ES2246498T3

ES2246498T3 - Aislados antivirales obtenidos de sanguijuelas.

Info

Publication number: ES2246498T3
Application number: ES96937576T
Authority: ES
Inventors: Gerard Voerman
Original assignee: Vitaleech Bioscience N V; VITALEECH BIOSCIENCE NV
Current assignee: Vitaleech Bioscience N V; VITALEECH BIOSCIENCE NV
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1996-11-13
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2016-11-13
Also published as: DK0861085T3; EP0861085A1; US6270808B1; WO1997017981A1; ATE299707T1; DE69634959D1; EP0861085B1; JP2000500156A; AU7508196A; CA2235394A1; DE69634959T2

Abstract

SE PROPORCIONAN METODOS, SUSTANCIAS Y COMPOSICIONES DERIVADOS DE SANGUIJUELAS, BACTERIAS ASOCIADAS A SANGUIJUELAS O COMBINACIONES DE ELLAS PARA PREVENIR INFECCIONES DE LAS CELULAS DEL HUESPED POR RETROVIRUS. MAS ESPECIFICAMENTE, LA INVENCION ESTA RELACIONADA CON LA INHIBICION DE LA REPLICACION DEL VIH. ASI, LA INVENCION PROPORCIONA METODOS Y SUSTANCIAS PARA EL TRATAMIENTO Y LA PREVENCION DE LA INFECCION POR EL VIH Y DEL SIDA. LOS COMPUESTOS O MEZCLAS PUEDEN OBTENERSE POR TECNICAS DE EXTRACCION DE SOLVENTES U ETAPAS DE SEPARACION, Y SE ENSAYARON DE LA SIGUIENTE MANERA. SE INOCULARON DOS AISLADOS DE VIH FORMADOR DE SINCITIO, HIVAMS55 Y HIVAMS37, EN CELULAS MONONUCLEARES EN SANGRE PERIFERICA Y EN MONOCITOS. DURANTE 14 DIAS, SE CONTROLARON LOS EFECTOS CITOPATICOS (ECP) INDUCIDOS POR EL VIH (FORMACION DE SINCITIO) Y LA PRODUCCION DEL VIRUS DETERMINADA POR ELISA DE CAPTURA DEL ANTIGENO P24, TRAS LA ADICION DE EXTRACTOS DE CABEZA DE SANGUIJUELA. LOS RESULTADOS DE ESTOS ENSAYOS CON LA SUSTANCIA O SUSTANCIAS INHIBIDORAS DEL VIH PARCIALMENTE PURIFICADAS FUERON LOS SIGUIENTES: 3 FRACCIONES INHIBIERON TANTO LA FORMACION DE SINCITIO COMO EL ANTIGENO P24 EN UN 1100 % CON UNA CONCENTRACION DE 0,067 M, 0,5 M Y 0,17 M, RESPECTIVAMENTE, EN LOS DOS AISLADOS DE VIH. UNA CUARTA FRACCION SUFRIO UNA SERIE DE DILUCIONES E INHIBIO TANTO EL ECP COMO EL ANTIGENO P24 EN UN 100 % A PARTIR DE LA CONCENTRACION DE 0,5 M EN LOS DOS AISLADOS DE VIH.

Description

Aislados antivirales obtenidos de sanguijuelas.

La presente invención se refiere al campo de compuestos anti-virales, por ejemplo, en el campo de enfermedades inmunes, particularmente enfermedades inmunes adquiridas, más en particular a infecciones con virus de la inmunodeficiencia humana.

Se describió una nueva inmunodeficiencia humana con infecciones y malignidades oportunistas en 1981. Se descubrió que el agente causante era un retrovirus, el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH). La patogénesis de la enfermedad comienza con la alteración y final agotamiento de las células de linfocitos T4, conduciendo a una destrucción progresiva del sistema inmune.

VIH es un retrovirus, que consta de un genoma de ARN encapsulado rodeado por una membrana central de doble capa. Un descubrimiento temprano fue la variación de las secuencias de nucleótidos de ciertas partes del genoma, especialmente en el gen de la cubierta (Shaw, y col, 1986).

Los genes gag y pol de VIH se traducen como dos poliproteínas (Pr55gag y Pr160gag-pol) (Jacks, y col, 1988). Estas se escinden posteriormente por la acción de una proteasa codificada por el virus en cuatro proteínas estructurales gag del núcleo del virión (p17, p24, p7 y p6) (Veronese, FD., y col., 1987), y las enzimas codificadas por pol esenciales para la replicación del retrovirus (proteasa, transcriptasa inversa, ribonucleasa H, y endonucleasa).

El componente gp120 del precursor glicoproteico del núcleo viral gp160 se une a CD4, un receptor celular del subconjunto de células T susceptible con alta afinidad (Berman, y col, 1989). Por lo tanto, el reconocimiento viral y la fusión de CD4 con gp120 es un suceso fundamental en el ciclo infeccioso. Debe observarse, sin embargo, que otros factores también pueden jugar un papel: Los anticuerpos que neutralizan el bucle V3 de gp120 evitan la infección incluso cuando no inhiben la unión a CD4 (Rusche, y col, 1985), y

La infección productiva de monocitos, en ausencia de proliferación y síntesis de ADN de linfocitos T, puede suceder y sirve como depósitos de larga vida relativa del virus (Weinberg, y col, 1991).

El desarrollo de fármacos frente a infección con VIH hasta ahora se ha dirigido a evitar la fusión entre la proteína de membrana CD4 y gp120 viral y a evitar por tanto la mediación de VIH en la entrada al citoplasma de linfocitos T4. La vacunación con gp120 recombinante (rgp120) condujo a la protección de chimpancés de infección con VIH (Berman PW., y col, 1990). La fusión citopática de células CD4 (sincitios) sucede en la expresión de gp120 en la membrana plasmática. CD4 soluble bloquea la secreción y la expresión en la superficie de gp120 evita dicha fusión celular (Buonocore & Rose, 1990).

