglichen. Ein Rückgang der Anzahl der mit Peptid beladenen Zellen zeigt eine spezifische Lyse der aktivierten CTLs an. Zu sehen ist jeweils die Fluoreszenz der Milz-Zellen im FL1 -Kanal (CFSE). Die spezifische Lyse wurde auf die Anzahl der unbeladenen Zellen berechnet und ist in Prozent angegeben.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen und ihre Verwen¬ dung sowie die Verfahren gemäß der Erfindung zeigen, daß es möglich ist, An- tigen-spezifisch zytotoxische T-Zellen zu aktivieren, die daraufhin auch funktio¬ nell sind. Voraussetzungen für die Funktionalität sind zum einen das Vorhan¬ densein von APC in der Haut, die einen MHC Klasse I-Liganden präsentieren können, und zum anderen Kenntnisse über die genaue Struktur der MHC- Moleküle und das Antigen, gegen welches immunisiert werden soll. Für das neue Impfverfahren sind keine Injektionen erforderlich, was das Verfahren we¬ sentlich vereinfacht und pharmazeutische Zubereitungen zu seiner Verwendung wesentlich kostengünstiger gestaltet.
Die vorliegende Erfindung betrifft also eine pharmazeutische Zubereitung, die mindestens einen Toll-like Rezeptor-Liganden, mindestens ein Peptid und ge¬ gebenenfalls eine oder mehrere Substanz(en) aus der Gruppe Träger, Hilfsstof- fe und Zusatzstoffe umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine pharmazeuti¬ sche Zubereitung gemäß der vorstehenden Definition, worin der mindestens eine Toll-like Rezeptor-Ligand gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus TLR2- Ligand, TLR3-Ligand, TLR7-Ligand, TLR8-Ligand und TLR9-Ligand, vorzugs¬ weise worin der mindestens eine Toll-like Rezeptor-Ligand ein TLR7-Ligand ist.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft eine pharma¬ zeutische Zubereitung nach der vorangehenden Definition, worin der mindes¬ tens eine Toll-like Rezeptor-Ligand gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen natürlicher und/oder synthetischer Herkunft, die von mindestens einem Toll-like Rezeptor erkannt werden und zur Auslösung eines oder mehre¬ rer die Immunantwort fördernden Signale(s) dienlich sind, vorzugsweise worin der mindestens eine Toll-like Rezeptor-Ligand gewählt ist aus der Gruppe be¬ stehend aus Pam3Cys, Poly-(I:C), Imiquimod, Loxoribine, R-848 und CpG- DNA, weiter bevorzugt worin der Toll-like Rezeptor-Ligand Imiquimod ist.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft eine pharma¬ zeutische Zubereitung nach einer der vorstehenden Definitionen, worin das mindestens eine Peptid gewählt ist aus Major Histocompatibility Komplex Klas¬ se I-Ligand, Major Histocompatibility Komplex Klasse Il-Ligand und weiteren, diese Liganden enthaltenden Peptiden.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft eine pharma¬ zeutische Zubereitung nach einer der vorstehenden Definitionen, die mindes¬ tens einen Toll-like Rezeptor-Liganden in einer Menge von 0,1 bis 10 Gew.-%; mindestens ein Peptid in einer Menge von 0,01 bis 30 Gew.-%; und eine oder mehrere Substanz(en) aus der Gruppe Träger, Hilfsstoffe und Zusatzstoffe in einer Gesamtmenge von 0,1 bis 99,9 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Ge¬ samtgewicht der pharmazeutischen Zubereitung, umfasst.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft eine pharma¬ zeutische Zubereitung nach einer der vorstehenden Definitionen, die den min¬ destens einen synthetischen Toll-like Rezeptor-Liganden und das mindestens eine synthetische Peptid in einer Formulierung zur gemeinsamen Verabrei¬ chung und Wirkung umfasst.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft eine pharma¬ zeutische Zubereitung nach einer der vorstehenden Definitionen, die den min¬ destens einen synthetischen Toll-like Rezeptor-Liganden und das mindestens eine synthetische Peptid in getrennten Formulierungen zur getrennten Verab¬ reichung und gemeinsamen Wirkung umfasst. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft eine pharma¬ zeutische Zubereitung nach einer der vorstehenden Definitionen in einer für die topische Verabreichung geeigneten Formulierung. .
