DE69233455T2

DE69233455T2 - Modifizierte proteine und deren verwendung zur kontrolle von virusinfektionen

Info

Publication number: DE69233455T2
Application number: DE69233455T
Authority: DE
Inventors: Walter Robert JANSEN; Klaas Dirk MEIJER; Grietje Molema; Desire Erik DE CLERCQ; Wilfried Rudi PAUWELS; Dominique Schols
Original assignee: Rijksuniversiteit Groningen
Current assignee: Rijksuniversiteit Groningen
Priority date: 1991-03-11
Filing date: 1992-02-24
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2012-02-25
Also published as: AU1566392A; NL9100434A; DE69233455D1; WO1992015316A1; JP2690813B2; DK0575432T3; ATE284222T1; EP0575432A1; EP0575432B1; JPH06505264A; ES2233923T3; HK1010684A1

Description

Die Erfindung betrifft pharmazeutische Zubereitungen, welche geeignet sind zur Behandlung oder Heilung von Virusinfektionen, einschließlich Grippe, und Immundefektkrankheiten wie Retrovirusinfektionen, einschließlich AIDS und mit AIDS in Beziehung stehende Erkrankungen, und welche auch verwendet werden können, um die Fusion von virusinfizierten Zellen mit nichtinfizierten Zellen zu hemmen, wobei die Zubereitungen modifizierte Proteine oder Polypeptide als Wirkstoff oder als Substanz, die zur Wirkung beiträgt, oder als Träger für andere Stoffe, welche ebenfalls wirksam sind, enthalten.
Die Verwendung von Glykoproteinen als zellspezifische Träger für 3'-Azido-3'-desoxythymidin (AZT) ist in der Veröffentlichung von Molema G., Jansen R. W., Pauwels R., De Clerq E. und Meijer D. K. F. in Biochem. Pharmacol., Teil 40, Nr. 12, S. 2603–2610 (1990), offenbart. Bis heute ist AZT das einzige eingetragene Mittel für die Behandlung von AIDS. AZT blockiert die Synthese der viralen DNA in den infizierten Zellen. Obwohl AIDS nicht geheilt wird, verlängert das Mittel die Lebenserwartung. Unglücklicherweise greift AZT auch gesunde Zellen an und ruft daher eine große Zahl von unerwünschten Nebenwirkungen hervor. Diese Nebenwirkungen treten besonders in Geweben auf, in denen eine große Menge an DNA hergestellt wird, zum Beispiel im Knochenmark. Im Einklang mit der oben erwähnten Veröffentlichung wird vorgeschlagen, AZT mit Hilfe eines Trägermoleküls zu den Zielzellen hinzuleiten. Gemäß der oben erwähnten Veröffentlichung werden Konjugate von Albumin (HSA) und Zuckern, zum Beispiel Mannose, Fuctose, Galactose und Glucose, hergestellt und auf ihre anti-HIV-Aktivität in Kombination mit AZTMP (zur Monophosphatform phosphoryliertes AZT) getestet. Es wird angenommen, daß das Trägermolekül den Wirkstoff freisetzt, sobald das Konjugat aus Glykoprotein und Wirkstoff durch die Zielzelle absorbiert worden ist.
Die Verwendung von sulfatierten Phenylpolymeren in Zubereitungen für die Behandlung von Retrovirusinfektionen ist in EP-A-384,532 offenbart. Die in dieser Veröffentlichung erwähnten sulfatierten Phenylpolymere sind sulfatierte Polyphenylalkohole, sulfatierte Copolymere von (Meth)acrylsäure und Phenylalkohol und pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon. Diese Wirkstoffe vermindern die Cytopathogenität von HIV-1 in MT-4-Zellen und die Antigen-Expression von HIV-1 in CEM-Zellen. Sie sind auch gegen die Replikation von HIV-2 wirksam. Außerdem wird die durch HIV-1 hervorgerufene Bildung von Riesenzellen (vielkernige Syncytiumzellen) und die Adsorption von HIV-Fragmenten an CD4-positive Zellen gehemmt.
Die Erfindung betrifft pharmazeutische Zubereitungen, welche geeignet sind zur Behandlung oder Heilung von Virusinfektionen und Immundefektkrankheiten, wie Retro virusinfektionen einschließlich AIDS und mit AIDS in Beziehung stehende Erkrankungen, und welche auch verwendet werden können, um die Fusion von virusinfizierten Zellen mit nichtinfizierten Zellen zu hemmen, wobei die Zubereitungen modifizierte Proteine oder Polypeptide als Wirkstoff oder als Substanz, welche zur Wirkung beiträgt, oder als Träger für andere Stoffe, welche ebenfalls wirksam sind, enthalten; wobei die modifizierten Proteine oder Polypeptide eine zusätzliche negative Nettoladung erworben haben, indem ihre Aminogruppen und/oder andere basische funktionelle Gruppen mit einem Reagens derivatisiert wurden, welches die Protonierung von basischen Aminosäuren und/oder anderen basischen funktionellen Gruppen verhindert oder die basischen Aminosäuren und/oder anderen basischen funktionellen Gruppen durch eine oder mehrere funktionelle Gruppen mit einer negativen Ladung ersetzt, so daß die Verlängerung der Retentionszeit des Protein- oder Polypeptid-Derivats im Vergleich zu derjenigen des Proteins oder Polypeptids, welches nicht in ein Derivat umgewandelt wurde, mindestens 9 Minuten beträgt, wobei die Retentionszeit mittels FPLC über eine Anionenaustauschersäule bestimmt wird.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, daß es einen Zusammenhang zwischen der negativen Ladung der modifizierten Proteine oder Polypeptide und der antiviralen Aktivität gibt. Je negativer der Wirkstoff ist, desto größer ist die antivirale Aktivität, insbesondere die anti-HIV-Aktivität.
