DE69634959T2

DE69634959T2 - Antivirale isolate von blutegeln

Info

Publication number: DE69634959T2
Application number: DE69634959T
Authority: DE
Inventors: Gerard Voerman
Original assignee: Vitaleech Bioscience N V; VITALEECH BIOSCIENCE NV
Current assignee: Vitaleech Bioscience N V; VITALEECH BIOSCIENCE NV
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1996-11-13
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2016-11-14
Also published as: CA2235394A1; EP0861085B1; DE69634959D1; DK0861085T3; EP0861085A1; JP2000500156A; ES2246498T3; ATE299707T1; WO1997017981A1; US6270808B1; AU7508196A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der antiviralen Verbindungen, z. B. in dem Gebiet der Immunkrankheiten, insbesondere der erworbenen Immunkrankheiten, noch genauer Infektionen mit dem menschlichen Immunschwächevirus.
Ein neues menschliches Immunschwächevirus mit opportunistischen Infektionen und Bösartigkeit wurde 1981 beschrieben. Das verursachende Agenz stellte sich als Retrovirus heraus, das Menschliche Immunschwächevirus (HIV). Die Pathogenese der Krankheit beginnt mit der Veränderung und schließlich der Erschöpfung der T4-Lymphocytenzellen, was zu einer fortschreitenden Zerstörung des Immunsystems führt.
HIV ist ein Retrovirus, das aus einem verkapselten RNA-Genom besteht, welches von einer doppelschichtigen Kernmembran umgeben ist. Ein früher Befund war die Variation der Nucleotidsequenzen bestimmter Teile des Genoms, insbesondere in dem Gen für die Hülle (Shaw et al., 1986).
Das gag- und das pol-Gen von HIV werden als zwei Polyproteine (Pr55gag und Pr160gag-pol) transkribiert (Jacks et al., 1988). Diese werden anschließend durch die Aktivität einer durch das Virus codierten Protease in vier strukturelle gag-Proteine des Virion-Kerns (p17, p24, p7 und p6) (Veronese, F.D. et al., 1987) und in die durch pol codierten Enzyme, die zur Replikation des Retrovirus essentiell sind (Protease, reverse Transkriptase, Ribonuclease H und Endonuclease) gespalten.
Die Komponente gp120 des viralen Kern-Glycoprotein-Vorläufers gp160 bindet an CD-4, einen zellulären Rezeptor der empfänglichen T-Zellen-Unterklasse, mit hoher Affinität (Berman et al., 1989). Daher ist die virale Erkennung und die Fusion von CD4 mit gp120 ein Schlüsselereignis in dem Infektionszyklus. Es sollte jedoch auch angemerkt werden, dass andere Faktoren ebenfalls eine Rolle spielen können: neutralisierende Antikörper gegen die V3-Schleife von gp120 verhindern die Infektion, obwohl sie nicht die Bindung an CD4 verhindern (Rusche et al., 1985), und.
Es kann die produktive Infektion von Monocyten bei Abwesenheit der Vermehrung und der DNA-Synthese der T-Lymphocyten erfolgen und als ein relativ langlebiges Reservoir des Virus dienen (Weinberg et al., 1991).
Die Entwicklung von Arzneistoffen gegen HIV-Infektionen zielte bisher auf die Verhinderung der Fusion zwischen dem CD4-Membranprotein und dem viralen gp120 ab und somit auf die Verhinderung der Vermittlung des Eintritts des HIV in das Cytoplasma von T4-Lymphocyten. Die Impfung mit rekombinantem gp120 (rgp120) führte zum Schutz von Schimpansen gegenüber einer HIV-Infektion (Berman P.W. et al., 1990). Die cytopathische Fusion von CD4-Zellen (Syncytien) erfolgt bei der Expression von gp120 an der Plasmamembran. Lösliches CD4 blockiert die Sekretion, und die Expression von gp120 an der Oberfläche verhindert eine solche Zellfusion (Buonocore & Rose, 1990).
Andere Versuche, Arzneistoffe gegen eine Infektion mit HIV zu entwickeln, konzentrierten sich bislang auf die Hemmung der reversen Transkriptase (RT) des HIV und der HIV-Protease. Die RT ist der Zielort von AZT, dem ersten anti-HIV-Arzneistoff mit klinischer Anwendung. Es wurde herausgefunden, dass das TIBO-Derivat R82150 50 % der HIV-RT bei einer Konzentration von 3,1 μM, beziehungsweise von 4,9 μM für unterschiedliche Virusstämme hemmt (Pauwels et al., 1990).
Die Hemmung der HIV-Protease wird zum Beispiel in EP 541168 , US 5,196,438 und in WO 092/08701 offenbart. Die Hemmung von Proteasen führt zur Bildung von nicht infektiösen Viruspartikeln und nicht prozessierten gag- und gag-pol-Vorläuferproteinen (Kohl et al., 1988; Loeb et al., 1990). Kürzlich erschienene Offenlegungen in der Patentliteratur, die auf die Hemmung entweder der HIV-Protease oder der HIV-RT abzielten; sind: WO 95/20384, WO 95/16688, WO 94/06454, EP 0666755 , EP 0666842 , WO 95/14011 und viele andere.
Es wurde eine Reihe HIVs mit unterschiedlichen antigenen Eigenschaften isoliert (die sogar in einem Individuum vorliegen können), was ein Hauptproblem bei der Entwicklung von Arzneistoffen gegen HIV verursacht. Darüber hinaus leiden viele Arzneistoffe, die in vitro vielversprechend erscheinen, unter der Tatsache, dass das Virus in der Lage ist, ihrer Wirkung in vivo durch rasche Mutagenese zu entkommen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Gruppe von Substanzen bereit, die in der Lage sind, das Menschliche Immunschwächevirus zu hemmen, und die somit dazu verwendet werden können, eine HIV-Infektion und/oder AIDS zu verhindern oder zu bekämpfen.
Im Verlauf von Laboruntersuchungen an einer neu entdeckten Reihe von Protease-Inhibitoren aus Blutegeln (vergleiche EP 94117053.2 und EP 95103637.5 ) wurden sehr potente Elastase-, Chymotrypsin-, Trypsin-, Plasmin- und Thrombin-Inhibitoren definiert. Da die proteolytische Spaltung der gag- und der env-Vorläufer im Replikationszyklus von HIV einen wichtigen Schritt darstellt, wurde untersucht, ob die neu beschriebenen Inhibitoren irgendeine Wirkung auf die Replikation des Virus haben. Die Entwicklung von Inhibitoren ist ein Grundprinzip bei der Entwicklung antiviraler Arzneistoffe. Das Ziel einer solchen Untersuchung war die Bewertung der antiviralen Kapazität der Protease-Inhibitoren, die der Gegenstand von EP 94117053.2 und EP 95103637.5 waren, auf primäre HIV-Isolate in dem am meisten physiologischen Testsystem der primären Zellen.