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft eine pharma¬ zeutische Zubereitung nach einer der vorstehenden Definitionen in einer für die topische Verabreichung einer Komponente und für die nicht-topische, vorzugs¬ weise die subkutane oder intradermale Verabreichung einer anderen Kompo¬ nente mit dem Ziel der gemeinsamen Wirkung geeigneten Formulierung.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft eine pharma¬ zeutische Zubereitung nach der vorstehenden Definition in einer für die topische Verabreichung mindestens eines Toll-like Rezeptor-Liganden und einer für die nicht-topische, vorzugsweise die subkutane oder intradermale Verabreichung mindestens eines synthetischen Peptids mit dem Ziel der gemeinsamen Wir¬ kung geeigneten Formulierung.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer pharmazeuti¬ schen Zubereitung nach einer der vorstehenden Definitionen zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch Viren und/oder Bakterien und/oder Pilze induzier¬ te Krankheiten bei einem Säuger.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer pharmazeuti¬ schen Zubereitung nach einer der vorstehenden Definitionen zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch exzessive Zell-Proliferation bedingten Krankheiten bei einem Säuger.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter die Verwendung einer pharmazeuti¬ schen Zubereitung nach einer der vorstehenden Definitionen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch Viren und/oder Bakterien und/oder Pilze induzierte Krankheiten bei einem Säuger. Die vorliegende Erfindung betrifft weiter die Verwendung einer pharmazeuti¬ schen Zubereitung nach einer der vorstehenden Definitionen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch exzessive ZeII- Proliferation bedingten Krankheiten bei einem Säuger.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung nach einer der vorstehenden Definitionen, worin der Säuger ein Mensch ist.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwen¬ dung nach einer der vorstehenden Definitionen im Wege der topischen Applika¬ tion der pharmazeutischen Zubereitung, vorzugsweise im Wege der Applikation der pharmazeutischen Zubereitung auf die Haut des Säugers.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwen¬ dung nach einer der vorstehenden Definitionen im Wege der getrennten topi¬ schen Applikation einer Komponente und nicht-topischen, vorzugsweise subku¬ tanen oder intradermalen, Applikation einer anderen Komponente mit dem Ziel einer gemeinsamen Wirkung, vorzugsweise im Wege der topischen Applikation einer Komponente auf die Haut des Säugers und der zeitlich unmittelbar vor oder nach oder gleichzeitig mit der topischen Applikation erfolgenden subkuta¬ nen oder intradermalen Applikation einer anderen Komponente.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwen¬ dung nach der vorstehenden Definition im Wege der getrennten topischen Ap¬ plikation einer mindestens einen Toll-like Rezeptor-Liganden umfassenden For¬ mulierung und subkutanen oder intradermalen Applikation einer mindestens ein synthetisches Peptid umfassenden Formulierung mit dem Ziel der gemeinsa¬ men Wirkung.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch Viren und/oder Bakterien und/oder Pilze induzierten Krank- heiten bei einem Säuger, das die Verabreichung einer pharmazeutischen Zube¬ reitung nach einer der vorstehenden Definitionen an den Säuger in einer für die Prophylaxe und/oder Therapie der genannten Krankheiten wirksamen Konzent¬ ration der pharmakologisch wirksamen Komponenten umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch exzessive Zell-Proliferation bedingten Krankheiten bei ei¬ nem Säuger, das die Verabreichung einer pharmazeutischen Zubereitung nach einer der vorstehenden Definitionen an den Säuger in einer für die Prophylaxe und/oder Therapie der genannten Krankheiten wirksamen Konzentration der pharmakologisch wirksamen Komponenten umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Aktivierung des adaptiven Immunsystems eines Säu¬ gers, das die Verabreichung einer pharmazeutischen Zubereitung nach einer der vorstehenden Definitionen an den Säuger in einer für die prophylaktische und/oder therapeutische Aktivierung des Immunsystems des Säugers wirksa¬ men Konzentration der pharmakologisch wirksamen Komponenten umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Aktivierung zytotoxischer T-Zellen des Immunsys¬ tems eines Säugers, das die Verabreichung einer pharmazeutischen Zuberei¬ tung nach einer der vorstehenden Definitionen an den Säuger in einer für die prophylaktische und/oder therapeutische Aktivierung der zytotoxischen T-Zellen wirksamen Konzentration der pharmakologisch wirksamen Komponenten um¬ fasst
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren nach ei¬ ner der vorstehenden Definitionen, worin der Säuger ein Mensch ist. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren nach einer der vorstehenden Definitionen, worin die Verabreichung der phar¬ mazeutischen Zubereitung auf topischem Weg erfolgt, vorzugsweise worin die pharmazeutische Zubereitung auf die Haut des Säugers aufgetragen wird.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren nach einer der vorstehenden Definitionen, worin die Verabreichung eines Teils der pharmazeutischen Zubereitung mit einer Komponente auf topischem Wege erfolgt und die Verabreichung eines anderen Teils der pharmazeutischen Zube¬ reitung mit einer anderen Komponente auf nicht-topischem, vorzugsweise auf subkutanem oder intradermalem Wege mit dem Ziel einer gemeinsamen Wir¬ kung erfolgt, weiter bevorzugt worin die Verabreichung eines Teils der pharma¬ zeutischen Zubereitung mit einer Komponente durch Auftragen auf die Haut des Säugers erfolgt und die Verabreichung eines anderen Teils der pharmazeuti¬ schen Zubereitung mit einer anderen Komponente durch unmittelbar vor oder nach dem oder gleichzeitig mit dem Auftrag auf die Haut erfolgende subkutane oder intradermale Verabreichung an den Säuger mit dem Ziel der gemeinsa¬ men Wirkung bewirkt wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Ver¬ fahren nach der vorstehenden Definition, worin die Verabreichung eines Teils der Zubereitung, die mindestens einen Toll-like Rezeptor-Liganden umfaßt, im Wege der topischen Auftragung auf die Haut erfolgt und die Verabreichung ei¬ nes anderen Teils der Zubereitung, die mindestens ein Peptid umfaßt, im Wege der subkutanen oder intradermalen Verabreichung erfolgt.

