JPH02275824A - 抗ｈｉｖ剤 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は新規な抗ＨＩ Ｖ（ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏ−ｄｅｆｌｃｉｅｎｃｙ ｖ（ｒｕｓ）剤に関するも
のである。
ｏ−ｄｅｆｌｃｉｅｎｃｙ ｖ（ｒｕｓ）剤に関するも
のである。
（従来の技術及び発明が解決しようとする課題）後天性
免疫不全症候群（ａｃｑｕｌｒｅｄ ｊｍｍｕｎｏ−
ａｅｒ＋ｃ＋ｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ；以下エイズ
という）の病原ウィルスがＨＩＶであるということが判
明して以来、該ウィルスについて分子生物学及び生化学
的研究等が精力的に行われた結果、ウィルスそのもの、
或いはウィルスの細胞への感染の機構が次第に解明され
つつある。生体内でのＨＩＶの感染経路として、血中に
放出されたＨＩＶが直接標的Ｔ細胞に結合する感染経路
、及びＨＩＶに感染した細胞が非感染細胞に結合し巨細
胞を形成しながら感染していく経路との２つが報告され
ている（ウェーバ−１Ｊ、Ｎ、及びライス、Ｒ，Ａ、：
（１９８８）、サイエンス（Ｓｃｌｅｎｔｌｆｌｃ Ａ
ｍ５ｒｌｃａｎ）日本開板、刊、Ｎｏ、１２． Ｈ−９
５）。しかしながら現在までのところエイズに対しては
有効な治療法がなく、発病した患者は殆ど全てが死亡す
るに至っている。そこでＨＩＶに感染したエイズ患者の
治療に有効な抗ＨＩＶ剤を求めて、世界各国で精力的な
研究がなされている。
免疫不全症候群（ａｃｑｕｌｒｅｄ ｊｍｍｕｎｏ−
ａｅｒ＋ｃ＋ｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ；以下エイズ
という）の病原ウィルスがＨＩＶであるということが判
明して以来、該ウィルスについて分子生物学及び生化学
的研究等が精力的に行われた結果、ウィルスそのもの、
或いはウィルスの細胞への感染の機構が次第に解明され
つつある。生体内でのＨＩＶの感染経路として、血中に
放出されたＨＩＶが直接標的Ｔ細胞に結合する感染経路
、及びＨＩＶに感染した細胞が非感染細胞に結合し巨細
胞を形成しながら感染していく経路との２つが報告され
ている（ウェーバ−１Ｊ、Ｎ、及びライス、Ｒ，Ａ、：
（１９８８）、サイエンス（Ｓｃｌｅｎｔｌｆｌｃ Ａ
ｍ５ｒｌｃａｎ）日本開板、刊、Ｎｏ、１２． Ｈ−９
５）。しかしながら現在までのところエイズに対しては
有効な治療法がなく、発病した患者は殆ど全てが死亡す
るに至っている。そこでＨＩＶに感染したエイズ患者の
治療に有効な抗ＨＩＶ剤を求めて、世界各国で精力的な
研究がなされている。
これまでに止車されている抗ＨＩＶ剤としてはアジドチ
ミジン（３’−ａｚｌｄｏ−２ ’ 、３ ’−ｄ Ｉ
ｄｅｏｘｙ−ｔｈｙｍｌｄｌｎｅｉ以下ＡＺＴという）
が存在するのみであるが（Ｍｌｔｓｕｙａ、Ｈ，ａｔ
ａｔ、二（１９＋１５） Ｐｒｏｃ。
ミジン（３’−ａｚｌｄｏ−２ ’ 、３ ’−ｄ Ｉ
ｄｅｏｘｙ−ｔｈｙｍｌｄｌｎｅｉ以下ＡＺＴという）
が存在するのみであるが（Ｍｌｔｓｕｙａ、Ｈ，ａｔ
ａｔ、二（１９＋１５） Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ１．ＵＳＡ、 ８２．７
０９８−７１００）、ＡＺＴは副作用として著明な骨髄
抑制作用があり、長期の投与には問題があるとされてい
る（ ＲＩｃｈｍａｎｎ 。
０９８−７１００）、ＡＺＴは副作用として著明な骨髄
抑制作用があり、長期の投与には問題があるとされてい
る（ ＲＩｃｈｍａｎｎ 。
Ｄ、Ｄ、 ａｔ ａｌ、： （１９Ｂ？） Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇ、 Ｊ、 Ｍｅｄ、、 ３１７゜１８５−１９１）
。
ｎｇ、 Ｊ、 Ｍｅｄ、、 ３１７゜１８５−１９１）
。
ＡＺＴは２’、３’−ジデオキシヌクレオシド（２′。
３ξｄｌｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｌｄｅ）の誘導体で
ある。このような構造を有する抗ＨＩＶ剤としては現在
臨床試験中のジデオキシシチジン（２’ 、３ ’−ｄ
ｌｄｅｏｘｙｃｙｔｌ’ｄｌｎｅ）がある。特開昭６３
−１０７９２４記載のピリミジンヌクレオシドの誘導体
や特開昭６３−１０７９３Ｇ記載のプリンヌクレオシド
の誘導体も２°、３Ｔ−ジデオキシヌクレオシドの誘導
体である。
ある。このような構造を有する抗ＨＩＶ剤としては現在
臨床試験中のジデオキシシチジン（２’ 、３ ’−ｄ
ｌｄｅｏｘｙｃｙｔｌ’ｄｌｎｅ）がある。特開昭６３
−１０７９２４記載のピリミジンヌクレオシドの誘導体
や特開昭６３−１０７９３Ｇ記載のプリンヌクレオシド
の誘導体も２°、３Ｔ−ジデオキシヌクレオシドの誘導
体である。
この他に可溶性ＣＤ４や硫酸デキストランも有力な抗Ｈ
ＩＶ剤として臨床試験が続けられている。
ＩＶ剤として臨床試験が続けられている。
ＣＤ４はＨＩＶが主要な標的とするヘルパーＴ細胞表面
に特に大量に存在している糖蛋白質であって、ＨＩｖ粒
子上のｇｐ１２Ｑと呼ばれる糖蛋白質がＣＤ４に強く結
合することによってＨＩＶがヘルパーＴ細胞に感染する
。可溶性ＣＤ４の投与により、ＨＩＶのｇｐ１２０がこ
の外来の可溶性のＣＤ４で占有され、ＨＩＶがヘルパー
Ｔ細胞上のＣＤ４と結合して感染が成立することが妨げ
られる。
に特に大量に存在している糖蛋白質であって、ＨＩｖ粒
子上のｇｐ１２Ｑと呼ばれる糖蛋白質がＣＤ４に強く結
合することによってＨＩＶがヘルパーＴ細胞に感染する
。可溶性ＣＤ４の投与により、ＨＩＶのｇｐ１２０がこ
の外来の可溶性のＣＤ４で占有され、ＨＩＶがヘルパー
Ｔ細胞上のＣＤ４と結合して感染が成立することが妨げ
られる。
硫酸デキストランは以前から抗血液凝固剤やコレステロ
ール降下剤として用いられて来たものであるが、ＨＩＶ
の感染と複製を抑制する効果を持つようになることが判
明してから（Ｊｐｎ、 Ｊ。
ール降下剤として用いられて来たものであるが、ＨＩＶ
の感染と複製を抑制する効果を持つようになることが判
明してから（Ｊｐｎ、 Ｊ。
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、 （１９Ｂ？） ７８．１１８
４−１１８８）注目されるようになった。しかし硫酸デ
キストランには肝障害の副作用がある。又抗血液凝固作
用をもつためにエイズ患者の中で血友病患者には投与で
きないという欠点がある。
４−１１８８）注目されるようになった。しかし硫酸デ
キストランには肝障害の副作用がある。又抗血液凝固作
用をもつためにエイズ患者の中で血友病患者には投与で
きないという欠点がある。
（課題を解決するための手段）
本願発明者らは新規な抗ＨＩＶ剤として有用な物質を開
発すべく研究を重ねた結果、血漿蛋白質の構成アミノ酸
残基の側鎖官能基を化学修飾してその電荷の極性を負へ
と変化させたところ、該化学修飾血漿蛋白質がＨＩＶ感
染細胞とＨＩＶ未感染細胞とが融合して生じる巨細泡形
成による細胞変性致死を阻止し、しかもＩｎ ＶｌｖＯ
及びＩｎ ｖｌｔｒｏで毒性が極めて少ない利点を有し
ていることを見い出し、該化学修飾血漿蛋白質を優れた
抗ＨＩＶ剤として使用し得ることを発見した。
発すべく研究を重ねた結果、血漿蛋白質の構成アミノ酸
残基の側鎖官能基を化学修飾してその電荷の極性を負へ
と変化させたところ、該化学修飾血漿蛋白質がＨＩＶ感
染細胞とＨＩＶ未感染細胞とが融合して生じる巨細泡形
成による細胞変性致死を阻止し、しかもＩｎ ＶｌｖＯ
及びＩｎ ｖｌｔｒｏで毒性が極めて少ない利点を有し
ていることを見い出し、該化学修飾血漿蛋白質を優れた
抗ＨＩＶ剤として使用し得ることを発見した。
化学修飾する血漿蛋白質としては、ヒト由来の血漿蛋白
質、例えば上記のヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブ
リン、ヒトトランスフェリン或いはヒトフィブリノーゲ
ン等が抗原性の面から好ましいと考えられる。これらの
他にウシ血漿蛋白質も本発明における化学修飾の対象と
して使用され得る。
質、例えば上記のヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブ
リン、ヒトトランスフェリン或いはヒトフィブリノーゲ
ン等が抗原性の面から好ましいと考えられる。これらの
他にウシ血漿蛋白質も本発明における化学修飾の対象と
して使用され得る。
化学修飾試薬としては、血漿蛋白質の構成アミノ酸残基
のアミノ基の電荷の極性を正から負へ変化させるものと
して、無水ジカルボン酸、無水トリカルボン酸或いはア
ルデヒド基を有する燐酸エステル等が用いられる。無水
ジカルボン酸としては好ましくは無水マレイン酸や無水
コＩ＼り酸等が用いられる。アルデヒド基を有する燐酸