Otros intentos de desarrollar fármacos frente a la infección con VIH hasta ahora se han centrado en la inhibición de la transcriptasa inversa (RT) de VIH y la proteasa de VIH. RT es la diana de AZT, el primer fármaco anti-VIH en uso clínico. Se descubrió que un derivado de TIBO, R82150, inhibía el 50% de RT de VIH a una concentración de 3,1 \muM y 4,9 \muM respectivamente para cepas virales diferentes (Pauwels, y col, 1990).

La inhibición de la proteasa de VIH se describe, por ejemplo, en los documentos EP 541168, US5.196.438, y en el documento WO092/08701. La inhibición de proteasas da como resultado la producción de partículas virales no infecciosas y proteínas precursoras gag y gag-pol no procesadas (Kohl, y col, 1988; Loeb, y col, 1990). Las recientes descripciones que se centran en la inhibición de la proteasa de VIH o RT de VIH en la bibliografía de patentes son: los documentos WO 95/20384, WO 95/16688, WO94/06454, EP 0666755, EP 0666842, WO 95/14011, y muchos más.

Se ha aislado un intervalo de VIH antigénicamente distintos (incluso en un individuo) que provocan un problema principal en el desarrollo de fármacos frente a VIH. Además, muchos fármacos que parecen prometedores in vitro sufren del hecho de que el virus es capaz de escapar de su efecto in vivo por mutagénesis rápida.

La presente invención proporciona un nuevo grupo de sustancias capaces de inhibir el Virus de la Inmunodeficiencia Humana, que puede por tanto usarse para prevenir o combatir la infección con VIH y/o SIDA.

Durante el ensayo en laboratorio de un intervalo recientemente descubierto de inhibidores de proteasa de sanguijuelas (véase, documento EP 94117053.2 y EP 95103637.5) se definieron inhibidores de elastasa, quimiotripsina, tripsina, plasmina y trombina potentes. Como la escisión proteolítica de los precursores gag y env en el ciclo de replicación de VIH es una etapa importante, se investigó si los inhibidores recientemente descritos tendrían un efecto en dicha replicación del virus. El desarrollo de inhibidores es un fundamento en el desarrollo de fármacos anti-virales. El objetivo de dicho estudio fue evaluar la capacidad antiviral de los inhibidores de proteasa, que eran el asunto de los documentos EP 94117053.2 y EP 95103637.5, en aislados primarios de VIH en la mayoría de los sistemas de ensayo biológico de células primarias.

Se concluyó en las solicitudes de patente anteriores, que la capacidad anti-viral estaba de hecho presente en los inhibidores descritos. Sin embargo, ahora se ha descubierto sorprendentemente, que una sustancia o grupo de sustancias anti-virales mucho más potentes residía en las extracciones con alcohol etílico de sanguijuela y cabeza de sanguijuela originales. Estas sustancias o grupos de sustancias que contenían dicha actividad sorprendente son el asunto de la presente invención. Se han purificado y caracterizado las sustancias.

El documento US 5 246 715 describe inhibidores de la agregación de plaquetas de la sangre obtenidos de la saliva de sanguijuelas de la familia Hirudinidae con un peso molecular menor de 2000 Da.

La presente invención, por tanto, proporciona un procedimiento para obtener un aislado o compuesto que tiene actividad inhibidora para virus, por ejemplo, para un virus de la inmunodeficiencia humana, obtenido de sanguijuelas del filo uniramia por técnicas de extracción con disolvente y que tiene un peso molecular de 300-600, preferiblemente 400-500 Dalton. Preferiblemente, el compuesto se obtiene de la subclase de euhirudinae, en particular se obtiene del suborden hirudiniformes, preferiblemente el orden de arhynchobdelidae. Son más preferidos los compuestos que se obtienen de la familia hirudinidae, en particular aquellos que se obtienen del género Limnatis, en particular la especie L. nilotica. L. nilotica (Savigny, 1820, como el siguiente de Autrum 1936) se describe como una "sanguijuela nasal" o sanguijuela del caballo (Mouquin-Tandon 1846). Se descubrió que estaba presente en toda el área litoral del Mediterráneo (Harant, 1929; Jarry, 1959). Vive en fuentes naturales y "oueds", y alimentos de ganado, perros y hombres (Blaise, 1874/5; Neveu & Lemaire, 1938; Turner, 1969; Keegan, y col, 1970).

Asombrosamente, los hábitos de alimentación de esta sanguijuela difiere de otras sanguijuelas hematófagas. Permanece unida a su huésped (cavidad nasal y laríngea) durante periodos prolongados (semanas a meses). El animal se alimenta de su huésped repetidamente. Se ha observado que la bebida de ganado estaba infectada con estas sanguijuelas, que no se desprenden cuando el ganado está bebiendo agua. Sólo las sanguijuelas gruesas, gordas, de tamaño adulto se desprenden en dichas ocasiones. Por lo tanto, está claro que esta Especie de sanguijuela está casi libre de sustancias antigénicas o inmunogénicas en sus producciones mucosa y de la glándula salival. Informes de animales huésped que mueren de esta especie de sanguijuela mencionan la anemia como una causa habitual, pero no se ha descrito un efecto antigénico directo. En un aspecto la invención, por tanto, proporciona compuestos que tienen actividad inhibidora de VIH que se puede obtener de la sanguijuela Limnatis nilotica o fragmentos o derivados de dichos compuestos que tienen actividad similar.

Dichos compuestos pueden obtenerse de todas las partes y secreciones corporales de la sanguijuela, incluyendo saliva y secreciones del intestino, intestinales y de la piel y mucus.

La fuente más adecuada para los compuestos de acuerdo con la invención es probablemente la extracción con disolvente de las cabezas de las sanguijuelas, o compuestos asociados con estas cabezas.

