KR20000069296A

KR20000069296A - 항바이러스 활성을 갖는 살비아 종의 추출물

Info

Publication number: KR20000069296A
Application number: KR1019997004954A
Authority: KR
Inventors: 마이언 한; 폴 리
Original assignee: 윌리암 제이.하트만; 조지타운 유니버시티
Priority date: 1996-12-05
Filing date: 1997-12-04
Publication date: 2000-11-25
Also published as: EP1011701A4; US5994400A; EP1011701A1; WO1998024460A1; JP2001505583A; AU5703198A; US6117903A

Abstract

본 발명은 본질적으로 pH≤3에서 수용액으로부터 침전하는 살비아(Salvia)로부터의 분획으로 이루어진 살비아 종의 추출물을 제공하며, 상기 침전은 약 pH 4에서 용해의 시작이 쉽게 관찰되며 pH 6에서 수용액에 본질적으로 완전히 용해하는 특성을 갖고, 상기 추출물은 ≤3500 달톤의 분자량을 갖는다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서는 ≤1000 달톤의 분자량을 갖는 활성제를 제공한다.

Description

항바이러스 활성을 갖는 살비아 종의 추출물 {Extracts of Salvia Species Having Antiviral Activity}

살비아 밀티오리자(Salvia Miltiorhiza; SM)은 심혈관계 질환과 간 질환을 치료하기 위한 중국 전통 의약으로 오랫동안 사용되어 왔다. 이들 식물은 추출될 수 있는 수종의 성분들을 갖고 있다. 뿌리의 성분들은 처음에 95% 에탄올로 추출한 다음 냉수 또는 열수로 추출한다. 물에 추출된 두 분획들은 모두 항바이러스 활성을 나타내고 동물에서 최소 독성을 나타낸다.

레트로바이러스는 게놈 DNA에서 mRNA로의 유전 정보의 정상적인 흐름을 역전시키는 능력을 갖고 있다. 레트로바이러스는 하나의 명백하게 규정되고 비교적 동종인 바이러스 속에서 유래하지만, 역사적으로 이들은 주로 감염의 병리학적 결과에 기초하여 3개의 분류 집단으로 세분되었다. 온코바이러스 아군은 감염된 숙주에서 종양 질환을 유발하는 능력을 갖는 레트로바이러스 뿐만 아니라 몇몇 동족이지만 외관상 양성인 바이러스를 포함한다. 렌티바이러스는 항상은 아니지만 대개 종양 성분이 없는 느리게 진행하는 만성 질환을 유발한다. 스푸마바이러스 아군의 구성원들은 조직 배양물에서 현저한 포말상 세포병리적 효과를 일으킨다. 이들은 여전히 임의의 사람 또는 동물 질병에 명백하게 관련시켜야 한다.

레트로바이러스 복제는 비리온 코어의 세포질내 침투로 개시하며, 그 과정은 바이러스 외피 당단백질과 특이적 세포 표면 수용체와의 특이적 상호작용에 의해 매개된다. 이어서, 비리온-연결된 RNA 의존 DNA 폴리머라제는 단일쇄 RNA 게놈을 이중쇄 선형 DNA 프로바이러스 중간체로 번역한다 (역전사). 삽입 단백질 (인테그라제)은 바이러스 DNA의 양쪽 말단을 모두 특이적으로 인식하고, 3'-말단으로부터 2개의 뉴클레오티드를 제거한다 (3'-공여체 처리). 이어서, 처리된 바이러스 DNA와 인테그라제는 핵으로 이동하고, 여기에서 바이러스 인테그라제는 레트로바이러스 게놈을 숙주 염색체 DNA에 공유 결합시켜 (쇄 전달) 레트로바이러스 프로바이러스를 형성한다.

