JPH05504761A

JPH05504761A - 哺乳類のｈｉｖ感染症の治療のための方法及び組成物

Info

Publication number: JPH05504761A
Application number: JP3500651A
Authority: JP
Inventors: フォルカー，エルフル; サエルマルク，トルベン
Priority date: 1989-12-07
Filing date: 1990-12-07
Publication date: 1993-07-22
Anticipated expiration: 2010-01-25
Also published as: AU6880891A; DE69011870D1; ATE110278T1; JPH075475B2; EP0504191A1; KR970005329B1; DE69011870T2; ES2048137T1; DE504191T1; EP0504191B1; ES2048137T3; WO1991008753A1; BR9007904A; DK0504191T3; GR930300031T1; AU646652B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】より実質的になる群より選ばれる、請求項３５に記載の方法。

３８、前記のメリチンの構造類似体が、連結している細胞結合性配列を有する又は有さない両親媒性αヘリックスを含む、請求項３１に記載の方法。

３９、前記のメリチンの構造類似体が、Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａ　ｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｌｅｕ −Ｐｒｏ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−Ｉ　１ｅ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙである、請求項３１に記載の方法。

４０、前記のポリペプチド混合物がメリチン及びその構造類似体Ｇｌｙ−１１ｅ −Ｇｌｙ−Ａ　ｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−Ｉ　１ｅ−５ｅｒ−Ｔｒｐ −Ｉ　１ｅ−Ｇｌｙ−Ｇ　１ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを含む、請求項３４に記載の方法。

小　Ｌｉ２　υ成功Ｉゴ膨ノ、ｌ／１千舌ｌハ偵姿　スヤムＴＪＴＶ憎脚１吐憔哺乳類のＨＩＶ感染症の治療のための方法及び組成物主所■宜量１、　の　る　′（本発明は哺乳類のＨＩＶ感染症の治療のための方法及び組成物に関し、そしてより詳しくは哺乳類宿主に導入され、そして該哺乳類のＨＩＶ感染細胞におけるウィルスの複製を制限又は実質的に阻害することがそれぞれできる膜翅類の毒素又はそのタンパク質性もしくはペプチド成分を利用する哺乳類の感染症の治療のためのこのような方法及び組成物に関する。

２、炎速ＪＪｂ列区哩医学者は長い間ＨＩＶ感染個体の治療のための有用な方法及び組成物を探している。本明細書にてＨＩＶ怒染症はＨｒｖｌ及びＨＩＶ２感染症の両方を含むことを意図している。

この観点において、本研究はＨｒｖ５染症と戦うための潜在的に有用な治療薬を探すことを目的とし、ここで該組成物はＨＩＶ感染細胞のウィルス再生を阻害しうるが、しかし真人なる有害な副作用を有さないものである。より詳しくは、本研究の目的は従来のＡＺＴの利用にとって代る治療剤である組成物を見い出すことにある。ところでこの組成物は有効性ウィルス細胞のレザーバーを含む又は実質的に制限するため胞を選択的に破壊せしめることが可能なものでなくてはならない。

理解される通り、ＨＩＶウィルスはレトロウィルスであり、従って最も適切にはＲＮＡウィルスとして分類される。ところで、このような特定のレトロウィルスのＲＮＡはレプリカーゼによって直接的に増殖されるのではなく、むしろ逆転写酵素の助成を有するＤＮＡ合成の介在を必要とする。理解されている通り、このＤＮＡはＲＮＡウィルスの増殖のための鋳型として働く。このＤＮＡは宿主細胞のゲノムの中に後に一体化する。この一体化の現象はその後、新たなるウィルス細胞の生産をもたらす。

低毒性（ｓｕｂｔｏｘｉｃ）濃度の膜Ｍ類の毒素又はそのタンパク質性もしくはペプチド成分を利用する本発明は、逆転写酵素を阻害せしめることによって低毒性濃度にてウィルス複製を妨害せしめること及び／又はＨＩＶ感染細胞の増殖を阻害せしめることにより、多数の長所を伴ってウィルスレザーバーを治療的に実質的になくすものと考える。

名称′ＭＥＴＨＯＤＳ　ＡＮＤ　Ｃｏ阿ＰＯ５ＩＴＩＯＮＳ　ＦＯＲＴｆｌＥ　ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ　ＯＦ門ＡＭＭ八へＩＡＮ　ＩＮＦＥＣＴＩＯＮＳ　ＥＭＰ［，０ＹｒＮＧ　ＭＥＤＩＣＡＭＥＮＴＳ　ＣＱＭＰＲＩＳＩＮＧ＋（ＹＭＥＮＯＰＴＥＲＡ　ＶＥＮＯＭ　ＯＲＰＲＯＴＥＴ［ＡＣＥＯＵＳ　ＯＲＰＯＬＹＰＥＰＴＩＯＥ　ＣＱｎＰＯＮＥＮＴＳ　ＴＨＥＲＥＯＦ″　（「膜翅類の毒素又はそのタンパク質性もしくはポリペプチド成分を含んで成る医薬品を利用する哺乳類の感染の治療のための方法及び組成物」）の、１９８９年４月１８日に承認されたＢｅｎｔｏｎらの米国特許第４．８２２．６０８号は、天然の二次薬剤、例えば膜翅類の毒素又はそのタンパク質性もしくはポリペプチド成分が抗菌剤を強める作用を有することを教示している。この文献は更に、このような組成物は種々の疾患における抗ウィルス、制癌性又は抗癌作用を有することも述べている。より詳しくは、Ｂｅｎｔｏｎらの文献はミツバチ毒素の主成分であるメリチン（ｍｅｌｉｔｔｉｎ）を、予め分っている感染性に対して抗ウィルス活性を有する様々な抗生物質と組合せて利用することを開示している。更にこの文献は、種々の治療的に有効な量におけるメリチンと様々な抗生物質との組合せにより相乗的な利点が得られることを教示している。

１３ｅｎｔｏｎらの従来技術文献に詳細に説明されている通り、ミツバチ毒素における主成分であるメリチンは実質的に２６個のアミノ酸残基を含むポリペプチドである。これらのアミノ酸残基はＧｌｙ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ− Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ− Ａｌａ−Ｌｅｕ−１１ｅ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ− Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｉｎ−アミドを含む。更に、この発明者は、メリチン類似体であって、少なくともその最後の６個のアミノ酸（Ｃ−末端）が変異して６個のグリシン残基に置き代わられているものの直接的な作用が、メリチンに類似する治療的利点を有すことを発見している。このアミノ酸類似体は、Ｇｌｙ−１１ｅ −Ｇｌｙ−Ａ　１ａ−Ｖａ　Ｉ　−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ　−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇ　Ｉｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−１１ｅ−５ｅｒ− Ｔｒｐ４１ｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの構造を有す。

従って、例えばＡＺＴにより成し遂げられる常用のＨＩＶ治療に関連するそれぞれの有害性を更に回避しながらも、哺乳類に感染しうるウィルスのリザーバー細胞をなくス又は大いに少なくすることが可能な安全且つ有効な手段におけるＨＩＶ感染細胞の治療のだめの方法及び組成物が長い間所望されていた。

の　・　び従って本発明の目的は、膜翅類の毒素又はそのタンパク質もしくはペプチド成分を利用する、哺乳類におけるＨＩＶｉ染症の治療のための改善された方法及び組成物の提供にある。

本発明の他の目的は、哺乳類におけるＨＩＶ惑染症の治療のためのこのような方法及び組成物であって、ここで該膜翅類毒素がミツバチ（ｈｏｎｅｙ　ｂｅｅ）毒、マルハナバチ（ｂｕｍｂｌｅ　ｂｅｅ）毒、スズメバチ（Ｆｅｌｌｏｗｊａｃｋｅｃｔ）毒、及びボールドフェースオオクマバチ（ｂａｌｄｆａｃｅｄ　ｈｏｒｎｅｔ）毒、該毒の活性タンパク質成分、該毒の活性タンパク質成分並びにその混合物より実質的になる群より選ばれる方法及び組成物の提供にある。

本発明の他の目的は、哺乳類におけるＨＩＶ惑染症の治療のためのこのような方法及び組成物の提供にあり、ここで該方法は哺乳類に有効な低毒性投与量のメリチンの類似体又はそれ自体を投与せしめることにより、哺乳類のＨＩＶ怒染細胞におけるウィルス複製を実質的に■害せしめることを含んでいる。

本発明の他の目的は、哺乳類におけるＨＩＶ感染症の治療のためのこのような方法及び組成物の提供にあり、ここで該方法は哺乳類に有効な低毒性投与量のメリチンとその構造類似体のポリペプチド混合物を投与せしめることにより、Ｈ１■ 感染細胞におけるウィルス細胞の複製を阻害せしめることを含んでいる。

本発明の更なる目的及び利点は、哺乳類のＨＴＶｉ染を治療するための、安全且つ有効であり、そしてこのような疾患の治療のための従来の治療法のそれぞれに関連する有害性を更に回避せしめる、改善された方法及び組成物の提供にある。