エステルとしては好ましくはピリドキサル燐酸が用いら
れる。血漿蛋白質の構成アミノ酸残基のチオール基の電
荷の極性を中性から負へ変化させるものとして、四チオ
ン酸化合物、好ましくは四チオン酸ナトリウムが用いら
れる。
のアミノ基の電荷の極性を正から負へ変化させるものと
して、無水ジカルボン酸、無水トリカルボン酸或いはア
ルデヒド基を有する燐酸エステル等が用いられる。無水
ジカルボン酸としては好ましくは無水マレイン酸や無水
コＩ＼り酸等が用いられる。アルデヒド基を有する燐酸
エステルとしては好ましくはピリドキサル燐酸が用いら
れる。血漿蛋白質の構成アミノ酸残基のチオール基の電
荷の極性を中性から負へ変化させるものとして、四チオ
ン酸化合物、好ましくは四チオン酸ナトリウムが用いら
れる。
化学修飾反応条件は、抗ＨＩＶ作用を育する化学修飾血
漿蛋白質を得ることが目的であって、血漿蛋白質を前記
各修飾試薬と公知の方法と反応条件で反応させ、血漿蛋
白質の構成アミノ酸残基のアζノ基若しくはチオール基
を化学修飾してその電荷の極性を正若しくは中性から負
へと変化させるものであればよく、修飾されるアミノ基
若しくはチオール基の数や一次構造上の位置に厳密な制
限はない。又化学修飾において副反応としてアミノ基若
しくはチオール基以外の側鎖官能基の一部が化学修飾さ
れたものであっても、それが本発明の抗ＨＩＶ作用を有
する限り、本発明に包含されるものであることは前記反
応条件から明らかである。
漿蛋白質を得ることが目的であって、血漿蛋白質を前記
各修飾試薬と公知の方法と反応条件で反応させ、血漿蛋
白質の構成アミノ酸残基のアζノ基若しくはチオール基
を化学修飾してその電荷の極性を正若しくは中性から負
へと変化させるものであればよく、修飾されるアミノ基
若しくはチオール基の数や一次構造上の位置に厳密な制
限はない。又化学修飾において副反応としてアミノ基若
しくはチオール基以外の側鎖官能基の一部が化学修飾さ
れたものであっても、それが本発明の抗ＨＩＶ作用を有
する限り、本発明に包含されるものであることは前記反
応条件から明らかである。
なお、修飾試薬として無水ジカルボン酸を使用した場合
、修飾部位は式−ＮＨＣＯＲＣＯＯｏ（ここでＲは有機
基を示す）で示される構造を、修飾試薬としてアルデヒ
ド基を持つ燐酸エステルを使用し、その後還元反応を行
った場合、修飾部位は式−ＮＨＣＨ＊ＲＯＰＯｓ−（こ
こでＲは有機基を示す）で示される構造を、修飾試薬と
して四チオン酸化合物を用いた場合、修飾部位は式−５
−Ｓ−８Ｏｓ−で示される構造（即ちＳ−スルフェニル
スルホン酸残基）を、それぞれ有する。
、修飾部位は式−ＮＨＣＯＲＣＯＯｏ（ここでＲは有機
基を示す）で示される構造を、修飾試薬としてアルデヒ
ド基を持つ燐酸エステルを使用し、その後還元反応を行
った場合、修飾部位は式−ＮＨＣＨ＊ＲＯＰＯｓ−（こ
こでＲは有機基を示す）で示される構造を、修飾試薬と
して四チオン酸化合物を用いた場合、修飾部位は式−５
−Ｓ−８Ｏｓ−で示される構造（即ちＳ−スルフェニル
スルホン酸残基）を、それぞれ有する。
以下、本発明の好ましい態様について詳しく説明する。
本発明の化学修飾血漿蛋白質の製造方法について述べる
と、マレイル化については、例えばＢｕｔｌａｒ、 Ｐ
、 Ｊ、 Ｇ、 ａｎｄ Ｈａｒｔｌｅｙ、 Ｂ、 Ｓ
、： （１９７２）Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ、、
２５．１９１−１！１９に、スクシニル化については
、例えばＨａｂｅｅｂ＋ Ａ、 Ｆ、 Ｓ、 Ａ、 ｅ
ｔ ａｌ。
と、マレイル化については、例えばＢｕｔｌａｒ、 Ｐ
、 Ｊ、 Ｇ、 ａｎｄ Ｈａｒｔｌｅｙ、 Ｂ、 Ｓ
、： （１９７２）Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ、、
２５．１９１−１！１９に、スクシニル化については
、例えばＨａｂｅｅｂ＋ Ａ、 Ｆ、 Ｓ、 Ａ、 ｅ
ｔ ａｌ。
：（１９５８） Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、
Ａｃｔａ、 ２９．５８７に、アルデヒド基を持つ燐
酸エステルによる燐酸基の付加については、例えばＫｉ
ｒｔｌｅｙ、 Ｍ、 Ｅ、 ａｎｄ Ｋｏｓｈｌａｎｄ
Ｊｒ、、 Ｄ、 Ｅ、 ：（１９７２） Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ、。
Ａｃｔａ、 ２９．５８７に、アルデヒド基を持つ燐
酸エステルによる燐酸基の付加については、例えばＫｉ
ｒｔｌｅｙ、 Ｍ、 Ｅ、 ａｎｄ Ｋｏｓｈｌａｎｄ
Ｊｒ、、 Ｄ、 Ｅ、 ：（１９７２） Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ、。
２６．５８８−５８９に、血漿蛋白質構成アミノ酸残基
のチオール基のＳ−スルフェニルスルホン酸残基への変
化については、例えばＰｉｈｌ、 Ａ、、 Ｌａｎｇｅ
、 Ｒ，：（１９６２） Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ
、、 ２３７．１３５６やＰａｒｋｅｒ、 Ｄ。
のチオール基のＳ−スルフェニルスルホン酸残基への変
化については、例えばＰｉｈｌ、 Ａ、、 Ｌａｎｇｅ
、 Ｒ，：（１９６２） Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ
、、 ２３７．１３５６やＰａｒｋｅｒ、 Ｄ。
Ｊ、、 Ａ１１ｉｓｏｎ、 ’Ｉｆ、 Ｓ、：（１９６
９） Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、２４４゜１８０
に記載の方法をそれぞれ使用し得る。具体的には、マレ
イル化血漿蛋白質は弱アルカリ性溶液中で血漿蛋白質と
無水マレイン酸とを反応させることによって、またスク
シニル化血漿蛋白質は弱アルカリ性溶液中で血漿蛋白質
と無水コハク酸とを反応させることによって、燐酸基の
付加された血漿蛋白質はｐＨ３〜１０の溶液中で血漿蛋
白質とピリドキナル５゛−燐酸とを反応させた後、Ｎａ
ＢＨ４等の還元剤で還元することによって、チオール基
をＳ−スルフェニルスルホン酸残基に変化させるには、
弱アルカリ性溶液中で血漿蛋白質と四チオン酸ナトリウ
ムとを反応させることによって得ることができる。
９） Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、２４４゜１８０
に記載の方法をそれぞれ使用し得る。具体的には、マレ
イル化血漿蛋白質は弱アルカリ性溶液中で血漿蛋白質と
無水マレイン酸とを反応させることによって、またスク
シニル化血漿蛋白質は弱アルカリ性溶液中で血漿蛋白質
と無水コハク酸とを反応させることによって、燐酸基の
付加された血漿蛋白質はｐＨ３〜１０の溶液中で血漿蛋
白質とピリドキナル５゛−燐酸とを反応させた後、Ｎａ
ＢＨ４等の還元剤で還元することによって、チオール基
をＳ−スルフェニルスルホン酸残基に変化させるには、
弱アルカリ性溶液中で血漿蛋白質と四チオン酸ナトリウ
ムとを反応させることによって得ることができる。
このようにして得たマレイル化、スクシニル化燐酸基付
加又はチオール基がＳ−スルフェニルスルホン酸残基に
変化した血漿蛋白質は、血中に放出されたＨＩＶの直接
標的細胞への結合及びＨＩＶに感染した細胞と非感染細
胞との融合により生じる巨大細胞形成を顕著に阻書する
。
加又はチオール基がＳ−スルフェニルスルホン酸残基に
変化した血漿蛋白質は、血中に放出されたＨＩＶの直接
標的細胞への結合及びＨＩＶに感染した細胞と非感染細
胞との融合により生じる巨大細胞形成を顕著に阻書する
。
本発明に係る抗ＨＩＶ剤の有効成分マレイル化血漿蛋白
質、スクシニル化血漿蛋白質、燐酸基付加血漿蛋白質、
若しくは構成アミノ酸残基のチオール基がＳ−スルフェ
ニルスルホン酸残基に変化した血漿蛋白質の患者への投
与量は、症杖の軽重や患者の年齢、性別、これら化学修
飾血漿蛋白質に対する忍容性などにより異なるが、通常
成人１日当たり１０μｇ〜１０ ｇであり、これを１回
或いは何回かに分けて投与する。本発明の抗ＨＩＶ剤は
単独で用いてもよく、他の抗ＨＩＶ剤と併用して投与し
てもよい。
質、スクシニル化血漿蛋白質、燐酸基付加血漿蛋白質、
若しくは構成アミノ酸残基のチオール基がＳ−スルフェ
ニルスルホン酸残基に変化した血漿蛋白質の患者への投
与量は、症杖の軽重や患者の年齢、性別、これら化学修
飾血漿蛋白質に対する忍容性などにより異なるが、通常
成人１日当たり１０μｇ〜１０ ｇであり、これを１回
或いは何回かに分けて投与する。本発明の抗ＨＩＶ剤は
単独で用いてもよく、他の抗ＨＩＶ剤と併用して投与し
てもよい。
投与方法は主として静脈注射による。
製剤化に際しては周知慣用の方法により製薬用の担体や
補助剤を用いて注射剤等を調製すればよい。すなわち必
要に応じて有効成分とｐＨＥＩｉ街剤、可溶化剤、防腐
剤、安定化剤等を混合して調製する。