중요한 인간 병원체로서 사람 면역결핍 바이러스 형(HIV)의 출현은 레트로바이러스에 대한 과학적 관심을 부활시켰다. 특히, 과학적인 증거에 의하면 상기 서술된 단순한 생활주기가 이 바이러스 속의 모든 구성원의 복제 사이클을 완전히 정확하게 설명한 것이 아님을 나타낸다. 예를 들면, HIV-1은 특징적 레트로바이러스 Gag, Pol 및 Env 이외에 6개의 유전자 산물을 암호화하고, 이들은 신규 세트의 단일 스플라이싱된 및 복수 스플라이싱된 바이러스 mRNA 종으로부터 번역된다. Tat 및 Rev로 칭하는 적어도 2개의 이들 부가 단백질은 HIV-1 유전자 발현을 직접적으로 조절하는 작용을 한다. 따라서, 침투와 프로바이러스 삽입 사이의 단계는 MLV(쥐 백혈병 바이러스) 및 HIV-1 둘 모두에 대해 매우 유사한 것으로 보이지만, 삽입후 사건은 후자에 있어서 상당히 더 복잡한 것으로 발견되었다. 더 최근에, HIV-1이 현재 복합 레트로바이러스로 부르는 동물 레트로바이러스의 전체 강 중 하나인 것이 분명해졌다. 이들 복합 레트로바이러스에 속하는 레트로바이러스는 모든 렌티바이러스, 스푸마바이러스, 및 HTLV-1와 관련 바이러스를 포함한다 (표 1).

레트로바이러스 사이의 주요 분류학적 부문

범주	아군	기본형	다른 예
단순 바이러스	레트로- C형 레트로바이러스 A군	RSV	ALV, ASV
	C형 레트로바이러스 B군	MLV	FeLV, MSV, SNV, REV, SSV
	B형 레트로바이러스	MMTV
	D형 레트로바이러스	MPMV	SRV-1
복합 바이러스	레트로- 렌티바이러스	HIV-1	HIV-2, SIV, 비스나 바이러스, FIV
	T세포 백혈병 바이러스	HTLV-1	EIAV HTLV-II, STLV, BLV
	스푸마바이러스	HSRV	SFV, BFV
약어: RSV, 라우스 육종 바이러스; ALV, 조류 백혈병 바이러스; ASV, 조류 육종 바이러스; FeLV, 고양이 백혈병 바이러스; MSV, 쥐 육종 바이러스; SNV, 비장 괴사 바이러스; REV, 세망내피증 바이러스; SSV, 유인원 육종 바이러스; MMTV, 마우스 유선암 바이러스; MPMV, 마손-화이자 원숭이 바이러스; SRV-1, 유인원 레트로바이러스 1형; STLV, 유인원 T세포 백혈병 바이러스; BFV, 소 포말상 바이러스

인간 병원체로서 HIV-1의 중요성으로 인해 렌티바이러스의 복제와 유전자 조절이 연구의 주요 목적이 되었다. 실제로, HIV-1은 렌티바이러스 아군 뿐만 아니라, 더 넓게는 일반적으로 복합 레트로바이러스의 기본형으로서 관찰될 수 있다.

항바이러스제의 발전에 관하여, 레트로바이러스의 생활주기를 억제하기 위한 많은 좋은 표적이 있다 (역전사효소, 프로테아제 및 인테그라제). 지금까지, HIV에 대해 확인되고 FDA에서 시판을 승인한 많은 화합물 중에 역전사효소 및 프로테아제 억제제만이 확인되고 있다.

최근의 연구에서 역전사효소(RT)와 프로테아제에 대한 조합 요법이 T 림프구에서 대부분의 HIV 바이러스를 제거할 수 있는 것으로 증명되었다. 불행하게도, 적은 부분의 잔류 바이러스가 돌연변이하여 이들 약물의 존재하에서도 계속 복제한다. 높은 복제율, 바이러스 서열 돌연변이 및 바이러스 집단의 빠른 회전율 (turnover)은 레트로바이러스의 전형적인 특질이다. 이들 특질은 HIV-1의 경우 더욱 두드러진다.

HIV의 분자 메카니즘에 대한 연구가 상당히 진행하였음에도 불구하고, 현재의 항HIV 화학요법은 독성 효과와 비교적 짧은 치료기 이후 바이러스 내성 균주의 유발을 포함하는 많은 단점을 갖는다. 그 결과, 이들 약물은 HIV-감염의 완전한 치료 또는 예방을 위해 필요한 요구되는 장기간의 이익이 없다.