In den vorstehend erwähnten Patentanmeldungen wurde gefolgert, dass die antivirale Kapazität in den beschriebenen Inhibitoren tatsächlich vorhanden war. Überraschenderweise wurde jetzt jedoch herausgefunden, dass ein weitaus wirksamerer antiviraler Stoff oder eine weitaus wirksamere Gruppe von Stoffen sich in dem ursprünglichen Blutegel und in den Ethylalkohol-Extrakten aus dem Kopf des Blutegels befinden. Diese Stoffe oder diese Gruppen von Stoffen, die eine solche überraschende Aktivität enthalten, sind der Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Wir haben die Stoffe gereinigt und charakterisiert. U.S. 5246715 offenbart Inhibitoren der Blutplättchen-Aggregation, die aus dem Speichel von Blutegeln der Familie Hirudinidae stammen, mit einem Molekulargewicht, das unter 2.000 Da liegt.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zum Erhalt eines Isolats oder einer Verbindung bereit, das oder die eine hemmende Wirkung gegen Viren aufweist, wie z. B. gegen das menschliche Immunschwächevirus, und aus Blutegeln des Stammes Uniramia durch Lösemittel-Extraktionsverfahren erhalten werden und die ein Molekulargewicht von 300–600, bevorzugt von 400–500 Dalton besitzen. Die Verbindung wird vorzugsweise aus der Unterklasse Euhirudinae gewonnen, insbesondere wird sie aus der Unterordnung Hirudiniformes gewonnen, bevorzugt aus der Ordnung Arhynchobdelidae. Am stärksten bevorzugt werden Verbindungen, die aus der Familie Hirudinidae erhalten werden, insbesondere diejenigen, die aus der Gattung Limnatis erhalten werden, insbesondere der Art L. nilotica. L. nilotica (Savigny, 1820, wie aus Autrum; 1936 folgt) wird als ein „Nasen-Blutegel" oder als Pferde-Blutegel beschrieben (Mouquin-Tandon, 1846). Es wurde herausgefunden, dass er in dem gesamten Küstengebiet des Mittelmeeres vorkommt (Harant, 1929; Jarry, 1959). Er lebt in Quellen und „oueds" und ernährt sich von Kühen, Hunden und Menschen (Blaise, 1874/5; Neveu & Lemaire, 1938; Turner, 1969; Keegan et al., 1970).
Erstaunlicherweise unterscheidet sich das Nahrungsaufnahmeverhalten dieses Blutegels von dem anderer blutsaugender Blutegel. Er verbleibt an seinen Wirt (Nasen- und Kehlkopf-Höhle) über längere Zeiträume (Wochen bis Monate) angeheftet. Das Tier ernährt sich wiederholt von seinem Wirt. Wir haben beobachtet, dass trinkende Kühe mit diesen Blutegeln infiziert waren, die nicht abfielen, während die Kühe Wasser tranken. Nur dicke, fette Blutegel, die eine erwachsene Größe erreicht haben, fallen bei solchen Gelegenheiten ab. Daher ist klar, dass diese Blutegelart weitestgehend frei von antigenen oder immunogenen Stoffen in ihren Schleim- oder Speicheldrüsen-Produkten ist. Berichte über Wirtstiere, die an dieser Blutegelart starben, erwähnen Blutarmut als die einzige gemeinsame Ursache, aber nach unserer Kenntnis wurde keine direkte antigene Wirkung beschrieben. Daher stellt die Erfindung in einem Aspekt Verbindungen bereit, die eine HIV hemmende Aktivität besitzen, die aus dem Blutegel Limnatis nilotica erhalten werden kann, oder Fragmente oder Derivate solcher Verbindungen, die eine ähnliche Aktivität aufweisen.
Solche Verbindungen können aus allen Körperteilen und Sekreten des Blutegels erhalten werden, einschließlich der Speichel-, der Darm-, der Eingeweide- und der Hautsekrete sowie des Schleims.
Die am besten geeignete Quelle für die Verbindungen gemäß der Erfindung ist wahrscheinlich ein Lösemittelextrakt aus den Köpfen der Blutegel oder Verbindungen, die mit den Köpfen assoziiert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Erhalten einer Verbindung bereit, die eine das menschliche Immunschwächevirus hemmende Aktivität besitzt, umfassend die Dehydratisierung von Blutegel-Gewebe, vorzugsweise von Blutegel-Köpfen, oder von Sekreten, vorzugsweise des Speichels, die optionale Gefriertrocknung des erhaltenen Extrakts, die Suspendierung des gefriergetrockneten Materials in einer wässrigen Lösung, die Zentrifugation des Materials, um ein Sediment zu erhalten, das Auftragen des erhaltenen Überstandes auf eine nach Größe fraktionierende Säule, das Eluieren der Säule mit einer wässrigen Lösung, das Sammeln von Fraktionen des eluierten Materials, das Austesten der Fraktionen auf hemmende Aktivität gegen das menschliche Immunschwächevirus und das Sammeln der aktiven Fraktionen.
Die Isolate, die durch den Prozess der Erfindung erhalten werden, weisen ohne Zweifel eine antivirale Aktivität auf. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen – z. B. aufgrund der hierin nachstehend angeführten analytischen Untersuchungsdaten – dass die antivirale Aktivität einem aktiven Bestandteil zugeschrieben werden kann, der die allgemeine Formel Ar¹-Spacer-Ar² besitzt, wobei Ar¹ einen aromatischen Sechser-Ring darstellt, der vorzugsweise para-substituiert ist, z. B. mit einer Hydroxylgruppe oder einer Aminogruppe, und wobei der Sechser-Ring ebenfalls an den anderen Positionen substituiert sein kann, z. B. mit C_1-4-Alkyl-Gruppen und Halogenen; wobei der Spacer eine C_1-8-Alkylengruppe enthält, die über eine hydrophile Gruppe, wie z. B. eine Amidogruppe, mit Ar¹ verbunden ist; und wobei Ar² ein heteroaromatisches Zweier-Ringsystem ist, das auf Kohlenstoff- und Stickstoffatomen basiert (das Zweier-Ringsystem besitzt 9 oder 10 Atome (Purin- oder Naphthen-ähnliche Ringsysteme)), wobei das Ringsystem substituiert sein kann, z. B. mit C_3-8-Alkylgruppen, Hydroxygruppen, Aminogruppen, Halogenen usw; sowie Additionssalze, Solvate und Dimere dieser Isolate.
Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass andere Bestandteile der erhaltenen Isolate die potenten Inhibitoren oder die antiviralen Verbindungen darstellen oder zu der gezeigten Aktivität mit beitragen.