EP A1 406,416 offenbart ein anti-HIV-Mittel, das als Wirkstoff ein Plasmaprotein enthält, welches mit einer Dicarbonsäure, z. B. Maleinsäureanhydrid oder Bernsteinsäureanhydrid, modifiziert wurde, wodurch die Aminogruppen umgewandelt werden, so daß ihre Polarität von positiv zu negativ verändert wird.
Wie bereits oben erwähnt, kann die "zusätzliche negative Nettoladung" basierend auf der Retentionszeit quantifiziert werden. Die Retentionszeit wird zum Beispiel gemäß der folgenden chromatographischen Methode bestimmt:

– Eine Lösung der zu testenden Substanz mit einer Konzentration von 1 mg/ml wird in Tris-HCl-Puffer (0,02 M) mit einem pH von 7,5 (Puffer A) hergestellt.
– 100 μl der Probe werden in ein FPLC-System (schnelle Protein-Flüssigkeitschromatogaphie, "Fast Protein Liquid Chromatography") von Pharmacia, Woerden, Niederlande, welches mit einer Mono-Q^®-HR 5/5-Anionenaustauschersäule von Pharmacia ausgestattet ist, eingespritzt.
– Die Elution wird unter Verwendung eines Gradienten von 100% Puffer A zu 100% Puffer B, bestehend aus Puffer A + 1 M NaCl, in einer Rate von 0,25 ml/min über 30 Minuten ausgeführt,
– Die Retentionszeit wird gemessen.

Die "zusätzliche negative Nettoladung" kann auch auf andere Weise quantifiziert werden, d. h. basierend auf der theoretischen negativen Nettoladung. Dieser theoretische Wert wird durch Multiplizieren der Anzahl an derivatisierten Gruppen mit der Ladungsänderung pro derivatisierter Gruppe, zuzüglich der Ladung des Ausgangsmaterials, berechnet. Im Falle der erfindungsgemäßen negativ geladenen Polypeptide oder modifizierten Proteine ist die negative Nettoladung geringer als –60 und liegt zum Beispiel in der Größenordnung von –60 bis –300 und weniger.
Das Kriterium der theoretischen negativen Nettoladung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele veranschaulicht.
In der Verbindung Suc-HSA (ein Reaktionsprodukt von menschlichemn Serumalbumin und Bernsteinsäureanhydrid), welche im Einklang mit der Erfindung verwendet werden kann, sind alle 61 positiven NH₂ ⁺-Gruppen von Lysin durch negative COO^–-Gruppen ersetzt worden. Folglich wird eine Ladungsänderung von 2 pro Lysinrest erhalten. Die theoretische Ladung dieser Verbindung beträgt daher: –15 (aus dem ursprünglichen Albumin oder HSA) + (2 × –61) = –137. Für Rinderserumalbumin (BSA) würde der Wert für das Suc-BSA-Material –140 betragen, da der Wert für die Ladung auf dem ursprünglichen BSA –15 beträgt.
Suc-HSA, das Reaktionsprodukt von menschlichem Serumalbumin und Bernsteinsäureanhydrid, welches im Einklang mit der Erfindung verwendet werden kann, besitzt eine theoretische negative Nettoladung von –137 (= –15 + 61 × –2).
Aco-HSA, das Reaktionsprodukt von menschlichem Serumalbumin und Aconitsäureanhydrid (das Anhydrid von cis- oder trans-Prop-1-en-1,2,3-tricarbonsäure), welches im Einklang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, besitzt eine theoretische negative Nettoladung von –196 (= –15 + (61 × –2)).
Die negative Ladung für das sehr stabile Reaktionsprodukt von Albumin und Propan-1,2,3-tricarbonsäureanhydrid, welches zu bevorzugen ist, weist einen ähnlichen Wert auf.
Außerdem beträgt die Verlängerung der Retentionszeit im Vergleich zu derjenigen von HSA, bestimmt unter den beschriebenen chromatographischen Bedingungen, 13 Minuten für Aco-HSA und 11,5 Minuten für Suc-HSA.
Weiterhin wird die theoretische Ladung auf den Proteinen/Polypeptiden als ein Durchschnittswert der Ladung auf allen in dem Molekül vorhandenen Aminosäuren (etwa 600 Aminosäuren im Falle von Serumalbumin) berechnet.
Es ist auch möglich, drei oder mehrere Carboxylgruppen pro Aminogruppe/basische Gruppe in die Ausgangsmaterialien einzuführen, welche im Einklang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Natürlich werden darin Wirkstoffmaterialien erhalten, welche eine noch höhere negative Ladung und eine Verlängerung der Retentionszeit, welche noch größer als der oben erwähnte Wert ist, aufweisen.
Die modifizierten Proteine oder Polypeptide, welche eine zusätzliche negative Nettoladung enthalten und welche in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen verwendet werden können, werden in der restlichen Beschreibung als "negativ geladene Polypeptide" bezeichnet. Verbindungen dieses Typs sind im allgemeinen wasserlöslich und können in einer Ionenform vorliegen.