화학적으로 복잡한 분자인 현재 사용되는 역전사효소 및 프로테아제의 억제제는 너무 비싸다. 현재 전형적인 HIV-1 양성 환자는 대략 매년 $12,000 내지 $20,000 정도 소비할 것으로 추정된다. HIV로 감염된 사람들의 90%가 개발국에 거주하므로, 산업화 국가의 대다수의 환자들도 이들 약물을 이용할 수 없었다. 따라서, 보다 경제적으로 실행가능한 방법을 찾아야 하는 것이 분명하다.

(발명의 개요)

본 발명은 현재 공지되고 사용되는 바이러스 억제제에 대한 대체제로서 항바이러스 활성을 갖는 살비아 속의 추출물을 제공한다. 본 발명은 본질적으로 pH ≤3에서 수용액으로부터 침전하는 살비아로부터의 분획으로 이루어진 살비아 종의 추출물을 제공하며, 상기 침전은 약 pH 4에서 용해의 시작이 쉽게 관찰되며 pH 6에서 수용액에 본질적으로 완전히 용해하는 특성을 갖고, 상기 추출물은 ≤3500 달톤의 분자량을 갖는다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서 ≤1000 달톤의 분자량을 갖는 활성제를 제공한다. 본 발명에서는 또한 살비아 윤나넨시스(Salvia yunnanensis)의 수용성 추출물이 레트로바이러스 감염의 치료에 유용함을 최초로 기록한다. 본 발명은 살비아 밀티오리자 (SM) 및 살비아 윤나넨시스 (SY)의 추출물을 사용하여 본원에서 예시한다. 활성 단리물은 pH ≤3에서 수성 조건 하에 살비아 종으로부터 침전한다. 침전은 약 pH 4에서 용해하기 시작하여 pH≥6에서 완전히 용해되며, pI는 약 6.5이다. 가장 활성인 성분은 투석 및 전자스프레이 이온화 질량 분광법으로 측정할 때 ≤1000 달톤의 분자 크기를 갖는다. 질량 분광 데이타는 성분들이 대략 다음: 79.8, 110.0, 136.1, 180.1, 198.4, 296.2, 494.3 및 984.1의 원자 질량 단위를 갖는 것으로 측정하였다. 본 발명의 약제는 제약학적으로 허용되는 담체 중에서 전신 또는 국소 투여할 수 있다.

본 발명은 극동 지역에서 발견되는 식물인 살비아(Salvia) 속의 추출물의 바이러스 복제를 억제하기 위한 용도에 관한 것이다.

본 발명은 식물 추출물로부터 유래된 의약의 제조 방법을 이용한다. 이들 활성제는 레트로바이러스의 생활주기에서 필수 단계인 레트로바이러스 삽입과 복제를 억제한다. 프로바이러스 삽입에 관여하는 단계는 단순 또는 복합 레트로바이러스 모두에 대해 매우 유사한 것으로 보인다. 지금까지 연구된 모든 유형 또는 종류의 레트로바이러스 인테그라제 및 역전사효소(RT) 사이의 구조 및 기능 특성에서 상당한 유사성이 발견되었다. 이러한 기전의 보편성으로 인해, 폴리머라제, 바이러스 인테그라제 및(또는) RT의 억제제는 사람 면역결핍 바이러스 (HIV), 유인원 면역결핍 바이러스 (SIV), 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV), 고양이 백혈병 바이러스 (FeLV), 쥐 백혈병 바이러스 (MuLV), 라우스 육종 바이러스 (RSV), 소 면역결핍 바이러스 (BIV) 및 사람 T세포 백혈병 바이러스 (HTLV)와 같은 광범위한 유기체를 억제할 것이다. 본 발명의 활성제는 또한 역전사효소, 폴리머라제 및 인테그라제 유사 단백질과 같은 다른 바이러스 복제 단백질의 억제제로서 사용할 수도 있다. 이들 레트로바이러스 이외에 본 발명의 활성제는 간염의 원인 물질 (B형 간염 바이러스 (HBV)) 및 사람 파필로마바이러스와 같은, 필수 폴리머라제 및 큰 T-항원 (바이러스 DNA를 숙주 크로모좀에 삽입시키는데 관여하는 단백질) 단백질을 생산하는 유기체에 대해 억제제로서 사용할 수 있다.