区血■呈車呈五里図１はメリチン濃度に依存する未処理コントロールのパーセンテージとしての、非感染及びＨＩＶ惑染細胞により得られる細胞増殖の比較を示すグラフ図である。

図２はメリチン濃度に依存する未処理コントロールのパーセンテージとしての、ＨＩＶ感染Ｔリンパ球細胞（ＫＥ３７−１／ｍβ）の培養上滑液の標準細胞系と比較した逆転写酵素の活性（ＲＴ％）、そして更には感染性（ＩＮＦ％）の比較を示すグラフ図である。

図３はメリチン類似体の濃度に依存する、未処理コントロールのパーセンテージとしての、非感染及びＨＩＶ感染細胞により得られる細胞増殖の比較を示すグラフ図である。

図４は、メリチン類似体の濃度に依存する、未処理コントロールのパーセンテージとしての、ＨＩＶ感染Ｔリンパ球細胞（ＫＥ３７−１−Ｉ１１β）の培養上清液の、標準化細胞数と比較した逆転写酵素の活性（ＲＴ％）及び感染性（ＩＮＦ％）を示すグラフ図である。

図５は）ＩＩＶウィルスのＣＰ４１分子のカルボキシ末端領域のグラフモデルである。

図６はメリチンの濃度に依存する、未処理コントロールのパーセンテージとしての、ＨＩＶｉ染及び非感染細胞により得られる細胞増殖の比較を示すグラフ図である。

図７はメリチンの濃度の関数としての、感染性細胞のパーセンテージを示すグラフ図である。

図８はメリチン６の濃度に依存する、未処理コントロールのパーセンテージとしての、ＨｒＶ感染及び非感染細胞により得られる細胞増殖の比較を示すグラフ図である。

図９はメリチン６の濃度の関数としての、感染性細胞のパーセンテージを示すグラフ図である。

図１０はメリチン４の濃度に依存する、未処理コントロールのパーセンテージとしての、ＨＩＶ感染及び非感染細胞により得られる細胞増殖のパーセンテージを示すグラフ図である。

図１１はメリチン４の濃度の関数としての、感染性細胞のパーセンテージを示すグラフ図である。

図１２はメリチンＥの濃度に依存する、未処理コントコールのパーセンテージとしての、ＨＩＶ感染及び非感染細胞により得られる細胞増殖のパーセンテージを示すグラフ図である。

図１３はメリチンＥの濃度の関数としての、感染性細胞のパーセンテージを示すグラフ図である。

図１４はメリチンＦの濃度に依存する、未処理コントロールのパーセンテージとしての、ＨＩＶ感染及び非感染細胞により得られる細胞増殖のパーセンテージを示すグラフ図である。

図１５はメリチンＦの濃度の関数としての、感染性細胞のパーセンテージを示すグラフ図である。

図１６はメリチン３の濃度に依存する、未処理コントロールのパーセンテージとしての、ＨＩＶ怒染及び非感染細胞により得られる細胞増殖のパーセンテージを示すグラフ図である。

図１７はメリチン３の濃度の関数としての、感染性細胞のパーセンテージを示すグラフ図である。

図１８はメリチン１−２０の濃度に依存する、未処理コントロールのパーセンテージとしての、ＨＩＶ感染及び非感染細胞により得られる細胞増殖のパーセンテージを示すグラフ図である。

図１９はメリチン１−２０の濃度の関数としての、感染性細胞のパーセンテージを示すグラフ図である。

図２０はマストパラン（ｍａｓｔｏｐａｒａｎ）の濃度に依存する、未処理コントロールのパーセンテージとしての、）（ＩＶ！ｇｔ、染及び非感染細胞により得られる細胞増殖のパーセンテージを示すグラフ図である。

図２１はマストパランの濃度の関数としての、感染性細胞のパーセンテージを示すグラフ図である。

図２２はＡＭＦＩ２の濃度により比較した、未処理コントロールのパーセンテージとしてのＨＩＶ感染及び非感染細胞により得られる細胞増殖のパーセンテージを示すグラフ図である。ＡＭＦ　Ｉ　１の濃度により比較した、未処理コントロールのパーセンテージとしてのＨＩＶｉ染及び非感染細胞についての細胞増殖のパーセンテージは図２２に示す結果と同じである。

図２３はＡＭＦ　Ｉ　２の濃度の関数としての感染性細胞のパーセンテージを示す。ＡＭＦ　Ｉ　１の濃度の関数としての感染性細胞のパーセンテージは図２３に示す結果と同一である。

図２４はＭＭＣペプチドの濃度により比較する、未処理コントロールのパーセンテージとしての、ＨＩＶ感染及び非感染細胞により得られる細胞増殖のパーセンテージを示すグラフ図である。

図２５はＭＨＣペプチドの濃度の関数としての、感染性細胞のパーセンテージを示すグラフ図である。

図２６はＤＭＳＯ（溶媒コントロール）の濃度により比較した、未処理コントロールのパーセンテージとしての、Ｈ１■惑染及び非感染細胞により得られる細胞増殖のパーセンテージを示すグラフ図である。

図２７はＤＭＳＯ（溶媒コントロール）の濃度の関数としての、感染性細胞のパーセンテージを示すグラフ図である。

図２８はＨＯＬＳＴペプチド（陰性コントロール）の濃度により比較した、未処理コントロールのパーセンテージとしての、ＨＩＶ感染及び非感染細胞により得られる細胞増殖のパーセンテージを示すグラフ図である。

図２９はＨＯＬＳＴペプチド（陰性コントロール）の濃度の関数としての、感染性細胞のパーセンテージを示すグラフ図である。

図３０は種々の時間間隔でメリチンの濃度により比較したＰ２４生産のパーセンテージを示すグラフ図である。

図３１は３時間目にてメリチンの濃度にて比較した細胞及び上清液におけるＰ２４生産のパーセンテージを示すグラフ図である。

図３２及び３３はそれぞれメリチンの存在下において３時間及び１４時間インキュベージクンせしめた後の細胞と上清液におけるＰ２４の濃度を示すグラフ図である。

図３４は種々の濃度のメリチンと３時間及び１４時間インキュベーションせしめた後の、それぞれの無細胞上清液中におけるＰ２４測定へのメリチンの効果を示すグラフ図である。

図３５は、マウスによる長期毒性試験を示し、より詳しくは特定の毒素の投与を開始してから種々の時間にて得られた、この毒性試験の際に用いた種々の毒素に対するマウスの有効体重を示す記録例である。

図３６は毒性試験に用いた物質の投与を開始してからの経過日数の関数としての、長期毒性試験におけるマウスの体重を示す記録例である。

図３７は投与を開始してから種々の日数でのハチミツ毒素の利用の関数としての、個々のマウスの体重を示す記録例である。

図３８は投与を開始してから種々の日数での、スズメバチ毒素の利用の関数としてのマウスの体重を示す記録例である。

図３９は投与を開始してから種々の日数での、オオクマバチ混合物毒素の利用の関数としてのマウスの体重を示す記録例である。

図４０は投与を開始してからの種々の日数での、スズメバチ科混合物の利用の関数としてのマウスの体重を示す記録例である。

図４１はマウスについての長期毒性試験を示し、これは毒性試験に従ってハチミツ及びスズメバチ混合物の付与されたマウスの種々の解剖器官それぞれの顕微鏡試験をまとめた記録例である。

図４１Ａは、図４０に紹介する種々のデーターの解説を示す。

図４２はメリチン及びその構造類似体の構造を示す。

ましい　の− 林ｎ点方広林−料以下に詳細のＫＥ３７−１　（非感染）及びＫＥ３７−１／■β（感染）細胞系はアメリカ合衆国におけるＮＩＨのＤｒ。

Ｒｏｂｅｒｔ　Ｇａｌｌｏｗｓ研究所より市販され、これを１ミリリッター当りペニシリン約１００ユニツト、ストレプトマイシン１００μｇ及びフンギシン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（アンフォテリシンＢ）約０．２５μｇを含む、１０％の仔牛血清を更に添加されているＲＰＭ１１６４０　（ＧＩＢＣＯ）の培地に増殖せしめた。下記に詳細のヒト開光組繊細胞系ＬＣ５及びＬＣ５−ＨＩＶは１９８９年３月９日にフランス国、パリのＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｄｅ　Ｌ’　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔＰａｓｔｅｕｒに寄託されており、それぞれ承認番号１−８４２及びｌ−８４３が付与されている。ＬＣ５及びＬＣ５−ＨＩＶ細胞系を、１０％の仔牛血清の添加されているＲＰＭ１１６４０培地において増殖せしめた。