Die negativ geladenen Polypeptide sind vorzugsweise Polyaminosäuren und modifizierte Plasmaproteine wie Albumin und saure α-Glylcoproteine ("Orosomukoid"). Polypeptide mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von etwa 70.000 sind geeignet. Jedoch kann das Molekulargewicht auch deutlich höher oder niedriger seins; wobei der wichtige Faktor dabei ist, daß eine polyanionische Polypeptidstruktur in dem Molekül vorliegt.
Es ist festgestellt worden, daß Lysin und Histidin als zu derivatisierende Gruppen in den negativ geladenen Polypeptiden zur Verwendung im Einklang mit der Erfindung bevorzugt werden. Die stickstoffhaltige Gruppe in Lysin ist eine Aminogruppe, während die stickstoffhaltige Gruppe in Histidin als eine "andere basische funktionelle Gruppe" angesehen wird. Außerdem kann auch zum Beispiel Polylysin geeigneterweise im Einklang mit der Erfindung verwendet werden.
Übliche Chemikalien, welche eine zusätzliche negative Nettoladung in das Ausgangsmaterial einführen können, werden verwendet, um das Derivat herzustellen. Vorzugsweise werden jedoch Aldehyde, Anhydride, Säurechloride und Iso(thio)cyanate verwendet. Es ist festgestellt worden, daß Reagenzien dieses Typs negativ geladene Polypeptide ergeben, welche eine pharmazeutische Zubereitung mit einer hervorragenden Wirkung gegen die oben erwähnten Erkrankungen und Zustände vorsehen.
Die folgenden Stoffe können als Beispiele für Reagenzien für die Herstellung der Derivate von Proteinen und Polypeptiden erwähnt werden.
1. Anhydride
1.1. Geradkettige Anhydride (nicht Bestandteil der Erfindung
Diese Anhydride ergeben bei der Umsetzung mit Aminen in Proteinen Amidbindungen, welche bei einem physiologischen pH nicht protoniert sind. NH₃ ⁺ → neutrales Amid
(Ladungsänderung = –1)
1.1.1. Symmetrische Anhydride
1.1.2. Asymmetrische Anhydride
1.2.1. Cyclische Anhydride (nicht Bestandteil der Erfindung)
Diese Anhydride ergeben bei der Umsetzung mit Aminen in Proteinen Amidbindungen, welche bei einem physiologischen pH nicht protoniert sind. Zusätzlich führen sie eine Carboxylgruppe ein, welche bei einem physiologischen pH deprotoniert ist. NH₃ ⁺ → neutrales Amid + negative Carboxylgruppe (Ladungsänderung = –2)
1.2.2. Cyclische Anhydride mit einer zusätzlichen Carboxylgruppe in dem Ring
Diese Anhydride ergeben bei der Umsetzung mit Aminen in Proteinen Amidbindungen, welche bei einem physiologischen pH nicht protoniert sind. Zusätzlich führen sie zwei Carboxylgruppen ein, welche bei einem physiologischen pH deprotoniert sind. NH₃ ⁺ → neutrales Amid + 2 negative Carboxylgruppen (Ladungsänderung = –3)
2. Säurehalogenide (im allgemeinen Säurechloride) (nicht Bestandteil der Erfindung)
Diese Verbindungen ergeben bei der Umsetzung mit Aminen in Proteinen Amidbindungen, welche bei einem physiologischen pH nicht protoniert sind. NH₃ ⁺ → neutrales Amid (Ladungsänderung = –1)
Die letzten zwei Verbindungen ergeben eine Ladungsänderung von –2, da zusätzlich zu der Entfernung der positiven Ladung aus der Aminogruppe eine negative Ladung in die Sulfonylgruppe eingeführt wird.
3. Aldehyde (nicht Bestandteil der Erfindung)
Diese Verbindungen ergeben bei der Umsetzung mit Aminen in Proteinen Imine. NH₃ ⁺ → neutrales Imin (Ladungsänderung = –1)
4. Isothiocyanate (nicht Bestandteil der Erfindung)
Diese Verbindungen ergeben bei der Umsetzung mit Aminen in Proteinen Thiocarbamylbindungen, welche bei einem physiologischen pH nicht protoniert sind. NH₃ ⁺ → neutrales Thiocarbamyl (Ladungsänderung = –1)
5. Isocyanate (nicht Bestandteil der Erfindung)
Diese Verbindungen ergeben bei der Umsetzung mit Aminen in Proteinen Harnstoffbindungen, welche bei einem physiologischen pH nicht protoniert sind. NH₃ ⁺ → neutraler Harnstoff (Ladungsänderung = –1)
Die oben erwähnten Reagenzien für den Erhalt polyanionischer Proteine oder Polypeptide sind keineswegs vollständig und gegen nur einige wenige Beispiele aus den verschiedenen Gruppen wieder.
Für alle Reagenzien gilt, daß zusätzliche anionische funktionelle Gruppen, wie Phosphate, Sulfate und Carboxylgruppen, falls möglich, in die Kette in einer solchen Weise eingebaut werden können, daß zusätzliche negative Ladungen eingeführt werden.