La presente invención también proporciona un procedimiento para obtener un compuesto que tiene actividad inhibidora del virus de la inmunodeficiencia humana que comprende deshidratar tejido de sanguijuela, preferiblemente cabezas de sanguijuela, o secreciones preferiblemente saliva, opcionalmente liofilizar el extracto resultante, suspender el material liofilizado en una solución acuosa, centrifugar el material para obtener un sedimento, cargar el sobrenadante resultante en un columna de fraccionamiento por tamaño, eluir la columna con una solución acuosa, recoger las fracciones del material eluido, ensayar las fracciones para la actividad inhibidora del virus de la inmunodeficiencia humana y recoger las fracciones activas.

Los aislados obtenidos por los procedimientos de la invención tienen indudablemente una actividad anti-viral. Sin desear unirse a una teoría, se supone -por ejemplo, en base a los datos de ensayo analíticos de este documento a continuación- que la actividad anti-viral puede atribuirse a un ingrediente activo que tiene la fórmula general Ar^{1}-espaciador-Ar^{2}, en la que Ar^{1} es un anillo aromático de seis miembros, que está preferiblemente sustituido en posición para, por ejemplo, con un grupo hidroxilo o un grupo amino, pudiendo el anillo de seis miembros estar también sustituido en las otras posiciones con, por ejemplo, grupos alquilo C_{1-4}, y halógenos; en la que el espaciador contiene un grupo alquileno C_{3-8} acoplado a través de un grupo hidrófilo, tal como un grupo amido, a Ar^{1}; y en la que Ar^{2} es un sistema de 2 anillos heteroaromático basado en átomos de carbono y nitrógeno (teniendo el sistema de 2 anillos 9 o 10 átomos (sistemas de anillo tipo purina o naftaleno)), pudiendo estar sustituido el sistema de anillo con, por ejemplo, grupos alquilo C_{3-8}, grupos hidroxi, grupos amino, halógenos etc.; así como sales de adición, solvatos y dímeros de estos aislados.

Sin embargo, no se puede descartar que otros ingredientes de los aislados obtenidos sean los inhibidores potentes o compuestos anti-virales o atribuirlo a la actividad mostrada.

Preferiblemente, dicho procedimiento comprende adicionalmente someter a las fracciones activas a una etapa de separación adicional, preferiblemente usando una columna de HPLC. Los aislados o compuestos obtenidos por estos procedimientos que se han aislado hasta ahora tienen un bajo peso molecular. Cuando se ensayaron estos compuestos para su capacidad inhibidora, se descubrió que los compuestos o mezclas de compuestos de acuerdo con la invención tienen actividad anti-viral en general, por ejemplo, actividad inhibidora del virus de la inmunodeficiencia humana en el intervalo micromolar. Se ha descubierto, por ejemplo, que el aislado inhibe completamente la formación de sincitio inducida por el virus de la inmunodeficiencia humana o producción de p24 a concentraciones de 0,5 \muM, preferiblemente 0,17 \muM, más preferiblemente 0,067 \muM. La invención proporciona adicionalmente el uso de estos compuestos o mezclas en la prevención o combate de infecciones con VIH y/o SIDA y por tanto también proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de acuerdo con la invención y un vehículo adecuado para su administración. En base al tipo y cantidad de actividad de los compuestos y las cantidades toleradas, que pueden determinarse en estudios animales usando dosis en aumento, el especialista en la técnica será capaz de desarrollar estas formulaciones farmacéuticas.

La administración puede conseguirse de cualquier manera adecuada, aunque para algunos compuestos en aplicaciones sistémicas pueden preferirse vías parenterales. Las dosificaciones para estas sustancias pueden tomarse de la bibliografía y diseñarse en base a actividades específicas de las sustancias, el peso molecular de las sustancias, el peso del sujeto a tratar, el tipo de aplicación, etc. La dosificación habitualmente estará entre 0,1 pg/kg y 10 mg/kg de peso corporal. Los excipientes adecuados son bien conocidos en la técnica y varían de agua para inyección a proteínas vehículo tales como albúmina de suero para, por ejemplo, preparaciones liofilizadas y sustancias inertes tales como manitol, celulosa y dextrano para comprimidos y granulados. El modo más fácil es, por supuesto, proporcionar simplemente los compuestos en agua estéril (o solución salina) para inyección.

Parte experimental

Durante el trabajo de investigación con inhibidores de proteasa obtenidos de L. nilotica, se observó sorprendentemente que, cercana a la actividad de inhibición de la replicación de VIH de los inhibidores de proteasa mencionados anteriormente, otra fracción, obtenida de extractos con etanol de cabezas de L. nilotica, era mucho más potente. Este grupo de sustancias se llama SILIAVIR en la presente descripción.

En un sistema de ensayo biológico con células primarias, que se describe adicionalmente a continuación, se concluyó, que el extracto de cabeza de sanguijuela completa mostraba una inhibición de la replicación de VIH dependiente de dosis en dos aislados de VIH separados, siendo casi completa a una concentración de 0,5 \muM (véase Tabla 1 y Tabla 2 de la Figura 1).

Los procedimientos en etapas de aislamiento y purificación adicionales, condujeron finalmente a un grupo de compuestos activos también llamados sustancias en este documento, que tienen un peso molecular alrededor de 0,5 kD, que muestra, por ejemplo, inhibición de la replicación de VIH al 100% a dichas concentraciones bajas como 0,06 \muM.

Los efectos biológicos medidos aún no se han relacionado con una de las estrategias conocidas en el desarrollo de fármacos frente a virus, en particular retrovirus, y más específicamente frente a VIH. Sin embargo, cualquiera de estas estrategias bien conocidas podría estar implicada (por ejemplo, inhibición de RT, sCD4, gp120 sustituto, inhibición de la proteasa de VIH). Otros posibles medios de activación no están excluidos (por ejemplo, aunque sin limitación: efectos en las células, así como efectos en los virus estimulantes, o la combinación de ambos), y se están investigando.

La presente invención revela las etapas de aislamiento y purificación, en combinación con el sistema de ensayo biológico en células primarias, que conduce a este grupo de sustancias nuevas y únicas, que tienen las actividades específicas descritas.