A. SM 및 SY로부터 추출물의 제조:

S.M. 및 S.Y.의 식물 추출물을 제조하였다. 식물 추출물의 다양한 분획을 다음 절차에 의해 얻었다 (하기 흐름도 1을 참조).

선택한 식물의 뿌리를 먼저 물로 세척하여 식물을 수확할 때 남는 잔류 파편을 제거하였다. 뿌리를 건조시킨 다음 작은 조각으로 절단하였다. 건조시킨 뿌리 조각에 10배 과량(v:v)의 Mili-Q dH₂O (18 mOhm/㎝)를 첨가하고, 뿌리를 98 내지 100℃에서 4시간 동안 비등시켰다. 이어서, 혼합물을 50 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 이어서, 여과된 추출물을 50℃ 및 720 ㎜Hg에서 1.3 g/㎖의 최종 밀도로 농축시켰다. 최종 수율은 원뿌리의 총 중량의 약 34%이었다.

단계 1: 추출물을 dH₂O로 1:5로 희석하고, GS-3 로터(rotor)에서 25℃에서 90분 동안 8,000 rpm으로 원심분리시켰다. 펠렛을 폐기하고, 상청액을 회수하였다. 이 상청액에 1/10 부피의 1.0N HCl 용액을 첨가하여 최종 농도를 0.1N HCl로 하였다. 이 생성물을 25℃에서 밤새 배양하였다. 용액을 GS-3 로터에서 25℃에서 90분 동안 8,000 rpm으로 원심분리한 다음, 생성된 펠렛을 95% 에탄올로 세척한 후 0.2 ㎛ 필터 시스템을 통해 여과하였다. 세척액이 투명해질 때까지 이 조작을 반복하였다. 이어서, 펠렛을 실온에서 여과 유닛에서 건조시킨 후 70℃ 오븐에서 밤새 배양하였다. 분말을 펠렛:물의 1:5 (w/w) 비로 dH₂O에 재현탁시켰다. 이어서, 얻어진 생성물을 Ti45 로터에서 25℃에서 30분 동안 25,000 rpm으로 원심분리시키고; 상청액을 폐기하고, 생성된 펠렛을 95% 에탄올로 세척하고, 0.2 ㎛ 여과 시스템을 사용하여 여과하고 상기한 바와 같이 건조시켰다. 분말을 분획 I로 지정하였다. 이 펠렛은 수율은 전체 원뿌리의 약 0.5%이었다.

단계 2: 분획 I을 3% NH₄OH 용액에 재현탁시키고 Ti45 로터에서 25℃에서 30분 동안 25,000 rpm으로 원심분리시켰다. 상청액을 회수하고 100% 에탄올을 첨가하여 최종 에탄올 농도를 75%로 하였다. 25℃에서 밤새 배양한 후, 용액을 Ti45 로터에서 25℃에서 30분 동안 25,000 rpm으로 원심분리시켰다. 상청액을 폐기하고 펠렛을 95% 에탄올로 세척하고, 여과하고, 상기 기재한 바와 같이 건조시켰다. 이 건조 펠렛을 분획 II로 지정하였다.

단계 3: 분획 I을 상청액이 투명해질 때까지 77% 에탄올로 세척하였다. 상청액을 0.2㎛ 여과 시스템을 이용하여 여과하였다 (분획 IV로 지정함). 불용성 펠렛을 70℃에서 밤새 배양하여 건조시켰다. 이 건조 분말을 분획 III으로 지정하였다.

단계 4: 분획 III을 25℃에서 교반하면서 밤새 dH₂O를 사용하여 배양하였다. 이어서, 용액을 Ti45 로터에서 25℃에서 30분 동안 25,000 rpm으로 원심분리시켰다. 펠렛을 70℃에서 밤새 배양하여 건조시켰다. 건조 분말을 분획 V로 지정하였다. 상청액을 분획 VI으로 지정하였다.

단계 5: 분획 VI를 1/10 부피의 1.0N HCl 용액으로 처리하여 최종 농도를 0.1N HCl로 하였다. 샘플을 25℃에서 밤새 배양한 다음, Ti45 로터에서 25℃에서 30분 동안 25,000 rpm으로 원심분리시켰다. 건조 펠렛을 분획 VII로 지정하였다. 상청액을 분획 VIII로 지정하였다.

