DE69011870T2

DE69011870T2 - Verfahren und zubereitung für die behandlung von hiv-infizierten säugetieren.

Info

Publication number: DE69011870T2
Application number: DE69011870T
Authority: DE
Inventors: Torben Saermark; Erfle Volker
Original assignee: STRAHLEN UMWELTFORSCH GmbH
Current assignee: STRAHLEN UMWELTFORSCH GmbH
Priority date: 1989-12-07
Filing date: 1990-12-07
Publication date: 1994-12-15
Anticipated expiration: 2010-12-08
Also published as: WO1991008753A1; EP0504191B1; AU646652B2; JPH075475B2; GR930300031T1; DE69011870D1; ES2048137T3; ES2048137T1; AU6880891A; EP0504191A1; DE504191T1; KR970005329B1; BR9007904A; DK0504191T3; ATE110278T1; JPH05504761A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung oder Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von HIV-Infektionen beim Säuger und insbesondere die Verwendung dieser Verbindung oder Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von HIV-Infektionen beim Säuger, das Tiergift von Hymenoptera oder Protein- oder Polypeptidkomponenten davon umfaßt, und das in die Säuger-Wirte eingeführt wird und einzeln wirken kann, wodurch die Replikation des Virus in den mit HIV infizierten Zellen des Saugers eingeschränkt oder wesentlich gehemmt wird.
Auf dem medizinischen Fachgebiet wird schon lange nach einem wirksamen Verfahren und einem wirksamen Mittel zur Behandlung von mit HIV infizierten Individuen gesucht. HIV-Infektion soll hier sowohl HIV1- als auch HIV2-Infektionen umfassen. Die vorliegende Untersuchung richtete sich in diesem Zusammenhang darauf, ein potentiell vorteilhaftes therapeutisches Mittel für die Herstellung eines Medikaments zu suchen, min dem die HIV-Infektion bekämpft wird, wobei dieses Mittel die Virusreproduktion von mit HIV infizierten Zellen hemmen kann, jedoch keine zahlreichen schädlichen Nebenwirkungen hat. Insbesondere besteht der Zweck dieser Untersuchung darin, ein Mittel zu finden, das eine alternative Behandlung zur gegenwärtigen Anwendung von AZT (Azidothymidin) darstellt. Dieses Mittel muß jedoch so wirken können, daß es mit HIV infizierte, oder alternativ HIV übertragende Zellen in einem Umfang selektiv zerstört, der das Reservoir verfügbarer Viruszellen umfaßt oder wesentlich einschränkt.
Selbstverständlich sind HIV-Viren Retroviren und werden folglich am geeignetsten als RNA-Viren klassifiziert. Die RNA dieser bestimmten Retroviren kann jedoch nicht direkt durch Replikation wachsen, sondern erfordert eher eine intermediäre DNA-Synthese unter Zuhilfenahme der reversen Transkriptase. Selbstverständlich dient die DNA als Templat für die Vermehrung des RNA-Virus dient. Diese DNA wird später in das Genom der Wirtszelle integriert. Dieser Fall der Integration führt anschließend zur Erzeugung neuer Viruszellen.
Die vorliegende Erfindung, die subtoxische Konzentrationen von Tiergift von Hymenoptera oder Protein- oder Polypeptidkomponenten davon anwendet, scheint die Virus-Replikation bei diesen subtoxischen Konzentrationen zu stören, indem sie die reverse Transkriptase hemmt und/oder das Wachstum von mit HIV infizierten Zellen selektiv hemmt, wodurch das Virusreservoir mit zahlreichen damit verbundenen Vorteilen wesentlich und therapeutisch eliminiert wird.
Das US-Patent Nr. 4 822 608 von Benton et al., das am 18. April 1989 veröffentlicht wurde und den Titel "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF MAMMALIAN INFECTIONS EMPLOYING MEDICAMENTS COMPRISING HYMENOPTERA VENOM OR PROTEINACEOUS OR POLYPEPTIDE COMPONENTS THEREOF" beschreibt, daß aus der Natur gewonnene sekundäre Mittel, z.B. Tiergift von Hymenoptera oder Protein- oder Polypeptidkomponenten davon auf antibakterielle Mittel eine erheblich verstärkende Wirkung ausüben. Diese Entgegenhaltung legt außerdem nahe, daß diese Mittel bei verschiedenen Krankheiten auch eine bessere Wirkung gegen einen Virus und bessere karzinostatische und antikarzinogene Wirkungen haben können. Diese Entgegenhaltung von Benton et al. beschreibt insbesondere die Verwendung von Melittin, das die Hauptkomponente von Bienengift ist, in Kombination mit einem ausgewählten Antibiotikum, das eine antibakterielle Wirkung gegen bestimmte Infektionen aufweist. Diese Entgegenhaltung beschreibt außerdem, daß durch die Kombination von Melittin und ausgewählten Antibiotika in verschiedenen therapeutisch wirksamen Mengen ein synergistischer Vorteil erreicht werden kann.
Wie es in dieser Entgegenhaltung aus dem Stand der Technik von Benton et al. detailliert beschrieben ist, ist Melittin, die Hauptkomponente im Toxin der Biene, ein Polypeptid, das im wesentlichen 26 Aminosäurereste beinhaltet. Diese Aminosäurereste umfassen Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr- Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln- Amid. Die Erfinder haben darüber hinaus eine direkte Wirkung von Melittin-Analoga entdeckt; und wenn mindestens die letzten 6 (C-Terminus) Aminosäuren geändert und durch 6 Glycin-Reste ersetzt werden, haben diese anscheinend eine dem Melittin ähnlichen therapeutischen Vorteil, wobei diese Aminosäure-Analoga die Struktur Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly- Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly aufweisen.
Aus dem Merck-Index (1983), 10. Ausgabe, Nr. 5643 ist darüber hinaus bekannt, daß Melittin als Mittel gegen Rheuma verwendet werden kann.
US-A-3 856 936 beschreibt ein Mittel zur Regelung des Cortisol-Wertes in Säugern durch eine topische Anwendung, das aus einer wirksamen Menge einer Verbindung besteht, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bienengift insgesamt und Melittin in Mischung mit Fettsäuren von Kakaobutter besteht.
Folglich sind bereits verschiedene medizinische Anwendungen von Tiergift von Hymenoptera oder Protein- oder Polypeptidkomponenten davon oder Melittin bekannt. In der bekannten Literatur gibt es jedoch keinen Hinweis auf die Verwendung von Melittin oder Tiergift von Hymenoptera bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von HIV-Infektionen.
Es ist folglich Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Verbindung oder eine Zusammensetzung für die Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von HIV-Infektionen bei Säugern bereitzustellen, das Tiergift von Hymenoptera oder Protein- oder Polypeptidkomponenten davon umfaßt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines solchen Mittels oder einer solchen Zusammensetzung zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von HIV-Infektionen bei Säugern, wobei das Tiergift der Hymenoptera im wesentlichen aus Bienengift, Gift von Wespen bzw. Hornissen (nachfolgend als Wespen bezeichnet), Gift der kahlen Hornisse, aktiven Proteinkomponenten dieses Tiergifts, aktiven Polypeptidkomponenten dieses Tiergifts und/oder Mischungen davon besteht.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine wirksame subtoxische Dosierung eines strukturellen Analogon von Melittin oder von Melittin selbst für die Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von HIV- Infektionen bei Säugern bereit zustellen, wodurch die Replikation des Virus in den mit HIV infizierten Zellen des Säugers wesentlich verzögert wird.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer wirksamen subtoxischen Dosierung einer Polypeptidmischung von Melittin und dessen strukturellen Analoga zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von HIV-Infektionen bei Säugern, wodurch die Replikation von Viruszellen in den mit HIV infizierten Zellen gehemmt wird.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Amfi1, Amfi2 und Peptiden von GP 41, die dem Melittin ähnlich sind, zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer HIV-Infektion beim Säuger.
Weitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung bestehen in der Schaffung einer Verbindung oder Zusammensetzung zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der HIV-Infektion beim Säuger, das sicher und effektiv ist und außerdem die Nachteile vermeidet, die mit der herkömmlichen Therapie der gleichen Krankheit individuell verbunden sind.
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, die einen Vergleich des Zellwachstums, das bei nicht infizierten und mit HIV infizierten Zellen erreicht wurde, als Prozentsatz von unbehandelten Kontrollen zeigt, das wechselseitig von der Melittinkonzentration abhängig ist.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, die die Aktivität der reversen Transkriptase (RT%) im Vergleich mit einer standardisierten Zellinie und außerdem im Vergleich mit der Infektiosität (INF%) des Kultur-Überstands von mit HIV infizierten T- Lymphom-Zellen (KE37-1/111β) als Prozentsatz der unbehandelten Kontrollen zeigt, das wechselseitig von der Konzentration von Melittin abhängig ist,