Da die zusätzliche negative Nettoladung auf den erfindungsgemäß verwendeten Polypeptiden für die Wirkung sehr wichtig ist, enthält das Protein-Ausgangsmaterial oder das Polypeptid-Ausgangsmaterial vorzugsweise so viele Gruppen wie möglich, welche derivatisiert werden können und auf diese Weise eine zusätzliche negative Ladung erwerben. Vorzugsweise weisen die natürlichen oder synthetischen Oligopeptide, welche als Ausgangsmaterialien verwendet werden, einen Anteil von mehr als 5%, insbesondere mehr als 15% und auch mehr bevorzugt mehr als 25% an Aminosäuren auf, welche funktionelle Aminogruppen oder andere basische funktionelle Gruppen, zum Beispiel das oben erwähnte Lysin und Histidin, enthalten.
Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können enteral oder parenteral verabreicht werden. Präparate, welche parenteral oder enteral verabreichbar sind, können auch aus den erfindungsgemäßen Zubereitungen hergestellt werden.
Medikamente, welche die erfindungsgemäßen negativ geladenen Polypeptide enthalten, können in Form von Pulvern, Suspensionen, Lösungen, Sprays, Emulsionen, Salben oder Cremes vorliegen, und können für die topische Anwendung, für die intranasale, rektale oder vaginale Verabreichung und auch für die orale oder parenterale (intravenös, intradermal, intramuskulär, intrathekal und dergleichen) Verabreichung verwendet werden. Solche Zubereitungen können durch das Kombinieren der negativ geladenen Polypeptide (zum Beispiel durch Mischen, Lösen oder dergleichen) mit pharmazeutisch annehmbaren Excipienten vom neutralen Typ, wie wäßrige oder nichtwäßrige Lösungsmittel, Stabilisatoren, Emulgiermittel, Detergenzien und Additive, und auch gegebenenfalls mit Färbemitteln und Aromastoffen hergestellt werden. Die Konzentration des negativ geladenen Polypeptids in der erfindungsgemäßen Zubereitung kann sehr variieren und beträgt abhängig von der Verabreichungsweise zwischen 0,001%, vorzugsweise 0,1%, und 100%. Ferner kann die Dosis des zu verabreichenden negativ geladenen Polypeptids zum Beispiel zwischen 0,1 und 100 mg/kg Körpergewicht liegen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Stoffen, welche eine erworbene zusätzliche negative Nettoladung, wie oben definiert, besitzen, als Wirkstoff oder als Substanz, welche zur Wirkung beträgt, oder als Träger für den Wirkstoff bei der Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen, welche geeignet sind zur Behandlung oder Heilung von Virusinfektionen und Immundefektkrankheiten, wie Retrovirusinfektionen einschließlich AIDS und mit AIDS in Beziehung stehende Erkrankungen, und welche verwendet werden können, um die Fusion von infizierten Zellen mit nichtinfizierten Zellen zu hemmen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, welche durch Retrovirusinfektionen verursacht werden, wie AIDS und mit AIDS in Beziehung stehende Erkrankungen, oder von Zuständen, bei denen eine Fusion des Virus mit Zellen oder eine Fusion von virusinfizierten Zellen mit nichtinfizierten Zellen erfolgt, wobei bei dem Verfahren ein zusätzlich negativ geladenes Protein oder Polypeptid, wie oben definiert, verwendet wird.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von modifizierten Proteinen und Polypeptiden, wobei bei dem Verfahren die Aminogruppen und/oder andere basische funktionelle Gruppen der Proteine oder Polypeptide mit einem Reagens derivatisiert werden, welches die Protonierung von basischen Aminosäuren verhindert, wobei die Proteine oder Polypeptide eine zusätzliche negative Nettoladung erwerben, so daß die Verlängerung der Retentionszeit des Protein- oder Polypeptid-Derivats im Vergleich zu derjenigen des Proteins oder Polypeptids, welches nicht in ein Derivat umgewandelt wurde, mindestens 9 Minuten beträgt, wobei die Retentionszeit mittels FPLC (schnelle Protein-Flüssigkeitschromatogaphie, "Fast Protein Liquid Chromatography") über eine Anionenaustauschersäule bestimmt wird.
Die Erfindung betrifft auch die neuen modifizierten Proteine und Polypeptide, umfassend ein Protein oder Polypeptid, worin die Aminogruppen und/oder andere basische funktionelle Gruppen mit einem Reagens umgesetzt worden sind, welches die Protonierung der basischen Aminosäuren und/oder anderen basischen Gruppen verhindert oder die basischen Aminosäuren und/oder anderen basischen Gruppen durch eine oder mehrere funktionelle Gruppen mit einer negativen Ladung ersetzt, wobei die modifizierten Proteine oder Polypeptide eine zusätzliche negative Nettoladung im Vergleich zu dem unmodifizierten Protein oder Polypeptid aufweisen, so daß die Verlängerung der Retentionszeit des Protein- oder Polypeptid-Derivats im Vergleich zu derjenigen des Proteins oder Polypeptids, welches nicht in ein Derivat umgewandelt wurde, mindestens 9 Minuten beträgt, wobei Retentionszeit mittels FPLC über eine Anionenaustauschersäule bestimmt wird.
Im Einklang mit der Erfindung ist festgestellt worden, daß negativ geladene Polypeptide u. a. wirksame und selektive anti-HIV-Mittel sind, welche die Syncytiumbildung und die Virus-Zell-Fusion wesentlich vermindern, nicht an das OKT4A-Epitop des CD4-Rezeptors binden und nur eine geringe Hemmwirkung auf die Wechselwirkung von anti-gp120 und mAb gp120 und die Bindung des Virus an Zellen in sehr geringen Konzentrationen besitzen. Die im Einklang mit der Erfindung verwendeten oder hergestellten negativ geladenen Polypeptide weisen keine oder nur eine geringe Toxizität auf.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die nachstehend beschriebenen Untersuchungen veranschaulicht.