補助剤を用いて注射剤等を調製すればよい。すなわち必
要に応じて有効成分とｐＨＥＩｉ街剤、可溶化剤、防腐
剤、安定化剤等を混合して調製する。
本発明に係る化学修飾血漿蛋白質の製造例をマレイル化
ヒト血清アルブミンを例として記す。
ヒト血清アルブミンを例として記す。
（製造例）
製造方法は、パトラ−らの方法（Ｂｕｔｌｅｒ、 Ｐ。
Ｊ、 Ｇ、 ａｎｄ ＨａｒｔｌｅＦ＋ Ｂ、 Ｓ、：
（１９７２） ＭｅｔｈｏｄＥｎｚｙ＋＋ｏ１．、２
５．１９１−１９９）に従った。
（１９７２） ＭｅｔｈｏｄＥｎｚｙ＋＋ｏ１．、２
５．１９１−１９９）に従った。
３０Ｇ−ｇのヒト血清アルブミン（シグマ社製、Ｎｏ。
Ａ ８７１ｉ３）を塩酸でｐＨ８，５に調整した０、２
Ｍ Ｎａ＊Ｂ４０↑溶液３（Ｈｔｅに溶解した。次に
無水マレイン酸粉末をこの溶液３Ｑｆｆｉｌに対して最
終濃度が０．１間になるように少しづつ加えた。この間
Ｎａ１ＣＯ１粉末を加えることにより、上記溶液のｐＢ
が８．５以下に下がらないように維持した。以上は全て
室温で行った。次いで反応溶液を０．ＩＭ ＮａＨＣＯ
ｓ ３）に対して２回、続いて蒸留水３Ｉに対して１回
、更に０゜０１Ｍ Ｎ■ａ ＨＣＯど３１に対して２回
、４℃で十分に透析した。
Ｍ Ｎａ＊Ｂ４０↑溶液３（Ｈｔｅに溶解した。次に
無水マレイン酸粉末をこの溶液３Ｑｆｆｉｌに対して最
終濃度が０．１間になるように少しづつ加えた。この間
Ｎａ１ＣＯ１粉末を加えることにより、上記溶液のｐＢ
が８．５以下に下がらないように維持した。以上は全て
室温で行った。次いで反応溶液を０．ＩＭ ＮａＨＣＯ
ｓ ３）に対して２回、続いて蒸留水３Ｉに対して１回
、更に０゜０１Ｍ Ｎ■ａ ＨＣＯど３１に対して２回
、４℃で十分に透析した。
ｊｆ１４ｆｆ終了俊、透終了液を凍結乾燥ｆｉ （Ｌａ
ｂｅＯｒｌＣａ社製、スペースセーパデラックス７５０
３５）によって凍結乾燥してマレイル化ヒト血清アルブ
ミン（以下Ｍ−ＩＳＡという）の最終粉末標品を得た。
ｂｅＯｒｌＣａ社製、スペースセーパデラックス７５０
３５）によって凍結乾燥してマレイル化ヒト血清アルブ
ミン（以下Ｍ−ＩＳＡという）の最終粉末標品を得た。
こうして得られたＭ−ＩＳＡは以下の物性を示す。
■分子量
分子量は、最終製品を８％５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって測定すると約ｓｏ、ｏｏｏである
。
ゲル電気泳動によって測定すると約ｓｏ、ｏｏｏである
。
■溶解性
水に可溶である。
■紫外部吸収
本物質の紫外部吸収を測定すると、未修飾ヒト血清アル
ブミン（以下Ｈ８Ａという）に比べて、２５０ ｎｍ付
近に吸収の増加が見られる。
ブミン（以下Ｈ８Ａという）に比べて、２５０ ｎｍ付
近に吸収の増加が見られる。
本製造例で得られたＭ−ＩＳＡのマレイル化率を無処理
のＩＳＡを対照として、未修飾アミノ基の量から計算し
たところ、約９０％であった。なおアミノ基の量の測定
はフィールズの方法（Ｆｉｅｌｄｓ。
のＩＳＡを対照として、未修飾アミノ基の量から計算し
たところ、約９０％であった。なおアミノ基の量の測定
はフィールズの方法（Ｆｉｅｌｄｓ。
Ｒ，： （１９〕２） Ｎａｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、、 ２５． ４８４−４１１ｉ８）によっ
た。
ｙｍｏｌ、、 ２５． ４８４−４１１ｉ８）によっ
た。
（実施例）
以下に本発明の実施例を示すが、ＨＩＶに感染・発症す
る適当な実験動物系が存在しないので、抗ＨＩＶ側作用
に関する実験はＩｎマｔｗｏの系では困難であるため、
以下の実施例においては培養細胞を用いたＩｎ ｖｌｔ
ｒｏの系で行った。
る適当な実験動物系が存在しないので、抗ＨＩＶ側作用
に関する実験はＩｎマｔｗｏの系では困難であるため、
以下の実施例においては培養細胞を用いたＩｎ ｖｌｔ
ｒｏの系で行った。
まず実施例で使用した細胞系、アッセイ方法、試薬及び
本発明に係る各種化学修飾血漿蛋白質ｐ抗ＨＩＶ効果の
評価方法について記載する。
本発明に係る各種化学修飾血漿蛋白質ｐ抗ＨＩＶ効果の
評価方法について記載する。
実施例１〜３で用いた細胞株は、ヒト急性白血病細胞株
Ｍｏ１ｔ−４の旧Ｖ持続感染細胞株Ｍｏ１ｔ−４／旧Ｖ
（Ｙａｍａｍｏｔｏ、 Ｎ、 ａｔ ｍｌ、：
（１９８５） Ｉｎｔ、 Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ
３６、４４５−４５１）及び旧Ｖに対して感受性の高い
細胞株Ｍｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ＋８ （Ｙ
ａｍａｗｏｔｏ、 Ｎ、 ｅｔ ａｌ、：（１９
８Ｂ） Ｊ、 Ｖｌｒｏｌ、 ５７．１１５！ｌ−１１
８２）である。これらの細胞株Ｍｏ１ｔ−４／ＨＩＶ及
びＭｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、８は山口大学医学
部の山本直樹博士より分与されたものである。
Ｍｏ１ｔ−４の旧Ｖ持続感染細胞株Ｍｏ１ｔ−４／旧Ｖ
（Ｙａｍａｍｏｔｏ、 Ｎ、 ａｔ ｍｌ、：
（１９８５） Ｉｎｔ、 Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ
３６、４４５−４５１）及び旧Ｖに対して感受性の高い
細胞株Ｍｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ＋８ （Ｙ
ａｍａｗｏｔｏ、 Ｎ、 ｅｔ ａｌ、：（１９
８Ｂ） Ｊ、 Ｖｌｒｏｌ、 ５７．１１５！ｌ−１１
８２）である。これらの細胞株Ｍｏ１ｔ−４／ＨＩＶ及
びＭｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、８は山口大学医学
部の山本直樹博士より分与されたものである。
培養液の組成はＲＰＭＩ−１［ｆ４０にウシ胎児血漿を
１０％（Ｖ／マ）添加したものである（以゛°下では培
養液のことを「培地」ともいう）。
１０％（Ｖ／マ）添加したものである（以゛°下では培
養液のことを「培地」ともいう）。
＠細胞の１ｔ養条件１ｔＩ常の細胞１１養条件（気相が
空気： Ｃｏ、 ： ９５：Ｓ、温度３７°Ｃ）である
。
空気： Ｃｏ、 ： ９５：Ｓ、温度３７°Ｃ）である
。
Ｍａｌｔ−４／旧ＶとＭａｌｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ
、８との混合培養系による生細胞数の測定はＮＴＴ （
３−（４，５−ｄｌｍｅｔｈｙｌ−ｔｈｌａｚｏｌ−２
−ｙｌ）−２，５−ｄｌｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏ
ｌｌｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）アッセイ（免疫実験操作法Ｘ
■、日本免疫学会編、ｐｐ、４４７７−４４８２）或い
はトリパンブルー色素排除法により行った。ＨＩＶのＭ
ｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅｎｏ 、８への直接感染系での
生細胞数の測定も前記と同じ方法で行った。
、８との混合培養系による生細胞数の測定はＮＴＴ （
３−（４，５−ｄｌｍｅｔｈｙｌ−ｔｈｌａｚｏｌ−２
−ｙｌ）−２，５−ｄｌｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏ
ｌｌｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）アッセイ（免疫実験操作法Ｘ
■、日本免疫学会編、ｐｐ、４４７７−４４８２）或い
はトリパンブルー色素排除法により行った。ＨＩＶのＭ
ｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅｎｏ 、８への直接感染系での
生細胞数の測定も前記と同じ方法で行った。
トリバンブルー色素排除法による生細胞数の算定は次の
ように行った。即ち４容の０．２％トリパンブルー液と
１容の５倍生理食塩水液を混合したものをトリパンブル
ー生理食塩水混合液とした。
ように行った。即ち４容の０．２％トリパンブルー液と
１容の５倍生理食塩水液を混合したものをトリパンブル
ー生理食塩水混合液とした。
実施例で使用される細胞浮遊液とトリパンブルー生理食
塩水混合液とを等量づつ混合して、血球計算板で色素に
染まっていない細胞を生細胞とじてその数をカウントし
た。
塩水混合液とを等量づつ混合して、血球計算板で色素に
染まっていない細胞を生細胞とじてその数をカウントし
た。
使用した血漿蛋白質はヒト血清アルブミン（Ｎｏ 。
Ａ ８７８３）、ヒト免疫グロブリンＧ（Ｎｏ、０４３
８Ｇ、ヒトトランスフェリン（Ｎｏ 、ＴＯ５１Ｂ）、
ヒトフィブリノーゲン（Ｎｏ、Ｆ ３８７９）、ウシ血
清アルブミン（Ｎｏ、Ａ７８３Ｂ）であって、これらは