Descripción del ensayo Biológico y de Aislamiento y Purificación A. Sistema de ensayo biológico Células mononucleares sanguíneas periféricas

Se inocularon PBMC estimuladas con fitohemaglutinina (PHA) de donantes sanos con dos aislados de VIH diferentes (HIVAms 37 e HIVAms 55). Después de una exposición de dos horas a los aislados de VIH, el inóculo se retiró y se añadieron concentraciones seriadas de Siliavir a los cultivos. El medio se cambió dos veces a la semana, se añadieron PBMC estimuladas con PMA reciente cada semana. Los revestimientos tamponantes se exploran de manera rutinaria para contaminantes virales y se usan sólo cuando son negativos para estos contaminantes. La producción de virus en los cultivos se controló con un ELISA de captura de p24, detectando la proteína del núcleo p24 de VIH. Los cultivos también se controlaron para la existencia de efectos citopáticos (formación de sincitio).

Medio de cultivo

Durante los dos primeros días después del aislamiento de las células, se cultivaron leucocitos sanguíneos periféricos primarios en Medio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM), suplementado con suero de ternera fetal (FCS) al 10%, polibrene (5 \mug/ml), fitohemaglutinina (5 \mug/ml), penicilina (100 IU/ml) y estreptomicina (100 IU/ml). Los blastos de células T después se cultivaron adicionalmente en IMDM suplementado con FCS al 10%, polibrene (5 \mug/ml), IL-2 recombinante (10 IU/ml), penicilina (100 IU/ml) y estreptomicina (100 IU/ml).

Virus

Se prepararon inóculos de alto título de dos aislados de VIH que inducen sincitio primario. Los títulos de la solución madre se determinaron en un ensayo TCID50.

Diseño experimental

Se inocularon un total de 10^{7} PBMC estimuladas con PHA con 10^{4} TCID50/ml de los aislados de VIH primarios en un volumen de 1 ml durante 2 horas a 37ºC. Después de 2 horas, las células se lavaron en un volumen total de 30 ml. Después de centrifugación, el sobrenadante se desechó para retirar el virus no absorbido. Las células se resuspendieron posteriormente a una concentración final de 10^{6}/ml. De cada suspensión celular se transfirieron alícuotas de 100 \mul que contenían 10^{5} células a pocillos de una placa de cultivo tisular de 96 pocillos. Se hicieron diluciones de fracciones de Siliavir de soluciones madre de 1 \muM, en medio de cultivo de modo que después de la adición de 50 \mul a cada pocillo las concentraciones finales en los pocillos fueron 0,063 \muM, 0,125 \muM, 0,25 \muM, y 0,5 \muM. Las células que recibieron medio solo sirvieron como cultivos de control no tratados. Cada concentración se analizó cuatro veces. Las células se cultivaron en una atmósfera humidificada a 37ºC, CO_{2} al 5%. La adición de 10^{5} PBMC estimuladas con PHA recientes y medio se realizó en el día 7. En paralelo, se añadió una nueva dosis de las mismas concentraciones de Siliavir.

Controles

En los días 4 y 7, los cultivos se analizaron para cualquier efecto citopático inducido por VIH reflejado por la presencia de sincitios. En los días 7, y 14, se recogieron 30 \mul del sobrenadante del cultivo para analizar la presencia de antígeno p24 en un ELISA de captura de antígeno p24. Para esto, dos veces a la semana, se recogieron alícuotas de 30 \mul de los cultivos y se inactivaron por la adición de 30 \mul de Triton-X-100 al 0,2%. Se añadieron 15 \mul de esta mezcla a los pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos revestida durante 2 horas a 37ºC con un anticuerpo anti-p24 que había demostrado reconocer todos los aislados de VIH. Se dejó el antígeno se uniera durante 2 horas a 37ºC. La unión de p24 se detectó con inmunoglobulina de conejo anti-p24 marcada con peroxidasa de rábano rusticano (90' a 37ºC). Después, se añadió el sustrato (TMB) y después de 20', la reacción se paró por la adición de H_{2}SO_{4}.

Los resultados se presentan en las Tablas 1 y 2 (Figura 1). Las tablas se deben leer con lo siguiente en cuenta.

Cálculo de los resultados

Para el cálculo del porcentaje de inhibición se usó la siguiente fórmula

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ producción de p24 en cultivos no tratados -\+\cr  \+ producción
de p24 en cultivos expuestos a  sustancia\+\cr  Porcentaje de
inhibición = \+
--------------------------------------------------------------------
\+ x 100%\cr  \+ producción de p24 en cultivos no
tratados\+\cr}

Criterios

Los cultivos se consideraron positivos si:

Se observó formación de sincitios en al menos una ocasión (los cultivos se examinaron dos veces a la semana) en combinación con un contenido en antígeno p24 elevado en el sobrenadante en al menos una ocasión.

Valoración del sincitio

- sincitio no observado en ninguno de los cuatro cultivos replicados

\pm sincitio observado en uno de los cuatro cultivos replicados

+ sincitio observado en dos de los cuatro cultivos replicados

++ sincitio observado en tres de los cuatro cultivos replicados

+++ sincitio observado en cuatro de los cuatro cultivos replicados

Resultados

Los efectos citopáticos inducidos por VIH-1 (CPE), la producción de antígeno p24, y los porcentajes de inhibición calculados se muestran en las Tablas 3 y 4 para la sustancia 1 y en las Tablas 1 y 2 para la sustancia 3.

Los datos para la producción de p24 representan la media de cuatro cultivos replicados.

Los cultivos inoculados con 10^{2} TCID_{50} permanecieron negativos para la producción de virus.

La sustancia tres, mencionada en estas tablas, representa extracto de cabezas de sanguijuela completas. El procesamiento, purificación y aislamiento del extracto se describen a continuación.

Cada vez que tiene lugar una nueva etapa de purificación (véase a continuación), se usa el sistema de ensayo biológico describo como un "sistema de ensayo de afinidad" para reducir adicionalmente las sustancias activas de la fracción de extracto.