단계 6: 분획 IV을 로터-뱁(rotor-vap)을 통해 10배 농축시켰다. 에탄올을 제거하고 샘플을 농축시켜, pH가 3 미만으로 낮아지므로 추출물에서 부분적인 침전이 일어났고, 침전은 pH 2에서 실질적으로 완료되었다. 혼합물을 물로 1:5 (v/v)로 희석한 다음 Ti45 로터에서 25℃에서 30분 동안 25,000 rpm으로 원심분리시켰다. 건조 펠렛 및 상청액을 각각 분획 IX 및 분획 X로 지정하였다.

단계 7: 분획 X를 1/10 부피의 1.0N HCl 용액으로 처리하여 최종 농도를 0.1N HCl로 한 다음, 25℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 용액을 GS-3 로터에서 25℃에서 90분 동안 8,000 rpm으로 원심분리시켰다. 생성된 건조 펠렛 및 상청액을 각각 분획 XI 및 분획 XII로 지정하였다.

B. 다양한 S.M. 및 S.Y. 분획의 물리적 및 화학적 특성

1. pH 의존 용해도의 측정

산 유도된 침전은 표 1에 요약한 바와 같이 대부분의 항바이러스 활성 성분을 함유하였다. 추출물의 분별시, pH 처리에 따라 차별적인 용해성이 관찰되었다. 분획들의 pH 의존 용해성을 정확하게 평가하기 위해, 다음 일련의 연구를 수행하였다.

실시예 1:

분획 VI의 900 ㎕ 샘플(3.6 ㎎/㎖)을 15개의 에펜도르프관의 각각에 넣고, 100 ㎕의 적절한 농도의 HCl 및 NaOH를 첨가하여 용액의 최종 pH를 1 내지 7로 하였다. 용액을 혼합하고, 마이크로원심분리기에서 30분 동안 4℃에서 14,000 rpm으로 원심분리시켰다. 각각의 관으로부터 상청액을 제거하였다. 각각의 pH 농도로부터의 가용성 분획을 1:10으로 희석하였다. 이로부터 150 ㎕ 분취액을 850 ㎕의 50 mM NH₄OH를 첨가하여 희석하였다. 불용성 분획을 1 ㎖의 50 mM NH₄OH에 용해시킨 다음, 150 ㎕의 각 분획에 850 ㎕의 50 mM NH₄OH을 첨가하여 희석하였다. 각각의 pH 가용성 또는 불용성 분획 1 ㎖에 대해 200 내지 500 ㎚의 흡광도 스캔을 수행하였다. 각 용액에 대한 280 ㎚에서의 피크 흡광도를 측정하였다. 결과는 분획 VI이 약 pH 4에서 침전하기 시작하고 pH 2 이하에서 완전히 침전되는 생성물을 함유하는 것을 증명한다 (pH 2.75에서 원하는 생성물의 50%가 용액에서 침전된다).

실시예 2:

용해도에 대한 에탄올의 영향을 평가하기 위해, pH 1 내지 14의 일련의 용액에서 25% 에탄올을 사용하거나 사용하지 않고 시험을 반복하였다. 상기 기재한 바와 같이, pH 용액을 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 계열 희석하고, 각각의 가용성 분획에 대해 200 내지 500 ㎚의 흡광도 스캔을 수행하였다. 각각의 용액에 대한 280 ㎚에서의 피크 흡광도를 측정하였다. 결과는 에탄올이 3 이하의 pH 용액에서 원하는 생성물의 용해도를 2배 (매우 활성인 제제로 밝혀졌고, 이후 "AA"로 부름) 증가시키는 것을 증명한다. 25% 에탄올의 존재하에, 식물 추출물은 모든 pH 범위에 걸쳐 높은 용해도를 나타낸다.