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, die einen Vergleich des Zellwachstums, das bei nicht infizierten und mit HIV infizierten Zellen erreicht wurde, als Prozentsatz von unbehandelten Kontrollen zeigt, das wechselseitig von der Konzentration der Melittin-Analoga abhängig ist.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der Aktivität von reverser Transkriptase (RT%) im Vergleich mit einer standardisierten Anzahl von Zellen und der Infektiosität (INF%) des Kultur-Überstands von mit HIV infizierten T-Lymphom-Zellen (KE37-1/111β) als Prozentsatz unbehandelter Kontrollen zeigt, das wechselseitig von der Konzentration der Melittin-Analoga abhängig ist.
Fig. 5 ist ein graphisches Modell des Bereichs des Carboxylterminus des GP41 Moleküls des HIV-Virus.
Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, die einen Vergleich des Zellwachstums, das bei mit HIV infizierten und nicht infizierten Zellen erreicht wurde, als Prozentsatz unbehandelter Kontrollen zeigt, das wechselseitig von der Melittinkonzentration abhängig ist.
Fig. 7 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz der infektiösen Zellen als Funktion der Melittinkonzentration zeigt.
Fig. 8 ist eine graphische Darstellung, die einen Vergleich des Zellwachstums, das bei mit HIV infizierten und nicht infizierten Zellen erreicht wurde, als Prozentsatz von unbehandelten Kontrollen zeigt, das wechselseitig von der Konzentration an Melittin 6 abhängig ist.
Fig. 9 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz der infektiösen Zellen als Funktion der Konzentration von Melittin 6 zeigt.
Fig. 10 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz des Zellwachstums, der bei mit HIV infizierten und nicht infizierten Zellen erreicht wurde, als Prozentsatz von unbehandelten Kontrollen zeigt, das wechselseitig von der Konzentration von Melittin 4 abhängig ist.
Fig. 11 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz der infektiösen Zellen als Funktion der Konzentration von Melittin 4 zeigt.
Fig. 12 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz des Zellwachstums, der bei mit HIV infizierten und nicht infizierten Zellen erreicht wurde, als Prozentsatz unbehandelter Kontrollen zeigt, das wechselseitig von der Konzentration von Melittin E abhängig ist.
Fig. 13 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz der infektiösen Zellen als Funktion der Konzentration von Melittin E zeigt.
Fig. 14 ist eine graphische Darstellung des Prozentsatzes des Zellwachstums, der bei mit HIV infizierten und nicht infizierten Zellen erreicht wurde, als Prozentsatz von unbehandelten Kontrollen zeigt, das wechselseitig von der Konzentration an Melittin F abhängig ist.
Fig. 15 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz der infektiösen Zellen als Funktion der Konzentration von Melittin F zeigt.
Fig. 16 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz des Zellwachstums, der bei mit HIV infizierten und nicht infizierten Zellen erreicht wurde, als Prozentsatz unbehandelter Kontrollen zeigt, das wechselseitig von der Konzentration an Melittin 3 abhängig ist.
Fig. 17 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz der infektiösen Zellen als Funktion der Konzentration von Melittin 3 zeigt.
Fig. 18 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz des Zellwachstums, der bei mit HIV infizierten und nicht infizierten Zellen erreicht wurde, als Prozentsatz von unbehandelten Kontrollen zeigt, das wechselseitig von der Konzentration von Melittin 1-20 abhängig ist.
Fig. 19 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz der infektiösen Zellen als Funktion der Konzentration von Melittin 1-20 zeigt.
Fig. 20 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz des Zellwachstums, der bei mit HIV infizierten und nicht infizierten Zellen erreicht wurde, als Prozentsatz von unbehandelten Kontrollen zeigt, das wechselseitig von der Konzentration von Mastoparan abhängig ist.
Fig. 21 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz der infektiösen Zellen als Funktion der Konzentration von Mastoparan zeigt.
Fig. 22 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz des Zellwachstums, der bei mit HIV infizierten und nicht infizierten Zellen erreicht wurde, als Prozentsatz der unbehandelten Kontrollen und im Vergleich mit der Konzentration von Amfi 2 zeigt. Der Prozentsatz des Zellwachstums für mit HIV infizierte und nicht infizierte Zellen als Prozentsatz der unbehandelten Kontrollen im Vergleich mit der Konzentration von Amfi 1 ist mit den in Fig. 22 gezeigten Ergebnissen identisch.
Fig. 23 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz der infektiösen Zellen als Funktion der Konzentration von Amfi 2 zeigt. Der Prozentsatz der infektiösen Zellen als Funktion der Konzentration von Amfi 1 ist mit den in Fig. 23 gezeigten Ergebnissen identisch.
Fig. 24 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz der beim Zellwachstum von mit HIV infizierten und nicht infizierten Zellen erreicht wurde, als Prozentsatz von unbehandelten Kontrollen und im Vergleich mit der Konzentration von MHC- Peptid zeigt.
Fig. 25 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz der infektiösen Zellen als Funktion der Konzentration von MHC- Peptid zeigt.
Fig. 26 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz der beim Zellwachstum von mit HIV infizierten und nicht infizierten Zellen erreicht wurde, als Prozentsatz von unbehandelten Kontrollen und im Vergleich mit der Konzentration von DMSO (Lösungsmittelkontrolle) zeigt.
Fig. 27 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz der infektiösen Zellen als Funktion der Konzentration von DMSO (Lösungsmittelkontrolle) zeigt.
Fig. 28 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz des Zellwachstums der bei mit HIV infizierten und nicht infizierten Zellen erreicht wurde, als Prozentsatz der unbehandelten Kontrollen und im Vergleich mit der Konzentration des Holst-Peptids (negative Kontrolle) zeigt.
Fig. 29 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz der infektiösen Zellen als Funktion der Konzentration an Holst-Peptid zeigt.
Fig. 30 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz der Erzeugung von P24 im Vergleich mit der Melittinkonzentration in unterschiedlichen Zeitintervallen zeigt.
Fig. 31 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz der Erzeugung von P24 in Zellen und im Überstand im Vergleich mit der Melittinkonzentration bei einem Zeitraum von drei Stunden zeigt.
Fig. 32 und 33 sind graphische Darstellungen, die die Konzentration von P24 in Zellen und Überständen drei Stunden bzw. vierzehn Stunden nach Inkubation in Gegenwart von Melittin zeigen.
Fig. 34 ist eine graphische Darstellung, die den Einfluß von Melittin auf die Bestimmung von P24 in zellfreien HIV-Überständen drei bzw. vierzehn Stunden nach Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen davon zeigt.
Fig. 35 ist eine graphische Darstellung, die eine längere Toxizitätsuntersuchung bei Mäusen und insbesondere dem effektiven Körpergewicht von Mäusen zeigt, das sich auf verschiedene Tiergifte bezieht, die während dieser Toxizitätsuntersuchung verwendet wurden, und die zu verschiedenen Zeitpunkten nach Beginn der Dosierung mit dem bestimmten Tiergift aufgenommen wurden.
Fig. 36 ist eine graphische Darstellung, die das Körpergewicht der Mäuse bei einer längeren Toxizitätsuntersuchung als Funktion der Anzahl der Tage nach Beginn der Dosierung mit der bei dieser Toxizitätsuntersuchung verwendeten Substanz zeigt.
Fig. 37 ist eine graphische Darstellung, die das Körpergewicht der einzelnen Mäuse als Funktion der Verwendung von Bienengift an verschiedenen Tagen nach Beginn der Dosierung zeigt.
Fig. 38 ist eine graphische Darstellung, die das Körpergewicht der Mäuse als Funktion der Verwendung von Wespengift an verschiedenen Tagen nach Beginn der Dosierung zeigt.
Fig. 39 ist eine graphische Darstellung, die das Körpergewicht der Mäuse als Funktion der Verwendung einer Hornissenmischung bzw. -kreuzung an verschiedenen Tagen nach Beginn der Dosierung zeigt.
Fig. 40 ist eine graphische Darstellung, die das Körpergewicht der Mäuse als Funktion der Verwendung einer Faltenwespenmischung an verschiedenen Tagen nach Beginn der Dosierung zeigt.
Fig. 41 ist eine graphische Darstellung, die eine längere Toxizitätsuntersuchung bei Mäusen zeigt und die mikroskopische Prüfung der verschiedenen anatomischen Teile der entsprechenden Mäuse nach der Toxizitätsuntersuchung zusammenfaßt, die die Bienen- und Wespenmischung erhalten haben.
Fig. 41A beinhaltet die Erläuterungen für die verschiedenen in Fig. 40 gezeigten Werte.
Fig. 42 ist eine graphische Darstellung der Struktur von Melittin und seinen strukturellen Analoga.
Die nachfolgend erläuterten Zellinien KE37-1 (nicht infiziert) und KE37-1/111β (infiziert) sind im Handel von Dr. Robert Gallows Laboratory der NIH, USA erhältlich und wurden in dem Medium RPMI 1640 (GIBCO) gezüchtet und außerdem mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt, das etwa 100 Einheiten Penicillin, 100 ug Streptomycin und etwa 0,25 um Fungizon (Amphotericin B) pro Milliliter enthielt. Die nachfolgend erläuterten Human- Mesenchym-Zellinien LC5 und LC5-HIV wurden am 9. März 1989 beim Collection De L'Institut Pasteur, Paris, Frankreich hinterlegt und haben die Zugangsnummern 1-842 bzw. 1-843 erhalten. Diese Zellinien LC5 und LC5-HIV wurden im Medium RPMI 1640 gezüchtet und mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt.