立爪ユニ天上ＧＰ４１由来のメリチンペプチド及び類似体は市販されているペプチド合成装置（Ｂｉｏｌｙｎｘモデル、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　ＵＫ）を用い、この装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　ＵＫ）に供給する予め秤量したアミノ＃１０　Ｐ　Ｅ　Ｐエステルにより合成した。この合成手法は、この装置のためのマニュアルに詳細の通り、Ｆｍｏ　ｃ手法に−ルに従い、６００ｎｓｘにてアニオン色素（アシッドバイオレット１７；ジメチルホルムアミド１００＋１及びジイソプロピルエチルアミン０．１４■ｌ当り３０ｍｇ）の遊離を利用してモニターした。この原理は対イオン分布モニター（Ｃｏｕｎｔｅｒ　ｉｏｎ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ二ＣＤＭ）として知られ、そして５ａｌｉｓｂｕｒｙ。

Ｓ、Ａ、、Ｔｒｅｅｍｅｒ、Ｅ、Ｊ、、Ｄａｖｉｅｓ、Ｊ。

Ｗ、及びＯｗｅｎ、Ｄ、、Ｅ、、１．、Ａ、、（１９９０）Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、Ｃｈｅｍ、Ｃｏｍｍｕｎ、、１９９０頁５３８−５４０に詳細されている。利用するリンカ−はペプチドアミドの遊離をもたらす（〔ウルトロシンＣＰＵ１ｔｒｏｓｙｎ　Ｃ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｃｈｒ。

ｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　ＵＫ）。

酸性に不安定なリンカ−、ウルトロシンＣ（０，１ｍｅｑ　）への第１のカップリングを対称無水物（０，４ｍｃｑ　）を用い、ジメチルアミノピリジンの添加（０，０５ｍｅｑ　）により行った。これは、Ｆｍｏｃ基の遊離により測定されるものとして、１時間後に少なくとも８０％のカップリングをもたらし、そして未反応部位は無水酢酸を用いてキャップせしめた。その後のカップリングは、市販されている活性エステル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ、ＵＫ）を用い、利用したソフトウェア−（上記）によって自動的に行われるＣＤＭによって決定されるカップリング時間にわたり行った。典型的なカップリング時間は一般に４倍過剰量のエステルを用いて１時間である。Ｓｅｔを無色となる迄ジヒドロキシベンゾトリアゾールを用いてカンプルせしめた（１．５−２時間）。

Ｆｍｏｃ基を５倍のベッド容量のピペリジン（ジメチルホルムアミド中で２０％）により除去せしめた。ジメチルホルムアミドを使用前に蒸留せしめ、アミンを含まないようにせしめた（Ｂｉｏｌｙｎｘに関するプロトコールに詳細のジニトロフルオロベンゼン試験により測定した）。これらのカップリングは何ら特別な問題を提供せず、そして粗ペプチドは高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ１以下参照）により８０％以上の純度であった。

該ペプチドを２％のアニソール及び２％のエタンジチオールの添加を伴ってトリフルオロ酢酸を用い、２時間かけて樹脂から切り離し、その後エーテル沈殿せしめた。このペプチドをＴＳＫ１２０Ｔ逆相カラム（７，５Ｘ３００ｍｍ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）におけるＨＰＬＣにより純度９５％以上に迄精製せしめた。このペプチドは、０．１％のトリフルオロ酢酸中における０〜８０％のアセトニトリルの９０分にわたる直線勾配を用いることにより、６５％のアセトニトリル（５５と７５％の間）にて典型的に溶出させた。

この配列をアプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ　ｏ　ｓ　ｙ　ｓ　ｔ　ｅｍ）シーケンサ−により、製造者に従うタンパク質シーケンシングにより確認した。

ＣＰ４１類似体及びマストパランの合成はメリチンについての詳細の通りに行った。利用したメリチン類位体及びその他のペプチドのリストは図４２に記載した。

立−灰図１〜４をより詳しく説明すると、メリチン及びその特定の類似体をＨＩＶ惑染Ｔリンパ球細胞へのそれらの作用について試験した。これに関し、以下の細胞系をこの試験において利用した：ＫＥ３７−１　（非感染）及びＫＥ３７−１／Ｉ［［β（ＨＴＬＶ−Ｉ［［βにより感染）、これらの感染細胞を試験条件のもとて７日間にわたり、３７℃の温度及び５％のＣＯ２の存在下においてインキュベートせしめた。ＲＰＭ１１６４０の培養培地（ＧＩＢＣＯ）を利用し、そして更にこれにペニシリン約１００ユニツト、ストレプトマイシン１００μｇ及びフンギシン（アンフォテリシンＢ）約０．２５μｇを１ｍｌ当りに含む１０％の仔牛血清を添加せしめた。これは培地１００Ｉｌｌ当り、１ｍｌの抗菌生物質−抗真菌溶液（ＧＩＢＣＯ；ジョンの後、以下の試験をこの培養物について行った。第１の試験はＭＴＴ試験を利用することにより提供される、ＨＩＶ感染細胞数の関数としての相対細胞濃度を測定する目的のために行ったにのＭＴＴ試験はＴ、Ｍｏｓｍａｎｎの、“Ｒａｐｉｄ　Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　Ａｓ５ａｙ　ｆｏｒ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　５ｕｒｖｉｖａｌ　：　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＡｓｓａｙｓ、”　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、第６５巻（１９８３）、頁５５−６３に従い、マイクロタイタープレート中で行った。このＭＴＴ試験は若干改良した２１０μｍのＭＴＴ溶液（ＰＢＳ中に５−ｇ／麟ｌのＭＴＴを溶解し、濾過により除菌した；　ＭＴＴは３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル−２，５−ジフェニルテトラゾリムプロミドである）を全てのウェルに加えである。細胞をＭＴＴと、３７°Ｃで４時間、５％のＣＯ７雰囲気下においてインキュベートにおける０、０４ＮのＨＣＩ　２００μｌを全てのウェルに加えることにより停止させ、そしてこの色素を抽出せしめる。

全てのホルマザン結晶を溶解せしめるために得られるこの熔液を強く混合した。

この溶液の吸光度を＝６００ａｍで測定した。この吸光度はこのような条件下の細胞密度と比例する。

第２の実験はＰｏ１ｅｓｚらにより詳細のＰＮＡＳ７７（１９８０）：１４１５ −１４１９に見い出せる試験を改良した方法を利用することにより、処理せしめたＨＩＶｉ染細胞培養物の上清液中における逆転写酵素の活性を測定するために行った。第３の試験は処理せしめたＨＩＶ感染細胞培養物の上清液の相対感染性を測定することを目的として行った。

これに関し、非感染化のＨｒＶ惑受性ヒト胎児肺細胞（ＬＣ５）を試験すべき培養上清液中においてインキュベートした。

これに続き新鮮培地中でのこの細胞の３日間培養を行った。

次にこれらの細胞をＨＩＶ特異的タンパク質の生産について試験した。

ＨＩＶタンパク質の存在をｉ認する方法は血清学試験を介して行った。ここでは、第１抗体であるこれらのタンパク質に対する抗体及び第２抗体であるこのイムノグロブリンに特異的な抗体、そしてこれに結合している西洋ワサビペルオキシダーゼを利用している。識別化のため、抗体−抗原複合３−アミノエチルカルバゾールを利用した。このＴｈｔは水に不溶性であった。この方法は間接的イムノペルオキシダーゼ比色法としてよく知られる。この方法はＭｅｌｌｅｒｔらのＨＴＬＶ−Ｉ［１／ＬＡＶ−Ａｎｔ　１ｋｉ５ｒｐｅｒｔｅｓｔ　：Ｉｎｄｊｒｅｋｔｅ　Ｉｍｍｕｎｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｆｊｒ　ｂ　ｕ　ｎ　ｇ　（ＨＴＬＶ −１［Ｉ／ＬＡＶ抗体試験：間接的イムノペルオキシダーゼ染色）Ａ　Ｉ　ＤＳ −ＦＯＲ３ＣＨＵＮＧ（ＡＩＦＯ）１９８６年２月、第２巻、頁１０５−１０７に詳細されている。図１−４に見られる通り、メリチンは５μｇ／ｍ１以上の濃度でＨＩＶ感染細胞及び非感染細胞両者に毒性であることがわかる。これに関連して、本試験データーの分析を更に補助するためにマウスに対する毒性試験を以降に提供する。以上の他、図３に示される通り特定のメリチン類似体は明らかにメリチンはど毒性でない。しかしながら、この１μ像体はより高い投与量、即ちＩＯμｇ／ｍｌでＨＩＶ感染細胞に対して選択的な増殖阻害作用を示す。更に、メリチンが感染及び非感染細胞の両者に毒性である濃度５μｇ７ｍｌにて、感染細胞の増殖はメリチンを利用することによりおよそ７日後にほぼ８０％下げるが、非感染細胞の増殖は容易には影響を受けないことを本発明者が発見したことに注目すべきである。

以上の他、図１−４に示す試験データーは２．５μｇ／■ｌの濃度のメリチンを示し、これでは細胞の増殖のレベルは未だ影響されず、この細胞の感染する能力及び逆転写酵素の活性はほぼＯ値に迄戻ることが明らかである。これは図２を参照することにより最もよく分る。