Ein solches Verfahren umfasst bevorzugt weiterhin das Unterwerfen der aktiven Fraktionen einem weiteren Trennungsschritt, vorzugsweise unter Verwendung einer HPLC-Säule. Die Isolate oder die Verbindungen, die durch diese Verfahren erhalten werden, und die bislang isoliert wurden, besitzen ein niedriges Molekulargewicht. Als diese Verbindungen auf ihre hemmende Aktivität hin untersucht wurden, wurde herausgefunden, dass die Verbindungen oder Gemische der Verbindungen gemäß der Erfindung eine antivirale Aktivität im Allgemeinen aufwiesen, wie z. B. eine hemmende Aktivität gegen das menschliche Immunschwächevirus im mikromolaren Bereich. Es wurde z. B. herausgefunden, dass das Isolat die durch das menschliche Immunschwächevirus induzierte Bildung von Syncytien oder die Produktion von p24 bei Konzentrationen von 0,5 μM, bevorzugt bei 0,17 μM und am meisten bevorzugt bei 0,067 μM vollständig hemmt. Die Erfindung stellt weiterhin die Verwendung dieser Verbindungen oder Gemische zur Verhinderung oder zur Bekämpfung von Infektionen mit HIV und/oder AIDS bereit und stellt somit ein Arzneimittel bereit, das mindestens eine Verbindung gemäß der Erfindung und ein geeignetes Vehikel zur Verabreichung umfasst. Auf der Grundlage der Art und der Menge der Aktivität der Verbindungen und der tolerierten Mengen, die durch Untersuchungen mit Tieren unter Verwendung steigernder Dosen bestimmt werden können, werden Fachleute in der Lage sein, diese pharmazeutischen Formulierungen zu entwickeln.
Die Verabreichung kann in jeder geeigneten Weise erfolgen, obwohl für einige Verbindungen bei systemischen Verabreichungen parenterale Wege bevorzugt werden können. Die Dosierungen für die Stoffe können der Literatur entnommen werden und auf der Grundlage der spezifischen Aktivitäten der Stoffe, des Molekulargewichts der Stoffe, des Gewichts des zu behandelnden Individuums, der Art der Verabreichung usw. bestimmt werden. Die Dosis liegt üblicherweise zwischen 0,1 μg/kg und 10 mg/kg Körpergewicht. Geeignete Excipienten sind im Fachgebiet wohlbekannt und reichen von Wasser zur Injektion bis hin zu Trägerproteinen wie Serumalbumin z. B. für gefriergetrocknete Präparate und inerte Stoffe wie z. B. Mannit, Cellulose und Dextran für Tabletten oder Granulate. Der einfachste Weg besteht natürlich einfach in der Bereitstellung der Verbindungen in sterilem Wasser (oder Kochsalzlösung) zur Injektion.
Experimentelles
Im Verlauf von Forschungsarbeiten mit aus L. nilotica stammenden Protease-Inhibitoren wurde überraschenderweise beobachtet, dass neben der hemmenden Aktivität der Protease-Inhibitoren auf die HIV-Replikation, die hierin vorstehend erwähnt wurde, eine andere Fraktion, die aus Ethanol-Extrakten von L. nilotica-Köpfen erhalten wurde, weitaus potenter war. Diese Gruppe an Stoffen wird als SILIAVIR in der vorliegenden Beschreibung bezeichnet.
Von einem biologischen Testsystem mit primären Zellen, das hierin nachstehend weiter beschrieben wird, wurde geschlossen, dass ein Gesamtextrakt aus Blutegel-Köpfen eine dosisabhängige Hemmung der HIV-Replikation bei zwei getrennten HIV-Isolaten zeigte, die bei einer Konzentration von 0,5 μM fast vollständig war (vergleiche mit Tabelle 1 und Tabelle 2 der 1).
Die weiteren Isolierungs- und Reinigungsverfahren in Schritten führten schließlich zu einer Gruppe von aktiven Verbindungen, die hierin auch als Stoffe bezeichnet werden, die ein Molekulargewicht von etwa 0,5 kDa aufweisen und die z. B. eine Hemmung der HIV-Replikation zu 100 % bei so niedrigen Konzentrationen wie 0,06 μM zeigen.
Die biologischen Wirkungen, wie gemessen, stehen noch nicht mit einer der bekannten Strategien der Arzneistoffentwicklung gegen Viren in Beziehung, insbesondere gegen Retroviren und noch spezifischer gegen HIV. Jede dieser wohlbekannten Strategien könnte jedoch beteiligt sein (z. B. Hemmung der RT, sCD4, gp120-Ersatz, Hemmung der HIV-Protease). Andere mögliche Wege der Aktivierung werden nicht ausgeschlossen (zum Beispiel Wirkungen auf die Zellen, sowie Wirkungen auf. das angreifende Virus oder eine Kombination der beiden, sind aber nicht auf diese beschränkt), und sie werden untersucht.
Die vorliegende Erfindung offenbart die Isolierungs- und die Reinigungsschritte in Kombination mit einem biologischen Testsystem in primären Zellen, die zu dieser Gruppe neuer und einzigartiger Stoffe führten, die die spezifischen Aktivitäten, wie beschrieben, aufweisen.
Beschreibung der Biologischen Untersuchungen und der Isolierung und der Reinigung.
A. Biologisches Testsystem
Mononukleäre Zellen aus peripherem Blut
Durch Phytohämagglutinin (PHA) stimulierte PBMC aus gesunden Spendern wurden mit zwei unterschiedlichen HIV-Isolaten (HIVAms 37 und HIVAms 55) beimpft. Nach einer zweistündigen Exposition gegenüber den HIV-Isolaten wurde das Impfmaterial entfernt, und Konzentrationsreihen an Siliavir wurden den Kulturen zugegeben. Das Medium wurde zweimal wöchentlich gewechselt, und frische, durch PMA stimulierte PBMC wurden jede Woche zugegeben. Die Leukocytenmanschetten wurden routinemäßig auf virale Verunreinigungen hin durchmustert und nur dann verwendet, wenn sie für diese Verunreinigungen negativ waren. Die Virusproduktion in den Kulturen wurde mit einem p24-Einfang-ELISA überwacht, der das p24-Kernprotein des HIV nachweist. Die Kulturen wurden ebenfalls auf das Auftreten von cytopathischen Wirkungen (Bildung von Syncytien) hin überwacht.
Kulturmedium
Während der ersten beiden Tage nach der Isolierung der Zellen wurden die primären peripheren Blut-Leukocyten in Iscove-modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) kultiviert, das mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS), Polybren (5 μg/ml) Phytohämagglutinin (5 μg/ml), Penicillin (100 IU/ml) und Streptomycin (100 IU/ml) ergänzt worden war. Die T-Zell-Blasten wurden dann in IMDM, das mit 10 % FCS, Polybren (5 μg/ml), rekombinantem IL-2 (10 IU/ml), Penicillin (100 IU/ml) und Streptomycin (100 IU/ml) ergänzt worden war, weiter kultiviert.