Die Melittin-Peptide und -Analoga von GP41 wurden mit handelsüblichen Geräten zur Peptidsynthese (Modell Biolynx, Pharmacia Biochrome, Cambridge UK) und den vorgegebenen Aminosäure-OPFP- Estern synthetisiert, die für dieses Gerät geliefert werden (Pharmacia Biochrome, Cambridge UK). Die Vorgehensweise dieser Synthese basierte auf der Fmoc-Strategie, die im Handbuch für diese Ausrüstung beschrieben ist. Die Acylierungsgeschwindigkeit wurde mit Bioplus-Software überwacht, wobei die Freisetzung eines anionischen Farbstoffs ("Acid Violet 17", 30 mg pro 100 ml Dimethylformamid und 0,14 ml Diisopropylethylamin) bei 600 nm ausgenutzt wurde, dies erfolgte nach dem vom Hersteller gelieferten Protokoll. Dieses Prizip ist als Überwachung der Verteilung der Gegenionen, CDM, bekannt und wird von Salisbury, S.A., Treemeer, E.J., Davies, J.W. und Owen, D., E., I., A., (1990), J.Chem.Soc., Chem.Commun., 1990, S. 538-540 beschrieben. Die verwendeten Linker führten zur Freisetzung von Peptid-amid (Ultrosyn C, Pharmacia Biochrome, Cambridge UK).
Die erste Kopplung an den säurelabilen Linker Ultrosyn C (0,1 mÄqu.) wurde mit dem symmetrischen Anhydrid (0,4 mÄqu.) und der Zugabe von Dimethylaminopyridin (0,05 mÄqu.) durchgeführt. Dies führte nach 1 Stunde zu einer Kopplung von mindestens 80%; diese wurde durch die Freisetzung der Fmoc-Gruppe bestimmt. Die unbehandelten Plätze wurden mit Essigsäureanhydrid gepfropft bzw. geschützt. Die anschließenden Kopplungen wurden mit handelsüblichen aktiven Estern (Pharmacia Biochrome, UK) durchgeführt, wobei die Kopplungszeit durch die CDM bestimmt wurde und dies von der (oben) verwendeten Software automatisch vorgenommen wurde. Typische Kopplungszeiten betrugen typischerweise 1 Stunde, wobei der 4-fache Überschuß der Ester verwendet wurde. Ser wurde unter Verwendung von Dihydroxybenzotriazolestern gekoppelt, bis die Farblosigkeit eintrat (1,5 bis 2 h). Die Fmoc-Gruppe wurde durch 5 Bettvolumina Piperidin (20% in Dimethylformamid) entfernt. Das Dimethylformamid wurde vor der Verwendung destilliert und war im wesentlichen aminfrei. Dies wurde mit dem Dinitrofluorbenzol- Test bestimmt, der im Protokoll für Biolynx beschrieben ist. Keine dieser Kopplungen zeigte besondere Probleme, und die rohen Peptide traten mit einer Reinheit von mehr als 80% auf; dies wurde durch Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC, siehe unten) bestimmt.
Die Peptide wurden mit Trifluoressigsäure und dem Zusatz von 2% Anisol und 2% Ethandithiol 2 Stunden lang vom Harz abgetrennt, danach folgte eine Fällung mit Ether. Das Peptid wurde durch HPLC auf einer TSK 120T-Umkehrphasensäule (7,5 x 300 mm) (Pharmacia, Schweden) bis zu einer Reinheit von mehr als 95% gereinigt. Die Peptide verschwanden typischerweise bei 65% Acetonitril (zwischen 55 und 75%) , wobei der lineare Gradient von 0 bis 80% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure innerhalb von 90 Minuten angewendet wurde. Die Sequenz wurde durch Protein-Sequenzierung mit einem Sequenzanalysator von Applied Biosystem nach den Angaben des Herstellers bestimmt.
Die Synthese von GP41-Analoga und Mastoparan wurde so durchgeführt, wie es für Melittine beschrieben ist. Eine Auflistung der verwendeten Melittin-Analoga und der anderen Peptide ist in Fig. 42 angegeben.
Es wird nun besonders auf die Fig. 1 bis 4 Bezug genommen; bei Melittin und seinen bestimmten Analoga wurde die Wirkung auf mit HIV infizierte T-Lymphoma-Zellen untersucht. Dabei wurden in diesem Versuch die folgenden Zellinien angewendet: KE37-1 (nicht infiziert) und KE37-1/111β (mit HTLV-111β infiziert). Diese infizierten Zellen wurden während eines Zeitraums von 7 Tagen bei Versuchsbedingungen und einer Temperatur von 37ºC und in Gegenwart von 5% CO&sub2; inkubiert. Es wurde das Kulturmedium RPMI 1640 (GIBCO) verwendet, es wurde außerdem mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt, das etwa 100 Einheiten Penicillin, 100 ug Streptomycin und etwa 0,25 ug Fungizon (Amphotericin B) pro Milliliter enthielt. Dies gleicht einem Milliliter der antibiotischen-antimykotischen Lösung (GIBCO Katalog Nr. 043-05240 pro 100 ml des Mediums). Nach einem Inkubationszeitraum von einer Woche in Gegenwart verschiedener Konzentrationen der oben genannten Substanzen, die dem Medium täglich frisch zugesetzt wurden, wurden mit diesen Kulturen die folgenden Tests durchgeführt. Der erste Test wurde vorgenommen, um die relative Zellkonzentration als Funktion der Anzahl der vorhandenen mit HIV infizierten Zellen zu bestimmen, wobei der MTT-Test angewendet wurde. Dieser MTT-Test wurde in Mikrotiterplatten nach T. Mosmann, "Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Applicattion to Proliferation and Cytotoxicity Assays", Journal of Immunological Methods, Bd. 65 (1983), S. 55-63 durchgeführt. Dieser MTT-Test wurde etwas modifiziert: 10 ul einer MTT-Lösung (5 mg/ml MTT in PBS gelöst, durch Filtration sterilisiert; MTT ist 3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolimbromid) wurden jeder Vertiefung zugegeben. Die Zellen wurden 4 Stunden lang bei 37º in einer 5%-igen CO&sub2;-Atmosphäre mit MTT inkubiert. Das gelbe MTT wird durch metabolisch aktive Zellen zu blauem Formazan reduziert. Die Reaktion wurde unterbrochen, indem jeder Vertiefung 200 ul 0,04 n HCl in Isopropanol zugegeben wurden, und der Farbstoff wurde extrahiert. Die resultierenden Lösungen wurden kräftig gemischt, um alle Formazen-Kristalle zu lösen. Die optische Dichte (OD) der Lösung wurde bei 600 nm bestimmt. Die optische Dichte ist bei diesen Bedingungen der Zelldichte proportional.
Der zweite Versuch wurde durchgeführt, um die Aktivität der reversen Transkriptase im Überstand der behandelten, mit HIV infizierten Zellkultur zu bestimmen, wobei der von Poiesz et al. beschriebene Test angewendet wurde, den man in PNAS 77 (1980): 1415-1419 findet, der anschließend modifiziert wurde. Ein dritter Test wurde durchgeführt, um die relative infektiöse Natur des Überstandes der behandelten, mit HIV infizierten Zellkulturen zu bestimmen. Dabei wurden nicht infizierte, HIV-empfängliche embryonale Human-Lungenzellen (LC5) in den zu untersuchenden Kultur-Überstand inkubiert, und danach folgte eine dreitätige Kultur der gleichen Zellen in einem frischen Medium. Diese Zellen wurden anschließend auf die Erzeugung von HIV-spezifischen Proteinen untersucht.
Das Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von HIV-Proteinen erfolgte durch serologische Untersuchung, wobei Antikörper für diese Proteine angewendet werden, d.h. primäre Antikörper und Antikörper, die auf die entsprechenden Immunoglobuline gerichtet sind, d.h. sekundäre Antikörper, an die Meerrettichperoxidase gekoppelt wird. 3-Aminoethylcarbazol wurde verwendet, um den Antikörper-Antigen-Komplex sichtbar zu machen. Diese Substanz ist nicht wasserlöslich. Dieses Verfahren ist als indirekte Immunoperoxidasefärbung besser bekannt. Dieses Verfahren wird von Mellert et al., "HTLV-III/LAV - Antikörpertest: Indirekte Immuperoxidasefärbung (HTLV-III/LAV antibody test: Indirect Immunoperoxidase staining," AIDS-FORSCHUNG (AIFO) Februar 1986, Heft 2, s. 105-107 beschrieben. Wie es aus den Fig. 1 bis 4 am besten ersichtlich ist, sollte darauf hingewiesen werden, daß Melittin bei Konzentrationen über 5 ug pro Milliliter für sowohl mit HIV infizierte Zellen als auch nicht infizierte Zellen toxisch ist. In diesem Zusammenhang werden später toxische Untersuchungen bei Mäusen aufgeführt, die ebenfalls zur Analyse dieser Versuchswerte beitragen. Außerderm scheint das bestimmte Melittin-Analogon, das in Fig. 3 gezeigt ist, deutlich weniger toxisch als Mellitin. Das gleiche Analogon entwickelt jedoch bei höheren Dosierungen, d.h. 10 ug pro Milliliter, eine selektive wachstumshemmende Wirkung bei mit HIV infizierten Zellen. Außerdem sollte festgestellt werden, daß die Erfinder bei einer Konzentration von 5 ug pro Milliliter, bei der Melittin für infizierte als auch nicht infizierte Zellen toxisch ist, gefunden haben, daß das Wachstum infizierter Zellen um nahezu 80% reduziert wird, wenn Melittin-Analoga nach einem Zeitraum von etwa 7 Tage verwendet wurden, wobei das Wachstum der nicht infizierten Zellen scheinbar nicht sofort beeinflußt wird.
Zusätzlich zum oben gesagten zeigen die in den Fig. 1 bis 4 aufgeführten Versuchswerte, daß bei einer Melittinkonzentration von 2,5 ug pro Milliliter, mit der der Wert des Zellwachstums anscheinend noch nicht beeinflußt wird, die Fähigkeit der Zellen zur Infektion als auch die Aktivität der reversen Transkriptase anscheinend im wesentlichen zu Null zurückkehren. Dies zeigt sich am deutlichsten anhand der Fig. 2.