図４を参照することにより最もよく分る試験データーは、メリチン類似体が逆転写酵素の活性及び上清液処理化ＨＩＶ感染細胞における感染性ウィルス細胞の量も低めることができることを示す。この作用は非感染細胞には毒性でないが、ＨＩＶ感染細胞には明らかに毒性である濃度範囲において生ずるものと考えられる。

まとめると、図１−４に示す試験データーは、メリチンが低毒性濃度で逆転写酵素を阻害することにより、ウィルス複製を阻害するための治療に有用であることが考えられることを示す。更に、メリチンはＨＩＶ感染細胞の増殖を選択的に阻害するものと考えられ、このことは哺乳類におけるウィルスリザーバーの撲滅を可能とする。

図１から４に示す試験結果を更に裏付けするために更なる試験を行った。図６から３４迄を参照することにより最もよく説明されるこれらの試験それぞれにおいて、メリチンがＨ■■感染細胞を阻害する考えられるメカニズムを調べた。序論により及び図５をより詳しく参照することにより、ＨＴＶタンパク質ＧＰ４１の表面のエネルギー最小化試験を、ニューラルネットワークコンピユーテイング（ｎｅｕｒａｌ　ｎｅｔｗｏｒｋ　ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）原理に基づく二次構造予測におけるＣＨＡＲＭアゴリズムを用いて行った。ここで利用するニューラルネットワークプログラムの用途はアミノ酸配列からの予測二次タンパク質構造であることが理解されるべきである。このネットワークはアミノ酸残基を３つの型の二次構造、即ち、アルファーヘリックス、ベーターシート及びランダムコイルに分けるようになっている。既知の二次構造を有するタンパク質の大量のセットをこれに教え込むことにより、二〇ニューラルネットワークはこのネットワークにとって新規なるタンパク質の二次構造について、その−次構造に単に基づいて予測することが可能となる。ヒト免疫不ントワーク法に基づ（コンピューターモデル化による分析は、Ｈ，Ａｎｄｒｅａｓｓｅｎらの“Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｂｅ　５ｅｃｏｎｄａｒｙ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｉｗｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ　（ＨＩＶ）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｐ１７＋　ｇｐ１２０　ａｎｄ　ｇｐ４１　ｂｙ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｍｏｄｅｌｉｎｇ　Ｂａ５ｅｄ　ｏｎ　Ｎｅｕｔｒａｌ　Ｎｅｔｗｏｒｋ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、’　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｃ　ｕｉｒｅｄ　Ｉｎｎ旦り呵七」匹り打所Δ至、第３巻、頁６１５−６２２に見い出せる。より詳しくは、これらの研究により導かれる考察は、ＧＰ４１タンパク質の２つのトランスメンブランセクションがメリチンの構造とのある程度を同一性を有することを示唆している。これに関して、この同一性はかなり注目すべきであり、その理由はメリチンとはかなり異なっているその他のメリチンの類似体が同じＨＩＶｆｆｉ害作用を有すことが明らかであるからである。従って、メリチンにおけるいくつかのアミノ酸は、両親媒性が保持されることを条件に該分子の活性の変化を伴うことなく交換されることができ、そして４つのメリチン分子のポリマー化が荷電相互作用により可能であることが明らかである。これらのデーターから導かれる考察であって以降により詳しく説明することは、即ち、メリチンは主なＨＩＶタンパク質のうちの１つ、糖タンパク質ＧＰ４１と相互作用するものと考えられることである。これは、ＧＰ４１のトランスメンブラン領域とメリチンが図５に示す通り類似する理由より考えられる。

メリチンはアミノ酸２６個分の長さの両親媒性ペプチドであると考えられる。高いイオン強度の水溶液中では、メリチンは４量体の構造を選択する。しかしながら、低イオン強度ではメリチンはモノマーのランダムコイルとなる。生理的なイオン強度ではこの２つの型の分布が等しくなるようである。

従来の研究が示すには、メリチンはモノマーヘリックスを形成せしめることにより細胞膜の疎水環境に適合することができることを示している。このヘリックスの一方の側面には電荷が分布し、そして膜に結合している側面には電荷は負荷されていない。この研究は、メリチンポリマーの表面がまわりの脂質に向いており従って電荷が負荷されていないことを更に示唆する。更に、メリチン分子のその他の特有なる特徴は、約１２０”のねじれがプロリン（アミノ酸番号１４）によってこのメリチンヘリックスに導入されていることである。類位のねじれが上記のＨＩＶ　ＧＰ４１メリチン様配列に見い出せる。

初期の研究は、メリチンかい（つかの作用を有すことで知られていることを示す、これらの作用は細胞表層結合プロセス及び重合プロセスとしてより詳細され、ここではアルファーヘリックスはチャンネルを形成するように配置している。

更に、Ｃ末端、即ち尾部の６個のアミノ酸によって結合することは細胞溶解のために重要であることが示されている。この事実は以降に詳細する実験的試験データーを理解する上で非常に重要である。メリチンがチャンネルを形成する正確なメカニズムはよく理解されていないことが理解されるべきである。しかしながら、メリチン分子はその塩基性Ｃ末端によってリン酸陰イオンと結合することが考えられ、これによって１０個のホスファチデルコリン分子と相互作用する。メリチン分子が結合したら、これは膜の外脂質層の中に入り込み、これによって膜の構造を乱すと考えられる。この働きに続き、膜の外層に孔が形成され、これによりイオンの透過性は高められ、その後膜は破れる。この膜において形成されるチャンネルはメリチン分子により安定化される。チャンネルの形成は細胞の溶解ももたらし、これは以降のメリチンの毒性に関連する。これはアルファートキシン及び補体が細胞毒性であるメカニズムと比較することができる。これらの分子は膜に広がることもでき、これによって同じ結果をもたらす孔が形成される。

チャンネル形成能力を含む両親媒性ペプチドの作用に加え、ホスホリパーゼＡ２における作用が詳細され、これも二種のタンパク質問の両親媒性相互作用を含む。このケースにおいて、メリチンはおそら（酵素タンパク質ホスホリパーゼＡ２の疎水部分と相互作用するか、又はそれはメチリン−リン脂質相互作用に起因しうる０以上の他、メリチンの作用は細胞内である可能性もある。例えば、メリチンは成長ホルモンの分泌をもたらす、下垂体前葉製剤における内因性ホスホリパーゼＡ２を刺激せしめることが知られる。

図６から３４にそれぞれ示す一連の実験は両極端を調べるためにデザインされている。これらの試験は特にウィルス遊離の阻害及び／又は低められた他の細胞への感染能力を有すウィルスの遊離を調べるためにデザインされている。他の細胞に感染する低められた能力は、例えばグリコジル化阻害剤により示され、ウィルス遊離への直接的な作用はアシル化阻害剤、ＲＴ阻害剤及びメリチンにより示される。ところで、この実験のデザインの最も重要な特徴はメチリンの毒性の検出である。本実験は星状細胞腫細胞系ＬＣ５−ＨＩＶ　（クローン化感染細胞）及びリンパ細胞腫細胞系ＫＥ３７−１／Ｉ［ｌβ（ＨＴＬＶ−Ｉ［［βによるクローン化感染細胞）の両者において行った。両ケースにおける結果は実質的に同じであった。

一連の本実験において、ＨＩＶｉｔｌ［は完全自動化研究室ロボットシステムにより試験し、これはＢｉｏｍｅｋ　１００としてＢｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓにより製造されている。このシステムは以下の段階を行う。第１に、慢性的に感染された細胞（クローン化）をマイクロタイタープレートにまき、そして７日間増殖させる。次に、これらをメリチンにより、図に示す期間の最終日又はその途中迄のいづれかにて作用を受けさせる。生存細胞数をＭＴＴ、即ち代謝（デヒドロゲナーゼ）試験により定量する。このＭＴＴ試験は自動で行う、毒性作用は実験時に調べ、別のコントロール実験において調べたのではない。更に、最終洗浄より２４時間から７日間の様々な経過期間由来のウィルス細胞を含む上清液をこの培養物から回収し、そして抗原又はウィルスの酵素の逆転写酵素（ＲＴ）を利用するウィルス定量のためのアリコートを保存した。更に、アリコートをマイクロタイタープレート中の非感染細胞の培養物に加え、これらの非感染細胞に伝染するこのウィルス細胞の能力をその後調べた。これに関連して、感染細胞の数をイムノペルオキシダーゼ染色法によって自動的に定量した。この試験結果は示した通り、メリチンの毒性（ＭＴＴ試験）；初期培養物からのＨＩＶの遊離（ＲＴ試験）；及びもとは感染されていない細胞に感染する遊離ウィルスの能力として表わした。

図６及び７を参照することにより最も分る通り、ＨＩＶｉ染細胞へのメリチンの全体的な作用は、感染細胞からのウィルス細胞の遊離の阻害であると考えられるが（図６）、しかしその天然の型は感染細胞に選択的に作用しないようである（図７）。この関係はメリチン６（図８と９）、メリチン４（図１０と１１）、メリチンＥ（図１２と１３）、メリチンＦ（図１４と１５）、メリチン３（図１６と１７）及びメリチン１−２０　（図１８と１９）それぞれに関しても示された。