Untersuchungen
Herstellung eines negativ geladenen Albumins mit Hilfe von Formaldehyd und Bernsteinsäureanhydrid (Form-HSA und Suc-HSA)
500 mg HSA wurden in 50 ml 0,2 M Na₂CO₃ (pH 10,0) gelöst. Anschließend wurde Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 20%, bezogen auf das Gewicht des Ausgangsmaterials, zugesetzt, und die gebildete Lösung wurde im Dunkeln für 72 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Um das unlösliche Material zu entfernen, wurde die Lösung durch einen Filter mit Poren von 0,2 um filtriert, auf einer Sephadex G25-Säule gereinigt, mit destilliertem Wasser auf einer PM10-Membran in einem "Zellen-Konzentrationsgerät mit Rührwerk" von Amicon gewaschen und schließlich gefriergetrocknet, wobei Form-HSA erhalten wurde.
500 mg HSA wurden in 50 ml 0,2 M K₂HPO₄ (pH 8,0) gelöst. 500 mg festes Bernsteinsäureanhydrid wurden zugegeben, und die Lösung wurde gerührt, bis sich das Bernsteinsäureanhydrid aufgelöst hatte. Der pH wurde unter Verwendung von 6 M Natriumhydroxid zwischen 8,0 und 8,5 gehalten. Die Reinigung wurde ausgeführt, wie für Form-HSA beschrieben wurde. Es wurde reines Suc-HSA erhalten.
Die zusätzliche negative Nettoladung des modifizierten Albumins wurde mit Hilfe eines FPLC-Systems (schnelle Protein-Flüssigkeitschromatogaphie, "Fast Protein Liquid Chromatography") von Pharmacia, Woerden, Niederlande, unter Verwendung einer Mono-Q-Anionenaustauschersäule von Pharmacia bestimmt. Puffer A war ein 0,02 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), und Puffer B bestand aus Puffer A plus 1 M NaCl. Die Elution wurde unter Verwendung eines Gradienten von 100% A zu 100% B in einer Rate von 0,25 ml/min über 30 Minuten ausgeführt. Die Proben des zu untersuchenden Stoffes wurden in einer Menge von 1 mg/ml in Puffer A gelöst, und in jedem Fall wurden 100 μl in das FPLC-System eingespritzt.
MT-4-Zellen aus einer HTLV-I tragenden T₄-Lymphocytenzelllinie wurden für den anti-HIV-1-Test verwendet. Die MT-4-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10 Vol.-% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) und 20 μg/ml Gentamicin, gezüchtet. MOLT-4-Zellen (Clon 8; vgl. J. Virol. 57, 1159–1162) wurden für den Test in Verbindung mit der Syncytiumbildung verwendet. Die Zellen wurden in einer feuchten Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft bei einer Temperatur von 37°C aufrechterhalten. Alle 3–4 Tage wurden die Zellen abzentrifugiert und in neue Kulturflaschen transferiert (2 × 10⁵ Zellen/ml). Die Zellen wurden regelmäßig auf die Anwesenleit von Mycoplasmen untersucht; wobei immer festgestellt wurde. daß sie frei von Mycoplasmen sind.
HIV-1 (Stamm HTLV-III_B) wurde aus der Kulturflüssigkeit von HIV-1-infizierten HUT-78-Zellen erhalten. Der Virustiter der Kulturflüssigkeit wurde in MT-4-Zellen bestimmt. Das Virus wurde bei –70°C gelagert.
Die antivirale Aktivität der negativ geladenen Polypeptide wurde basierend auf der Hemmwirkung auf eine virusinduzierte Cytopathogenität in MT-4-Zellen bestimmt und mit Hilfe der 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Methode, welche in J. Virol. Methods 20, 309–321, beschrieben ist, protokolliert.
Die Syncytiumbildung wurde wie folgt nachgewiesen. Die modifizierten Polypeptide wurden in RPMI verdünnt und in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten übertragen. 5 × 10⁴ HIV-1-infizierte HUT-78-Zellen, welche vorher zweimal gewaschen worden waren, um freie Viruspartikel zu entfernen, wurden dann zu den Vertiefungen zugegeben, unmittelbar gefolgt durch die Zugabe von 5 × 10⁴ MOLT-4-Zellen, wobei ein Endvolumen von 200 μl erhalten wurde. Die Zellmischungen wurden bei 37°C in einem CO, enthaltenden Zellinkubator gezüchtet. Die ersten Syncytien wurden nach 4–6 Stunden gebildet. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch eine mikroskopische Untersuchung und mittels Laser-Durchflußcytofluorographie analysiert.
Der Test in Verwendung mit der Virusadsorption wurde wie folgt ausgeführt.
MT-4-Zellen wurden HIV-1-Virionen in Abwesenheit oder Anwesenheit der erfindungsgemäßen negativ geladenen Polypeptide ausgesetzt. Nach einer Inkubation für 30 Minuten bei 37°C wurden die Zellen gewaschen, um ungebundene Viruspartikel zu entfernen. Die Zellen wurden dann unter Verwendung eines polyclonalen Antikörpers für HIV-1 für einen indirekten Fluoreszenznachweis gefärbt, und die an die Zellen gebundenen HIV-1-Partikel wurden mittels Laser-Durchflußcytofluorographie analysiert.