Diese Versuchswerte, die am besten aus Fig. 4 ersichtlich sind, zeigen auch, daß die Melittin-Analoga ebenfalls in der Lage sind, die Aktivität der reversen Transkriptase und die Menge der infektiösen Viruszellen im Überstand von behandelten, mit HIV infizierten Zellen zu verringern. Dieser Effekt tritt anscheinend in Konzentrationsbereichen auf, die für nicht infizierte Zellen noch nicht, jedoch für mit HIV infizierte Zellen deutlich toxisch sind.
Zusammenfassend zeigen die in den Fig. 1 bis 4 gezeigten Versuchswerte, daß Melittin anscheinend therapeutisch vorteilhaft ist, um die Virusreplikation bei subtoxischen Konzentrationen zu erschweren, indem die reverse Transkriptase gehemmen wird. Mellitin scheint außerdem das Wachstum von mit HIV infizierten Zellen selektiv zu hemmen, dies bewirkt eine Eliminierung des in Säugern möglichen Virusreservoirs.
Es wurden weitere Versuche durchgeführt, um die in den Fig. 1 bis 4 gezeigten Versuchsergebnisse weiter zu ergänzen. Bei diesen Versuchen, die in den Fig. 6 bis 34 am deutlichsten gezeigt sind, wurde der (die) mögliche(n) Mechanismus (Mechanismen) untersucht, durch den (die) Melittin das Wachstum von mit HIV infizierten Zellen hemmt. Als Einführung für und ausführlicheren Bezug auf Fig. 5 wurden Untersuchungen der Minimierung der Energie auf der Oberfläche des HIV-Proteins GP41 durchgeführt, wobei der CHARMM-Algorithmus für sekundäre Strukturvorhersagen verwendet wurde, der auf neuralen Netzwerkprinzipien basiert. Selbstverständlich besteht die Anwendung des hier verwendeten neuralen Netzwerkprogramms in der Vorhersage sekundärer Proteinstrukturen aus Aminosäuresequenzen besteht. Dieses Netzwerk wurde trainiert, um Aminosäurereste in drei Arten von sekundären Strukturen zu klassifizieren: α-Helix, β-Faltblatt und Zufallsknäuel. Durch das Training für einen großen Satz von Proteinen mit bekannter sekundärer Struktur kann das neurale Netzwerk Vorhersagen über die sekundäre Struktur von für das Netzwerk neuen Proteinen treffen, wobei dies nur auf der Basis ihrer primären Struktur beruht. Eine Analyse der sekundären Struktur des Human-Immuno- defizienz-Virus (HIV-Protenin GP41) durch ein Computermodell auf der Basis neuraler Netzwerkverfahren findet man in H. Andreassen et al., "Analysis of the Secondary Structure of the Human Immunodeficiency Virus (HIV) Protein p17, gp120, and gp41 by Computer Modeling Based on Neutral Network Methods", Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes, Bd. 3 (1990), S. 615-622. Besonders die aus diesen Untersuchungen gezogenen Schlußfolgerungen zeigen, daß zwei Transmembranregionen des GP41 Proteins eine bestimmte Homologie zur Struktur von Melittin aufweisen. Diese Homologie ist in diesem Zusammenhang sehr bemerkenswert, da andere Analoga von Melittin, die sich von Melittin stark unterscheiden, anscheinend den gleichen HIV- hemmenden Effekt haben. Es scheint folglich, daß einige der Aminosäuren im Melittin ersetzt werden können, ohne daß die Aktivität des Moleküls verändert wird, vorausgesetzt daß die Amphiphilie erhalten bleibt, und daß eine Polymerisation von vier Melittinmolekülen durch eine Wechselwirkung der Ladung möglich ist. Die aus diesen Untersuchungen gezogenen Schluβ- folgerungen, die später detailliert erläutert werden, bestehen darin, daß Melittin anscheinend mit einem der Hauptproteine von HIV, Glycoprotein GP41, in Wechselwirkung tritt. Dies scheint aufgrund der Ähnlichkeit der Transmembranregionen von GP41 und Melittin möglich, wie es in Fig. 5 gezeigt ist.
Melittin ist selbstverständlich ein amphiphiles Peptid, das eine Länge von 26 Aminosäuren hat. In einer wässrigen Lösung mit hoher Ionenstärke nimmt Melittin eine tetramere Konfiguration an. Bei geriner Ionenstärke erscheint Melittin jedoch als monomeres Zufallsknäuel. Bei physiologischen Ionenstärken scheint die Verteilung zwischen diesen beiden Formen gleich zu sein. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, daß Melittin anscheinend in der Lage ist, sich der hydrophoben Umgebung einer Zellmembran anzupassen, indem eine monomere α- Helix gebildet wird, bei der die elektrischen Ladungen auf einer Seite der Helix verteilt sind und die ungeladene Seite mit der Membran verbunden ist. Diese Untersuchung zeigt außerdem, daß die Oberfläche des Melittinpolymers, die zum umgebenden Lipid zeigt, folglich ungeladen ist. Ein weiteres besonderes Merkmal des Melittinmoleküls besteht außerdem darin, daß durch Prolin (Aminosäure Nr. 14) in die Helix des Melittins ein Knick von etwa 120º eingeführt wird. Ein ähnlicher Knick findet sich in der dem Melittin ähnlichen Sequenz von HIV GP41, das oben erläutert wurde.
Frühere Untersuchungen zeigten, daß Melittin für verschiedene Wirkungen bekannt ist. Diese Wirkungen werden am besten als Bindungsverfahren an die Zelloberfläche und als Polymerisationsverfahren beschrieben, wobei sich die α-Helices ausrichten, so daß ein Kanal entsteht. Es wurde außerdem gezeigt, daß anscheinend die Bindung durch den C-Terminus, d.h. die sechs Aminosäuren des Schwanzes, für die Zellauflösung notwendig. Diese Tatsache ist zum Verständnis der nachfolgend beschriebenen Versuchswerte sehr wichtig. Selbstverständlich ist der genaue Mechanismus unbekannt, mit dem Melittin einen Kanal bildet. Es scheint jedoch, daß sich das Melittinmolekül mit seinem basischen C-Terminus mit den Phosphatanionen verbindet, wodurch es mit zehn (10) Phosphatidylcholin-Molekülen in Wechselwirkung tritt. Wenn das Melittin einmal verankert ist, scheint es sich in die äußere Lipidschicht der Membran zu drehen, wodurch die Struktur dieser Membran zerstört wird. Dieser Aktivität folgt die Bildung von Poren durch die Außenschicht der Membran, wodurch die Ionenpermeabilität zunimmt und die Membran anschließend zerbricht. Die in der Membran gebildeten Kanäle werden anscheinend durch die Melittinmoleküle stabilisiert. Die Bildung dieses Kanals führt auch zur Zellauflösung und wird nachfolgend als Toxizität des Melittins bezeichnet. Dies kann mit einem Mechanismus verglichen werden, durch den α-Toxin und das Komplement cytotoxisch sind. Diese Moleküle können auch in der Lage sein, die Membran zu durchspannen, wodurch eine Pore mit den gleichen Begleitergebnissen gebildet wird.
Zusätzlich zu den Wirkungen, die die Möglichkeiten amphiphiler Peptide zur Kanalbildung einschließen, wurde eine Wirkung auf Phospholipase A2 beschrieben, die auch die amphiphile Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen beinhalten kann. In diesem Fall kann Melittin möglicherweise mit den hydrophoben Teilen des enzymatischen Proteins Phospholipase A2 in Wechselwirkung treten, oder dies kann auf Wechselwirkungen von Melittin- Phospholipid beruhen. Außerdem ist es möglich, daß die Wirkungen von Melittin auch intrazellulär sein können. Es ist zum Beispiel bekannt, daß Melittin die endogene Phospholipase A2 in der vorderen Hypophyse stimuliert, was zu einer steigenden Hormonsekretion führt.
Es wurde eine Reihe von Versuchen durchgeführt, die in den Fig. 6 bis 34 graphisch dargestellt sind, um zwei Extremfälle nachzuweisen. Diese Versuche wurden so gestaltet, daß die Unterdrückung der Freisetzung des Virus und/oder die Freisetzung eines Virus nachgewiesen wurde, der eine geringere Fähigkeit zur Infektion anderer Zellen aufweist. Diese geringere Fähigkeit zur Infektion anderer Zellen zeigt sich zum Beispiel durch Glycosylierungs-Inhibitoren; die direkte Wirkung auf die Freisetzung des Virus zeigt sich durch Acylierungs- Inhibitoren, RT-Inhibitoren und Melittin. Das wichtigste Merkmal dieser Versuchsgestaltung besteht jedoch im Nachweis der Toxizität von Melittin. Diese Versuche wurden sowohl bei der Astrocytom-Zellinie LC5-HIV (geklonte infizierte Zellen) als auch der T-Lymphocytom-Zellinie KE37-1/IIIβ (geklonte mit HTLV-IIIβ infizierte Zellen) durchgeführt. In beiden Fällen waren die Ergebnisse im wesentlichen identisch.
Bei der vorliegenden Versuchsreihe wurde die HIV-Freisetzung mit einem vollständig automatisierten Laborrobotersystem geprüft, das von Beckman Instruments als Biomek 1000 hergesellt wird. Dieses System führte die folgenden Schritte durch. Erstens werden chronisch infizierte Zellen (geklont) in Mikrotiterplatten aufgebracht und siebe Tagen lang gezüchtet. Sie werden dann während dieses Zeitraums entweder am letzten Tag oder innerhalb des gesamten Zeitraums von Melittin angeregt, wie es in den Figuren gezeigt ist. Die Anzahl der lebenden Zellen wird durch MTT mengenmäßig erfaßt, d.h. durch einen metabolischen (Dehydrogenase-)Test. Dieser MTT-Test wird automatisch durchgeführt. Die toxische Wirkung wird zum Zeitpunkt des Versuchs und nicht in einem separaten Kontrollversuch nachgewiesen. Der Überstand, der freigesetzte Viruszellen aus dem Zeitraum enthält, der seit der letzten Waschung vergangen ist und von 24 Stunden bis 7 Tagen variieren kann, aus der Kultur aufgefangen, und eine aliquote Menge wird für die mengenmäßige Erfassung des Virus aufgehoben, bei der ein Antigen oder das Virusenzym reverse Transkriptase (RT) eingesetzt werden. Eine aliquote Menge wird außerdem einer Kultur nicht infizierter Zellen in Mikrotiterplatten zugegeben, um anschließend die Fähigkeit der Viruszellen zur erneuten Infektion dieser nicht infizierten Zellen zu messen. Dabei wird die Anzahl der infizierten Zellen durch ein Immunoperoxidasefärbungsverfahren automatisch mengenmäßig erfaßt. Die gezeigten Versuchsergebnisse werden als Toxizität des Melittins (MTT-Test), Freisetzung des HIV aus der primären Kultur (RT-Test) und die Fähigkeit des freigesetzten Virus, vorher nicht infizierte Zellen zu infizieren, ausgedrückt.