このデーターから得られる情報は注目すべきであり、その理由はメリチンの膜への作用はメリチンのそのＣ末端を介しての細胞への表層結合に依存すると考えられるからである。初めに説明した通り、この結合特性はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ −Ａｒ　ｇ−Ｇ　１　ｎ−Ｇ　１　ｎ−アミドのアミノ酸配列を含むＣ末端配列に基づく陽電荷に依存するとも考えられる。メリチンの作用が既知のチャンネル形成のメカニズムに基づくか、又は知られていないプロセスによるものかを調べるため、本発明者は（１−２０）−６−（Ｇｌｙ）−アミドを試験した。

この型のメリチンの電荷の欠如に基づき、これはその両親媒性特性と同じ方法において作用し、そして細胞表層との特異的な相互反応に依存しないものと考えられていた。しかしながらこの発明者の仮説に反して、図１８及び１９を参照することにより最もよく分る通り、細胞表層に特異的結合せず、そしてそれ故より毒性の低いメリチン類似体は、ウィルス細胞遊Ｍを阻害し且つＨＩＶ感染細胞を選択的に殺傷もすることがはっきり認められた。この実験データは、メリチンの毒性、細胞毒性効果が感染細胞の選択的な殺傷をおそらくマスクすることを示唆する傾向にあった。これはメリチンの溶解特性がその抗−ＨＩＶ作用に含まれていない可能性を予測させる。従ってこれは新規であり、且つ今迄開示されていないメリチンの作用の態様である。

更に試験結果は天然のメリチンがＨＩＶ感染ＬＣ５細胞を溶解せしめることができることを明白に示す０例えばこの試験データーは、この作用の性質がこの臨界濃度の現象に関連すると考えられることを示した。より詳しくは、この臨界濃度に達している場合（１０μｇ／ｍｌ）、全ての細胞、即ち、非感染及び感染細胞は殺傷される。この作用はＨＩＶ遊離における作用よりも１０倍高い濃度で生ずる。メリチンＣ０ＯＨを試験し、そしてこれはメリチンアミドよりも効力が弱いことがわかった。以上の他、２種類のメリチン類似体を試験した。これらは位置２１−２６において陽電荷アミノ酸の結合性尾部が欠如していた。これら両者のメリチン類似体はＨ■Ｖ怒染細胞に同一と判断される作用を有し、即ちこれらの感染細胞は選択的に殺傷された。例えば、１０μｇ／ｌにて、半数の感染細胞が殺傷され、そして非感染細胞は実質的に影響を受けなかった。更に、臨界濃度での細胞溶解に基づき、メリチンの毒性として説明されることができる細胞の溶解は、利用した濃度において観察されなかった。メリチン類似体の作用は類似体の濃度の上昇により、感染細胞の生存率を定常的に低下させることを示した。このメリチンＭ似体の作用は簡単には説明できない。即ち、感染細胞は非感染細胞と同程度に明らかに生存しており、従ってもしＨＩＶ遊離が阻害される場合、それらは非感染細胞よりも速い速度で死滅することはないであろう。更に、両親媒性構造を介して作用する、抗ウイルス物質としてのメリチンの作用はメリチン（１ −２０）の作用により更に実証された（それぞれ図１８及び１９）。

これに関して、メリチン１−２０はその分子の細胞結合部が欠如していることを理解すべきである。しかしながら、この類個体はそれにもかかわらず天然のメリチン及びメリチン（１−２０）−６−（Ｇｌｙ）−アミドと同様にＨＩＶ遊離を阻害した。更にこのメリチンは、陽電荷Ｃ末端を有さないメリチン、即ちメリチン（１−２０）　−６−（Ｇ　１　ｙ）〜アミドと同様に感染細胞の増殖を阻害した。従って、メリチンの抗ウィルス作用はメリチンの既知の細胞溶解メカニズムに依存せず、むしろメリチンの両親媒性及び膜カオトロピック作用に依存すると考えられる。従い、感染細胞の選択的殺傷はＨＩＶ遊離の阻害と相関する。これは現状では推測であるが、この作用はメリチンの現在迄分っていない作用に基づくであろう。

毒性マストパランの作用も図２０及び２１に示す、これは両親媒性ペプチドであるが、やや短めのものと考えられ、そして１４個のアミノ酸残基のみを含む。従って、これはポリマー型においてのみ膜に分散することができる。類似の構造を有すペプチド、即ちＭＭＣ（ＭＡＪＯＲ組織適合性複合配列）及びＧＰ４１ｉ僚体、並びにマストパランは既に明らかである作用を有していないことに注目することが重要である。

更に、メリチンと明らかに構造上類似していないコントロールペプチドも作用を有さなかった。

図３０及び３１をより詳しく参照すると、本発明者は、細胞内におけるウィルスタンパク質２４の形成を測定することにより、メリチンにより処理された感染体（クローン培養物）においてこのウィルスタンパク質合成は全体的に低められることを発見した。このことは本質的に、該ウィルスにおけるメリチンの作用は、感染細胞から遊離する前のウィルスに攻撃することであり、しかも細胞培養物等へのメリチンの添加の最中又は直後にウィルスの数を低下せしめることが可能であることを意味する。しかしながら、この事実はウィルス生産がこの培養を開始から約３〜５日かけて最大値に達することを示している。この時点において、メリチンは培養物には存在していない。更に、得られるこれらの試験はメリチンが１９時間の半減期を有し、且つそれは培養物に添加して２時間を経過した後はこの培地中において測定ができない、即ち、これは細胞に取り込まれていることを示す。この観察は「細胞遊離」ウィルス、即ち、上清液に放出されたウィルスにおけるメリチンの直接的作用によって説明される実験結果を全てを排除する。

膜翅類毒素の繰り返し投与の作用をマウスにおいて調べた。

１０匹のＮＭＲＩマウス（それぞれの性を５匹づつ）のグループに以下の毒素を皮下的に付与した。ハチミツ、スズメバチ、オオクマバチ混合物又はスズメバチ科の混合物を０，４゜７．１２．１４及び１６日目に与えた。各動物にそれぞれ１゜２．５．５．１０．２５及び５０μｇの毒素を投与せしめた。

その後、各動物は５０μｇの毒素の注射を毎月５ケ月にわたり受けた。第５のグループにはコントロール溶液を与え、これをコントロールとした。このデーターをそれぞれ図３５から４１Ａにまとめた。臨床観察及び体重記録を繰り返し行った。この実験の終了時に、全ての動物を解剖し、そして組織学的検査を行った。

この検査の結果より、マウスはこの４種の毒素に非常に耐性であることが考えられた。異常な成長又は顕微鏡的変化は見られなかった。

算　−に　いた　・と　法々の　、の序ヨ」會哺乳類における膜翅類毒素の繰り返し投与の効果を評価するため、長期毒性試験をマウスにおいて行った。

跋辰立ｉ以下の膜翅類の種由来の毒素を試験した：ハチミツバチ（アピスメリフェラ：Ａｐｉｓ　ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）（ｒｅｆ、Ｎｒ、ＢＶＯ２）、スズメバチ（ベスブラマクリフロンス）（ｒｅｆ、Ｎｒ。

ＹＪＯ２）、オオクマバチ混合物〔白色類オオクマバチ（ベスブラマクラタ：ｖｅｓｐｕｌａ　ｍａｃｕｌａｔａ）、及びスズメバチ（ヘスブラアレナリア：ｖｅｓｐｕｌａ　ａｒｅｎａｒｉａ））（ｒｅｆ、ｎｒ、ＭＨＯＩ）スズメバチ科混合物（スズメバチ、白色頭オオクマバチ及びスズメバチ）（ｒｅｆ、Ｎｏ、ＭＶＯ２）。

コントロール動物は以下のコントロール？８ｍ、を受けた：ＮａＣｌ：０．　１２Ｍヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）：０．０３％マンニドロール：３％リン酸ナトリウム：０．００５ＭｐＨ７，４成果■！ｌこれらの毒素を種々の濃度においてエバン（Ｅｖａｎ）の緩衝食塩水、ｐＨ７に、各投与時に同一の投与量、即ち、０゜５−１／動物を確保するために希釈せしめた。

ＮａＨＰＯ４・２Ｈｚ　Ｏ０，７１１ｇ／ＬＫＨ，ＰＯ４−０，３６３ｇ／ＬＮａＣ１−５ｇ／Ｌフェノール−４ｇ／ＬジーＮａ　ＥＤＴＡ　・２　Ｈｚ　Ｏ０，１ｇ／　Ｌ監批反墾条註動物：マウス、ＮＭＲＩ種、ＳＰＦ　（Ａｎ　ｔ　ｉ　ｃ　ｉｍｅ　ｙ。