全てシグマ社から購入したしたもので、括弧内の番号は
シグマ社の製品番号を示す。この他に、硫酸デキストラ
ン（シグマ社製、平均分子量的ｓ、ｏｏｏ、製品番号Ｎ
ｏ、Ｄ ０７１１８）を従来公知の抗ＨＩＶ剤として比
較のために実施例で用いた。
８Ｇ、ヒトトランスフェリン（Ｎｏ 、ＴＯ５１Ｂ）、
ヒトフィブリノーゲン（Ｎｏ、Ｆ ３８７９）、ウシ血
清アルブミン（Ｎｏ、Ａ７８３Ｂ）であって、これらは
全てシグマ社から購入したしたもので、括弧内の番号は
シグマ社の製品番号を示す。この他に、硫酸デキストラ
ン（シグマ社製、平均分子量的ｓ、ｏｏｏ、製品番号Ｎ
ｏ、Ｄ ０７１１８）を従来公知の抗ＨＩＶ剤として比
較のために実施例で用いた。
化学修飾血漿蛋白質、硫酸デキストラン（以下測定試料
或いは薬物という）の効果は、巨細泡形成によって生じ
る細胞変性致死の、測定試料による阻止率（ＩＲ）の値
で評価した。ここでＩＲは、測定試料を添加したＮｏ１
ｔ−４ノＩＩＩＶとＭｏ１ｔ−１ｃｌｏｎａ ｎｏ、８
との混合培養系をＭＴＴアッセイ或いはトリ／＜ンブル
ー色素排除法で測淀した値をＡ１ 薬物無添加のＭｏ１
ｔ−４／ＩＩＩＶとＭｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、
８との混合培養系をＮＴＴアッセイ或いはトリパンブル
ー色素排除法で測定した値をＢ、 Ｍｏ１ｔ−４，ｃｌ
ｏｎｅ ｎｏ、８の単独培養をＮＴＴアッセイの値或い
はトリパンブルー色素排除法で測定した値をＣとしたと
き、以下の式で定義される。
或いは薬物という）の効果は、巨細泡形成によって生じ
る細胞変性致死の、測定試料による阻止率（ＩＲ）の値
で評価した。ここでＩＲは、測定試料を添加したＮｏ１
ｔ−４ノＩＩＩＶとＭｏ１ｔ−１ｃｌｏｎａ ｎｏ、８
との混合培養系をＭＴＴアッセイ或いはトリ／＜ンブル
ー色素排除法で測淀した値をＡ１ 薬物無添加のＭｏ１
ｔ−４／ＩＩＩＶとＭｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、
８との混合培養系をＮＴＴアッセイ或いはトリパンブル
ー色素排除法で測定した値をＢ、 Ｍｏ１ｔ−４，ｃｌ
ｏｎｅ ｎｏ、８の単独培養をＮＴＴアッセイの値或い
はトリパンブルー色素排除法で測定した値をＣとしたと
き、以下の式で定義される。
実施例１（ＨＩＶ感染細胞とＨＩＶ非感染細胞との混合
培養による巨細泡形成に対する化学修飾アルブミンの阻
止効果） 細胞株Ｍｏ１ｔ−４／旧ＶとＨＯＩｔ−４，０ＩＱｎｅ
ｎｏ、８とを混合培養すると急速に多核巨細胞が出現
し、やがて該巨細胞は死滅することが知られている （Ｙａｍａｍｏｔｏ、 Ｎ、 ｅｔ ａｌ、： （１９
８Ｇ） Ｊ、 Ｖｌｒｏｌ、 ５Ｌ１１５９−ＩＬＧ２
）。そこでＭ−Ｈ３Ａ及びスクシニル化血清アルブミン
（以下５−Ｈ３Ａという）がこの現象を阻止する効果が
あることを示す実験を行った。
培養による巨細泡形成に対する化学修飾アルブミンの阻
止効果） 細胞株Ｍｏ１ｔ−４／旧ＶとＨＯＩｔ−４，０ＩＱｎｅ
ｎｏ、８とを混合培養すると急速に多核巨細胞が出現
し、やがて該巨細胞は死滅することが知られている （Ｙａｍａｍｏｔｏ、 Ｎ、 ｅｔ ａｌ、： （１９
８Ｇ） Ｊ、 Ｖｌｒｏｌ、 ５Ｌ１１５９−ＩＬＧ２
）。そこでＭ−Ｈ３Ａ及びスクシニル化血清アルブミン
（以下５−Ｈ３Ａという）がこの現象を阻止する効果が
あることを示す実験を行った。
測定試料としてＭ−Ｈ８Ａ％ Ｓ −ＨＳ Ａ、 及
びマレイル化ウシ血清アルブミン（以下Ｍ−ＢＳＡとい
う）、対照としてＨ８Ａ及び公知の抗ＨＩＶ剤として硫
酸デキストラン（以下ＤＳという）を、種々の濃度で細
胞株Ｍｏ１ｔ−４／旧ＶとＨａｌｔ−４，ｃｌｏｎａ
ｎｏ、８との混合培養系に加えて効果を見た。
びマレイル化ウシ血清アルブミン（以下Ｍ−ＢＳＡとい
う）、対照としてＨ８Ａ及び公知の抗ＨＩＶ剤として硫
酸デキストラン（以下ＤＳという）を、種々の濃度で細
胞株Ｍｏ１ｔ−４／旧ＶとＨａｌｔ−４，ｃｌｏｎａ
ｎｏ、８との混合培養系に加えて効果を見た。
細胞株Ｈａｌｔ−４／ＨＩＶとＭｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎ
ｅ ｎｏ、８との混合培養は８６穴或いは２４穴マイク
ロプレートで行い、ソレソレノ細胞を ０．５Ｘ］Ｇ’
個／＊ｌｓ２．Ｏ×ＩＱｉ個／ａｔの濃度で培養した。
ｅ ｎｏ、８との混合培養は８６穴或いは２４穴マイク
ロプレートで行い、ソレソレノ細胞を ０．５Ｘ］Ｇ’
個／＊ｌｓ２．Ｏ×ＩＱｉ個／ａｔの濃度で培養した。
更に上記の薬物を加えないで混合培養した系とＨａｌｔ
−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、ｆｌ細胞のみを培養した系と
をそれぞれ対照として用いた。
−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、ｆｌ細胞のみを培養した系と
をそれぞれ対照として用いた。
混合培養の結果、巨細泡形成によって生じる細胞変性致
死を薬物か阻止する効果を経時的にＮＴＴアッセイによ
り測定し、また細胞の形態なＷ４微鏡で観察した。結果
を第１図、第２図−（Ａ）乃至第２図−（Ｄ）、第３図
、及び第４図に示した。
死を薬物か阻止する効果を経時的にＮＴＴアッセイによ
り測定し、また細胞の形態なＷ４微鏡で観察した。結果
を第１図、第２図−（Ａ）乃至第２図−（Ｄ）、第３図
、及び第４図に示した。
第１図はＭｏ１ｔ−４／旧ＶとＭｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎ
ｅ ｎｏ、８との混合培養系に最終濃度２０μｇ／ｊ！
ｔのＭ−Ｈ８Ａ或いは５０μｇ／ｍｌ！のＤＳを添加し
て、巨細泡形成によって生じる細胞変性致死を上記Ｍ−
Ｈ８Ａ或いはＤＳが阻止する効果について、経時的に調
べた結果を示すものである（生細胞数はＭＴＴアッセイ
で測定した）。この図中、ローロはＭｏ１ｔ−４，Ｃｌ
０ｎｅ ｎｏ、８細胞のみを培養したもの、ムームは混
合培養系にＭ−Ｈ８Ａ或いはＤＳを加えないで培養した
もの、◆−◆は混合培養系にＭ−Ｈ８Ａを２０μｇ ／
ａｔ添加して培養したもの、◇−・◇は混合培養系に
ＤＳを５０μｇ／ｎｌ添加して培養したものを表わす。
ｅ ｎｏ、８との混合培養系に最終濃度２０μｇ／ｊ！
ｔのＭ−Ｈ８Ａ或いは５０μｇ／ｍｌ！のＤＳを添加し
て、巨細泡形成によって生じる細胞変性致死を上記Ｍ−
Ｈ８Ａ或いはＤＳが阻止する効果について、経時的に調
べた結果を示すものである（生細胞数はＭＴＴアッセイ
で測定した）。この図中、ローロはＭｏ１ｔ−４，Ｃｌ
０ｎｅ ｎｏ、８細胞のみを培養したもの、ムームは混
合培養系にＭ−Ｈ８Ａ或いはＤＳを加えないで培養した
もの、◆−◆は混合培養系にＭ−Ｈ８Ａを２０μｇ ／
ａｔ添加して培養したもの、◇−・◇は混合培養系に
ＤＳを５０μｇ／ｎｌ添加して培養したものを表わす。
ＩＲを算出すると、培養後３日日において、Ｍ−Ｈ８Ａ
添加の場合は８８％、ＤＳの添加の場合は７Ｃ％であっ
た。更に培養後４日日では、Ｍ−ＩＳＡ添加の場合は８
８％、ＤＳ添加の場合では７８％であった。
添加の場合は８８％、ＤＳの添加の場合は７Ｃ％であっ
た。更に培養後４日日では、Ｍ−ＩＳＡ添加の場合は８
８％、ＤＳ添加の場合では７８％であった。
第２図−（Ａ）乃至第２図−（Ｄ）は培養４日月の細胞
の形態を顕微鏡で観察した際のスケッチである。これら
の図が示すように、Ｍｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅｎｏ 、
８細胞を単独で培養したもの（第２図−（Ａ））に比べ
てＭｏ１ｔ−４／旧Ｖ細胞とＭｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎａ
ｎｏ、８細胞との混合培養系では巨細泡形成による細
胞変性致死が認められた（第２図−（Ｂ））。これに対
して２０μｇ ／ ｍｅのＭ−Ｈ８Ａを前記混合培養系
に添加することにより巨細泡形成による細胞変性致死に
対する阻止効果が認められた（第２図−（Ｃ））。
の形態を顕微鏡で観察した際のスケッチである。これら
の図が示すように、Ｍｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅｎｏ 、
８細胞を単独で培養したもの（第２図−（Ａ））に比べ
てＭｏ１ｔ−４／旧Ｖ細胞とＭｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎａ
ｎｏ、８細胞との混合培養系では巨細泡形成による細
胞変性致死が認められた（第２図−（Ｂ））。これに対
して２０μｇ ／ ｍｅのＭ−Ｈ８Ａを前記混合培養系
に添加することにより巨細泡形成による細胞変性致死に
対する阻止効果が認められた（第２図−（Ｃ））。
５０μｇ ／ｍｅのＤＳを前記混合培養系添加した場合
も同様の効果が認められた（第２図−（Ｄ））。