B. Procedimientos para el aislamiento y purificación

Se deshidrataron un total de 15 g de cabezas cortadas de Limnatis nilotica congeladas en alcohol etílico al 94% a temperatura ambiente. Se hicieron tres cambios de un total de 134 ml, después de lo cual se añadieron 400 ml de agua destilada, y el extracto se liofilizó posteriormente en viales. Se recogió un total de aproximadamente 90 mg de material liofilizado. (También se pueden usar, como alternativa, cabezas picadas de estas sanguijuelas, o usar las secreciones mucosas activadas de sanguijuelas vivas, sumergiéndolas, por ejemplo, durante 10 minutos en alcohol etílico al 4% a temperatura ambiente).

El material liofilizado (aproximadamente 90 mg) primero se suspendió en 4,55 ml de agua destilada. Después de ello, se añadieron tres porciones de 4,55 ml de agua destilada. Después se diluyó adicionalmente el 50% de esta suspensión (9,1 ml) con 30 ml de agua destilada, el otro 50% se almacenó a -20ºC. La suspensión se dividió entre dos tubos de centrifugación y se centrifugaron. El sedimento se almacenó a -20ºC. El 50% del sobrenadante también se almacenó a -20ºC. El otro 50% del sobrenadante se cargó en una columna de Sephadex G-75 (longitud 180 cm, diámetro 1,85 cm). El eluyente es agua destilada, el tamaño de fracción: aproximadamente 4-7 ml; el flujo se ajustó de aproximadamente 0,5 a 1 ml/min. Se tomaron muestras de un total de 149 fracciones y se midió la absorción a 214 nm. Se redujo el flujo en la columna de su ajuste inicial de 1 ml/min a aproximadamente 0,5 ml/min y el tamaño de fracción disminuyó de 7 ml iniciales a 4 ml (fracción 1 a 25:aproximadamente 7 ml; fracción 26 a 29: aproximadamente 6 ml; fracción 30 a 79:aproximadamente 5 ml y fracción 80-149: aproximadamente 4 ml). Fue visible una ligera opalescencia en las fracciones 19 a 24, mientras que fue visible una precipitación en las fracciones 95 a 108. En base al diagrama de absorción (Figura 2) y SDS-PAGE (Figura 3) se hicieron las siguientes combinaciones para ensayos adicionales:

fracción 16 a 29 (aproximadamente 83 ml); nombre de la muestra: 3A

fracción 30 a 75 (aproximadamente 230 ml); nombre de la muestra: 3B

fracción 76 a 97 (aproximadamente 92 ml); nombre de la muestra: 3C

fracción 98 a 130 (aproximadamente 132 ml); nombre de la muestra: 3D.

La precipitación encontrada en la combinación 98 a 130 se almacenó a -20ºC.

El material total a través del gel de filtración es aprox. 50% x 50% de 90 mg = aprox. 22,5 mg.

Las Muestras A a D se presentaron para ensayo con el sistema de ensayo biológico usando células primarias como se ha descrito, estimada cada muestra a 5 mg (pérdidas incluidas).

La estimación del peso de sustancia de las muestras, es la siguiente:

Muestra 3A: 83 ml, que contenían 5 mg, concentración 60 \mug/ml.

Muestra 3B: 230 ml, que contenían 5 mg, concentración 22 \mug/ml.

Muestra 3C: 92 ml, que contenían 5 mg, concentración 54 \mug/ml.

Muestra 3D: 132 ml, que contenían 5 mg, concentración 38 \mug/ml.

De la Muestra 3A se añadió una fracción de 0,625 ml a 2,9 ml de agua destilada, 1 ml de medio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM) concentrado 5 veces y 0,5 ml de suero de Ternera Fetal (FCS), dando como resultado de este modo una solución con una concentración de 1 \muM.

De la Muestra 3B se añadió una fracción de 1,7 ml a 1,8 ml de agua destilada, 1 ml de IMDM concentrado 5 veces y 0,5 ml de FCS, dando como resultado de este modo una solución con una concentración de 1 \muM.

De la Muestra 3C se añadió una fracción de 0,694 ml a 2,8 ml de agua destilada, 1 ml de IMDM concentrado 5 veces, y 0,5 ml de FCS, dando como resultado de este modo una solución con una concentración de 1 \muM.

De la Muestra 3D se añadió una fracción de 0,987 ml a 2,5 ml de agua destilada, 1 ml de IMDM concentrado 5 veces, y 0,5 ml de FCS, dando como resultado de este modo una solución con una concentración de 1 \muM.

Todas las fracciones se filtraron a través de un filtro de 0,22 \muM antes de su uso.

Los resultados se representan en las tablas y adjuntos a estas. La Muestra 3A se representa en las Tablas 3 y 4 en la Figura 4, la Muestra 3B en las Tablas 5 y 6 en la Figura 5, la Muestra 3C en las Tablas 7 y 8 en la Figura 6, y la Muestra 3D en las Tablas 9 y 10 en la Figura 7.

Resultados del ensayo biológico de las Muestras 3A a 3D.

Sólo la Muestra 3D mostró una inhibición de la replicación de ambos aislados de virus en estudio dependiente de dosis. La inhibición fue completa (100%) a una concentración de 0,125 \muM.

La Muestra 3D, que originalmente constaba de 132 ml, de los que se usó casi 1 ml en el sistema de ensayo biológico, se analizó adicionalmente por HPLC en un sistema TFA.

El sistema TFA-HPLC comprende una columna de nucleosil 10C18 que tiene una longitud de 150 mm y un diámetro de 2 mm en un aparato HP 1090M, por la que el flujo es a una velocidad de 350 \mul/min. El eluyente es un gradiente de A al 100%/B al 0% a B al 100% y A al 0% en 120 minutos por lo que el eluyente A es TFA al 0,05% (ácido trifluoroacético) en agua destilada y el eluyente B es TFA al 0,03% en acetonitrilo.