Ｎｏｒｒｖｉｋｅｎ）、生後７週間、体重（♀）２５ｇ、（♂）３０ｇ、５匹／ケージで飼育。

えさ：任意量のヘレノト（Ａｎｔ　ｉｃｉｍｅｘ、Ｒ３）及び水。

温度（周囲）：２２±１℃。

湿度（相対）：５０±ｌＯ％。

光（人工）＝１２時間／日。

グループのサイズ１０匹づつの動物（各性５匹づつ）をランダムに選別して５つのグループに分けた（１組のコントロールグループを含む）。

グループ　マウスＮｏ、　化合物１　１−１０　コントロール２　１０１−１１０　ハチミツバチ３　２０１−２１０　スズメバチ４　３０１−３１０　オオクマバチ混合物５　４０１−４１０　スズメバチ科混合物改亙ＩＮｏ、　２〜５の各グループに、以下の投与スケジュールを利用した。

日　０　１　μｇ　毒素／動物〃　１６　５０　〃　〃　〃その後、各マウスは毎月５０μｇの毒素を５ケ月間受けた。

従ってこの実験期間中に各マウスの注射された毒素の量の合計は３４３．５μｇであった。コントロール動物も同じタイムスケジュールに従ったが、それらはグループ２及び３と同一のマンニトール及びＩＳＡの相対濃度を含むエハンの緩衝食塩水に希釈せしめたコントロール溶液０．５■ｌ／−匹を各時点にて受けた。

改与■夾二上背の中央の腰椎部に皮下的に投与。

奴−察不健康又は毒性の臨床徴候をコントロールし、そして毎日記録した。

生−１個体の体重を投与開始前及び各投与の後に記録した。

量笠跋襞５０Ｍｇ注射を開始してから６ケ月後、全てのマウスを殺し、そして解剖した。

組織学的調製品及び組織病理学検査のための組織を以下の器官から採取した；皮膚、だ液腺、気管、肺及び気管支、心臓及び大動脈、甲状腺、副甲状腺、食道、胃、十二指腸、斎場、回腸、盲腸、結腸、腸間膜のリンパ腺、肝臓、胆嚢、大腿筋、座骨神経、胸骨分節、胸腺、膵臓、膵臓、腎臓、副腎、膀胱、精嚢、前立腺、精巣、卵巣、子宮、脳、下垂体、目、を髄及び注射部。

藍−来検査の結果のそれぞれのデータを図３５−４１Ａに示した。

簸−呈真東微茨マウス、３０９号（オオクマハチ混合物）はこの実験期間の最後の２ケ月間、連続的に円運動するようになった。

マウス、２０３号（スズメハチ）はこの実験の終了１ケ月前の短い間、脱毛を伴った水腫状且つただれた前足を有した。

生−里　図３６−４０を参照のこと。

体重は投与の影響を受けなかった。

ｌ終跋襞杏■力射且ヱ膵臓はマウス３０４号（オオクマバチ混合物）において腹壁に、そしてマウス４０６号（スズメバチ科混合物）において膵臓に固く付着していた。マウス１０１号及び１０５号（ハチミツバチ）はそれぞれ固い、１ｍ１ｍ１の小塊をその肺に有していた。その他の顕著な肉眼的発見はできなかった。注射部位は膨潤又はその他の変化を伴うことなく、殺傷時のままであった。

顕徽鳳力五理！顕微鏡検査の結果を図４１及び４１Ａに示した。腸間膜のリンパ腺における反応性壊死が以下のマウスに見られた＝１１０号（ハチミツバチ）、３０７号及び３０８号（オオクマバチ混合物）、４０６及び４１０号（スズメバチ科混合物）。

マウス２１０号（スズメバチ）において、その腸間膜リンパ腺に中程度のリンパ球過形成が生していた。

マウス３１０号（オオクマバチ混合物）において、その膵臓に亜急性又は慢性細胞反応を伴う病巣壊死があった。マウス３０４号（オオクマバチ混合ＩＦＩ）において、膵臓から腹壁にかけての付着は慢性的な繊維形成によるものであり、そしてマウス４０６号（スズメバチ科混合物）における肺臓がら膵臓にかけての付着は慢性繊維形成によるものであり且つよ（血管化（ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ）されていることが見い出せた。

腸間膜リンパ腺及びＩｉＱ！臓における上記の変化は該毒素にょ肺において小さな腫腺が、マウス１０１号及び１０５号（ハチミツバチ）並びにマウス４０２号（スズメバチ混合物）において見られた。マウス４０７号（スズメバチ混合物）において、小さな結節性気管支上皮過形成が見られた。これらのタイプの変化は自発的に生じる。

コントロールマウス及びこれらの毒素の付与されたマウスにおいて、わずかな細胞浸潤物を有す肝実質細胞（ｈ　ｅ　ｐ　ａｔｉｃ　ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ　ｃｅｌｌｓ）の小さな壊死がしばしば見られた。更に、若干の慢性炎症変化が３匹のコントロールマウスにおける腎臓に見られた。

ローシャー　Ｒａｕｓｈｅｒ　白　マウスにおける生叉翌ローシャー白血病マウスは一般に認められている哺乳類のレトロウィルス感染症のモデルである。このウィルスはマウスに赤血球生成白血病を生じさせ、これは赤血球の生産の増大の指標としての肺臓のサイズの増大により示される。肺臓のサイズは感染動物の死を実質的にもたらす疾患の進行の測定として取られる。６個のＧｌｙの尾部を有すメリチン類似体の作用をこのシステムにおいて試験した。

メリチンの抗ウィルス作用の原理の試験をＢａ１ｂ　Ｃマウスで行った（生後１２週間；全で雄）。この動物をケージ当り４匹で飼育した。ローシャー白血球ウィルスによって、腹腔的注射によりこれらの動物を感染せしめ（−匹当り、０゜２ｍｌの容量において１０’個感染性粒子（ウィルス））、その１０分後に試験物質を皮下注射せしめた。これらの動物はコントロール（食塩水の疑似注射を受けたもの）又は試験動物（メリチン類似体を受けたもの）として２つのグループに分けた。

上記の通りに感染せしめたバルブＣマウスそれぞれ１６匹の２つのグループに、リン酸緩衝食塩水（２５■ＨのＫＨ２ＰＯ４，１５０ｍＭのＮａＣ１、ｐＨ７，８；ＰＢＳと称す）又はメリチン−６−ｇ１ｙ　（０，１ｍｌの容量において、５μｇ／体重ｗｇ）のいづれかを注射した。このペプチドは１１００ｕ／ｍｌとして溶解せしめ、そしてコントロール及び試験動物のそれぞれは皮下的に同容量（０，１ｍ１）のＰＢＳ又はＰＢＳ＋試験物質を注射された。この注射は、感染性ウィルスの注射の１０分後に行った。２日後、これらの動物は新たなるメリチン類似体（１０μｇ／体重量ｇ）又はＰＢＳの注射を、０゜１００１の皮下注射として受けた。最初の注射から４日後、２０μｇ／体重−ｇのメリチン類似体を用いて第３回目の注射を行った。全ての動物はメリチン類似体又はＰＢＳの注射によって影響を受けることはなく、そして注射の厳しい期間生存し続けた。

通常、感染マウスは２週間以内に１５０ｍｇ以上の重さの肺臓を生じせしめうる。このサイズは２．５ｇ迄大きくなることができる。正常な肺臓は小さくて０．１ｗｇ、太き（て０゜１５ｍｇであり、９５％のマウスがこの範囲内の肺臓を有す。

２週間後に１７０ｇ以上の＃臓を明らかな感染症として解釈し、正常値の上限値１５０１ｇと１７０ｍｇの間の肺臓をボーダーラインのケースとした。２週間後、コントロールグループにおいて試験した全ての動物は１５０ｔｍｇより大きい肺臓を示した。試験した動物のテストグループの２５％においても１５０−ｇ以上であるが１７０−ｇ以上の肺臓を示し、そしてこれらはボーダーラインケースとして考えられる。しかしながら、残りはｐＩ臓の増大の徴候を示さず、即ち、それは正常な動物としての１００〜１５０ｓ＋ｇ内であった。１匹の動物のみがコントロールグループにおける１００％と比較して病理的であった。

以下の考察が上記の実験から導かれる。

１、動物は、本特許明細書に詳細のインビトロ実験と匹敵する濃度におけるメリ千ン類体による処置に生存し続ける。

２、該メリチンＭｍ体は、哺乳類におけるレトロウィルスの発育を阻害する。なぜなら、比較処置したコントロールグループにおいて疾患は１００％発症したのと比べ、感染動物の７５％は疾患を発症せしめなかったからである。

３、ＨＩＶのみでなく、その他のレトロウィルスもメリチン及びその類億体により阻害される。

３二」１全体的な印象は、マウスは該４種の毒素、即ち、ハチミツバチ、スズメバチ、オオクマハチ混合物及びスズメバチ科混合物を少量の投与養生法において投与された場合にそれらに耐性であったことである。異常な肉眼的又は顕微鏡的変化は見い出せなかった。