も同様の効果が認められた（第２図−（Ｄ））。
第３図はＭ−Ｈ８Ａ１５−ＢＳＡ、Ｍ−ＢＳＡ及びＤＳ
の種々の濃度（Ｍ−ＢＳＡ、５−ＢＳＡ。
の種々の濃度（Ｍ−ＢＳＡ、５−ＢＳＡ。
及びＭ−ＢＳＡでは５００μｇ／ｘｉ１１００μｇ／ｍ
ｅｚ ２０μｇ／ｌＪ、及び４ ｔｔｇＡｅ、 Ｄ
Ｓｔ’ｊｔ１００μｇ／悠ｌ及び５０μｇ／Ｒｊ）で混
合培養系に添加してから４日目のＩＲを示す。生細胞数
の測定はＭＴＴアッセイを用いた。
ｅｚ ２０μｇ／ｌＪ、及び４ ｔｔｇＡｅ、 Ｄ
Ｓｔ’ｊｔ１００μｇ／悠ｌ及び５０μｇ／Ｒｊ）で混
合培養系に添加してから４日目のＩＲを示す。生細胞数
の測定はＭＴＴアッセイを用いた。
この図に示されるようにＩＲは、Ｍ−ＢＳＡでは５００
μｔｔ／ｒｎｅで１０２％、１００μｇ／ｍ＃で９５％
、２０μｇ／−で８８％、４μｇ／−で７７９Ａ、
５−ＢＳＡでは５００１１ｇ１ｍｅで９５％、１００１
１ｔ／１１４で８８％、２０ ｕ ｃ／ｍｅで８４％、
４μｇ／ｍｌで７３％、Ｍ−ＢＳＡでは、５００μｇ／
−で１０８％ｓ １００μｇＺｍ＆で８７％、２０μｇ
／Ｒｅで８８％１４μｇｌｙｘｌで７２％であった。ま
た、ＤＳの場合ＩＲは１００μｇ／ゴで７９％、５０μ
ｇ７ｍｌで７８９Ａであった。
μｔｔ／ｒｎｅで１０２％、１００μｇ／ｍ＃で９５％
、２０μｇ／−で８８％、４μｇ／−で７７９Ａ、
５−ＢＳＡでは５００１１ｇ１ｍｅで９５％、１００１
１ｔ／１１４で８８％、２０ ｕ ｃ／ｍｅで８４％、
４μｇ／ｍｌで７３％、Ｍ−ＢＳＡでは、５００μｇ／
−で１０８％ｓ １００μｇＺｍ＆で８７％、２０μｇ
／Ｒｅで８８％１４μｇｌｙｘｌで７２％であった。ま
た、ＤＳの場合ＩＲは１００μｇ／ゴで７９％、５０μ
ｇ７ｍｌで７８９Ａであった。
第４図は、第３図のＮＴＴアッセイの結果から得られた
ＩＲを確認するために、培養４日目における種々の濃度
のＭ −ＨＳ Ａ （５００μｇ／４ｇ、 ｆｏＯμ
ｇ／ｍｅ２０ ｕ ｇ／Ｓ！ｅ Ｎ 及ヒ４ ｕ ｇ／
ｍｅ ）、ＨＳＡ（５００μｇ／ｘＬｌ！のみ）及び
ＤＳ（１００μｇ／１．Ｉｊ及び５０μｇ／ｍｅ）のＩ
Ｒについてトリパンブルー色素排除法の結果から算出し
たものである。Ｍ−ＢＳＡでは５００μｇ／ｘｉで９１
％、１００μｇ／＋ノＬｌで８０％、２０μｇ／１ｎｌ
ｌで７５％、４ ｕ ｔ／ｍｅで３５％の、またＤＳで
は１００μｇ／ｍＪで８４％、５０μｇ／＊ｌで６４％
のＩＲが認められた。しかしながら）ＩＳＡは５００μ
ｇ／ｌｎｌ添加でも巨細胞形成による細胞変性致死の阻
止効果は殆ど認められなかった。
ＩＲを確認するために、培養４日目における種々の濃度
のＭ −ＨＳ Ａ （５００μｇ／４ｇ、 ｆｏＯμ
ｇ／ｍｅ２０ ｕ ｇ／Ｓ！ｅ Ｎ 及ヒ４ ｕ ｇ／
ｍｅ ）、ＨＳＡ（５００μｇ／ｘＬｌ！のみ）及び
ＤＳ（１００μｇ／１．Ｉｊ及び５０μｇ／ｍｅ）のＩ
Ｒについてトリパンブルー色素排除法の結果から算出し
たものである。Ｍ−ＢＳＡでは５００μｇ／ｘｉで９１
％、１００μｇ／＋ノＬｌで８０％、２０μｇ／１ｎｌ
ｌで７５％、４ ｕ ｔ／ｍｅで３５％の、またＤＳで
は１００μｇ／ｍＪで８４％、５０μｇ／＊ｌで６４％
のＩＲが認められた。しかしながら）ＩＳＡは５００μ
ｇ／ｌｎｌ添加でも巨細胞形成による細胞変性致死の阻
止効果は殆ど認められなかった。
以上の結果から、Ｍ−Ｈ８ＡＸＭ−ＢＳＡ及びＤＳが濃
度に依存して巨細胞形成による細胞変性致死を阻止する
ことが認められた。そしてＭ−ＢＳＡ及びＭ−ＢＳＡは
ＤＳと比べてより低濃度、例えば２０μｇ ／ｍｌであ
っても巨細胞形成による細胞変性致死の阻止作用がある
ことが見い出された。
度に依存して巨細胞形成による細胞変性致死を阻止する
ことが認められた。そしてＭ−ＢＳＡ及びＭ−ＢＳＡは
ＤＳと比べてより低濃度、例えば２０μｇ ／ｍｌであ
っても巨細胞形成による細胞変性致死の阻止作用がある
ことが見い出された。
一方、ＢＳＡには細胞変性致死の阻止効果は殆ど認めら
れなかった。
れなかった。
実施例２（ＨＩＶｌｉｌ！！染細胞とＨＩＶ非細胞細胞
との混合培養による巨細胞形成に対するその他の化学修
飾血漿蛋白質の阻止効果） 実施例１に記載の化学修飾血清アルブミン以外の化学修
飾血漿蛋白質の抗ＨＩＶ効果を示すために、実施例１と
同様、細胞株Ｍｏ１ｔ−４／旧ＶとＮｏ１ｔ−４、ｃｌ
ｏｎｅ ｎｏ、８の混合培養系での多核巨細泡形成を阻
止する効果があることを示す実験を、ＭＴＴアッセイで
求めたＩＲ及び形態学的観察により行った。
との混合培養による巨細胞形成に対するその他の化学修
飾血漿蛋白質の阻止効果） 実施例１に記載の化学修飾血清アルブミン以外の化学修
飾血漿蛋白質の抗ＨＩＶ効果を示すために、実施例１と
同様、細胞株Ｍｏ１ｔ−４／旧ＶとＮｏ１ｔ−４、ｃｌ
ｏｎｅ ｎｏ、８の混合培養系での多核巨細泡形成を阻
止する効果があることを示す実験を、ＭＴＴアッセイで
求めたＩＲ及び形態学的観察により行った。
測定試料としては次に記載の代表的な血漿蛋白質をマレ
イル化若しくはスクシニル化したものを用いた。
イル化若しくはスクシニル化したものを用いた。
即ちマレイル化免疫グロブリンＧ（以下Ｍ−１ｇという
）、スクシニル化免疫−グロブリン（以下Ｓ−Ｉｇとい
う）、マレイル化トランスフェリン（以下Ｍ−Ｔｆとい
う）、スクシニル化トランスフェリン（以下５−Ｔｆと
いう）、スクシニル化フィブリノーゲン（以下５−Ｆｂ
という）である。このほかに既知の抗ＨＩＶ剤であるＤ
Ｓを比較のために用いた。以上の測定試料を種々の濃度
で細胞株Ｈａｌｔ−４／ＨＩＶとＨａｌｔ−４：’ａｌ
ｏｎｅ ｎｏ、８との混合培養系に加えて効果を見た。
）、スクシニル化免疫−グロブリン（以下Ｓ−Ｉｇとい
う）、マレイル化トランスフェリン（以下Ｍ−Ｔｆとい
う）、スクシニル化トランスフェリン（以下５−Ｔｆと
いう）、スクシニル化フィブリノーゲン（以下５−Ｆｂ
という）である。このほかに既知の抗ＨＩＶ剤であるＤ
Ｓを比較のために用いた。以上の測定試料を種々の濃度
で細胞株Ｈａｌｔ−４／ＨＩＶとＨａｌｔ−４：’ａｌ
ｏｎｅ ｎｏ、８との混合培養系に加えて効果を見た。
細胞株Ｍｏ１ｔ−４／■ＩＶとＭｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎ
ｅ ｎｏ、８の混合培養は９Ｂ穴マイクロプレートで行
い、細胞数やその他の諸条件は実施例１と同様であった
。対厨として前記の測定試料を加えないで混合培養した
ものとＭｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、８細胞のみを
培養したものをそれぞれ用いた。結果は第５図に示す。
ｅ ｎｏ、８の混合培養は９Ｂ穴マイクロプレートで行
い、細胞数やその他の諸条件は実施例１と同様であった
。対厨として前記の測定試料を加えないで混合培養した
ものとＭｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、８細胞のみを
培養したものをそれぞれ用いた。結果は第５図に示す。
また、培養後４日目にＭＴＴアッセイ及び細胞の形態を
顕微鏡で観察した。
顕微鏡で観察した。
第５図は培１４日月のＭ−Ｉｇｌ Ｓ−Ｉｇ、Ｍ−Ｔｆ
％ ５−Ｔｆ、、Ｓ−Ｆ’ｂ及びＤＳのそれぞれの濃度
におけるＩＲ（ＮＴＴアッセイで求めた生細胞数から算
出）を示したものである。
％ ５−Ｔｆ、、Ｓ−Ｆ’ｂ及びＤＳのそれぞれの濃度
におけるＩＲ（ＮＴＴアッセイで求めた生細胞数から算
出）を示したものである。
この図に示されるようにＭ−Ｉ ｇでは４０％ｇ／”／
’で７０％、Ｓ−Ｉｇでは８００ ｕ ｇ／” テ９１
％、Ｍ、−Ｔｆでは３００μｇ ／ ｍＡ’で１１０％
、５−Ｔｆでは１８０μｇ／ｄで１０４％、５−Ｆｂで
は１１０ｔｔｇ／ｍｌで６５％のＩＲが認められた。ま
た、ＤＳでは１００μｇ ／ ｍｅで１０３％のＩＲが
認められた。
’で７０％、Ｓ−Ｉｇでは８００ ｕ ｇ／” テ９１
％、Ｍ、−Ｔｆでは３００μｇ ／ ｍＡ’で１１０％
、５−Ｔｆでは１８０μｇ／ｄで１０４％、５−Ｆｂで
は１１０ｔｔｇ／ｍｌで６５％のＩＲが認められた。ま
た、ＤＳでは１００μｇ ／ ｍｅで１０３％のＩＲが
認められた。
以上の結果から、化学修飾アルブミン以外の他のマレイ
ル化血漿蛋白質やスクシニル化血漿蛋白質も、巨細胞形
成による細胞変性致死を阻止していることが示された。
ル化血漿蛋白質やスクシニル化血漿蛋白質も、巨細胞形
成による細胞変性致死を阻止していることが示された。
更に、各々の測定試料添加による混合培養細胞の形態変
化を培養４日月で顕微鏡下で観察したところ、巨核細胞
形成の阻止効果が認められた（図は示さない）。
化を培養４日月で顕微鏡下で観察したところ、巨核細胞
形成の阻止効果が認められた（図は示さない）。
実施例１及び実施例２の結果から、いろいろな血漿蛋白
質と無水ジカルボン酸を反応させて該血漿蛋白質の構成
アミノ、酸残基を負に化学修飾した血漿蛋白質はＨＩＶ
の感染を効果的に阻止するものと考えられる。