Viren
Es wurde Impfmaterial mit hohem Titer von zwei primäre Syncytien induzierenden HIV-Isolaten hergestellt. Die Titer der Stammlösungen wurden mit einem TCID50-Testansatz bestimmt.
Während der ersten beiden Tage nach der Isolierung der Zellen wurden die primären peripheren Blut-Leukocyten in Iscove-modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) kultiviert, das mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS), Polybren (5 μg/ml) Phytohämagglutinin (5 μg/ml), Penicillin (100 IU/ml) und Streptomycin (100 IU/ml) ergänzt worden war. Die T-Zell-Blasten wurden dann in IMDM, das mit 10 % FCS, Polybren (5 μg/ml), rekombinantem IL-2 (10 IU/ml), Penicillin (100 IU/ml) und Streptomycin (100 IU/ml) ergänzt worden war, weiter kultiviert.
Experimenteller Aufbau
Eine Gesamtmenge von 10⁷ durch PHA stimulierte PBMC wurden mit 10⁴ TCID50/ml der primären HIV-Isolate in einem Volumen von 1 ml 2 Stunden bei 37 °C beimpft. Nach 2 Stunden wurden die Zellen in einem Gesamtvolumen von 30 ml gewaschen. Nach Zentrifugation wurde der Überstand verworfen, um nicht absorbierte Viren zu entfernen. Anschließend wurden die Zellen in einer Endkonzentration von 10⁶/ml resuspendiert. Aus jeder Zellsuspension wurden 100 μl-Aliquote, die 10⁵ Zellen enthielten, in die Vertiefungen einer Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen überführt. Es wurden Verdünnungen der Fraktionen von Siliavir aus 1 μM Stammlösungen in Kulturmedium hergestellt, und zwar so, dass nach der Zugabe von 50 μl zu jeder Vertiefung die Endkonzentrationen in den Vertiefungen 0,063 μM, 0,125 μM, 0,25 μM und 0,5 μM betrugen. Zellen, denen nur Medium zugegeben wurde, dienten als unbehandelte Kontrollkulturen. Jede Konzentration wurde vierfach untersucht. Die Zellen wurden in einer feuchten Atmosphäre bei 37 °C, 5 % CO₂ kultiviert. Die Zugabe von 10⁵ frischen durch PHA stimulierten PBMC und Medium wurde am Tag 7 durchgeführt. Dazu parallel wurde eine neue Dosis mit den gleichen Konzentrationen an Siliavir zugegeben.
Kontrollen
An den Tagen 4 und 7 wurden die Kulturen auf jegliche durch HIV induzierte cytopathische Wirkung hin untersucht, wie sie die Anwesenheit von Syncytien widerspiegelt. An den Tagen 7 und 14 wurden 30 μl des Kulturüberstandes geerntet, um mit einem p24-Antigen-Einfang-ELISA die Anwesenheit des p24-Antigens zu untersuchen. Dazu wurden zweimal die Woche 30 μl-Aliquote aus den Kulturen geerntet und durch die Zugabe von 30 μl 0,2 % Triton X-100 inaktiviert. 15 μl dieses Gemisches wurden in die Vertiefungen einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen gegeben, die 2 Stunden bei 37 °C mit einem anti-p24-Antikörper beschichtet worden war, von dem gezeigt worden war, dass er alle HIV-Isolate erkennt. Dem Antigen wurde erlaubt für 2 Stunden bei 37 °C zu binden. Das gebundene p24 wurde mit Meerrettich-Peroxidase-markiertem anti-p24-Immunglobulin aus Kaninchen nachgewiesen (90 Min. bei 37 °C). Dann wurde das Substrat (TMB) zugegeben, und nach 20 Min. wurde die Reaktion durch die Zugabe von H₂SO₄ beendet.
Die Ergebnisse werden in den Tabellen 1 und 2 (1) gezeigt. Die Tabellen sollten unter Berücksichtigung des Folgenden gelesen werden.
Berechnung der Ergebnisse
Zur Berechnung des Prozentsatzes der Hemmung wurde die folgende Formel verwendet.
Kriterien
Die Kulturen wurden als positiv angesehen, wenn:
die Bildung von Syncytien bei mindestens einer Gelegenheit (die Kulturen wurden zweimal die Woche untersucht) in Kombination mit einem erhöhten p24-Anitgengehalt in dem Überstand bei mindestens einer Gelegenheit beobachtet wurde.
Syncytiumbewertung:

– es wurden keine Syncytien in irgendeiner der vier Replika-Kulturen beobachtet,
± in einer von vier Replika-Kulturen wurden Syncytien beobachtet
+ in zwei von vier Replika-Kulturen wurden Syncytien beobachtet
++ in drei von vier Replika-Kulturen wurden Syncytien beobachtet
+++ in vier von vier Replika-Kulturen wurden Syncytien beobachtet

Ergebnisse
Die durch HIV-1 induzierten cytopathischen Wirkungen (CPE), die Produktion des p24-Antigens und die berechneten Prozentsätze der Hemmung werden in den Tabellen 3 und 4 für den Stoff 1 und in den Tabellen 1 und 2 für den Stoff 3 gezeigt.
Die Daten zur p24-Produktion stellen den Mittelwert aus vier Replika-Kulturen dar.
Die Kulturen, die mit 10² TCID₅₀ beimpft worden waren, blieben bei der Produktion des Virus negativ.
Der in diesen Tabellen erwähnte Stoff drei stellt den Extrakt aus gesamten Blutegel-Köpfen dar. Die Verarbeitung, Reinigung und Isolierung des Extrakts werden nachstehend beschrieben.
Jedes Mal, wenn ein neuer Reinigungsschritt erfolgt (vergleiche nachstehend), wird das beschriebene biologische Testsystem als ein „Affinitäts-Testsystem" verwendet, um die aktiven Stoffe aus den Fraktionen des Extrakts weiter einzugrenzen.
B. Verfahren zur Isolierung und zur Reinigung
Eine Gesamtmenge von 15 g abgeschnittener Köpfe von eingefrorenem
Limnatis nilotica wurde in 94 % Ethylalkohol bei Zimmertemperatur dehydratisiert. Es erfolgten drei Austausche mit einem Gesamtvolumen von 134 ml, danach wurden 400 ml destilliertes Wasser zugegeben, und der Extrakt wurde anschließend in Röhrchen gefriergetrocknet. Es wurde eine Gesamtmenge von ca. 90 mg gefriergetrockneten Materials gesammelt. (Als Alternative kann man ebenfalls die zerschnittenen Köpfe dieser Blutegel verwenden oder die aktivierten Schleimsekrete lebender Blutegel verwenden, in dem man sie zum Beispiel 10 Minuten in 4 Ethylalkohol bei Zimmertemperatur eintaucht).