初めに説明した通り、メリチンは哺乳類におけるＨＩＶｉ染症の治療を、おそらく主要ＨＩＶタンパク質の１つ、即ち、環タンパク質ＧＰ４１との相互作用によって提供すると考えられる。このことは、ＧＰ４１のトランスメンプラン領域とメリチンとの間の類似性により考えられ、そしてこのことは図５を参照することによって最もよくわかる。

図５において示す通り、ＧＰ４１は分子の膜結合部の顕著な特徴でありうる両親媒性部位を有する。ＧＰ４１の両親媒性部は荷電アミノ酸の交差ループを形成し、ここでこのループの二本の脚部はメリチンの重合体に関連する構造と類似する電荷中和構造を形成せしめる。メリチンはＧＰ４１による分子内電荷中和の正常なる形成も妨げ、これによってＣ，Ｐ４１の構造を大きく変化せしめる。このことはウィルスの形成に影響を及ぼし、その理由はウィルスの形成は基礎的なウィルス発芽プロセスを行えるようにするＧＰ４１とウィルスタンパク譬Ｐ１７の核との相互作用に依存すると考えられるからである。ウィルス、例えばＨＩＶは、ウィルスゲノムを含む細胞表層上の小さな膜芽（ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｂｕｄ）の形成を含むプロセスにより細胞から細胞へと広がるものと理解されている。このプロセスは細胞表層の変化に感受性であると考えられる０例えば、脂質成分の添加はを染細胞からのウィルスの遊離を妨げることがよく知られている。この作用はおそらく細胞股上のカオトロピック作用に基づく。しかしながら、この作用のメカニズムは未だ明確でない。

メリチンの相互作用を可能にするＧＰ４１の構造的な特徴はアミノ酸７７０〜８５６の間にあると考えられ、そしてここには７７０〜７９４及び８２４〜８５６の両親媒性配列が含まれる。図５を参照のこと、これらの配列の両親媒性は、低い全体的な疎水性と、組合さったそれらの高い疎水性運動により検出される。この二本の両親媒性脚部は分子力学によってモデル化され、そしてそれらはその両親媒性に基づいて相互作用することができ、これによってそれらはトランスメンブランループを形成することによって膜の中に侵入することが潜在的に可能となる。他方、それらは細胞膜の内部表層上に浮いていることもできる。どのケースにおいても、メリチンとの相互作用はＧＰ４１の細胞質部分の部位の位置を変化せしめ、これによってウィルス形成の重要な先駆体と考えられるｐ１７との相互作用を妨げる。これに関連して、メリチン及びＧＰ４１の両親媒性配列８２４〜８５６の間の興味ある類似性は、それらが共にその両親媒性ヘリックスにおいてプロリンを有することにある。この構造的な特徴は初めに説明した通り、このヘリックスに１２０’のねじれを導入せしめ、従ってそれらがわずかに折り曲った形を有することを引き起こさせる。他方、メリチンは膜と相互作用することができ、これによってカオトロピック剤として働きうる。このことも、その両親媒性的性質によるであろう。カオトロピック剤の作用は膜に並んでいるリン脂質の配列の乱れを引き起こすことにあると考えられる。このような作用は膜の相転移期における変化及びその後のそれらの厚みの変化を引き起こす。期待された通りの、メリチンの浮化がカオトロピック効果を引き起こす事実は驚くべきことではない。しかしながら、この現象がどのようにてウィルスの発芽プロセスに作用にするかは不明確であり、そして現在迄分っていない。しかしながら、大いなる抗ＨＩＶ作用の徴候又は変化が膜の脂質配列の並びにおいて生じた。更に、種々のリン脂質成分の添加も感染細胞からのＨＩＶの遊離を防いだ。しかしながらこの作用を引き起こす脂質分子を同定することはできていない。

ところでメリチンはリン脂質と相互作用することが知られ、そしてこの未Ｗｆ！認脂質分子のこの作用又はその結合はＨＩＶ遊離に関連するとも考えられ、これもメリチンの抗作用の説明を提供するであろう。おそらくこの脂質はリン脂質ではなく、その理由はリン脂質の添加はメリチンと非常に類似する作用を有すからである。

考察において、これらの試験結果はメリチンが二つの作用を有することを示唆する。即ち、メリチンはウィルスを不活性化せしめる短い第−期及び少なくともＰ２４の生産を低める長い第二期を有すと考えられる。これらの特徴はノリチン両親媒性ヘリックスの特異的な構造に起因するであろう。更に、この試験の情報は、尾部構造が類似体の有効性を決定するがその作用の性質は決定しないことを示唆する。即ち、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを先端に含む尾部を有す類似体の有効濃度は該尾部を有さないメリチンの有効濃度の約１００分の１である。上記の他、この試験結果は上滑液の感染性が低毒性濃度でのメリチンによる単独処理によって引き下げられることを示唆した。これに関して、この処理は培養を開始することであり、そして感染性の測定は処理の７日後である。前記した通り、この型の培養物における最大ウィルス濃度値は培養の５日後迄到達されなかった。

本発明者が上記より導くことができる考察は、処理７日後の低められているウィルス感染性がウィルスにおけるメリチンの直接的な作用にのみ基づくならば、メリチン又は活性フラグメントの効果が処理の５日後のような遅さで現れていることと理解されるであろう、この可能性はなく、その理由は本発明者はメリチンが培養の開始後数時間以内に細胞によって吸収されることを発見したからである。

更に、上滑液の感染性の低下が、ウィルスの不適切な集成又は新たに合成されるピリオンの破壊と対立して、低められたウィルス生産に部分的に基づくなら、このような現象においてこれは細胞内及び／又はメリチン処理培養物の上清液中における低められたウィルスタンパク質の量に反映されるべきである。この仮説が正しいかを調べるため、本発明者はウィルスのタンパク質生産に関するマーカーとしてＰ２４マーカーを選んだ。この試験データーは、メリチンとの３時間のインキュベーションにより、細胞及び上清液のＰ２４のあるにしてもほんのわずかな低下のみを示した。しかしながら、メリチンとの１４時間のインキュベーションによっては、細胞及び上滑液におけるＰ２４のめざましい低下が得られた（６０％迄の低下）。そして、細胞Ｐ２４は上清液Ｐ２４よりも早く且つより強く引き下げられると考えられる。更に、メリチンとの無細胞ＨＩ■のインキュベーションはＰ２４抗原の検出を弱めることはなかった。これはウィルスの感染性を引き下げることを引き起こすのみであると考えられる。

マウスにおけるインビトロ実験も実施した。

以下の考察が上記の実験から導かれる。

１、動物は、本特許明細書に詳細のインビトロ実験と対比する濃度におけるメリチン類体による処置に生存し続ける。

２、該メリチンＭ似体は、醋乳類におけるレトロウィルスの発育を阻害する。なぜなら、比較処置したコントロールグループにおいて疾患は１００％発症したのと比べ、感染動物の７５％は疾患を発症せしめなかったからである。

３、ＨＩＶのみでなく、その他のレトロウィルスもメリチン及びその類似体により阻害される。

本発明を最も実用的且つ好ましい態様において詳細してきたが、これらの改良を本発明の範囲を逸脱することなくなされることが理解できうる。

メリチン類似体−Ｌ１ｇ／ｍｌメリチン類位体−四／ｍ１ＧＰ４１のカルボキシ未頷領域のモデル・ん増殖〃感染中心値 °ん増殖が感染中心値 °入増殖 °／、惑染中心値 °人感染中心値１ °入増殖Ｍ惑染中心値 °ん増殖 γ・感染中心値６人　増５η °／、増殖〃増殖ス増殖 °４増殖細胞数に関連付けられたＰ２５生産率（ＯＣＴ、２５．１９９０）メリチンとの３ｈ及び１４ｈのインキュページジン後の細胞及び上清液中のＰ２４ＦＩＧ、４１　（その１）ＦＩＧ、４１　（その２）ＦＩＧ、４１（その３）ＦＩＧ、４１Ａ膜翅類毒素。長期毒性試験−マウス。

Ｆ　ｉ　ｇ、　４１．の解説１、　リンパ球細胞の病巣的な小さい堆積化。

２・　おそらく気管支上皮に由来する小さな種線。

３、　気管支上皮の小さな結Ｉ！ｆｆ過形成。

５・　多量の多形核の浸潤を有する病巣的な古めかしい壊死。

６、　多核性顆粒球の浸潤を伴う広範囲且つ不明瞭な壊死。

７、　中程度のリンパ系過形成。

８・　わずかな細胞浸潤を有する数個の肝細胞の壊死。

１０、若干の慢性腎孟腎炎。

１１・　腹壁への慢性繊維性付着。

１２・　膵臓への慢性繊維性付着及びよく血管化された付着。

利用したメリチン類似体及びその他のペプチド要　約　書哺乳類のＨＩＶ怒染細胞の増殖又は感染細胞におけるウィルスの複製を阻害する、哺乳類に低毒性有効投与量のメリチンを投与することを含む哺乳類ＨＩＶ感染症の治療のための方法及び組成物について開示する。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成４年６月５日