Claims

Patentansprüche
1. Pharmazeutische Zubereitung, umfassend mindestens einen Toll-like Re¬ zeptor-Liganden, der gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus TLR2- Ligand, TLR3-Ligand, TLR7-Ligand, TLR8-Ligand und TLR9-Ligand, min¬ destens ein Peptid und gegebenenfalls eine oder mehrere Substanz(en) aus der Gruppe Träger, Hilfsstoffe und Zusatzstoffe, worin das mindestens eine Peptid gewählt ist aus Major Histocompatibility Komplex Klasse I-Ligand, Major Histocompatibility Komplex Klasse Il-Ligand und weiteren, diese Li¬ ganden enthaltenden Peptiden, die von MHC Klasse I-Molekülen als auch von MHC Klasse Il-Molekülen präsentiert werden können.
2. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1 , worin der mindestens eine Toll-like Rezeptor-Ligand gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Verbin¬ dungen natürlicher und/oder synthetischer Herkunft, die von mindestens ei¬ nem Toll-like Rezeptor erkannt werden und zur Auslösung eines oder meh¬ rerer die Immunantwort fördernden Signale(s) dienlich sind, vorzugsweise worin der mindestens eine Toll-like Rezeptor-Ligand ein TLR7-Ligand ist, weiter bevorzugt worin der mindestens eine Toll-like Rezeptor-Ligand ge¬ wählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pam3Cys, Poly-(I:C), Imiquimod, Loxoribine, R-848 und CpG-DNA, noch mehr bevorzugt worin der Toll-like Rezeptor-Ligand Imiquimod ist.
3. Pharmazeutische Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, umfas¬ send mindestens einen Toll-like Rezeptor-Liganden in einer Menge von 0,1 bis 10 Gew.-%; mindestens ein Peptid in einer Menge von 0,01 bis 30 Gew.- %; und eine oder mehrere Substanz(en) aus der Gruppe Träger, Hilfsstoffe und Zusatzstoffe in einer Gesamtmenge von 0,1 bis 99,9 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der pharmazeutischen Zubereitung.
4. Pharmazeutische Zubereitung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, umfassend den mindestens einen synthetischen Toll-like Rezeptor- Liganden und das mindestens eine synthetische Peptid in einer Formulie¬ rung zur gemeinsamen Verabreichung und Wirkung.
5. Pharmazeutische Zubereitung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, umfassend den mindestens einen synthetischen Toll-like Rezeptor- Liganden und das mindestens eine synthetische Peptid in getrennten For¬ mulierungen zur getrennten Verabreichung und gemeinsamen Wirkung.
6. Pharmazeutische Zubereitung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 in einer für die topische Verabreichung geeigneten Formulierung.
7. Pharmazeutische Zubereitung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3 und 5 in einer für die topische Verabreichung einer Komponente und für die nicht-topische, vorzugsweise die subkutane oder intradermale Verab¬ reichung einer anderen Komponente mit dem Ziel der gemeinsamen Wir¬ kung geeigneten Formulierung.
8. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 7 in einer für die topische Ver¬ abreichung mindestens eines Toll-like Rezeptor-Liganden und einer für die nicht-topische, vorzugsweise die subkutane oder intradermale Verabrei¬ chung mindestens eines synthetischen Peptids mit dem Ziel der gemeinsa¬ men Wirkung geeigneten Formulierung.
9. Verwendung einer pharmazeutischen Zubereitung nach einem oder mehre¬ ren der Ansprüche 1 bis 8 zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch Vi¬ ren und/oder Bakterien und/oder Pilzen induzierte Krankheiten bei einem Säuger.