Der CD4-Immunfluoreszenztest wurde mittels der in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 Nr. 42, 3322–3326, beschriebenen Methode ausgeführt. MT-4-Zellen wurden über verschiedene Zeiträume bei Raumtemperatur in Abwesenheit oder Anwesenheit eines negativ geladenen Polypeptids inkubiert. Die Zellen wurden darin mit optimalen Konzentrationen der monoclonalen Antikörper OKT4A-FITC (Orthodiagnostics) oder anti-leu3a-PE und "Simultest Immuno Monitoring" mit einem Kontrollmaterial (FITC-markiertes IgG₁ und PE-markiertes IgG₂) (Becton Diclinson) für 20 Minuten bei 4°C gefärbt, einmal in PBS gewaschen und in 0,5 ml 0,5 Gew.-% Parafomaldehyd in PBS fixiert.
Die oben beschriebenen Untersuchungen zeigten, daß eine deutliche Korrelation zwischen der antiviralen Aktivität und der negativen Ladung besteht. Zum Beispiel wird durch das einfache Succinylieren der Lysingruppen von Albumin eine anionische Verbindung erhalten, welche einen sehr niedrigen IC₅₀-Wert (1 μg/ml) besitzt. Für keines der getesteten negativ geladenen Polypeptide wurde bei Konzentrationen von bis zu 1.000 μg/ml eine Cytotoxizität nachgewiesen.
Das Aco-HSA-Material wurde analog zu dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt. Die anti-HIV-Aktivität dieses Materials ist sehr hoch: IC₅₀ = 0.0056 μg/ml. Diese Verbindung ist daher 175mal wirksamer als Suc-HSA und ist eine der aktivsten Verbindungen, welche gegenwärtig bekannt sind (ungefähr 25mal aktiver als AZT).
Die erfindungsgemäßen negativ geladenen Polypeptide hemmen die Virusadsorption nur in einem geringen Ausmaß; zum Beispiel in einer Konzentration von 100 μg/ml. Zum Vergleich: Dextransulfat hemmte die Virusadsorption in einer Konzentration von 25 μg/ml praktisch vollständig.
Die Syncytiumbildung wird durch die erfindungsgemäßen negativ geladenen Polypeptide erkennbar vermindert; zum Beispiel um 50% bei einer Konzentration von nur etwa 2 μg/ml. Um eine ähnliche Hemmung mit zum Beispiel Dextransulfat zu erhalten, ist eine Konzentration von 28 μg/ml notwendig, was einer Menge entspricht, die etwa 50mal höher als der IC₅₀-Wert hiervon in dem antiviralen Test ist (0,6 μg/ml).
Es ist bekannt, daß OKT4A-mAb an ein Epitop des CD4-Moleküls bindet, welches für die HIV-Adsorption verantwortlich ist, und die Bindung von HIV-Partikeln an die Zellen verhindern kann. Aurintricarbonsäure (ATA) ruft eine spezifische Wechselwirkung mit diesem Epitop des CD4-Moleküls hervor und wurde als positive Kontrolle verwendet. Die OKT4A-mAb-CD4-Wechselwirkung wurde durch ATA in einer Konzentration von 25 μg/ml vollständig gehemmt. Die erfindungsgemäßen negativ geladenen Polypeptide (und auch Dextransulfat) hatten in Konzentrationen von bis zu 100 μg/ml keinen Einfluß auf diese Wechselwirkung, woraus gefolgert werden kann, daß die erfindungsgemäßen Wirkstoffe nicht an dieses Epitop des CD4-Rezeptors binden.
Persistent HIV-1-infizierte HUT-78-Zellen und ein spezifischer anti-gp120-mAb, welcher die V3-Region von gp120 erkennt und welcher bei der Bildung von Riesenzellen eine wichtige Rolle spielt, wurden bei der Untersuchung der direkten Wechselwirkung der negativ geladenen Polypeptide mit dem viralen gp120 verwendet. Dextransulfat hemmte die Bindung von anti-gp120-mAb an gp120 in einer konzentrationsabhängigen Weise, wobei die verwendeten Mengen den Mengen entsprechen, welche eine antivirale Wirkung besitzen. Die erfindungsgemäßen negativ geladenen Polypeptide hemmen die anti-gp120-mAb-gp120-Wechselwirkung ebenfalls in einer konzentrationsabhängigen Weise. Doch ist die Konzentration, welche für eine 50%ige Hemmung notwendig ist, um ein Vielfaches (zum Beispiel 100mal) höher als der IC₅₀-Wert, woraus gefolgert werden kann, daß die Abschirmung von gp120 wahrscheinlich nicht der einzige Wirkungsmechanismus der erfindungsgemäßen Verbindungen ist.
Der Wirkungsmechanismus der erfindungsgemäßen Verbindungen basiert auf der Verhinderung der Fusion des Virus mit den Zellen und mit einer Verbindung aus der Fusion von infizierten Zellen mit nichtinfizierten Zellen. Sehr wahrscheinlich ist hier die Wechselwirkung der Verbindungen mit viralen Fusionsproteinen (wie GP41 im Falle von HIV) unbedingt erforderlich. Dieser Wirkungsmechanismus ist vorher zu keiner Zeit beschrieben worden.
Verfahren für weitere Experimente und Ergebnisse hiervon in Verbindung mit einer antiviralen und antikoagulierenden Wirkung
Es wird auf die beigefügten Tabellen 1, 2, 3 und 4 Bezug genommen.