Claims

【特許請求の範囲】

１．哺乳類におけるＨＩＶ感染症の治療のための方法であって：該哺乳類に低毒性有効投与量のメリチンを投与せしめ、これにより、該哺乳類のＨＩＶ感染細胞におけるウイルス複製が阻害されることを含んで成る方法。
２．哺乳類におけるＨＩＶ感染症の治療のための方法であって：該哺乳類に低毒性有効投与量のメリチンの構造類似体を投与せしめ、これにより、該哺乳類のＨＩＶ感染細胞におけるウイルス複製が阻害されることを含んで成る方法。
３．哺乳類におけるＨＩＶ感染症の治療のための方法であって：該哺乳類に低毒性有効投与量のメリチン及びその構造類似体のポリペプチド混合物を投与せしめ、これにより、該哺乳類のＨＩＶ感染細胞におけるウイルス複製が阻害されることを含んで成る方法。
４．哺乳類におけるＨＩＶ感染症の治療のための方法であって：該哺乳類に、少なくとも１種類の膜翅類毒素、少なくとも１種類の膜翅類毒素の活性タンパク質成分、少なくとも１種類の膜翅類毒素のポリペプチド成分、及びその混合物より成る群から選ばれる薬剤を低毒性有効投与量で投与せしめ、これにより、哺乳類のＨＩＶ感染細胞におけるウイルス複製が阻害されることを含んで成る方法。
５．前記の薬剤がメリチンである、請求項４に記載の方法。
６．前記の薬剤が：ハチミツ毒素、マルハナバチ毒素、スズメバチ毒素、ボールドフェースオオクマバチ毒素、該毒素の活性タンパク質成分、該毒素の活性タンパク質成分、及びその混合物、より実質的になる群より選ばれる、請求項４に記載の方法。
７．前記のメリチンの構造類似体が、連結している細胞結合性配列を有する又は有さない両親媒性αヘリックスを含む、請求項２に記載の方法。
８．前記のメリチンの構造類似体が、【配列があります】である、請求項２に記載の方法。
９．前記のポリペプチド混合物がメリチン及びその構造類似体【配列があります】を含む、請求項３に記載の方法。
１０．哺乳類におけるＨＩＶ感染症の治療のための方法であって：該哺乳類に低毒性有効投与量のメリチンを投与せしめ、これにより該哺乳類におけるＨＩＶ感染細胞の増殖が阻害されることを含んで成る方法。
１１．哺乳類におけるＨＩＶ感染症の治療のための方法であって：該哺乳類に低毒性有効投与量のメリチンの構造類似体を投与せしめ、これにより該哺乳類におけるＨＩＶ感染細胞の増殖が阻害されることを含んで成る方法。
１２．前記の構造類似体がＡｍｆｉ１及びメリチン様のＧＰ４１のペプチドである、請求項１１に記載の方法。
１３．前記の構造類似体がＡｍｆｉ２及びメリチン様のＧＰ４１のペプチドである、請求項１１に記載の方法。
１４．哺乳類におけるＨＩＶ感染症の治療のための方法であって：該哺乳類に低毒性有効投与量のメリチン及びその構造類似体のポリペプチド混合物を投与せしめ、これにより、ＨＩＶ感染細胞の増殖が阻害されることを含んで成る方法。
１５．哺乳類におけるＨＩＶ感染症の治療のための方法であって：該哺乳類に、少なくとも１種類の膜翅類毒素、少なくとも１種類の膜翅類毒素の活性タンパク質成分、少なくとも１種類の膜翅類毒素のポリペプチド成分、及びその混合物より成る群から選ばれる薬剤を低毒性有効投与量で投与せしめ、これにより、哺乳類におけるＨＩＶ感染細胞の増殖が低められる、又は阻害されることを含んで成る方法。
１６．前記の薬剤がメリチンである、請求項１５に記載の方法。
１７．前記の薬剤が：ハチミツ毒素、マルハナバチ毒素、スズメバチ毒素、ボールドフェースオオクマバチ毒素、該毒素の活性タンパク質成分、該毒素の活性タンパク質成分、及びその混合物、より実質的になる群より選ばれる、請求項１５に記載の方法。
１８．前記のメリチンの構造類似体が、連結している細胞結合性配列を有する又は有さない両親媒性αヘリックスを含む、請求項１１に記載の方法。
１９．前記のメリチンの構造類似体が、【配列があります】である、請求項１１に記載の方法。
２０．前記のポリペプチド混合物がメリチン及びその構造類似体【配列があります】を含む、請求項１４に記載の方法。
２１．哺乳類におけるレトロウイルス感染症の治療のための方法であって：該哺乳類に低毒性有効投与量のメリチンを投与せしめ、これにより、該哺乳類のレトロウイルス感染細胞におけるウイルス複製が阻害されることを含んで成る方法。
２２．哺乳類におけるレトロウイルス感染症の治療のための方法であって：該哺乳類に低毒性有効投与量のメリチンの構造類似体を投与せしめ、これにより、該哺乳類のレトロウイルス感染細胞におけるウイルス複製が阻害されることを含んで成る方法。
２３．哺乳類におけるレトロウイルス感染症の治療のための方法であって：該哺乳類に低毒性有効投与量のメリチン及びその構造類似体のポリペプチド混合物を投与せしめ、これにより、該哺乳類のレトロウイルス感染細胞におけるウイルス複製が阻害されることを含んで成る方法。
２４．哺乳類におけるＨＩＶ感染症の治療のための方法であって：該哺乳類に、少なくとも１種類の膜翅類毒素、少なくとも１種類の膜翅類毒素の活性タンパク質成分、少なくとも１種類の膜翅類毒素のポリペプチド成分、及びその混合物より成る群から選ばれる薬剤を低毒性有効投与量で投与せしめ、これにより、哺乳類のレトロウイルス感染細胞におけるウイルス複製が低められる又は阻害されることを含んで成る方法。
２５．前記の薬剤がメリチンである、請求項２４に記載の方法。
２６．前記の薬剤が：ハチミツ毒素、マルハナバチ毒素、スズメバチ毒素、ポールドフェースオオクマバチ毒素、該毒素の活性タンパク質成分、該毒素の活性タンパク質成分、及びその混合物、より実質的になる群より選ばれる、請求項２４に記載の方法。
２７．前記のメリチンの構造類似体が、細胞結合性配列に連結している、又は連結していない両親媒性αヘリックスを含む、請求項２２に記載の方法。
２８．前記のメリチンの構造類似体が、【配列があります】である、請求項２２に記載の方法。
２９．前記のポリペプチド混合物がメリチン及びその構造類似体【配列があります】を含む、請求項２３に記載の方法。
３０．哺乳類におけるレトロウイルス感染症の治療のための方法であって：該哺乳類に低毒性有効投与量のメリチンを投与せしめ、これにより、該哺乳類におけるレトロウイルス感染細胞の増殖が阻害されることを含んで成る方法。
３１．哺乳類におけるレトロウイルス感染症の治療のための方法であって：該哺乳類に低毒性有効投与量のメリチンの構造類似体を投与せしめ、これにより、該哺乳類におけるレトロウイルス感染細胞の増殖が阻害されることを含んで成る方法。
３２．前記の構造類似体がＡｍｆｉ１及びメリチン様のＧＰ４１のペプチドである、請求項３１に記載の方法。
３３．前記の構造類似体がＡｍｆｉ２及びメリチン様のＧＰ４１ペプチドである、請求項３１に記載の方法。
３４．哺乳類におけるレトロウイルス感染症の治療のための方法であって：該哺乳類に低毒性有効投与量のメリチン及びその構造類似体のポリペプチド混合物を投与せしめ、これにより、レトロウイルス感染細胞の増殖が阻害されることを含んで成る方法。
３５．哺乳類におけるレトロウイルス感染症の治療のための方法であって：該哺乳類に、少なくとも１種類の膜翅類毒素、少なくとも１種類の膜翅類毒素の活性タンパク質成分、少なくとも１種類の膜翅類毒素のポリペプチド成分、及びその混合物より成る群から選ばれる薬剤を低毒性有効投与量で投与せしめ、これにより、該哺乳類におけるレトロウイルス感染細胞の増殖が低められる又は阻害されることを含んで成る方法。
３６．前記の薬剤がメリチンである、請求項３５に記載の方法。
３７．前記の薬剤が：ハチミツ毒素、マルハナバチ毒素、スズメバチ毒素、ボールドフェースオオクマバチ毒素、該毒素の活性タンパク質成分、該毒素の活性タンパク質成分、及びその混合物、より実質的になる群より選ばれる、請求項３５に記載の方法。
３８．前記のメリチンの構造類似体が、連結している細胞結合性配列を有する又は有さない両親媒性αヘリックスを含む、請求項３１に記載の方法。
３９．前記のメリチンの構造類似体が、【配列があります】である、請求項３１に記載の方法。
４０．前記のポリペプチド混合物がメリチン及びその構造類似体【配列があります】を含む、請求項３４に記載の方法。