Wie es am besten aus den Fig. 6 und 7 ersichtlich ist, scheint die Gesamtwirkung des Melittins auf mit HIV infizierte Zellen die Unterdrückung der Freisetzung der Viruszellen aus infizierten Zellen zu sein (Fig. 6); in seiner natürlichen Form scheint es jedoch die infizierten Zellen nicht selektiv zu beeinflussen (Fig. 7). Dieses Verhältnis zeigt sich auch bei Melittin 6 (Fig. 8 und 9); Melittin 4 (Fig. 10 und 11); Melittin E (Fig. 12 und 13); Melittin F (Fig. 14 und 15); Melittin 3 (Fig. 16 und 17) bzw. Melittin 1-20 (Fig. 18 und 19). Die aus diesen Versuchswerten gewonnene Information ist deshalb bemerkenswert, da der membranolytische Effekt des Melittins anscheinend von der Oberflächenbindung des Melittins an die Zellen durch seinen C-Terminus abhängig ist. Wie es bereits erläutert wurde, scheint dieses Bindungsverfahren auch von den positiven Ladungen aufgrund der C-Terminussequenz abhängig zu sein, die eine Aminosäuresequenz von Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln- Amid umfaßt. Zur Bestimmung, ob die Wirkung des Melittins auf dem bekannten Mechanismus der Kanalbildung oder auf einem unbekannten Verfahren basiert, haben die Erfinder (1-20)-6- (Gly)-Amid getestet. Daraus wurde der Schluß gezogen, daß diese Form des Melittins aufgrund der fehlenden Ladungen in einer Weise wirken sollte, die mit ihren amphiphilen Eigenschaften übereinstimmt und nicht von der spezifischen Wechselwirkung mit der Zelloberfläche abhängt. Wie es am besten aus den Fig. 18 und 19 ersichtlich ist, wurde jedoch im Gegensatz zur Hypothese der Erfinder deutlich, daß Melittin-Analoga, die sich nicht spezifisch mit der Zelloberfläche binden und folglich viel weniger toxisch sind, anscheinend die Freisetzung der Viruszellen hemmen und die mit HIV infizierten Zellen auch selektiv töten. Diese Versuchsergebnisse führen zu dem Hinweis, daß es denkbar ist, die toxische, zytolytische Wirkung des Melittins das selektive Töten von infizierten Zellen verschleiern bzw. blockieren kann. Dies wäre zu erwarten, wenn die lytischen Eigenschaften des Melittins nicht an seinen Wirkungen gegen HIV beteiligt wären. Dies ist folglich ein neuer und bisher nicht erwarteter Aspekt der Wirkung von Melittin.
Die Versuchsergebnisse zeigen außerdem deutlich, daß natürliches Melittin in der Lage war, mit HIV infizierte LC5-Zellen aufzulösen. Die Versuchswerte zeigten zum Beispiel, daß die Natur dieser Wirkung anscheinend mit dem Phänomen seiner kritischen Konzentration in Zusammenhang stand. Besonders dann, wenn die kritische Konzentration (10 ug pro ml) erreicht wurde, wurden alle Zellen getötet, d.h. infizierte und nicht infizierte. Diese Wirkung trat bei Konzentrationen auf, die zehnmal höher als die Wirkung auf die Freisetzung von HIV sind. Melittin-COOH wurde geprüft und erschien weniger wirksam als das Melittin-amid. Zusätzlich dazu wurden zwei Melittin- Analoga geprüft, die keinen verbindenden Schwanz aus positiv geladenen Aminosäuren in den Positionenen 21 bis 26 aufwiesen. Diese Melittin-Analoga hatten beide die gleiche verstärkte Wirkung auf mit HIV-infizierte Zellen, d.h. daß diese infizierten Zellen selektiv getötet wurden. Bei 10 ug pro ml wurde zum Beispiel die Hälfte der infizierten Zellen getötet, wohingegen die nicht infizierten Zellen im wesentlichen unbeeinflußt blieben. Bei den verwendeten Konzentrationen wurde darüber hinaus keine Auflösung der Zellen beobachtet, die aufgrund der Auflösung bei der kritischen Konzentration als Toxizität des Melittins beschrieben werden könnte. Die Wirkung der Melittin-Analoga zeigte ein konstant sinkendes Überleben infizierter Zellen durch steigende Konzentrationen der Analoga. Dieser Einfluß der Melittin-Analoga läßt sich nicht leicht erklären. Das heißt, daß infizierte Zellen anscheinend bis zum gleichen Grad lebensfähig sind wie nicht infizierte Zellen, und folglich nicht zu erwarten ist, daß sie mit einer größeren Geschwindigkeit als nicht infizierte Zellen sterben, wenn die HIV-Freisetzung gehemmt wird. Der Einfluß des Melittins als Antivirus-Substanz, die durch ihre amphiphile Struktur wirkt, wurde darüber hinaus durch die Wirkungen des Melittins (1-20) in den Fig. 18 bzw. 19 untermauert. Es sollte in diesem Zusammenhang selbstverständlich sein, daß dem Melittin 1-20 der zellbindende Teil des Moleküls fehlt. Dieses Analogon unterdrückte trotzdem die Freisetzung von HIV, wie es beim natürlichen Melittin und Melittin (1-20)- 6-(Gly)-Amid der Fall ist. Das gleiche Melittin hemmte darüber hinaus auch das Wachstum infizierter Zellen, wie auch das Melittin ohne positiv geladenen C-Terminus, d.h. Melittin (1- 20)-6-(Gly)-Amid. Die Antiviruswirkung des Melittins ist anscheinend von den bekannten zellauflösenden Mechanismen des Melittins unabhängig und scheint eher von den amphiphilen und für die membranchaotropen Wirkungen des Melittins abzuhängen. Das selektive Töten infizierter Zellen kann folglich eine Funktion der Unterdrückung der Freisetzung von HIV sein, obwohl dies zum gegenwärtigen Zeitpunkt spekulativ ist und diese Wirkung auf einer bisher unentdeckten Wirkung des Melittins beruhen kann.
Die Wirkungen des Toxins Mastoparan, die in den Fig. 20 und 21 gezeigt sind, wurden ebenfalls erklärt. Dies ist ebenfalls ein amphiphiles Peptid, das jedoch beträchtlich kürzer ist und nur 14 Aminosäurereste enthält. Folglich kann es die Membran nur in polymerisierter Form durchspannen. Die Ergebnisse sind in den Fig. 20 und 21 zusammengefaßt. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, daß Peptide mit einer ähnlichen Struktur, d.h. MHC (Haupt-Histokompatibilitätskomplex-Sequenz) und GP41-Analoga, als auch Mastoparan keine leicht erkennbaren Wirkungen aufweisen. Ein Kontrollpeptid, das jedoch keine dem Melittin scheinbar ähnliche Struktur aufwies, war ebenfalls ohne Wirkung.
Es wird nachfolgend besonders auf die Fig. 30 und 31 Bezug genommen; die Erfinder haben entdeckt, daß es durch Messung der Bildung des Virusproteins P24 innerhalb der Zelle möglich ist nachzuweisen, daß die Virusproteinsynthese in vollständig infizierten (Klon-)Kulturen reduziert ist, die mit Melittin behandelt wurden. Dies bedeutet im Kern, daß die Wirkung des Melittins auf den Virus im Angriff des Virus besteht, ehe er aus einer infizierten Zelle freigesetzt wird; obwohl es möglich ist, daß die Verringerung der Virusanzahl während und unmittelbar nach der Zugabe von Melittin zu einer Zellkultur oder auf andere Weise möglich sein kann. Der vorliegende Fall zeigt jedoch, daß die Viruserzeugung etwa 3 bis 5 Tage benötigt um nach Einleitung der Kultur ihren Höchstwert zu erreichen. Zu diesem Zeitpunkt ist Melittin in der Kultur nicht vorhanden. Die erhaltenen Versuchsergebnisse zeigen außerdem, daß Melittin eine Halbwertszeit von 19 Stunden hat und zwei Stunden nach der Zugabe zu dieser Kultur im Medium nicht meßbar ist, d.h. es ist von den Zellen aufgenommen worden. Diese Beobachtung schließt jeden Effekt in den Versuchen aus, der durch einen direkten Einfluß des Melittins auf einen "zellfreien" Virus, d.h. einen in den Überstand freigesetzten Virus erklärt werden kann.
Der Einfluß einer wiederholten Verabreichung von Tiergiften von Hymenoptera wurde bei Mäusen untersucht. Gruppen aus 10 NMRI-Mäusen (5 von jedem Geschlecht) wurden subkutan die folgenden Gifte verabreicht: Biene, Wespe, Hornissenmischung oder Faltenwespenmischung, an den Tagen 0, 4, 7, 12, 14 und 16. Jedem Tier wurden auch 1, 2,5, 5, 10, 25 bzw. 50 ug des Tiergifts verabreicht. Danach erhielt jedes Tier fünf monatliche Injektionen von 50 ug dieses Tiergiftes. Einer fünften Gruppe wurde eine Kontrollösung gegeben, sie diente als Kontrolle. Die Werte sind in den Fig. 35 bis 41a zusammengefaßt. Es wurden wiederholt klinische Untersuchungen und Registrierungen des Körpergewichtes durchgeführt. Am Ende des Versuches wurde bei allen Tieren eine Autopsie vorgenommen, und es wurde eine gewebspathologische Prüfung durchgeführt. Aus den Ergebnissen dieser Untersuchung wurde die Schlußfolgerung gezogen, daß die Mäuse die vier Tiergifte sehr gut tolerierten. Es wurden keine ernsthaften Gewächse oder mikroskopische Veränderungen gefunden.