Esta muestra, que constaba de aproximadamente 130 ml, se liofilizó, después de retener 1400 \mul. La sustancia liofilizada se resuspendió en 1 ml de agua destilada y se centrifugó. Se examinó el 0,1% del sobrenadante en HPLC analítica (véase el resultado en el gráfico 95E038 en la Figura 8), y el 10% del sobrenadante se separó después de HPLC preparativa (véase el resultado en el gráfico 95E043 en la Figura 9). Cinco fracciones se aislaron, liofilizaron, resuspendieron en agua, y liofilizaron otra vez. Estas fracciones se llamaron 3D1, 3D2, 3D3, y 3D4 (véase Figura 10), la fracción 3D5 se almacenó a -20ºC. Las muestras de las fracciones 3D3 y 3D4 se analizaron por análisis de secuencia, y no se detectó ninguna secuencia en ninguna fracción.

Las fracciones 3D1, 3D2, 3D3 y 3D4 se presentaron para ensayo en el sistema de ensayo biológico como se ha descrito anteriormente. La estimación de las cantidades de fracción después de HPLC, y en base a la cromatografía, fue respectivamente: 120 \mug, 30 \mug, 50 \mug y 50 \mug.

Los resultados del ensayo de la inhibición de la replicación de VIH con estas fracciones se representan en las Tablas 11 a 18 (Figuras 1-18).

Se concluyó que las subfracciones 3D3 y 3D4 mostraron un efecto inhibidor en la replicación de los dos aislados de VIH primarios. La inhibición por la subfracción 3D3 fue completa a una concentración de 0,25 \muM. La inhibición por la subfracción 3D4 fue completa a una concentración de 0,063 \muM.

Las fracciones 3D3 y 3D4 se analizaron adicionalmente por HPLC.

Por lo tanto, de la Muestra 3D (como se ha especificado anteriormente) se tomó dos veces un 10% como material de partida. Se realizaron dos realizaciones de HPLC preparativa (misma técnica que antes) (véase cromatograma 95E058-2, Figura 19). Se aislaron por separado 10 fracciones (Nº 1 a 10) en los tiempos de elución de 22 y 32 minutos (véase cromatograma con las fracciones en la Figura 20). Cuatro de estas fracciones, Nº 6, 7, 8 y 9 se liofilizaron, resuspendieron en agua destilada y liofilizaron otra vez y se presentaron otra vez para ensayo en el sistema biológico como se ha descrito anteriormente.

La estimación de cantidades de fracción dio: 1 \mug, 39 \mug, 7,5 \mug y 2,5 \mug respectivamente. Tres fracciones (6, 8 y 9) se disolvieron en 1 ml de medio (IMDM) + FCS al 10%, dando como resultado de este modo soluciones madre de 0,2 \muM para la fracción 5, 1,5 \muM para la fracción 8, y 0,5 \muM para la fracción 9. El 50% de estas soluciones madre se añadió a 100 \mul de medio, proporcionando concentraciones finales de 0,067 \muM para la fracción 6, de 0,5 \muM para la fracción 8, y de 0,17 \muM para la fracción 9. Se hizo un intervalo de dilución sólo de la fracción 7 (0,5 \muM, 0,25 \muM, 0,125 \muM y 0,063 \muM).

Estas cuatro fracciones ahora se rellamaron: \alpha, \beta, \gamma y \delta respectivamente.

Los resultados fueron: inhibición de la replicación de VIH completa (100%) para las fracciones \alpha, \beta, \gamma y \delta a la concentración ensayada. Se observó una inhibición dependiente de dosis para la fracción \beta, siendo completa a una concentración de 0,5 \muM (véanse Tablas 19 a 22 en las Figuras 21-24).

En un experimento adicional, se demostró, que de la fracción \beta, podían aislarse varias fracciones. Por lo tanto, se pasó la fracción 3D4\beta, aislada de cromatografía en HPLC 95E058-2, en una RT-HPLC en acetato de amonio.

La etapa de HPLC comprende la misma columna descrita para TFA-HPLC al mismo caudal, siendo el eluyente también un gradiente que va desde A al 100% y B al 0% a B al 100% y A al 0% en 120 minutos, por lo que A y B en este sistema son acetato de amonio al 0,1% en agua destilada a pH=6 (A) y acetonitrilo al 100% (B).

El resultado de esta nueva cromatografía se muestra en cromatograma: 95E070 (véase Figura 25).

La espectrometría de masas de las fracciones 3d3 y 3d4 (subfracciones 1 a 10) mostraron moléculas con masas entre 400 y 500 Dalton.

Las subfracciones 4, 5, 6, 8 y 10 se presentaron para ensayarlas en el mismo sistema de ensayo biológico como se ha descrito anteriormente.

Los resultados de ensayo mostraron baja actividad de inhibición de la replicación de VIH para las subfracciones 4, 5, 6 y 10 hasta una concentración de 0,06 \muM. Las subfracciones 8 mostraron una inhibición de la replicación de VIH dependiente de dosis con una inhibición del 100% para HIVams55 y una inhibición del 90% para HIVams37 a una concentración de 0,046 \muM.

La subfracción 8 experimentó una serie de ensayos para espectrometría de masas. Se determinó que esta subfracción constaba de una mezcla de dos moléculas con masas de 426 y 440 D.

Las medidas de EN/EMEM para la subfracción 8^{426} y 8^{440} mostraron producciones positivas de las siguientes masas: ambas tuvieron un grupo de 120 D, un grupo de 17 D, un grupo de 18 D, y un grupo de 11D. Difieren en un grupo de 42 D para 8^{426}, frente a un grupo de 56 D para 8^{440}. No se detectaron iones negativos.

La espectrometría de masas de otras fracciones en las Muestras 3d3 y 3d4 (subfracciones 1 a 10) mostraron moléculas con masas de aproximadamente 500 Dalton.

Se ejecutó una Espectrometría de Masas de Alta Resolución por Electronebulización (EN-EMAR) sobre las sustancias que mostraron inhibición de la replicación de VIH (subfracción 8, Siliavir). Estas se definieron anteriormente en este documento por procedimientos de aislamiento, purificación y ensayo biológico.