質と無水ジカルボン酸を反応させて該血漿蛋白質の構成
アミノ、酸残基を負に化学修飾した血漿蛋白質はＨＩＶ
の感染を効果的に阻止するものと考えられる。
実施例３（ＨＩＶ感染によるＭｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅ
ｎｏ、８細胞の障害に対するマレイル化血漿蛋白質及
びスクシニル化血漿蛋白質の阻止効果） 実施例１及び２において、マレイル化血漿蛋白質及びス
クシニル化血漿蛋白質がＨＩＶ感染細胞と非感染細胞間
との巨細胞形成による細胞変性致死を阻止する効果を示
したが、更にもう１つのＨＩＶ感染経路であるＨＩＶの
ヘルパーＴ細胞への直接感染を、マレイル化血漿蛋白質
及びスクシニル化血漿蛋白質が阻止することを示す実験
を行った。
ｎｏ、８細胞の障害に対するマレイル化血漿蛋白質及
びスクシニル化血漿蛋白質の阻止効果） 実施例１及び２において、マレイル化血漿蛋白質及びス
クシニル化血漿蛋白質がＨＩＶ感染細胞と非感染細胞間
との巨細胞形成による細胞変性致死を阻止する効果を示
したが、更にもう１つのＨＩＶ感染経路であるＨＩＶの
ヘルパーＴ細胞への直接感染を、マレイル化血漿蛋白質
及びスクシニル化血漿蛋白質が阻止することを示す実験
を行った。
測定試料としてはＭ−ＩＳＡ、Ｍ−Ｔｆｌ Ｍ−Ｉ ｇ
ｓ 及び５−Ｆｂを用い、又対照としてＤＳを用い、Ｈ
ＩＶを感染させるヘルパーＴ細胞株としてはＨａｌｔ−
４，（ｉｌｏｎｅ ｎｏ、８細胞を用いた。
ｓ 及び５−Ｆｂを用い、又対照としてＤＳを用い、Ｈ
ＩＶを感染させるヘルパーＴ細胞株としてはＨａｌｔ−
４，（ｉｌｏｎｅ ｎｏ、８細胞を用いた。
ＨＩＶを含む溶液として、ＨＩＶ産生細胞株Ｍｏ１ｔ−
４／旧Ｖを４日間培養して培養上清を遠心分離し、更に
０．４５μｍのフィルター（ミリポア社製）で濾過した
濾液を用いた。
４／旧Ｖを４日間培養して培養上清を遠心分離し、更に
０．４５μｍのフィルター（ミリポア社製）で濾過した
濾液を用いた。
Ｍｏ１ｔ−４，ＱＩＯｎｅ ｎｏ、８細胞を９６穴マイ
クロプレートに２．３ Ｘ １０４個／１５０μ！培養
液／ウェル接種し、５０μｍのＨＩＶ溶液を各ウェルに
添加して、各々のウェルに上記の測定試料或いはＤＳを
添加して４日間培養を行った。培養終了後に細胞形態の
顕微鏡下の観察とトリパンブルー色素排除法による生細
胞数の測定を行った。
クロプレートに２．３ Ｘ １０４個／１５０μ！培養
液／ウェル接種し、５０μｍのＨＩＶ溶液を各ウェルに
添加して、各々のウェルに上記の測定試料或いはＤＳを
添加して４日間培養を行った。培養終了後に細胞形態の
顕微鏡下の観察とトリパンブルー色素排除法による生細
胞数の測定を行った。
第６図−（Ａ）乃至第８図−（Ｄ）にｉ微鏡下で観察し
たスケッチを示す。Ｍａｌｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、
８細胞のみを培養したもの（第６図−（Ａ））に比べて
Ｍｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、８の細胞培養にＨＩ
Ｖ溶液のみを加えて培養したものではＨＩＶ感染のため
に巨細胞が形成され細胞変性致死が認められた（第８図
−（Ｂ））。Ｍｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、８の細
胞培養にＨＩＶ溶液を加えたものに、Ｍ−ＩＳＡを添加
したもの（第６図−（Ｃ））や、Ｍ−Ｔｒを添加したも
の（第６図−（Ｄ））はＨＩＶ感染により引き起こされ
る巨細胞形成による細胞変性致死の阻止効果が認められ
た。
たスケッチを示す。Ｍａｌｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、
８細胞のみを培養したもの（第６図−（Ａ））に比べて
Ｍｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、８の細胞培養にＨＩ
Ｖ溶液のみを加えて培養したものではＨＩＶ感染のため
に巨細胞が形成され細胞変性致死が認められた（第８図
−（Ｂ））。Ｍｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、８の細
胞培養にＨＩＶ溶液を加えたものに、Ｍ−ＩＳＡを添加
したもの（第６図−（Ｃ））や、Ｍ−Ｔｒを添加したも
の（第６図−（Ｄ））はＨＩＶ感染により引き起こされ
る巨細胞形成による細胞変性致死の阻止効果が認められ
た。
第７図はトリバンプルー色素排除法による生細胞数の無
定値上りＩＲを求め、これをグラフに示したものである
。ＩＲは、Ｍ−ＩＳＡでは１００μｇ／ａｔで５８％、
Ｍ−Ｉｇでは４０μｇ／ｘｌで６７％、Ｍ−Ｔｆでは３
ＤＯ１１ｇ７ｍｌで５６％、５−Ｆｂでは１７０μｇ／
ｍｅＴ！ ５４１％、ＤＳでは１００μｇ／ ｘ／テＧ
４％ ”ｌ？あツタ。
定値上りＩＲを求め、これをグラフに示したものである
。ＩＲは、Ｍ−ＩＳＡでは１００μｇ／ａｔで５８％、
Ｍ−Ｉｇでは４０μｇ／ｘｌで６７％、Ｍ−Ｔｆでは３
ＤＯ１１ｇ７ｍｌで５６％、５−Ｆｂでは１７０μｇ／
ｍｅＴ！ ５４１％、ＤＳでは１００μｇ／ ｘ／テＧ
４％ ”ｌ？あツタ。
以上の結果は、ＨＩＶのヘルパーＴ細胞への直接の感染
についても、マレイル化血漿蛋白質及びスクシニル化血
漿蛋白質全般はこれを阻止できることを示しているもの
と考えられる。
についても、マレイル化血漿蛋白質及びスクシニル化血
漿蛋白質全般はこれを阻止できることを示しているもの
と考えられる。
実施例４ （Ｉｎ ｖｌｔｒｏ系における正常リンパ球
に対するマレイル化血漿蛋白質及びスクシニル化血漿蛋
白質の影響） 本発明に係る化学修飾Ｈ８Ａのヒト正常末梢血リンパ球
に対する影響を調べるために放射性チミジン（Ｃ”ＨＩ
−Ｔｈｙｍｔｄｔｔ＋ａ）の取り込みを指標とするＤＮ
Ａ合成活性の測定を行った。
に対するマレイル化血漿蛋白質及びスクシニル化血漿蛋
白質の影響） 本発明に係る化学修飾Ｈ８Ａのヒト正常末梢血リンパ球
に対する影響を調べるために放射性チミジン（Ｃ”ＨＩ
−Ｔｈｙｍｔｄｔｔ＋ａ）の取り込みを指標とするＤＮ
Ａ合成活性の測定を行った。
ヒト正常末梢血をフィコールφパック（ファルマシア社
製）を用いてリンパ球を分画し、これに前記培地を添加
した。そして９Ｇ穴マイクロプレートに細胞数が４．０
Ｘ１０’Ｉ／２００μＡ！培養液／ｖａｌｌとなるよう
に蒔いた。
製）を用いてリンパ球を分画し、これに前記培地を添加
した。そして９Ｇ穴マイクロプレートに細胞数が４．０
Ｘ１０’Ｉ／２００μＡ！培養液／ｖａｌｌとなるよう
に蒔いた。
次いで、Ｍ−Ｈ８Ａ１５−ＩＳＡ、或いはＩＳＡの溶液
を、各々最終濃度が！Ｂμｇ／ゴ、３２μｇ／ＩＩＩ／
１Ｂ３１１ｔｔ／Ｍｅ、 １２５μに／ｘｔｌ、 ２
５０ｔｔＥ／Ｒｅ、 ５００μｇ／ｍ／％ｔ、ｏｏｏμ
ｇ／Ｉ！／、及びＬＯＯＯ／Ｊｇ／ｍｌとなるように上
記マイクロプレートに加えた。また、化学修飾血漿蛋白
質によるリンパ球に対する影響とマイトジェンのリンパ
球幼弱化反応とを比較するために、上記測定試料の代わ
りにフィトヘマアグルチニン（ｐｈｙｔｏｈａｍａｇｇ
ｌｕｔｌｎｌｎ；以下ＰＨＡという）を最終濃度５μｇ
／ｍｔ１ 或いはフンカナバリンＡ （ｃｏｎｃａｎａ
ｖａｌｌｎム；以下ＣｏｎＡという）を最終濃度ｌＯμ
ｇ／ｍｅとなるように上記マイクロプレートに加えた系
も用意した。そして５％ＣＯ２，９５％空気の加湿培養
器（３７℃）で８０時間培養後、放射性チミジン（アマ
−ジャム社製）を各ウェル当たり０．５μＣ１を加え、
更に１２時間培養した。培養終了後、セル・ハーベスタ
−によって細胞をガラス繊維濾紙にハーベストした。こ
の濾紙を乾煽させ、液体シンチレーシ■ンカウンターで
放射活性（単位はｃｐ＠）を測定した。測定試料或いは
マイトジェンを加えないで代わりにＰＢＳを培地に加え
、上と同様の操作を行ったものをコントロールとした。
を、各々最終濃度が！Ｂμｇ／ゴ、３２μｇ／ＩＩＩ／
１Ｂ３１１ｔｔ／Ｍｅ、 １２５μに／ｘｔｌ、 ２
５０ｔｔＥ／Ｒｅ、 ５００μｇ／ｍ／％ｔ、ｏｏｏμ
ｇ／Ｉ！／、及びＬＯＯＯ／Ｊｇ／ｍｌとなるように上
記マイクロプレートに加えた。また、化学修飾血漿蛋白
質によるリンパ球に対する影響とマイトジェンのリンパ
球幼弱化反応とを比較するために、上記測定試料の代わ
りにフィトヘマアグルチニン（ｐｈｙｔｏｈａｍａｇｇ
ｌｕｔｌｎｌｎ；以下ＰＨＡという）を最終濃度５μｇ
／ｍｔ１ 或いはフンカナバリンＡ （ｃｏｎｃａｎａ
ｖａｌｌｎム；以下ＣｏｎＡという）を最終濃度ｌＯμ
ｇ／ｍｅとなるように上記マイクロプレートに加えた系
も用意した。そして５％ＣＯ２，９５％空気の加湿培養
器（３７℃）で８０時間培養後、放射性チミジン（アマ
−ジャム社製）を各ウェル当たり０．５μＣ１を加え、
更に１２時間培養した。培養終了後、セル・ハーベスタ
−によって細胞をガラス繊維濾紙にハーベストした。こ
の濾紙を乾煽させ、液体シンチレーシ■ンカウンターで