VERWENDUNG VERSCHIEDENER TIERGIFTE VON HYMENOPTERA

Einführung

Zur Einschätzung der Wirkung der wiederholten Verabreichung von Tiergiften von Hymenoptera bei Säugern wurde bei Mäusen eine längere Toxizitätsuntersuchung durchgeführt.

Testsubstanzen

Es wurden Tiergifte von den folgenden Hymenoptera-Spezies untersucht:
Biene (Apis mellifera) (Ref.-Nr. BV 02)
Wespe (Vespula maculifrons) (Ref.-Nr. YJ 02)
Hornissenmischung (blasse Hornisse (Vespula maculata) und gelbe Hornisse (Vespula arenaria)) (Ref.-Nr. MH 01)
Faltenwespenmischung (Wespe, blasse Hornisse und gelbe Hornisse) (Ref.-Nr. MV 02)
Die Kontrolltiere erhielten die folgende Kontrollösung:
NaCl: 0,12 m
Human-Serumalbumin (HSA): 0,03%
Manitol: 3%
Natriumphosphat: 0,005 m
pH = 7, 4

Herstellung der Substanz

Die Tiergifte wurden in gepufferter Evans'-Kochsalzlösung verdünnt:
Na&sub2;HPO&sub4;. 2H&sub2;O - 0,711 g/l
KH&sub2;PO&sub4; - 0,363 g/l
NaCl - 5 g/l
Phenol - 4 g/l
Di-Na-EDTA 2 H&sub2;O - 0,1 g/l
Ph 7 in unterschiedlichen Konzentrationen und um zu jedem Zeitpunkt das gleiche Dosierungsvolumen zu erhalten, und zwar 0,5 ml/Tier. Die Substanzen wurden bei jeder Verabreichung frisch hergestellt.

Tiere und Bedingungen

Tiere: Mäuse, Stamm NMRI, SPF (Anitcimex, Norrviken), sieben Wochen alt, Gewicht etwa 25 g ( ) und 30 g ( ), wurden mit 5 Tieren/Käfig gehalten.
Ernährung: Pellets (Anticimex, R3) und Wasser nach belieben.
Temperatur (Umgebung): 22 ± 1ºC
Feuchtigkeit (relative) : 50 + 10%
Licht (künstlich) : 12 Stunden/Tag.

Größe der Gruppe

Zehn Tiere (fünf von jedem Geschlecht) wurden durch willkürliche Auswahl jede der fünf Gruppen zugeteilt (einschließlich einer Kontrollgruppe). Gruppe Nr. der Mäuse Verbindung Kontrollen Biene Wespe Hornissenmischung Faltenwespenmischung

Dosierung

Bei jeder der Gruppen Nr. 2-5 wurde die folgende Dosierungsvorschrift angewendet: Tag Tiergift/Tier
Danach erhielt jede Maus fünf monatliche Injektionen von 50 ug dieses Tiergiftes. Die Gesamtmenge des Tiergiftes, die bei diesem Versuchszeitraum pro Maus injiziert wurde, betrug folglich 343,5 ug. Die Kontrolltiere folgten der gleichen Zeitvorschrift, erhielten jedoch bei jeder Gelegenheit 0,5 ml der Kontrollösung pro Tier, die in einer gepufferten Evans'-Kochsalzlösung verdünnt worden war, so daß sie die gleichen relativen Konzentrationen von Manitol und HSA wie die Gruppe 2 und 3 enthielt. Verabreichungsweg Subkutan im mittleren hinteren Lendenbereich.

Beobachtungen

Klinische Symptome

Die klinischen Symptome von Krankheit, Gesundheit oder Toxizität wurden kontrolliert und täglich aufgezeichnet.

Körpergewicht

Das einzelne Körpergewicht wurde bei jeder Verabreichung vor Beginn der Dosierung und danach aufgezeichnet.

Abschlußuntersuchungen

Sechs Monate nach Beginn der Injektionen mit 50 ug wurden alle Mäuse getötet und einer Autopsie unterzogen. Aus den folgenden Organen wurden Gewebe für ein histologisches Präparat und die gewebspathologische Prüfung entnommen: Haut, Speicheldrüse, Luftröhre, Lungen und Bronchien, Herz und Aorta, Schilddrüse, Nebenschilddrüse, Speiseröhre, Magen, Zwölffingerdarm, Leerdarm, Krummdarm, Caecum, Grimmdarm, mesenteriale Lymphknoten, Leber, Gallenblase, Oberschenkelmuskel, Ischiasnerv, Sternebra, Thymusdrüse, Bauchspeicheldrüse, Milz, Nieren, Nebennieren, Blase, Samenbläschen, Prostata, Hoden, Ovarien, Uterus, Gehirn, Hypophyse, Augen, Rückenmark und Injektions- stellen.

Ergebnisse

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden in den Fig. 35 bis 41A als Einzelwerte gezeigt.

Beobachtungen

Klinische Symptome

Die Maus Nr. 309 (Hornissenmischung) bewegte sich während der letzten zwei Monate des Versuchszeitraums kontinuierlich im Kreis.
Die Maus Nr. 203 (Wespe) hatte Ödeme und Geschwüre an den Vorderbeinen und verlor das Fell kurzzeitig einen Monat vor Abschluß des Versuchs.

Körpergewicht Siehe Fig. 36-40

Das Körpergewicht wurde durch die Medikamentengabe nicht beeinflußt.

Abschlußuntersuchungen

Gesamtpathologie

Bei der Maus Nr. 304 (Hornissenmischung) haftete die Milz fest an der Bauchwand und bei der Maus Nr. 406 (Faltenwespenmischung) fest an der Bauchspeicheldrüse. Die Maus Nr. 101 und 105 (Biene) hatten jeweils einen festen 1 mm großen Knoten in ihren Lungen. Es wurden keine weiteren bemerkenswerten allgemeinen Entdeckungen gemacht. Die Injektionsstellen waren zum Zeitpunkt der Tötung ohne Schwellung oder andere Veränderungen

Mikroskopische Pathologie

Die Ergebnisse der mikroskopischen Prüfung sind in den Fig. 41 und 41A gezeigt.
Bei den folgenden Mäusen wurde eine reaktionsfähige Nekrose in den mesenterialen Lymphknoten gefunden: Nr. 110 (Biene), Nr. 307 und 308 (Hornissenmischung), Nr. 406 und 410 (Faltenwespenmischung). Bei der Maus Nr. 210 (Wespe) wurde im mesenterialen Lymphknoten eine mäßige lymphoide Hyperplasie gefunden.
Bei der Maus Nr. 310 (Hornissenmischung) gab es eine herdförmige Nekrose mit einer subakuten oder chronischen Zellreaktion in der Milz. Bei der Maus Nr. 304 (Hornissenmischung) wurde gefunden, daß die Haftung der Milz an der Bauchwand von einer chronisch fasrigen Art war, und die Haftung der Milz an der Bauchspeicheldrüse bei der Maus Nr. 406 (Faltenwespenmischung) war chronisch fasrig und gut mit Gefäßen durchzogen.
Die beschriebenen Veränderungen in den mesenterialen Lymphknoten und in den Milzen können von den Tiergiften hervorgerufen sein, sie werden jedoch in Anbetracht des Zustandes der Tiere als unschädlich eingeschätzt.
Bei den Mäusen Nr. 101 und 105 (Biene) und bei der Maus Nr. 402 (Faltenwespenmischung) waren kleine Adenome in den Lungen sichtbar. Bei der Maus Nr. 407 (Faltenwespenmischung) gab es eine kleine knötchenförmige Hyperplasie des bronchialen Epithels. Diese Arten der Veränderungen traten spontan auf.
Bei den Kontrollmäusen als auch den Mäusen, die die Tiergifte erhalten hatten, gab es gelegentlich die Entdeckung einer sehr geringen Nekrose der hepatischen parenchymatösen Zellen mit einer geringen zellulären Infiltration. Außerdem wurden in den Nieren der drei Kontrollmäuse geringe chronische entzündliche Veränderungen gefunden.