Por lo tanto se usó el 10% de la subfracción 8 de HPLC 95E085 (solubilizada en TFA al 0,1%).

Se encontraron dos moléculas separadas como fracciones principales. Una de estas dos moléculas tuvo la masa de 426,164300 D (subfracción 8^{426} o Siliavir^{426}), la otra de las dos moléculas con la masa de 440,1816 D (subfracción 8^{440} o Siliavir^{440}). (Véase Figura 26). El experimento se ejecutó con un instrumento Finnigan-MAT 900 al poder de resolución de R = 10.000. Por consiguiente, se ejecutó una espectrometría de masas secuencial (CL-EM)^{n}, y que confirmó los descubrimientos anteriores de medidas EN-EMEM.

Resonancia Magnética Nuclear (RMN)

Se ejecutó RMN con un instrumento Varian Unity 500 Mhz sobre Siliavir. Se preparó una muestra a partir del nuevo material base para la que se prepararon extractos con etanol de cabeza de sanguijuela sin tratar como antes. El material base liofilizado se resuspendió con 50 ml de H_{2}O. Se realizó una etapa de separación para separar las masas por debajo y por encima de 3 kD. Por lo tanto, esta solución resuspendida se volvió a repartir entre 8 tubos centriprep-3 (kD) y se centrifugaron 4 veces. Los filtrados de cada etapa de filtración se combinaron, liofilizaron y por consiguiente se resuspendieron en HAc al 50%.

Posteriormente, como se describió anteriormente en este documento, se realizó HPLC preparativa sobre el filtrado resuspendido. Columna 7,7 x 250 mm (Nucleosil 10C18; flujo ajustado a 2 ml/min; detección a 254 nm o 280 nm, sistema TFA; eluyente A es TFA al 0,05%; eluyente B es TFA al 0,05% en acetonitrilo al 100%; gradiente: B al 0% a B al 100% en 60 minutos). La fracción entre 24,2 y 27 minutos se recogió por separado (Véase HPLC analítica de la Figura 27) y se liofilizó.

Esta fracción, separada, se resuspendió en 500 \mul de Hac al 50%, y se pasó otra vez a HPLC, con el sistema de acetato de amonio. (Columna 7,7 x 250 mm; Nucleosil 10C18, flujo ajustado a 2 ml/min, detección a 254 nm; sistema de Acetato de Amonio (A.A.); eluyente A es A.A. al 0,1% en H_{2}O a pH=6; eluyente B es acetonitrilo al 100% en 60 minutos).

Como esta muestra mostró una precipitación dependiente de tiempo, se centrifugó y el sobrenadante y el sedimento se analizaron por separado (Véase Figura 28 para el cromatograma del sobrenadante, y Figura 29 para el cromatograma del sedimento, que se resuspendió en 1,6 ml de HAC al 50%).

Las fracciones que eluyeron entre 24 y 27 minutos tanto del pase del sobrenadante en HPLC como el pase del sedimento en HPLC se recogieron, se combinaron y se liofilizaron. Se muestra un cromatograma de HPLC analítica de este material recogido, que consta tanto del componente Siliavir^{426} como Siliavir^{440}, en la Figura 30.

El material descrito se preparó y se resuspendió con D_{2}O y DAc al 50% para su pase en el instrumento Varian Utility 500 Mhz. Por separado, el sedimento resuspendido de la Figura 29 anterior también se pasó por separado en el mismo instrumento. Se hicieron diferentes tipos de Espectros de RMN (de Protones, C13, DQCosy, y Noesy). Los resultados se muestran en las Figuras 31-41 para los espectros de ambos componentes juntos, mientras que los resultados para el sedimento resuspendido (donde un componente, supuestamente Siliavir^{426}, está presente al 85% en la muestra, y el otro componente, supuestamente Siliavir^{440}, está presente al 15%) se muestran en las Figuras 42-49.

Microscopia Electrónica de Barrido/Espectroscopia de Dispersión de Energía (MEB/EDE)

El instrumento usado para este experimento fue un ISIDS-130 (Akhashi). La preparación del material de ensayo se realizó con ambos componentes (Siliavir^{426} y Siliavir^{440}). Los espectros mostraron picos para C, N, y O. Además, se muestra un pico de Si, que probablemente deriva del material de la columna de HPLC aunque no se puede excluir que derive del compuesto activo. La presente de S en el espectro puede atribuirse a un derivado del compuesto, por ejemplo, una sal, pero también puede ser una contaminación. No se encontró P.

Resultados de RMN, EM y MEB/EDE y análisis

Se analizan los resultados de las medidas de RMN sobre el material de ensayo que consta de la mezcla de los dos componentes (como se muestra en las Figuras 31-41) y de las medidas de RMN sobre el material que consta del 85% de un componente y el 15% del otro componente (como se muestra en las Figuras 42-49).

Un singlete a 9,3 ppm se correlaciona en HSQC a 148 ppm. Este puede ser un CH aromático aislado entre 2 N.

Dos dobletes a 6,75 y 7,54 ppm: 2 x 2 parejas de protones con 8,5 Hz. Esta constante es comparable con tirosina, y por lo tanto esto apunta a un anillo aromático sustituido en posición para.

Este fragmento de fenilo tiene dos sustituyentes, probablemente no directos a C ya que la interacción se pierde en el espectro Noesy.

Dos singletes a 3,5 y 3,7 ppm: 2 x 3 protones. Sin interacciones DQCosy y/o Noesy. Se correlaciona en HSQC a aproximadamente 30 ppm. Estos son probablemente grupos N-CH_{3}, y probablemente no grupos O-CH_{3}. A causa de su posición en el campo inferior, un sistema de anillo Z heteroaromático dimetilado, por ejemplo, un fragmento tipo xantina (un alcaloide de purina), es una probable explicación para estos picos junto con el pico de 9,3 ppm.

Un triplete a 3,7 ppm: 2 protones. Se correlaciona en DQCosy con un multiplete a 1,72 ppm (2 protones); este multiplete se correlaciona con el multiplete a 1,46 ppm (2 protones).