Die antivirale Aktivität von zwei erfindungsgemäßen Stoffen (Aco-HSA und Suc-HSA) gegen Viren, welche einen Immundefekt hervorrufen, wird mit der Aktivität von Dextransulfat, einer anderen polyanionischen antiviralen Verbindung, verglichen. Schlußfolgerung: Die erfindungsgemäßen Stoffe sind gegen HIV-1, HIV-2, FIV und SIV wirkam.
Der anti-HIV-1-Test ist bereits vorstehend beschrieben worden.
HIV-2 (LAV-2_ROD) (erhalten von Dr. L. Montagnier, Paris, Frankreich) wurde aus dem Mediumüberstand von persistent LAV-I_ROD-infizierten MOLT-4-Zellen isoliert. Der anti-HIV-2-Test ist mit dem anti-HIV-1-Test identisch.
FIV-48 und FIV-113 wurden aus peripheren einkernigen Blutzellen von seropositiven Wildkatzen isoliert. Der anti-FIV-Test wurde gemäß der Methode von Egberink et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 3087–3091) ausgeführt.
Thymocyten aus einer Mitogen-stimulierten Katze wurden in 1,6 cm² große Vertiefungen (10⁶ Zellen pro ml) in Gegenwart verschiedener Konzentrationen der zu testenden Stoffe ausplattiert. Nach Inkubation für 1 Stunde bei 37°C wurde FIV in einer Menge zugesetzt, welche einer reversen Transkriptase (RT)-Aktivität von 6 × 10⁶ CpM entspricht. Nach Inkubation für 1 Stunde bei 37°C wurde das Medium durch frisches Medium, enthaltend verschiedene Konzentrationen der zu testenden Stoffe, ersetzt. Die RT-Aktivität in dem Überstand wurde nach Inkubation für 4 bzw. 6 Tage bei 37°C bestimmt (vgl. Tabelle 2).
Die antivirale Aktivität von zwei erfindungsgemäßen Stoffen (Aco-HSA und Suc-HSA) gegen DNA-Viren wird mit der Aktivität von Dextransulfat, einer anderen polyanionischen antiviralen Verbindung, verglichen. Schlußfolgerung: Die erfindungsgemäßen Stoffe weisen im Gegensatz zu Dextransulfat keine Aktivität gegen die getesteten DNA-Viren auf.
Anti-CMV-Test: Menschliche embryonale Lungen (HEL)-Fibroblasten wurden in MEM-Medium, zu dem 10% fötales Kälberserum, 1% L-Glutamin und 0,3% Natriumbicarbonat zugegeben wurden, gezüchtet. Die Zellen wurden mit 100 PFU (Plaque-bildenden Einheiten) des menschlichen Cytomegalievirus (CMV; Stamm AD 169 und Davis-Stamm) infiziert. Zur gleichen Zeit wurden die zu testenden Stoffe in verschiedenen Konzentrationen zugegeben. Die Virus-Plaquebildung und der durch das Virus verursachte Zelltod wurden bestimmt, wie durch Snoek et al., 32 (1988), 1839–1844 beschrieben wurde (vgl. Tabelle 2).
Die antivirale Aktivität von zwei erfindungsgemäßen Stoffen (Aco-HSA und Suc-HSA) gegen RNA-Viren wird mit der Aktivität von Dextransulfat, einer anderen polyanionischen antiviralen Verbindung, verglichen. Schlußfolgerung: Die erfindungsgemäßen Stoffe weisen mit Ausnahme von Grippe keine Aktivität gegen die getesteten RNA-Viren auf. Im Gegensatz dazu weist Dextransulfat nur eine Aktivität gegen VSV und das Sindbis-Virus auf.
Die Aktivität der Stoffe gegen das Poliovirus, Coxsackie-Virus, VSV, Sindbis-Virus, Semliki-Forest-Virus, Reovirus, Parainfluenzavirus, HSV-1, HSV-2 und das VMW-Virus wurde auf folgende Weise bestimmt:
Konfluente Zellkulturen (Vero-Zellen, HeLa-Zellen und primäre Kaninchen-Nierenzellen) wurden mit den verschiedenen Viren bis zu dem 100fachen der CCID₅₀ (der für 50% der Zellkultur infektiösen Dosis) in Gegenwart verschiedener Konzentrationen der zu testenden Stoffe beimpft. Nach 1 Stunde wurde das Medium durch Medium ersetzt, worin nur noch die zu testenden Stoffe in verschiedenen Konzentrationen vorhanden waren. Der durch die Viren verursachte Zelltod wurden im Anschluß an die Infektion nach 1 bis 2 Tagen für VSV; nach 2 Tagen für das Coxsackie-Virus, Semliki-Forest-Virus und das Poliovirus; nach 2 bis 3 Tagen für HSV-1, HSV-2 und das Sindbis-Virus; und nach 6 Tagen für das Parainfluenzavirus und das Reovirus bestimmt.
Die Aktivität der zu testenden Stoffe gegen das Sendai-Virus und das Grippevirus wurde durch Messen der Fusion der Virusmembran mit Erythrocytenschatten und Liposomen und mit BHK-21-Zellen oder LLC-MK₂D-Zellen bestimmt. Zu diesem Zweck wurde die R₁₅-Dequenching-Methode, wie durch Hoekstra et al., Biochemistry 23 (1984), 5675–5681, und Wildschut et al. in Molecular Mechanisms of Membrane Fusion (Ohki S., Doyle D., Flanagan T. D., Hui S. W. und Mayhew E., Herausgeber), 1988, Plenum Press, New York, S. 441–450, beschrieben, angewendet.