10. Verwendung einer pharmazeutischen Zubereitung nach einem oder mehre¬ ren der Ansprüche 1 bis 8 zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch ex¬ zessive Zell-Proliferation bedingten Krankheiten bei einem Säuger.
11.Verwendung nach einem der Ansprüche 9 oder 10, worin der Säuger ein Mensch ist.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 11 im Wege der topischen Applikation der pharmazeutischen Zubereitung, vorzugsweise im Wege der Applikation der pharmazeutischen Zubereitung auf die Haut des Säugers.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 11 im Wege der getrennten topischen Applikation einer Komponente und nicht-topischen, vorzugsweise subkutanen oder intradermalen, Applikation einer anderen Komponente mit dem Ziel einer gemeinsamen Wirkung, vorzugsweise im Wege der topi¬ schen Applikation einer Komponente auf die Haut des Säugers und der zeit¬ lich unmittelbar vor oder nach oder gleichzeitig mit der topischen Applikation erfolgenden subkutanen oder intradermalen Applikation einer anderen Kom¬ ponente.
14. Verwendung nach Anspruch 13 im Wege der getrennten topischen Applika¬ tion einer mindestens einen Toll-like Rezeptor-Liganden umfassenden For¬ mulierung und subkutanen oder intradermalen Applikation einer mindestens ein synthetisches Peptid umfassenden Formulierung mit dem Ziel der ge¬ meinsamen Wirkung.
15. Verfahren zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch Viren und/oder Bak¬ terien und/oder Pilze induzierten Krankheiten bei einem Säuger, umfassend die Verabreichung einer pharmazeutischen Zubereitung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 an den Säuger in einer für die Prophylaxe und/oder Therapie der genannten Krankheiten wirksamen Konzentration der pharmakologisch wirksamen Komponenten.
16. Verfahren zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch exzessive ZeII- Proliferation bedingten Krankheiten bei einem Säuger, umfassend die Ver¬ abreichung einer pharmazeutischen Zubereitung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 an den Säuger in einer für die Prophylaxe und/oder Therapie der genannten Krankheiten wirksamen Konzentration der pharma¬ kologisch wirksamen Komponenten.
17. Verfahren zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Aktivierung des adaptiven Immunsystems eines Säugers, umfassend die Verabreichung ei¬ ner pharmazeutischen Zubereitung nach einem oder mehreren der Ansprü¬ che 1 bis 8 an den Säuger in einer für die prophylaktische und/oder thera¬ peutische Aktivierung des Immunsystems des Säugers wirksamen Konzent¬ ration der pharmakologisch wirksamen Komponenten.
18. Verfahren zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Aktivierung zyto¬ toxischer T-Zellen des Immunsystems eines Säugers, umfassend die Verab¬ reichung einer pharmazeutischen Zubereitung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 an den Säuger in einer für die prophylaktische und/oder therapeutische Aktivierung der zytotoxischen T-Zellen wirksamen Konzentration der pharmakologisch wirksamen Komponenten.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, worin der Säuger ein Mensch ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, worin die Verabreichung der pharmazeutischen Zubereitung auf topischem Weg erfolgt, vorzugswei¬ se worin die pharmazeutische Zubereitung auf die Haut des Säugers aufge¬ tragen wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, worin die Verabreichung eines Teils der pharmazeutischen Zubereitung mit einer Komponente auf topischem Wege erfolgt und die Verabreichung eines anderen Teils der pharmazeutischen Zubereitung mit einer anderen Komponente auf nicht- topischem, vorzugsweise auf subkutanem oder intradermalem Wege mit dem Ziel einer gemeinsamen Wirkung erfolgt, weiter bevorzugt worin die Verabreichung eines Teils der pharmazeutischen Zubereitung mit einer Komponente durch Auftragen auf die Haut des Säugers erfolgt und die Ver¬ abreichung eines anderen Teils der pharmazeutischen Zubereitung mit einer anderen Komponente durch unmittelbar vor oder nach dem oder gleichzeitig mit dem Auftrag auf die Haut erfolgende subkutane oder intradermale Ver¬ abreichung an den Säuger mit dem Ziel der gemeinsamen Wirkung bewirkt wird.
22. Verfahren nach Anspruch 21 , worin die Verabreichung eines Teils der Zube¬ reitung, die mindestens einen Toll-like Rezeptor-Liganden umfaßt, im Wege der topischen Auftragung auf die Haut erfolgt und die Verabreichung eines anderen Teils der Zubereitung, die mindestens ein Peptid umfaßt, im Wege der subkutanen oder intradermalen Verabreichung erfolgt.
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