In vivo Versuche mit Rausher-Leukämiemäusen

Die Rausher-Leukämiemaus stellt ein Modell für Retrovirusinfektionen von Säugern dar, das allgemein anerkannt wird. Der Virus ruft bei Mäusen eine erythropoethische Leukämie hervor, die durch eine Vergrößerung der Milz als Nachweis einer erhöhten Erzeugung von roten Blutzellen erkennbar ist. Die Größe der Milz wird als Merkmal für das Fortschreiten der Krankheit angesehen, die eventuell zum Tod der infizierten Tiere führt. Bei diesem System wurde die Wirkung des Melittin- Analogon mit dem Schwanz 6 Gly untersucht.
Die Prüfung der Antiviruswirkung des Melittin-Prinzips wurde bei Balb C-Mäusen (12 Wochen alt, alle männlich) durchgeführt. Die Tiere wurden zu viert in einem Käfig gehalten. Die Tiere wurden mit dem Rausher-Leukämievirus (10&sup5; infektiöse Partikel (Viren) pro Tier in einem Volumen von 0,2 ml) infiziert, dies erfolgte durch intraperitoneale Injektion und anschließende subkutane Injektion der Testsubstanz nach 10 Minuten. Die Tiere wurden in zwei Gruppen unterteilt, die als Kontrollen (die eine simulierte Injektion mit Kochsalzlösung erhielten) oder Versuchstiere (die das Melittin-Analogon erhielten) bezeichnet wurden.
Beiden Gruppen der Balb C-Mäuse aus jeweils 16 infizierten Tieren, wie es oben beschrieben ist, wurde entweder eine mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (25 mmol KH&sub2;PO&sub4;, 150 mmol NaCl, pH = 7,8, als PBS bezeichnet) oder Melittin-6-Gly (5 ug/mg Körpergewicht in einem Volumen von 0,1 ml) in PBS injiziert. Das Peptid wurde mit 100 ug/ml gelöst, und den Kontrollen als auch den Versuchstieren wurde subkutan das gleiche Volumen (0,1 ml) von PBS oder PBS + Testsubstanz injiziert. Die Injektion wurde 10 Minuten nach der Injektion des infektiösen Virus durchgeführt. Nach 2 Tagen erhielten die Tiere eine neue Injektion des Melittin-Analogon (10 ug/mg Körpergewicht) oder PBS als subkutane Injektion mit 0,100 ml. Nach 4 Tagen nach der ersten Injektion wurde eine dritte Injektion durchgeführt, wobei 20 ug/mg Körpergewicht des Melittin-Analogon verwendet wurden. Alle Tiere wurden durch die Injektionen des Melittin- Analogon oder PBS nicht beeinflußt und alle überlebten die akute Phase der Injektionen.
Normal infizierte Mäuse entwickeln innerhalb von zwei Wochen eine Milz mit einem Gewicht von mehr als 150 mg. Die Größe kann auf 2,5 g zunehmen. Die normale Milz liegt zwischen 0,1 und 0,15 mg als unterer und oberer Wert; das bedeutet, daß 95% der Mäuse eine Milz in diesem Bereich haben. Eine Milz mit mehr als 170 mg wurde nach zwei Wochen als deutliche Infektion angesehen, eine Milz zwischen dem oberen Normalwert von 150 mg und 170 mg wurde als Grenzfall angesehen. Nach 2 Wochen hatten alle in der Kontrollgruppe geprüften Tiere eine Milz mit mehr als 150 mg entwickelt. In der Testgruppe hatten 25% der geprüften Tiere ebenfalls eine Milz von mehr als 150 mg, jedoch weniger als 170 mg entwickelt und wurden als Grenzfälle angesehen. Der Rest zeigte jedoch keinen Hinweis auf eine Vergrößerung der Milz, d.h. er lag als normale Tiere im Bereich von 100 bis 150 mg. Nur ein Tier hatte eine Milz, die pathologisch mit 100% in der Kontrollgruppe verglichen wurde.
Folgende Schlußfolgerungen wurden aus diesen Versuchen gezogen.
1. Die Tiere überlebten die Behandlung mit Melittin-Analoga in Konzentrationen, die den in vitro Versuchen vergleichbar sind, die in dieser Patentanmeldung beschrieben werden.
2. Das Melittin-Analogon zeigt eine deutliche Entwicklung des Retrovirus in Säugern, da 75% der infizierten Tiere keine Krankheit entwickeln - verglichen mit der 100%-igen Entwicklung der Krankheit in einer vergleichbar behandelten Kontrollgruppe.
3. Durch Melittin und seine Analoga werden nicht nur HIV sondern auch andere Retroviren gehemmt.

Schlußfolgerung

Der Gesamteindruck bestand darin, daß die Mäuse diese vier Tiergifte sehr gut tolerierten, d.h. Biene, Wespe, Hornissenmischung und Faltenwespenmischung, wenn diese in den Bereichen einer geringen Dosis verabreicht wurden. Es wurden keine ernsthaften groben oder mikroskopischen Veränderungen gefunden.
Wie es bereits erläutert wurde, zeigt Melittin anscheinend ein Verfahren zur Behandlung von HIV-Infektionen in Säugern, indem es vielleicht mit einem der wichtigen HIV-Proteine in Wechselwirkung tritt, d.h. mit dem Glycoprotein GP41. Dies ist aufgrund der Ähnlichkeit zwischen den Transmembranregionen von GP41 und Melittin möglich und wird in Fig. 5 am besten gezeigt.
Wie es in Fig. 5 gezeigt ist, weist GP41 einen amphiphilen Abschnitt auf, der das vorherrschende Merkmal der zu diesem Molekülteil gehörenden Membran sein kann. Dieser amphiphile Teil des GP41 kann eine gegenläufige Schleife aus geladenen Aminosäuren bilden, bei der die beiden Schenkel der Schleife eine geladene neutralisierende Struktur bilden, die der mit der Polymerisation von Melittin verbundenen Struktur ähnlich ist. Melittin kann auch die normale Bildung einer intramolekularen Ladungsneutralisierung durch GP41 verhindern und dadurch die Struktur von GP41 sehr stark verändern. Dies kann die Bildung des Virus beeinflussen, da die Bildung des Virus anscheinend von der Wechselwirkung von GP41 mit dem Kern des Virusproteins P17 abhängt, die das grundsätzliche budding-Verfahren des Virus durchführen kann. Es sollte klar sein, daß sich Viren, wie HIV, durch ein Verfahren von Zelle zu Zelle verteilen, das die Bildung einer kleinen Membranknospe auf der Oberfläche der Zelle beinhaltet, die das Virus-Genom enthält. Dieses Verfahren scheint für Modifikationen der Zelloberfläche empfindlich zu sein. Es ist zum Beispiel allgemein bekannt, daß der Zusatz von Lipid-Formulierungen die Freisetzung des Virus aus infizierten Zellen verhindert. Dieser Effekt beruht möglicherweise auf der chaotropen Wirkung auf die Zellmembran. Der Mechanismus dieser Wirkung ist jedoch noch unklar.
Die Strukturmerkmale von Protein GP41, die es dem Melittin gestatten, mit diesem in Wechselwirkung zu treten, sind anscheinend zwischen den Aminosäuren 770 und 856 angeordnet und umfassen die amphiphilen Sequenzen 770 bis 794 und 824 bis 856. Siehe Fig. 5. Die Amphiphilie dieser Sequenzen wurde durch ihren starken hydrophoben Impuls in Verbindung mit einer geringen gesamten Hydrophobie nachgewiesen. Die zwei amphiphilen Schenkel wurden durch die Moleküldynamik geformt, und es zeigte sich, daß sie auf der Basis ihrer Amphiphilie zur Wechselwirkung fähig sind und dadurch potentiell in der Lage sind, sich in die Membran einzufügen, indem sie eine Transmembran-Schleife bilden. Alternativ können sie auf der Innenoberfläche der Zellmembran schwimmen. In jedem Fall kann die Wechselwirkung mit Melittin eine geänderte Anordnung der Stelle des cytoplasmären Teils von GP41 hervorrufen, wodurch die Wechselwirkung mit P17 verhindert wird, die als notwendige Vorstufe zur Virusbildung angesehen wird. Eine zunehmende Analogie zwischen Melittin und GP41 bei der amphiphilen Sequenz 824 bis 856 liegt in diesem Zusammenhang darin, daß sie beide in der amphiphilen Helix Prolin aufweisen. Wie es bereits erläutert wurde, bringt dieses Strukturmerkmal einen Knick von 120º in der Helix mit sich, wodurch sie eine etwas gebogene Form aufweist. Alternativ kann Melittin mit der Membran in Wechselwirkung treten, es wirkt folglich als chaotropes Mittel. Dies kann auch auf seiner amphiphilen Natur beruhen. Selbstverständlich bestehen die Wirkungen der chaotropen Mittel darin, daß sie eine Störung der geregelten Phospholipid-Anordnung in der Membran hervorrufen. Diese Wirkungen rufen Veränderungen der Phasenumwandlungspunkte der Membranen und anschließende Veränderungen ihrer Dicke hervor. Wie zu erwartet war, ist die Tatsache nicht überraschend, daß das schwimmende Melittin einen chaotropen Einfluß auf die Zellmembran hervorruft. Wie der gleiche Fall das budding- Verfahren des Virus beeinflußt, ist jedoch unklar und gegenwärtig nicht bekannt. Es gibt jedoch deutliche Hinweise auf Wirkungen gegen HIV oder Veränderungen, die in der Ordnung der Lipidanordnung der Membran eingeleitet werden. Die Zugabe verschiedener Phospholipid-Formulierungen verhindert darüber hinaus ebenfalls die Freisetzung von HIV aus infizierten Zellen. Es war jedoch noch nicht möglich, die Lipid-Spezies zu identifizieren, die für diesen Effekt sorgen.
Melittin ist jedoch dafür bekannt, daß es mit den Phospholipiden in Wechselwirkung tritt, und dieser Effekt oder die Bindung einer nicht identifizierten Lipid-Spezies hat anscheinend eine Funktion bei der HIV-Freisetzung und kann auch eine Erklärung für diese Gegenwirkung des Melittins sein. Es wird angenommen, daß dieses Lipid kein Phospholipid ist, da die Zugabe von Phospholipiden eine Wirkung hat, die der von Melittin sehr ähnlich ist.
Als Schlußfolgerung scheinen diese Versuchsergebnisse darauf hinzuweisen, daß Melittin zwei Wirkungen hat, das heißt, daß es anscheinend eine erste kurzzeitige Inaktivierung des Virus und eine zweite langzeitige Verringerung von zumindest der Erzeugung von P24 aufweist. Diese Eigenschaften scheinen auf der spezifischen Struktur der amphiphilen Helix des Melittins zu beruhen. Die Information aus diesem Versuch weist außerdem darauf hin, daß die Schwanz struktur die Effektivität eines Analogs, jedoch nicht die Qualität seiner Wirkung bestimmt. Das heißt, daß die wirksame Konzentration eines Analogon mit einem Schwanz, der Lys-Arg-Lys-Arg-Gly-Gly umfaßt, an seinem Schwanz etwa einhundertmal geringer als die wirksame Konzentration von Melittin ohne Schwanz (no-tail melittin) ist. Außerdem zeigen die Versuchsergebnisse, daß die Infektiosität des überstands nach einer einzigen Behandlung mit Melittin bei subtoxischen Konzentrationen verringert wurde. Die Behandlung bestand dabei im Kulturbeginn und die Messung der Infektiosität erfolgte sieben Tage nach der Behandlung. Wie es bereits erläutert wurde, wurde die maximale Viruskonzentration in Kulturen dieser Art fünf Tage nach der Kultur nicht erreicht. Es ist selbstverständlich und die vom Erfinder daraus gezogenen Schlußfolgerungen bestehen darin, daß, wenn eine verringerte Virusinfektösität sieben Tage nach der Behandlung nur auf den direkten Wirkungen des Melittins auf den Virus beruhen, das Melittin oder ein aktives Fragment in diesem Fall fünf Tage nach der Behandlung vorhanden sein muß. Dies ist nicht möglich, da die Erfinder entdeckt haben, daß Melittin innerhalb von Stunden nach der Einführung in die Kultur von der Zelle absorbiert wird. Wenn diese Verringerung und Infektiosität des Überstands teilweise auf der reduzierten Erzeugung des Virus beruht, was zu einem inkorrekten Virusaufbau oder einer Zerstörung eines neu synthetisierten Virions im Gegensatz steht, dann sollte sich das in diesem Fall durch verringerte Mengen an Virusproteinen in den Zellen und/oder ihren Überständen der mit Melittin behandelten Kulturen widerspiegeln. Um festzustellen, ob diese Hypothese korrekt ist, hat der Erfinder den Marker P24 als Marker für die Virusproteinerzeugung gewählt. Diese Versuchswerte zeigten, daß es 3 Stunden nach der Inkubation mit Melittin, wenn überhaupt, nur eine geringe Verringerung von P24 in den Zellen und im Überstand gab. 14 Stunden nach der Inkubation mit Melittin gab es jedoch eine deutliche Verringerung von P24 in den Zellen als auch im Überstand (bis auf 60% gesenkt). Folglich wird zelluläres P24 anscheinend schneller und stärker verringert als P24 im Überstand. Die Inkubation von zellfreiem HIV mit Melittin beeinträchtigt darüber hinaus den Nachweis des P24 Antigens nicht. Sie scheint eher nur zu bewirken, daß die Infektiosität des Virus abnimmt.
Es wurden auch in vitro Versuche bei Mäusen durchgeführt. Es wurden die folgenden Schlußfolgerungen gezogen:
1. Die Tiere überlebten die Behandlung mit Melittin-Analoga in Konzentrationen, die denen bei den in dieser Patentanmeldung beschriebenen in vivo Versuchen vergleichbar sind.
2. Das Melittin-Analogon hemmt die Entwicklung von Retroviren in Säugern deutlich, da 75% der infizierten Tiere keine Krankheit entwickelten - verglichen mit einer 100%-igen Entwicklung der Krankheit in einer vergleichbar behandelten Kontrollgruppe.
3. Nicht nur HIV sondern auch andere Retroviren werden durch Melittin und seine Analoga gehemmt.