Zusammenfassung: Das Grippevirus und das Sendai-Virus wurden mit R₁₅ markiert, woraus eine 70%ige Selbstauslösung der Fluoreszenz resultierte. 35 μl einer konzentrierten Suspension des R₁₅-markierten Virus wurden in eine Küvette eingebracht, welche Liposomen und Erythrocytenschatten von verschiedenen Zellen (in HEPES-Puffer) enthielt, und die durch die Fusion hervorgerufene Zunahme der Fluoreszenz (Dequenching) wurde durchgängig gemessen (Anregung 560 nm, Emission 590 nm). Dasselbe Verfahren wurde in Gegenwart verschiedener Konzentrationen der zu testenden Stoffe ausgeführt.
Andere polyanionische antivirale Verbindungen wie Dextransulfat und Heparin weisen als wesentliche negative Nebenwirkung eine schwerwiegende antikoagulierende Aktivität auf. Die erfindungsgemäßen Stoffe weisen diese Nebenwirkung nicht auf. Nur Aco-HSA weist bei hohen Konzentrationen von zum Beispiel 100 μg/ml (dies entspricht einem Wert von mehr als 10.000 × der antiviralen Konzentration) eine geringe antikoagulierende Aktivität auf. Tabelle 1 Hemmwirkung (IC₅₀: μg/ml) polyanionischer Verbindungen auf Retroviren

+: Aktivität bestimmt.
ND: Nicht bestimmt.

Tabelle 2 Hemmwirkung (IC₅₀: μg/ml) polyanionischer Verbindungen auf DNA-Viren
Tabelle 3 Hemmwirkung (IC₅₀: μg/ml) polyanionischer Verbindungen auf die Replikation von RNA-Viren
Tabelle 4 Antikoagulierende Wirkung der Verbindungen, bestimmt als APTT (sec)
Die Verbindungen wurden in PBS, pH 7,2, gelöst, und 30 μl wurden zu 270 μl Plasma zugegeben.
Als Kontrolle wurden 30 μl PBS zu 270 μl Plasma zugegeben, woraus sich ein APTT-Wert von 38,0 sec ergab.
APTT = Aktivierte partielle Thromboplastinzeit (Sekunden).
Die APTT wurde mittels Standardverfahren elektromechanisch bestimmt.

Claims

Modifiziertes Protein oder Polypeptid, umfassend ein Protein oder Polypeptid, worin die Aminogruppen und/oder andere basische funktionelle Gruppen mit einem Reagenz umgesetzt worden sind, welches die Amino- und/oder die anderen basischen funktionellen Gruppen durch ein oder mehrere funktionelle Gruppen ersetzt, worin: (a) die funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus cis-Aconitat-Gruppen, wobei die cis-Aconitat-Gruppen von cis-Aconitsäureanhydrid abgeleitet sind, (b) das modifizierte Protein oder Polypeptid eine zusätzliche negative Nettoladung aufweist, sodass die Verlängerung der Retentionszeit des Protein- oder Polypeptid-Derivats im Vergleich zu der des Proteins oder Polypeptids, welches nicht in das Derivat umgewandelt wurde, mindestens 9 Minuten beträgt und (c) das modifizierte Protein oder Polypeptid eine polyanionische Polypeptidstruktur enthält.
Modifiziertes Protein oder Polypeptid nach Anspruch 1, worin das modifizierte Protein oder Polypeptid aus Polyaminosäuren und modifizierten Plasmaproteinen erhalten worden ist.
Verfahren zur Herstellung von modifizierten Proteinen oder Polypeptiden, worin die Aminogruppen und/oder andere basische funktionelle Gruppen der Proteine oder Polypeptide mit einem Reagenz derivatisiert werden, welches die Amino- und/oder die anderen basischen funktionellen Gruppen durch ein oder mehrere funktionellen Gruppen ersetzt, worin: (a) die funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus cis-Aconitat-Gruppen, (b) das Reagenz cis-Aconitsäureanhydrid ist, (c) das modifizierte Protein oder Polypeptid eine zusätzliche negative Nettoladung aufweist, sodass die Verlängerung der Retentionszeit des Protein- oder Polypeptid-Derivats im Vergleich zu der des Proteins oder Polypeptids, welches nicht in das Derivat umgewandelt wurde, mindestens 9 Minuten beträgt und (d) die Proteine oder Polypeptide eine polyanionische Polypeptidstruktur erlangen.
Verfahren nach Anspruch 3, worin das modifizierte Protein oder Polypeptid aus Polyaminosäuren und modifizierten Plasmaproteinen erhalten worden ist.
Pharmazeutische Zubereitungen zur Behandlung oder Heilung von HIV-Infektionen, wobei die Zubereitungen modifizierte Proteine oder Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 2 enthalten.
Pharmazeutische Zubereitungen nach Anspruch 5, worin die HIV-Infektion eine HIV-1-Infektion ist.
Pharmazeutische Zubereitungen zur Behandlung oder Heilung von Grippe, wobei die Zubereitungen modifizierte Proteine oder Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 2 enthalten.
Verwendung eines modifizierten Proteins oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 2 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von HIV-Infektionen.
Verwendung nach Anspruch 8, worin die HIV-Infektion eine HIV-1-Infektion ist.
Verwendung eines modifizierten Proteins oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 2 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Grippe.