放射活性（単位はｃｐ＠）を測定した。測定試料或いは
マイトジェンを加えないで代わりにＰＢＳを培地に加え
、上と同様の操作を行ったものをコントロールとした。
測定結果は第８図−（Ａ）及び第８図−（Ｂ）に示す。
第８図−（Ａ）にあるようにＳ −ＨＳ Ａ５．０００
μｇ ／ ｗｅの濃度で若干のＤＮＡ合成抑制が認めら
れたものの、１８μｇ ／ｌｘｅから１．０００μｇ／
ｍｅの濃度ではＤＮＡ合成の抑制がなかった。またＭ−
ＩＳＡ及びＩＳＡでは１６ａｇ／ｍｅから５．０００
μｇ／ｍｌ！の全ての濃度に亘って全＜ＤＮＡ合成の抑
制は見られなかった・ Ｍ−ＩＳＡの場合極く僅かなリンパ球幼弱化反応が認め
迭れたが、第８図−（Ｂ）に示されるＰＨＡやＣｏｎＡ
の値と比較すると１０分の１程度であったＯ 以上の結果から、本発明に係るマレイル化Ｈ８Ａ及びス
クシニル化Ｈ８Ａは細胞周期の静止期（Ｇｓ期）にある
ヒトリンパ球に対して毒性を示さないことが確認された
。
μｇ ／ ｗｅの濃度で若干のＤＮＡ合成抑制が認めら
れたものの、１８μｇ ／ｌｘｅから１．０００μｇ／
ｍｅの濃度ではＤＮＡ合成の抑制がなかった。またＭ−
ＩＳＡ及びＩＳＡでは１６ａｇ／ｍｅから５．０００
μｇ／ｍｌ！の全ての濃度に亘って全＜ＤＮＡ合成の抑
制は見られなかった・ Ｍ−ＩＳＡの場合極く僅かなリンパ球幼弱化反応が認め
迭れたが、第８図−（Ｂ）に示されるＰＨＡやＣｏｎＡ
の値と比較すると１０分の１程度であったＯ 以上の結果から、本発明に係るマレイル化Ｈ８Ａ及びス
クシニル化Ｈ８Ａは細胞周期の静止期（Ｇｓ期）にある
ヒトリンパ球に対して毒性を示さないことが確認された
。
実施例５（急性毒性試験）
本発明に係る化学修飾血漿蛋白質のマウスにおける静脈
内投与急性毒性試験をＭ−ＩＳＡを用いて行った。
内投与急性毒性試験をＭ−ＩＳＡを用いて行った。
Ｍ−ＩＳＡが低毒性物質であることが予想されることか
ら、技術的に投与し得る最大投与容量３．９２ ｇ／Ｋ
ｇを投与して試験を行った。
ら、技術的に投与し得る最大投与容量３．９２ ｇ／Ｋ
ｇを投与して試験を行った。
３．９２ ｇ／ＫｇのＭ−）ＩＳＡを体重２４．４〜２
８．９ｇのＤＢＡ／２マウス雄５匹（日本チャルズリバ
ー）に静脈投与を行い、一般症状及び体重推移を観察し
たが、異常は認められなかった。
８．９ｇのＤＢＡ／２マウス雄５匹（日本チャルズリバ
ー）に静脈投与を行い、一般症状及び体重推移を観察し
たが、異常は認められなかった。
以上のようにＭ−ＩＳＡは非常に安全性の高い物質であ
ることが認められた。
ることが認められた。
この結果は、血漿蛋白質をマレイル化若しくはスクシニ
ル化する限り、同様な結果を得ることができることを示
すものであり、マレイル化血漿蛋白質及びスクンニル化
血漿蛋白質全般の安全性を示唆するものであるといえる
。
ル化する限り、同様な結果を得ることができることを示
すものであり、マレイル化血漿蛋白質及びスクンニル化
血漿蛋白質全般の安全性を示唆するものであるといえる
。
（発明の効果）
以上の実施例１〜５の結果から明らかなように本発明に
係る抗ＨＩＶ剤の有効成分である無水ジカルボン酸によ
り化学修飾された血漿蛋白質は、ＨＩＶ感染細胞とＨＩ
Ｖ非感染細胞との混合培養による巨細胞形成の阻止効果
及び、ＨＩｖのヘルパーＴ細胞へのＨＩＶの直接感染の
阻止効果を持つことが示された。かつ高濃度においても
ＤＮＡ合成に影響を及ぼさず、又急性毒性試験における
異常も示さないことから非常に安全性の高いものである
。
係る抗ＨＩＶ剤の有効成分である無水ジカルボン酸によ
り化学修飾された血漿蛋白質は、ＨＩＶ感染細胞とＨＩ
Ｖ非感染細胞との混合培養による巨細胞形成の阻止効果
及び、ＨＩｖのヘルパーＴ細胞へのＨＩＶの直接感染の
阻止効果を持つことが示された。かつ高濃度においても
ＤＮＡ合成に影響を及ぼさず、又急性毒性試験における
異常も示さないことから非常に安全性の高いものである
。
これらの結果から本発明の有効成分である無水ジカルボ
ン酸により化学修飾された血漿蛋白質はＨＩＶ感染患者
の治療に利用できることが期待される。
ン酸により化学修飾された血漿蛋白質はＨＩＶ感染患者
の治療に利用できることが期待される。
第１図は細胞株Ｍｏ１ｔ−４／Ｈ！ｖとＨａｌｔ−４，
ｃｌｏｎｅ ｎｏ。 ８との混合培養液に最終濃度２０μｇ／ｌｘｌのＭ−Ｉ
ＳＡ或いは５０μｇｏａｌのＤＳを添加して、巨細胞形
成によって生じる細胞変性致死を阻止する効果について
経時的にＮＴＴアッセイを用いて生細胞数を調べた結果
を示すグラフである。 第２図−（Ａ）乃至第２図−（Ｄ）は、Ｍ−Ｈ８Ａ１
ＤＳ存在下で細胞株Ｈａｌｔ−４／［Ｌ！： Ｈａｌｔ
−４゜ａｌｏｎｅ ｎｏ、８とを混合培養した際の形態
変化を培養４日目に顕微鏡下で観察したスケッチを示す
。第２図−（Ａ）はＭｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、
８細胞を単独培養したもの、第２図−（Ｂ）はＨａｌｔ
−４／旧■とＭｏ１ｔ−４、ｃｌｏｎｅ ｎｏ、８とを
薬物無添加で混合培養したもの、第２図−（Ｃ）はＭｏ
１ｔ−４／ＨＩＶとＭｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ。 ８との混合培養に本発明のＭ−ＩＳＡを２０μｇ／ｘｒ
ｌ添加して培養したもの、第２図−（Ｄ）はＨａｌｔ−
４／ＦＪＩＶとＭｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、８と
の混合培養にＤＳを５０μｇ、／ｌｌ添加して培養した
ものである。 第３図は細胞株Ｍ０１ｔ−４／旧ＶとＭｏ１ｔ−４，ｃ
ｌｏｎｅ ｎｏ。 ８との混合培養４日目におけるＭ−ＩＳＡ、５−ＩＳＡ
、Ｍ−ＢＳＡ及びＤＳのそれぞれの濃度におけるＩＲを
ＮＴＴアッセイを用いて求めた生細胞数から算出した結
果を示すグラフである。 第４図は、細胞株Ｍｏ１ｔ−４／ＨＩＶとＭｏ１ｔ−４
，ｃｌｏｎｅｎｏ 、８と混合培養４日目における穏々
の濃度のＭ−ＩＳＡ、ＩＳＡ及びＤＳのＩＲをトリパン
ブルー色素排除法を用いて求めた生細胞数から算出した
結果を示すグラフである。 第５図は細胞株Ｍｏ１ｔ−４／旧ＶとＭｏ１ｔ−４，ｃ
ｌｏｎｅ ｎｏ。 ８と混合培養４日目におけるＭ−Ｉｇ、５−１ｇ％Ｍ−
Ｔｆ’、５−Ｔｒ、５−Ｆｂ及びＤＳのそれぞれの濃度
におけるＩＲをＮＴＴアッセイを用いて求めた生細胞数
から算出した結果を示すグラフである。 第８図−（Ａ） 乃至第８図−ＣＤ） ！ｔ、ＨＩ Ｖ
のＴ細胞（細胞株Ｍｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎａ ｎｏ、８
）への直ｖｃｇ染系におけるＭ ｌ−１８Ａ、Ｍ−Ｔ
ｆ存在下での形態変化を培養４日目で顕微鏡下で観察し
たスケッチを示すものである。第８図−（Ａ）はＭｏ１
ｔ−４゜ａｌｏｎｅ ｎｏ、８細胞を単独培養したもの
、ｒＪ６図−（Ｂ）はＨａｌｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ
、８にＨＩＶを含む溶液のみを添加し培養したもの、第
８図−（Ｃ）はＭｏＩｔ−４，（！１ａｎｅ ｎｏ、８
にＨＩＶを含む溶液を添加し本発明に係るＭ−ＭＳＡを
１（１０μｔ／ｙｘｌ添加して培養したもの、第６図−
（Ｄ）は）Ｉｏｌｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、８にＨＩ
Ｖを含む溶液を添加し本発明に係るＭ−Ｔｆを３００μ
ｚ／ｍｅ添加して培養したものを示す。 第７図はＨＩＶのＴ細胞（細胞株Ｍｏ１ｔ−４，ｃｌｏ
ｎｅｎｏ、 ８）への直接感染系における培養４日目の
Ｍ−ＩＳＡｌＭ−Ｉｇ、Ｍ−Ｔｆ、５−Ｆｂ及ｃＦＤＳ
のＩＲを、トリパンブルー色素排除法を用いて測定した
生細胞数から算出した結果を示すグラフである。 第８図−（Ａ）はＩｎ ｖｌｔｒｏ系における正常ヒト
リンパ球に対するマレイル化血漿蛋白質及びスクシニル
化血漿蛋白質の影響を調べるために、ヒト正常末梢血リ
ンパ球を種々の濃度のマレイル化ヒト血清アルブミン、
スクシニル化ヒト血涜アルブミン、未修飾ヒト血清アル
ブミンの存在下で３日間培養し、培養終了後に放射性チ
ミジンの取り込み量を測定した結果を示すグラフである
。第８図−（Ｂ）はＰＨＡ１或いはＣｏｎＡの存在下で
ヒト正常末梢血リンパ球を３日間培養し、培養終了後に
放射性チミジンの取り込み量を測定した結果を示すグラ
フである。 ソ、上 生細胞数（任意単位） ン＾ の Ｓ 第６図− （Ａ） 第６図− （Ｃ） 第６図− （Ｂ） 第６図− （Ｄ） 第８図−（Ａ） 第８図−（Ｂ） ５ｕｇ／ｍ１ １０μｇ／ｍｌ
ｃｌｏｎｅ ｎｏ。 ８との混合培養液に最終濃度２０μｇ／ｌｘｌのＭ−Ｉ
ＳＡ或いは５０μｇｏａｌのＤＳを添加して、巨細胞形
成によって生じる細胞変性致死を阻止する効果について
経時的にＮＴＴアッセイを用いて生細胞数を調べた結果
を示すグラフである。 第２図−（Ａ）乃至第２図−（Ｄ）は、Ｍ−Ｈ８Ａ１