Das gefriergetrocknete Material (ca. 90 mg) wurde zuerst in 4,55 ml destilliertem Wasser suspendiert. Danach wurden drei Teile von 4,55 ml destilliertem Wasser zugegeben. 50 % dieser Suspension (9,1 ml) wurden mit 30 ml destilliertem Wasser weiter verdünnt und die anderen 50 % bei –20 °C aufbewahrt. Die Suspension wurde auf zwei Zentrifugationsröhrchen verteilt und zentrifugiert. Das Sediment wurde bei –20 °C aufbewahrt. 50 % des Überstandes wurden ebenfalls bei –20 °C gelagert. Die anderen 50 % des Überstandes wurden auf eine Sephadex G-75-Säule (Länge 180 cm, Durchmesser 1,85 cm) geladen. Das Elutionsmittel ist destilliertes Wasser, die Fraktionsgröße: ca. 4–7 ml; die Durchflussrate wurde auf ca. 0,5 – 1 ml/min eingestellt. Insgesamt wurden 149 Fraktionen gesammelt, und die Absorption wurde bei 214 nm gemessen. Die Durchflussrate der Säule verminderte sich von ihrer anfänglichen Einstellung von 1 ml/min auf ca. 0,5 ml/min, und die Fraktionsgröße verminderte sich von anfänglichen 7 ml auf 4 ml (Fraktionen 1 bis 25: ca. 7 ml; Fraktionen 26 bis 29: ca. 6 ml; Fraktionen 30 bis 79: ca. 5 ml und Fraktionen 80–149: ca. 4 ml). In den Fraktionen 19 bis 24 wurde eine leichte Opaleszenz beobachtet, während in den Fraktionen 95 bis 108 ein Präzipitat sichtbar war. Aufgrund des Absorptions-Diagramms (2) und einer SDS-PAGE (3) wurden die folgenden Pools für weitere Versuche hergestellt:

Fraktion 16 bis 29 (ca. 83 ml); Probenname: 3A
Fraktion 30 bis 75 (ca. 230 ml); Probenname: 3B
Fraktion 76 bis 97 (ca. 92 ml); Probenname: 3C
Fraktion 98 bis 130 (ca. 132 ml); Probenname:3D.

Das Präzipitat, das in Pool 98 bis 130 gefunden wurde, wurde bei –20 °C aufbewahrt.
Das Gesamtmaterial durch die Gelfiltration beträgt etwa 50 % × 50 % von 90 mg = etwa 22,5 mg.
Die Proben A bis D wurden dem Test mit dem biologischen Testsystem unter Verwendung primärer Zellen, wie beschrieben, unterzogen, jede Probe enthielt geschätzt 5 mg (einschließlich von Verlusten).
Die Abschätzung des Gewichts des Stoffs in der Probe erfolgt wie folgt:

Probe 3A: 83 ml, Gehalt: 5 mg, Konzentration: 60 μg/ml.
Probe 3B: 230 ml, Gehalt: 5 mg, Konzentration: 22 μg/ml.
Probe 3C: 92 ml, Gehalt: 5 mg, Konzentration: 54 μg/ml.
Probe 3D: 132 ml, Gehalt: 5 mg, Konzentration: 38 μg/ml.

Aus Probe 3A wurde eine Fraktion von 0,625 ml zu 2,9 ml destilliertem Wasser, 1 ml 5-fach konzentriertem Iscove-modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) und 0,5 ml Fötalem Kälberserum (FCS) gegeben, was zu einer Lösung mit einer Konzentration von 1 μM führte.
Aus Probe 3B wurde eine Fraktion von 1,7 ml zu 1,8 ml destilliertem Wasser, 1 ml 5-fach konzentriertem IMDM und 0,5 ml FCS gegeben, was zu einer Lösung mit einer Konzentration von 1 μM führte.
Aus Probe 3C wurde eine Fraktion von 0,694 ml zu 2,8 ml destilliertem Wasser, 1 ml 5-fach konzentriertem IMDM und 0,5 ml FCS gegeben, was zu einer Lösung mit einer Konzentration von 1 μM führte.
Aus Probe 3D wurde eine Fraktion von 0,987 ml zu 2,5 ml destilliertem Wasser, 1 ml 5-fach konzentriertem IMDM und 0,5 ml FCS gegeben, was zu einer Lösung mit einer Konzentration von 1 μM führte.
Vor der Verwendung wurden alle Fraktionen durch einen 0,22 μm-Filter filtriert.
Die Ergebnisse werden in den Tabellen dargestellt und sind hieran angehängt. Die Probe 3A wird in den Tabellen 3 und 4 in 4 dargestellt, Probe 3B in den Tabellen 5 und 6 in 5, Probe 3C in den Tabellen 7 und 8 in 6 und Probe 3D in den Tabellen 9 und 10 in 7.
Ergebnisse der biologischen Untersuchung der Proben 3A bis 3D.
Nur die Probe 3D zeigte eine dosisabhängige Hemmung der Replikation der beiden Virus-Isolate, die untersucht wurden. Die Hemmung war vollständig (100 %) bei einer Konzentration von 0,125 μM.
Die Probe 3D, die ursprünglich aus 132 ml bestand, von denen fast 1 ml in dem biologischen Testsystem verbraucht worden war, wurde durch HPLC in einem TFA-System weiter untersucht.
Das TFA-HPLC-System umfasst eine Nucleosil 10C18-Säule mit einer Länge von 150 mm und einem Durchmesser von 2 mm in einem HP 1090M-Apparat, wobei die Durchflussrate 350 μl/min beträgt. Das Elutionsmittel ist ein Gradient von 100 A/0 % B bis 100 % B und 0 % A in 120 Minuten, wobei das Elutionsmittel A aus 0,05 TFA (Trifluoressigsäure) in destilliertem Wasser und das Elutionsmittel B aus 0,03 TFA in Acetonitril besteht.
Diese ca. 130 ml umfassende Probe wurde gefriergetrocknet, nachdem 1400 μl zurückbehalten worden waren. Der gefriergetrocknete Stoff wurde in 1 ml destilliertem Wasser resuspendiert und zentrifugiert. 0,1 % des Überstandes wurden durch analytische HPLC untersucht (Ergebnis: vergleiche mit Darstellung 95E038 in 8), und 10 % des Überstandes wurden durch eine nachfolgende präparative HPLC aufgetrennt (Ergebnis: vergleiche mit Darstellung 95E043 in 9). Es wurden fünf Fraktionen isoliert, gefriergetrocknet, in Wasser resuspendiert und erneut gefriergetrocknet. Diese Fraktionen wurden als 3D1, 3D2, 3D3 und 3D4 bezeichnet (vergleiche mit 10), die Fraktion 3D5 wurde bei –20 °C aufbewahrt. Proben der Fraktionen 3D3 und 3D4 wurden durch Sequenzanalyse untersucht; in keiner Fraktion konnte eine Sequenz nachgewiesen werden.