Claims

1. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung von Melittin bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer HIV-Infektion bei einem Säuger, wodurch die Virusreplikation in den mit HIV infizierten Zellen des Säugers verringert oder gehemmt wird.

2. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung eines strukturellen Analogon von Melittin bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 1.

3. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung einer Polypeptidmischung von Melittin und eines strukturellen Analogon davon bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 1.

4. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung eines Mittels, das aus mindestens einem Tiergift von Hymenoptera, mindestens einer aktiven Proteinkomponente eines Tiergifts von Hymenoptera, mindestens einer Polypeptidkomponente eines Tiergifts von Hymenoptera und/oder Mischungen davon besteht, bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 1.

5. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung von Bienengift, Hummelgift, Wespengift, Gift der kahlen Hornisse, wirksamen Proteinkomponenten dieses Tiergifts, wirksamen Polypeptidkomponenten dieses Tiergifts und Mischungen davon bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 1.

6. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung einer amphiphilen α-Helix mit oder ohne angefügte Zellbindungssequenz bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 1.

7. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung von Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro- Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 1.

8. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung von Melittin und strukturellen Analoga mit Gly-Ile-Gly-Ala-Val- Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp- Ile-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 1.

9. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung von Melittin bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer HIV-Infektion beim Säuger, wodurch das Wachstum der mit HIV infizierten Zellen im Säuger verringert oder gehemmt wird.

10. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung eines strukturellen Analogon von Melittin bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 9.

11. Verwendung von Amfi 1 und Peptiden von GP41, die dem Melittin ähnlich sind, bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 9.

12. Verwendung von Amfi 2 und Peptiden von GP41, die dem Melittin ähnlich sind, bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 9.

13. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung einer Polypeptidmischung von Melittin und eines strukturellen Analogon davon bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 9.

14. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung eines Mittels, das aus mindestens einem Tiergift der Hymenoptera, mindestens einer aktiven Proteinkomponente eines Tiergifts der Hymenoptera, mindestens einer Polypeptid- komponente eines Tiergifts der Hymenoptera und/oder Mischungen davon besteht, bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 9.

15. Verwendung einer wirksamen Dosierung eines Mittels, das im wesentlichen aus Bienengift, Hummelgift, Wespengift, Gift der kahlen Hornisse, wirksamen Proteinkomponenten dieses Tiergifts, wirksamen Polypeptidkomponenten dieses Tiergifts und/oder Mischungen davon besteht, bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 9.

16. Verwendung einer wirksamen Dosierung einer amphiphilen α- Helix mit oder ohne angefügte Zellbindungssequenz bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 9.

17. Verwendung einer wirksamen Dosierung von Gly-Ile-Gly-Ala- Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser- Trp-Ile-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 9.

18. Verwendung einer wirksamen Dosierung von Melittin und des strukturellen Analogon Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val- Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Gly-Gly- Gly-Gly-Gly-Gly bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 9.

19. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung von Melittin bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Retrovirus-Infektion beim Säuger, wodurch die Replikation des Virus in den mit Retroviren infizierten Zellen des Säugers verringert oder gehemmt wird.

20. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung eines strukturellen Analogon von Melittin bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 19.

21. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung einer Polypeptidmischung von Melittin und eines strukturellen Analogon davon bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 19.

22. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung eines Mittels, das aus mindestens einem Tiergift der Hymenoptera, mindestens einer aktiven Proteinkomponente eines Tiergifts der Hymenoptera, mindestens einer Polypeptid- komponente eines Tiergifts der Hymenoptera und/oder Mischungen davon besteht, bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 19.

23. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung eines Mittels, das im wesentlichen aus Bienengift, Hummelgift, Wespengift, Gift der kahlen Hornisse, wirksamen Proteinkomponenten dieses Gifts, wirksamen Polypeptidkomponenten dieses Gifts und/oder Mischungen davon besteht, bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 19.

24. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung einer amphiphilen α-Helix mit oder ohne angefügte Zellbindungssequenz bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 19.

25. Verwendung einer wirksamen Dosierung von Gly-Ile-Gly-Ala- Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser- Trp-Ile-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 19.

26. Verwendung einer wirksamen Dosierung von Melittin und des strukturellen Analogon Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val- Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Gly-Gly- Gly-Gly-Gly-Gly bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 19.

27. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung von Melittin bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Retrovirus-Infektion beim Säuger, wodurch das Wachstum der mit Retroviren infizierten Zellen beim Säuger verringert oder gehemmt wird.

28. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung eines strukturellen Analogon von Melittin bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 27.

29. Verwendung von Amfi 1 und Peptiden von GP41, die dem Melittin ähnlich sind, bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 27.

30. Verwendung von Amfi 2 und Peptiden von GP41, die dem Melittin ähnlich sind, bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 27.

31. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung einer Polypeptidmischung von Melittin und einem strukturellen Analogon davon bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 27.

32. Verwendung einer wirksamen subtoxischen Dosierung eines Mittels, das aus mindestens einem Tiergift der Hymenoptera, mindestens einer aktiven Proteinkomponente eines Tiergifts der Hymenoptera, mindestens einer Polypeptidkomponente eines Tiergifts der Hymenoptera und/oder Mischungen davon besteht, bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 27.

33. Verwendung eines Mittels, das im wesentlichen aus Bienengift, Hummelgift, Wespengift, Gift der kahlen Hornisse, wirksamen Proteinkomponenten dieses Gifts, wirksamen Polypeptidkomponenten dieses Gifts und/oder Mischungen davon besteht, bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 27.

34. Verwendung einer amphiphilen α-Helix mit oder ohne angefügte Zellbindungssequenz bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 27.

35. Verwendung von Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr- Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Gly-Gly-Gly-Gly- Gly-Gly bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 27.

36. Verwendung von Melittin und einem strukturellen Analogon Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro- Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly bei der Herstellung eines Medikaments nach Anspruch 27.