ＤＳ存在下で細胞株Ｈａｌｔ−４／［Ｌ！： Ｈａｌｔ
−４゜ａｌｏｎｅ ｎｏ、８とを混合培養した際の形態
変化を培養４日目に顕微鏡下で観察したスケッチを示す
。第２図−（Ａ）はＭｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、
８細胞を単独培養したもの、第２図−（Ｂ）はＨａｌｔ
−４／旧■とＭｏ１ｔ−４、ｃｌｏｎｅ ｎｏ、８とを
薬物無添加で混合培養したもの、第２図−（Ｃ）はＭｏ
１ｔ−４／ＨＩＶとＭｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ。 ８との混合培養に本発明のＭ−ＩＳＡを２０μｇ／ｘｒ
ｌ添加して培養したもの、第２図−（Ｄ）はＨａｌｔ−
４／ＦＪＩＶとＭｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、８と
の混合培養にＤＳを５０μｇ、／ｌｌ添加して培養した
ものである。 第３図は細胞株Ｍ０１ｔ−４／旧ＶとＭｏ１ｔ−４，ｃ
ｌｏｎｅ ｎｏ。 ８との混合培養４日目におけるＭ−ＩＳＡ、５−ＩＳＡ
、Ｍ−ＢＳＡ及びＤＳのそれぞれの濃度におけるＩＲを
ＮＴＴアッセイを用いて求めた生細胞数から算出した結
果を示すグラフである。 第４図は、細胞株Ｍｏ１ｔ−４／ＨＩＶとＭｏ１ｔ−４
，ｃｌｏｎｅｎｏ 、８と混合培養４日目における穏々
の濃度のＭ−ＩＳＡ、ＩＳＡ及びＤＳのＩＲをトリパン
ブルー色素排除法を用いて求めた生細胞数から算出した
結果を示すグラフである。 第５図は細胞株Ｍｏ１ｔ−４／旧ＶとＭｏ１ｔ−４，ｃ
ｌｏｎｅ ｎｏ。 ８と混合培養４日目におけるＭ−Ｉｇ、５−１ｇ％Ｍ−
Ｔｆ’、５−Ｔｒ、５−Ｆｂ及びＤＳのそれぞれの濃度
におけるＩＲをＮＴＴアッセイを用いて求めた生細胞数
から算出した結果を示すグラフである。 第８図−（Ａ） 乃至第８図−ＣＤ） ！ｔ、ＨＩ Ｖ
のＴ細胞（細胞株Ｍｏ１ｔ−４，ｃｌｏｎａ ｎｏ、８
）への直ｖｃｇ染系におけるＭ ｌ−１８Ａ、Ｍ−Ｔ
ｆ存在下での形態変化を培養４日目で顕微鏡下で観察し
たスケッチを示すものである。第８図−（Ａ）はＭｏ１
ｔ−４゜ａｌｏｎｅ ｎｏ、８細胞を単独培養したもの
、ｒＪ６図−（Ｂ）はＨａｌｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ
、８にＨＩＶを含む溶液のみを添加し培養したもの、第
８図−（Ｃ）はＭｏＩｔ−４，（！１ａｎｅ ｎｏ、８
にＨＩＶを含む溶液を添加し本発明に係るＭ−ＭＳＡを
１（１０μｔ／ｙｘｌ添加して培養したもの、第６図−
（Ｄ）は）Ｉｏｌｔ−４，ｃｌｏｎｅ ｎｏ、８にＨＩ
Ｖを含む溶液を添加し本発明に係るＭ−Ｔｆを３００μ
ｚ／ｍｅ添加して培養したものを示す。 第７図はＨＩＶのＴ細胞（細胞株Ｍｏ１ｔ−４，ｃｌｏ
ｎｅｎｏ、 ８）への直接感染系における培養４日目の
Ｍ−ＩＳＡｌＭ−Ｉｇ、Ｍ−Ｔｆ、５−Ｆｂ及ｃＦＤＳ
のＩＲを、トリパンブルー色素排除法を用いて測定した
生細胞数から算出した結果を示すグラフである。 第８図−（Ａ）はＩｎ ｖｌｔｒｏ系における正常ヒト
リンパ球に対するマレイル化血漿蛋白質及びスクシニル
化血漿蛋白質の影響を調べるために、ヒト正常末梢血リ
ンパ球を種々の濃度のマレイル化ヒト血清アルブミン、
スクシニル化ヒト血涜アルブミン、未修飾ヒト血清アル
ブミンの存在下で３日間培養し、培養終了後に放射性チ
ミジンの取り込み量を測定した結果を示すグラフである
。第８図−（Ｂ）はＰＨＡ１或いはＣｏｎＡの存在下で
ヒト正常末梢血リンパ球を３日間培養し、培養終了後に
放射性チミジンの取り込み量を測定した結果を示すグラ
フである。 ソ、上 生細胞数（任意単位） ン＾ の Ｓ 第６図− （Ａ） 第６図− （Ｃ） 第６図− （Ｂ） 第６図− （Ｄ） 第８図−（Ａ） 第８図−（Ｂ） ５ｕｇ／ｍ１ １０μｇ／ｍｌ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、血漿蛋白質の構成アミノ酸残基の側鎖官能基の電荷
の極性が負に化学修飾された化学修飾蛋白質を有効成分
として含有する抗ＨＩＶ剤。 ２、血漿蛋白質の構成アミノ酸残基のアミノ基の電荷の
極性が負に化学修飾された化学修飾蛋白質を有効成分と
する抗ＨＩＶ剤。 ３、血漿蛋白質の構成アミノ酸残基のチオール基の電荷
の極性が負に化学修飾された化学修飾蛋白質を有効成分
とする抗ＨＩＶ剤。 ４、血漿蛋白質の構成アミノ酸残基のアミノ基の電荷の
極性が無水ジカルボン酸若しくは無水トリカルボン酸に
より負に化学修飾された化学修飾蛋白質を有効成分とす
る抗ＨＩＶ剤。 ５、血漿蛋白質をアルデヒド基を有する燐酸エステルと
反応させ、その後還元を行うことにより該血漿蛋白質の
構成アミノ酸残基のアミノ基の電荷の極性を負に化学修
飾した化学修飾蛋白質を有効成分とする抗ＨＩＶ剤。 ８、血漿蛋白質の構成アミノ酸残基のチオール基の電荷
の極性が四チオン酸化合物により負に化学修飾された化
学修飾蛋白質を有効成分とする抗ＨＩＶ剤。 ７、無水ジカルボン酸が無水マレイン酸若しくは無水コ
ハク酸である請求項４の抗ＨＩＶ剤。 ８、アルデヒド基を有する燐酸エステルがピリドキサル
燐酸である請求項５の抗ＨＩＶ剤。 ９、四チオン酸化合物が四チオン酸ナトリウムである請
求項６の抗ＨＩＶ剤。 １０、血漿蛋白質がヒト由来若しくはウシ由来のもので
ある請求項１乃至請求項９の抗ＨＩＶ剤。 １１、血漿蛋白質がヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロ
ブリン、ヒトトラスフェリン、ヒトフィブリノーゲン及
びウシ血清アルブミンから成る群の中から選ばれたもの
である請求項１０の抗ＨＩＶ剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1033080A JP2696379B2 (ja) | 1989-01-09 | 1989-02-13 | 抗ｈｉｖ剤 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1-2574 | 1989-01-09 | ||
| JP257489 | 1989-01-09 | ||
| JP1-18790 | 1989-01-27 | ||
| JP1879089 | 1989-01-27 | ||
| JP1033080A JP2696379B2 (ja) | 1989-01-09 | 1989-02-13 | 抗ｈｉｖ剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02275824A true JPH02275824A (ja) | 1990-11-09 |
| JP2696379B2 JP2696379B2 (ja) | 1998-01-14 |
Family
ID=27275423
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1033080A Expired - Lifetime JP2696379B2 (ja) | 1989-01-09 | 1989-02-13 | 抗ｈｉｖ剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2696379B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010106700A1 (ja) * | 2009-03-17 | 2010-09-23 | 国立大学法人東京大学 | タンパク質の電荷調節剤、及びタンパク質内包高分子ミセル複合体 |
-
1989
- 1989-02-13 JP JP1033080A patent/JP2696379B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010106700A1 (ja) * | 2009-03-17 | 2010-09-23 | 国立大学法人東京大学 | タンパク質の電荷調節剤、及びタンパク質内包高分子ミセル複合体 |
| JP5472288B2 (ja) * | 2009-03-17 | 2014-04-16 | 国立大学法人 東京大学 | タンパク質の電荷調節剤、及びタンパク質内包高分子ミセル複合体 |
| US9051354B2 (en) | 2009-03-17 | 2015-06-09 | The University Of Tokyo | Protein charge regulator and protein-encapsulating polymer micelle complex |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2696379B2 (ja) | 1998-01-14 |
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