Die Fraktionen 3D1, 3D2, 3D3 und 3D4 wurden dem Test mit dem biologischen Testsystem unterworfen, wie hierin vorstehend beschrieben wurde. Die Abschätzung der Mengen in den Fraktionen nach der HPLC, die auf dem Chromatogramm basiert, ergab 120 μg, 30 μg, 50 μg bzw. 50 μg.
Die Ergebnisse des Tests der Hemmung der HIV-Replikation mit diesen Fraktionen sind in den Tabellen 11 bis 18 (11–18) dargestellt.
Es wurde gefolgert, dass die Subfraktionen 3D3 und 3D4 eine hemmende Wirkung auf die Replikation der beiden primären HIV-Isolate hatten. Die Hemmung durch die Subfraktion 3D3 war bei einer Konzentration von 0,25 μM vollständig. Die Hemmung durch die Subfraktion 3D4 war bei einer Konzentration von 0,063 μM vollständig.
Die Fraktionen 3D3 und 3D4 wurden durch HPLC weiter untersucht.
Dazu wurden aus Probe 3D (wie hierin vorstehend spezifiziert) zweimal 10 % als Startmaterial entnommen. Es wurden zwei präparative HPLC-Durchgänge (gleiches Verfahren wie vorstehend) durchgeführt (vergleiche mit dem Chromatogramm 95E058-2, 19). 10 Fraktionen wurden getrennt isoliert (Nrn. 1 bis 10) und zwar innerhalb von Minute 22 bis 32 des Elutionszeitraums (vergleiche das Chromatogramm mit den Fraktionen in 20). Vier dieser Fraktionen, die Nrn. 6, 7, 8 und 9, wurden gefriergetrocknet, in destilliertem Wasser resuspendiert und erneut gefriergetrocknet, und sie wurden erneut dem Test in dem biologischen System unterworfen, wie vorstehend beschrieben wurde.
Die Abschätzung der Mengen in den Fraktionen ergaben: 1 μg, 39 μg, 7,5 μg bzw. 2,5 μg. Drei Fraktionen (6, 8 und 9) wurden in 1 ml Medium (IMDM) + 10 FCS gelöst, woraus sich Stammlösungen von 0,2 μM für die Fraktion 6, 1,5 μM für die Fraktion 8 und 0,5 μM für die Fraktion 9 ergaben. 50 μl dieser Stammlösungen wurden zu 100 μl Medium gegeben, woraus sich Endkonzentrationen von 0,067 μM für Fraktion 6, von 0,5 μM für Fraktion 8 und von 0,17 μM für Fraktion 9 ergaben. Eine Verdünnungsreihe wurde nur aus der Fraktion 7 hergestellt (0,5 μM, 0,25 μM, 0,125 μM und 0,063 μM).
Diese vier Fraktionen wurden nun neu bezeichnet: α, β, γ bzw. δ.
Die Ergebnisse waren: vollständige (100 %) Hemmung der HIV-Replikation für die Fraktionen α, β, γ und δ bei den untersuchten Konzentrationen. Eine dosisabhängige Hemmung wurde für die Fraktion β beobachtet, die bei einer Konzentration von 0,5 μM vollständig war (vergleiche mit den Tabellen 19 bis 22 in den 21-24).
In einem weiteren Experiment wurde gezeigt, dass aus der Fraktion β eine Anzahl an Fraktionen isoliert werden konnte. Daher wurde die Fraktion 3D4β, wie sie durch die HPLC-Chromatographie 95E058-2 isoliert worden war, über eine RP-HPLC in Ammoniumacetat geschickt.
Der HPLC-Schritt umfasst die gleiche Säule, wie für die TFA-HPLC beschrieben, mit der gleichen Durchflussrate, das Elutionsmittel ist ebenfalls ein Gradient von 100 % A und 0 % B bis 100 % B und 0 % A in 120 Minuten, wobei A und B in diesem System 0,1 % Ammoniumacetat in destilliertem Wasser bei pH = 6 (A) und 100 % Acetonitril (B) sind.
Die Ergebnisse dieser neuen Chromatographie sind in dem Chromatogramm 95E070 (vergleiche mit 25) dargestellt.
Die Massenspektrometrie der Fraktionen 3d3 und 3d4 (Subfaktionen 1 bis 10) zeigte Moleküle mit Massen zwischen 400 und 500 Dalton.
Die Subfraktionen 4, 5, 6, 8 und 10 wurden dem Test mit dem gleichen biologischen Testsystem, wie vorstehend beschrieben, unterworfen.
Die Testergebnisse zeigten eine niedrige Hemmung der HIV-Replikation für die Subfraktionen 4, 5, 6 und 10 bis zu einer Konzentration von 0,06 μM. Die Subfraktion 8 zeigte eine dosisabhängige Hemmung der HIV-Replikation mit 100 Hemmung für HIVams55 und 90 % Hemmung für HIVams37 bei einer Konzentration von 0,046 μM.
Die Subfraktion 8 wurde einer Reihe von Untersuchungen für die Massenspektrometrie unterworfen. Es wurde bestimmt, dass diese Subfraktion aus einem Gemisch von zwei Molekülen mit Massen von 426 und 440 Dalton bestand.
ES/MSMS-Messungen der Subfraktionen 8⁴²⁶ und 8⁴⁴⁰ zeigten eine positive Produktion der folgenden Massen: beide besaßen eine Gruppe von 120 Da, eine Gruppe von 17 Da, eine Gruppe von 18 Da und eine Gruppe von 11 Da. Sie unterschieden sich in einer Gruppe von 42 Da für 8⁴²⁶ gegenüber einer Gruppe von 56 Da für 8⁴⁴⁰. Es wurden keine negativen Ionen nachgewiesen.
Die Massenspektrometrie der anderen Fraktionen in den Proben 3d3 und 3d4 (Subfraktionen 1 bis 10) zeigten Moleküle mit Massen von annähernd 500 Dalton.
Es wurde eine Hochauflösende Elektronenspray-Massenspektrometrie (ES-HRMS) mit den Stoffen durchgeführt, die eine Hemmung der HIV-Replikation zeigten (Subfraktion 8, Siliavir). Diese wurden hierin vorstehend durch die Verfahren zur Isolierung, Reinigung und der biologischen Untersuchung definiert.
Dafür wurden 10 % der Subfraktion 8 aus der HPLC 95E085 (solubilisiert in 0,1 % TFA) verwendet.
Es wurden zwei separate Moleküle als Hauptfraktionen gefunden. Eines dieser beiden Moleküle besaß eine Masse von 426,164300 Da (Subfraktion 8⁴²⁶ oder Siliavir⁴²⁶), das andere der beiden Moleküle besaß eine Masse von 440,1816 Da (Subfraktion 8⁴⁴⁰ oder Siliavir⁴⁴⁰) (vergleiche mit 26). Das Experiment wurde mit einem Finnigan-MAT 900-Instrument mit einer Auflösungskraft von R = 10.000 durchgeführt. Anschließend wurde eine sequentielle Massenspektrometrie (LC-MS)ⁿ durchgeführt, die die früheren Befunde der ES-MSMS-Messungen bestätigte.