Un triplete a 3,4 ppm: 2 protones. Se correlaciona en DQCosy con un multiplete a 1,65 ppm (2 protones); este multiplete se correlaciona con el mismo multiplete a 1,46 ppm (2 protones).

Se concluye a partir de estos tripletes y multipletes que esto puede apuntar a un fragmento X1-(CH_{2})_{5}-X5, en el que X_{1} y X_{2} son lo más probablemente N, en base a las posiciones de cambio químico de los CH_{2} alfa.

Señales a 1,2 y 1,4 ppm: probablemente artefactos o contaminación.

Los átomos de azufre no parecen estar presentes a partir de estos espectros de RMN.

Las señales de RMN de los dos componentes muestran que estos son isómeros. Sólo difieren 14,0173 D, que puede representar sólo CH_{2}. Por lo tanto, se concluye que Siliavir 440 es igual a Siliavir ^{426} más CH_{2}.

La presencia de los siguientes grupos se concluye o supone:

Un anillo aromático sustituido en posición para, masa = 76 + Y_{1} + Y_{2}.

Sistema AB en el anillo aromático, por ejemplo de fórmula:

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1

\vskip1.000000\baselineskip

en la que Y_{1} puede ser, por ejemplo, -OH, -CH_{2}OH, -N=C=O o -C(O)H, mientras que Y_{2} puede ser un átomo de oxígeno, un grupo NH, un grupo N sustituido con alquilo C_{1-3} o alquilo (sustituido) C_{1-3}, C=O.

\newpage

Un fragmento pentano en el componente 426, posiblemente hexano en el componente 440, por ejemplo, de fórmula:

2

en la que X_{1} y X_{2} pueden ser, por ejemplo: C, N, NCH_{3}, NSO_{4}, y

X_{3} a X_{4} pueden ser, por ejemplo: H, NH_{2}, N=C=O o X_{3}+X_{4}, X_{5}+X_{6}, X_{7}+X_{8}, X_{9}+X_{10}, X_{11}+X_{12}, X_{13}+X_{14} pueden ser juntos un oxígeno a un grupo =NH.

Un heterociclo aromático metilado, por ejemplo, fragmento tipo xantina, con dos grupos CH_{3}, por ejemplo, del tipo:

3

4

en el que Z_{1}, Z_{2}, Z_{5}, Z_{7} pueden ser, por ejemplo: C, H, CH_{2}OH, OH, NCO_{3}; y Z_{3}, Z_{4}, Z_{6}, Z_{8} pueden ser, por ejemplo: C, H, CH_{3}, OH, CH_{2}OH.

Un C-H entre dos N.

En base a las suposiciones anteriores, los compuestos activos pueden ser compuestos de los tipos:

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6

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7

8

en los que "\bullet" es un átomo de carbono con uno o dos átomos de hidrógeno.

Conclusión

Se puede concluir que la inhibición de la replicación de VIH esta fuertemente presente en un grupo de sustancias, que pueden atribuirse a aislados o moléculas separadas, o combinación de moléculas en este grupo. El grupo de sustancias se describe anteriormente en este documento por procedimientos para el aislamiento y ensayo biológico.

El grupo de sustancias que contiene la inhibición de la replicación de VIH comprende, por ejemplo:

3D3 y 3D4 como se ha descrito. Las moléculas contenidas en este grupo de sustancias para la mayor parte tienen pesos moleculares de alrededor de 500 Dalton.

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Veronese FD. y col.: J Virol 1988, 62: 795-801.

Claims

1. Un procedimiento para obtener un compuesto que tiene actividad anti-viral que comprende aplicar una técnica de extracción con disolvente a un tejido o secreción de una sanguijuela del filo uniramia y aislar un compuesto que tiene actividad anti-viral y un peso molecular en el intervalo de 300 a 600 Dalton.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se aísla un compuesto que tienen actividad inhibidora de VIH.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que se aísla un compuesto que tiene actividad inhibidora de VIH en el intervalo micromolar.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que se aísla un compuesto que tiene una actividad inhibidora de formación de sincitio inducida por VIH o producción de p24 a una concentración de 0,5 \muM.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que se aísla un compuesto que tiene actividad inhibidora de formación de sincitio inducida por VIH o producción de p24 a una concentración de 0,17 \muM.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que se aísla un compuesto que tiene actividad inhibidora de formación de sincitio inducida por VIH o producción de p24 a una concentración de 0,067 \muM.

7. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que se aísla un compuesto que tiene un peso molecular en el intervalo de 400 a 500 Dalton.

8. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el compuesto se aísla de una sanguijuela de la subclase euhirudinae.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el compuesto se aísla de una sanguijuela del suborden hirudiniformes orden arhynchobdelidae.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el compuesto se aísla de una sanguijuela de la familia hirudinidae.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el compuesto se aísla de una sanguijuela del género Limnatis.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el compuesto se aísla de un sanguijuela de la especie Limnatis nilotica.

13. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el compuesto se aísla de las cabezas de sanguijuelas.

14. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicación 1-13, que comprende la deshidratación y extracción con disolvente de dicho tejido o secreción de sanguijuela, opcionalmente liofilizar el extracto resultante, suspender el material resultante en una solución acuosa, centrifugar el material para obtener un sedimento, cargar el sobrenadante resultante en una columna de fraccionamiento por tamaño, eluir la columna con una solución acuosa, recoger fracciones del material eluido, ensayar las fracciones para la actividad anti-viral, recoger las fracciones activas, someter opcionalmente las fracciones activas a una etapa de separación adicional y asilar un compuesto que tiene actividad anti-viral y un peso molecular en el intervalo de 300 a 600 Dalton.

15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicha etapa de separación adicional es sobre una columna de HPLC.

16. Un procedimiento para preparar una composición farmacéutica o medicamento que tiene actividad anti-viral que comprende obtener un compuesto que tiene actividad anti-viral por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15 y combinar el compuesto resultante con un vehículo adecuado para su administración.