Kernmagnetische Resonanz (NMR)
Die NMR wurde mit Siliavir mit einem Varian Unity 500 MHz-Instrument durchgeführt. Eine Probe wurde aus neuem Grundmaterial hergestellt, für das rohe Ethanolextrakte von Blutegelköpfen wie vorstehend hergestellt wurden. Das gefriergetrocknete Grundmaterial wurde mit 50 ml H₂O resuspendiert. Es wurde ein Trennungsschritt durchgeführt, um Massen unter- und oberhalb von 3 kDa zu trennen. Dazu wurde diese resuspendierte Lösung auf 8 Centriprep-3 (kDa)-Röhrchen verteilt und 4-mal zentrifugiert. Die Filtrate aus jedem Filtrationsschritt wurden vereinigt, gefriergetrocknet und anschließend in 50 % HAc resuspendiert.
Anschließend wurde, wie hierin vorstehend beschrieben, eine präparative HPLC mit dem resuspendierten Filtrat durchgeführt. Säule: 7,7 × 250 mm (Nucleosil 10C18; Durchflussrate eingestellt auf 2 ml/min; Nachweis bei 254 oder 280 nm; TFA-System; Elutionsmittel A ist 0,05 % TFA; Elutionsmittel B ist 0,05 % TFA in 100 % Acetonitril; Gradient: 0 % B bis 100 % B in 60 Minuten). Die Fraktion zwischen 24,2 und 27 Minuten wurde getrennt gesammelt (vergleiche mit der analytischen HPLC in 27) und gefriergetrocknet.
Diese abgetrennte Fraktion wurde in 500 μl 50 % HAc resuspendiert und erneut über HPLC mit dem Ammoniumacetat-System geschickt. (Säule: 7,7 × 250 mm; Nucleosil 10C18, Durchflussrate eingestellt auf 2 ml/min; Nachweis bei 254 nm; Ammoniumacetat (A.A.)-System; Elutionsmittel A ist 0,1 % A.A. in H₂O bei pH = 6; Elutionsmittel B ist 100 % Acetonitril in 60 Minuten).
Da diese Probe eine zeitabhängige Präzipitatbildung aufwies, wurde sie zentrifugiert, und der Überstand und das Sediment wurden getrennt analysiert (vergleiche mit 28 für ein Chromatogramm des Überstandes und mit 29 für ein Chromatogramm des Sediments, das in 1,6 ml 50 % HAc resuspendiert worden war).
Fraktionen, die zwischen 24 und 27 Minuten sowohl bei der Passage des Überstandes bei der HPLC als auch bei der Passage des Sediments bei der HPLC eluierten, wurden gesammelt, vereinigt und gefriergetrocknet. Ein analytisches HPLC-Chromatogramm dieses gesammelten Materials, das aus den beiden Komponenten Siliavir⁴²⁶ und Siliavir⁴⁴⁰ bestand, wird in 30 gezeigt.
Das beschriebene Material wurde hergestellt und in D₂O und 50 % DAc zur Passage über das Varian Utility 500 MHz-Instrument suspendiert. Getrennt davon wurde das resuspendierte Sediment aus der vorstehenden 29 ebenfalls getrennt über das gleiche Gerät geschickt. Es wurden unterschiedliche Arten an NMR-Spektren (Proton, C13, DQCosy, HSQC und Noesy) aufgenommen. Die Ergebnisse werden in den 31–41 für die Spektren beider Komponenten zusammen gezeigt, während die Ergebnisse für das resuspendierte Sediment (in dem ein Bestandteil, vermutlich Siliavir⁴²⁶, zu 85 % in der Probe vorliegt und der andere Bestandteil, vermutlich Siliavir⁴⁴⁰, nur zu 15 % vorhanden ist) in den 42–49 gezeigt werden.
Rasterelektronenmikroskopie/energiedisperqierende Spektroskopie (SEM/EDS) Das für dieses Experiment verwendete Gerät war ein (Akhashi) ISIDS-130. Die Herstellung des Untersuchungsmaterials wurde mit beiden Komponenten (Siliavir⁴²⁶ und Siliavir⁴⁴⁰) durchgeführt. Die Spektren wiesen Peaks für C, N und O auf. Darüber hinaus wird ein Si-Peak gezeigt, der vermutlich aus dem HPLC-Säulenmaterial stammt, obwohl nicht ausgeschlossen werden kann, dass er aus der aktiven Verbindung stammt. Die Anwesenheit von S in dem Spektrum kann einem Derivat der Verbindung zugeschrieben werden, wie z. B. einem Salz, könnte aber auch eine Verunreinigung darstellen. Es wurde kein P gefunden.
Ergebnisse der NMR, MS und EMS/EDS und Diskussion
Es werden die Ergebnisse der NMR-Messungen mit dem Untersuchungsmaterial, das aus dem Gemisch der beiden Komponenten besteht (wie in den 31–41 gezeigt), und der NMR-Messungen mit dem Material, das aus 85 % der einen Komponente und aus 15 % der anderen Komponente besteht (wie in den 42–49 gezeigt), diskutiert.
Das Singulett bei 9,3 ppm korreliert bei HSQC bei 148 ppm. Es könnte sich um eine isolierte aromatische CH-Gruppe zwischen zwei N-Atomen handeln.
Die beiden Dublette bei 6,75 und 7,54 ppm: 2 × 2 Protonen koppeln mit 8,5 Hz. Diese Konstante ist mit Tyrosin vergleichbar und deutet daher auf einen parasubstituierten aromatischen Ring hin.
Dieses Phenylfragment besitzt zwei Substituenten, vermutlich keine direkten C-Atome, da die Wechselwirkung im Noesy-Spektrum fehlt.
Die beiden Singulette bei 3,5 und 3,7 ppm: 2 × 3 Protonen. Keine DQCosy- und/oder Noesy-Wechselwirkungen. Korrelationen bei HSQC bei ca. 30 ppm. Dies sind wahrscheinlich N-CH₃-Gruppen und wahrscheinlich nicht O-CH₃-Gruppen. Aufgrund ihrer Position im niedrigen Feld ist ein dimethyliertes heteroaromatisches Z-Ringsystem, wie z. B. ein Xanthin-ähnliches Fragment (ein Purin-Alkaloid) eine wahrscheinliche Erklärung für diese Peaks in Verbindung mit dem 9,3 ppm-Peak.
Ein Triplett bei 3,7 ppm: 2 Protonen. Korreliert bei DQCosy mit einem Multiplett bei 1,72 ppm (2 Protonen); dieses Multiplett korreliert mit dem Multiplett bei 1,46 ppm (2 Protonen).
Ein Triplett bei 3,4 ppm: 2 Protonen. Korreliert bei DQCosy mit einem Multiplett bei 1,65 ppm (2 Protonen); dieses Multiplett korreliert mit dem gleichen Multiplett bei 1,46 ppm (2 Protonen).
Aus diesen Tripletts und Multipletts wird gefolgert, dass dies auf ein X1-(CH₂)₅-X5-Fragment hindeutet, bei dem X₁ und X₂ am wahrscheinlichsten N sind, und zwar aufgrund der Positionen der chemischen Verschiebung der alpha-CH₂-Gruppen.
Signale bei 1,2 und 1,4 ppm: wahrscheinlich Artefakte oder Verunreinigungen. Nach diesen NMR-Spektren ist es unwahrscheinlich, dass Schwefelatome vorhanden sind.
Die NMR-Signale der beiden Komponenten zeigen, dass diese Isomere sind. Sie unterscheiden sich nur um 14,0173 Da, wobei es sich nur um CH₂ handeln kann. Daher wird gefolgert, das Siliavir⁴⁴⁰ gleich Siliavir⁴²⁶ plus CH₂ ist.
Das Vorhandensein der folgenden Gruppen wird gefolgert oder angenommen: Ein para-substituierter aromatischer Ring, Masse = 76 + Y₁ + Y₂.
AB-System in aromatischem Ring, z. B. mit der Formel:
wobei Y₁ zum Beispiel -OH, -CH₂OH, -N=C=O oder -C(O)H sein kann, während Y₂ ein Sauerstoffatom, eine NH-Gruppe, eine N-Gruppe, die durch C_1-3-Alkyl oder durch C_1-3(substituiertes) Alkyl substituiert ist, oder C=O sein kann.
Ein Pentan-Fragment in der Komponente 426, möglicherweise Hexan in der Komponente 440, z. B. mit der Formel:
worin X₁ und X₂ z. B. sein können: C, N, NCH₃, NSO₄ und X₃ bis X₄ z. B. sein können: H, NH₂, N=C=O oder X₃ + X₄, X₅ + X₆, X₇ + X₈, X₉ + X₁₀, X₁₁ + X₁₂, X₁₃ + X₁₄, können zusammen ein Sauerstoffatom oder eine =NH-Gruppe sein.
Ein methyliertes aromatisches heterozyklisches, z. B. ein Xanthin-ähnliches, Fragment mit zwei CH₃-Gruppen, z. B. des Typs:
worin Z₁, Z₂, Z₅, Z₇ z. B. sein können: C, N, CH₂OH, OH, NCO₃; und Z₃, Z₄, Z₆, Z₈ z. B. sein können: C, N, CH₃, OH, CH₂OH.
Ein C-H zwischen zwei N-Atomen.
Aufgrund der vorstehenden Annahmen könnten die aktiven Verbindungen Verbindungen der folgenden Art sein:
worin „•" ein Kohlenstoffatom darstellt, das mit einem oder mit zwei Wasserstoffatomen substituiert ist.
Schlussfolgerung
Es kann geschlossen werden, dass die Hemmung der HIV-Replikation bei einer Gruppe von Stoffen in hohem Maße vorhanden ist, die getrennten Isolaten oder Molekülen oder Kombinationen der Moleküle innerhalb dieser Gruppe zugeschrieben werden kann. Die Stoffgruppe wurde hierin vorstehend durch Verfahren zur Isolierung und zur biologischen Untersuchung beschrieben.
Die Stoffgruppe, welche die Hemmung der HIV-Replikation enthält, umfasst z. B.:
3D3 und 3D4, wie beschrieben. Die Moleküle, die in dieser Stoffgruppe enthalten sind, besitzen zum größten Teil Molekulargewichte von etwa 500 Dalton.
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Claims

Verfahren zum Erhalten einer Verbindung mit antiviraler Aktivität umfassend das Anwenden einer Extraktionstechnik unter Verwendung eines Lösungsmittels auf ein Gewebe oder die Sekretion eines Blutegels des Stamms Uniramia und Isolieren einer Verbindung, die antivirale Aktivität und ein Molekulargewicht im Bereich von 300 bis 600 Dalton aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei eine Verbindung isoliert wird, die eine HIV-inhibierende Aktivität aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei eine Verbindung isoliert wird, die eine HIV-inhibierende Aktivität im mikromolaren Bereich aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei eine Verbindung isoliert wird, die bei einer Konzentration von 0,5 μM die Aktivität aufweist, die HIV-induzierte Bildung eines Syncytiums oder p24-Produktion zu inhibieren.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei eine Verbindung isoliert wird, die bei einer Konzentration von 0,17 μM die Aktivität aufweist, die HIV-induzierte Bildung eines Syncytiums oder p24-Produktion zu inhibieren.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei eine Verbindung isoliert wird, die bei einer Konzentration von 0,067 μM die Aktivität aufweist, die HIV-induzierte Bildung eines Syncytiums oder p24-Produktion zu inhibieren.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei eine Verbindung isoliert wird, die ein Molekulargewicht im Bereich von 400 bis 500 Dalton aufweist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Verbindung aus einem Blutegel der Unterklasse Euhirudinae isoliert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Verbindung aus einem Blutegel der Unterordnung Hirudiniformes, Ordnung Arhynchobdelidae isoliert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Verbindung aus einem Blutegel der Familie Hirudinidae isoliert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Verbindung aus einem Blutegel der Gattung Limnatis isoliert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Verbindung aus einem Blutegel der Art Limnatis nilotica isoliert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Verbindung aus den Köpfen der Blutegel isoliert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, umfassend das Dehydrieren und Extrahieren des Gewebes oder der Sekretion eines Blutegels unter Verwendung eines Lösungsmittels, gegebenenfalls Lyophilisieren des erhaltenen Extrakts, Suspendieren des erhaltenen Materials in einer wässerigen Lösung, Zentrifugieren des Materials, um ein Pellet zu erhalten, Beladen einer Größenfraktionierungssäule mit dem erhaltenen Überstand, Eluieren der Säule mit einer wässrigen Lösung, Sammeln von Fraktionen des eluierten Materials, Testen der Fraktionen auf antivirale Aktivität, Sammeln der aktiven Fraktionen, gegebenenfalls Durchführen eines weiteren Trennungsschritts mit den aktiven Fraktionen und Isolieren einer Verbindung mit antiviraler Aktivität und einem Molekulargewicht im Bereich von 300 bis 600 Dalton.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei der weitere Trennungsschritt über eine HPLC-Säule läuft.
Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels oder Medikaments mit antiviraler Aktivität, umfassend das Erhalten einer Verbindung mit antiviraler Aktivität durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 und Kombinieren der erhaltenen Verbindung mit einem zur Verabreichung geeigneten Träger.