실시예 3:

분획 VI, 분획 VII 및 분획 VIII 사이의 pH 의존 차별 용해도를 평가하기 위해, 동일한 양의 각 분획을 건조시키고 칭량하여 7개의 에펜도르프관에 넣었다. 이들 관에 pH 2.2 내지 8.0의 0.2M 인산염-시트르산염 및 인산염 완충액을 첨가하였다. 용액을 5분 동안 혼합한 다음, 4℃에서 30분 동안 14,000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 동일한 pH 완충액에 1.5 내지 1000으로 계열 희석하고, 200 내지 500 ㎚로 흡광도 스캔닝하였다. 분획은 280 ㎚에서 흡광도/분획의 완전한 pH 의존 흡광도 스캔에서의 pH의 함수로서의 pH 의존 용해도를 갖는 것으로 나타났다. 결과는 분획들이 상이한 pH 의존 가용성 성분을 갖는 것을 증명한다. 분획 VI은 pH 3에서 용해되기 시작하고, pH 5에서 약 50% 용해되며 pH 6에서 완전히 용해된다. 분획 VII은 pH 5.0 미만에서는 불용성이지만, pH 7에서는 완전히 용해된다. 분획 VIII은 pH 2.0 내지 8.0에서 용해 상태로 유지된다.

2. 활성 분획들의 성분(들)의 겉보기 분자량(들)의 평가

a) 투석:

다음 흐름도 2에 요약한 바와 같이, 2가지 분획 (분획 II 및 분획 IV)를 10,000, 3,500 및 1,000의 상이한 분자 컷오프(cutoff)를 갖는 3종의 상이한 투석막에 대해 투석하였다.

실시예 4:

0.1% NH₄OH 용액 (v/v)에 용해시킨 분획 II를 10,000 분자량 컷오프 막에 넣고, 2ℓ의 0.1% NH₄OH 용액에 대해 밤새 투석하였다. 투석 백에 남아있는 용액을 분획 XIII으로 지정하고, 투석액을 분획 XIV로 지정하였다.

분획 XIV를 로터-뱁을 통해 100 ㎖로 농축시키고, 3,500 분자량 컷오프 막에 넣었다. 이 분획을 2ℓ의 0.1% NH₄OH (v/v) 용액에 대해 밤새 투석하였다. 투석 백에 남아있는 용액을 분획 XV로 지정하고, 백에서 투석된 용액을 분획 XVI로 지정하였다.

분획 XVI을 로터-뱁을 통해 100 ㎖로 농축시키고 1,000 분자량 컷오프 막에 넣었다. 이 분획을 2ℓ의 0.1% NH₄OH (v/v) 용액에 대해 밤새 투석하였다. 생성된 비투석 및 투석 용액을 각각 분획 XVII 및 분획 XVIII으로 지정하였다.

실시예 5:

77% 에탄올 용액 (v/v)에 용해시킨 분획 IV을 6ℓ의 77% 에탄올 용액 (v/v)에 대해 밤새 투석하였다. 흐름도 2 및 실험예 1에 기재된 바와 같이, 분획 XIX, 분획 XXI 및 분획 XXIII은 각각 10,000, 3,500 및 1,000 분자량 컷오프 막에 대해 투석되지 않는다. 분획 XX, XXII 및 XXIV는 각각 10,000, 3,500 및 1,000 분자량 컷오프 막에 대해 투석된다.

상기 분획들의 시험관내 HIV-1 인테그라제 분석의 결과는 하기에 표 2에 요약하였다.

b) 전자스프레이 이온화 질량 분광법:

1,000 분자량 투석 분획 및 3,500 분자량 투석/1,000 분자량 비투석 분획을 둘 모두 포지티브 및 네가티브 전자스프레이 이온화 질량 분광법에 의해 분석하였다. 다음 원자 질량 단위 중량은 두 분획 모두에 공통이었다: 79.8±5, 110.1±5, 136.1±5, 180.1±5, 198.4±5, 296.2±5, 494.3±5 및 984.1±5.

C. S.M. 및 S.Y. 추출물의 생물학적 특성

본 발명의 목적은 인테그라제 활성을 억제하고 항바이러스제로서 작용하는 분획을 얻기 위해 살비아 종의 식물의 수용성 추출물의 활성 성분(들)을 정제하는 방법을 제공하는 것이다. 항바이러스 활성에 대한 2가지 조건은 저농도의 약물에서의 효능과 안전성이다. 다음 섹션은 분획 I의 효능과 안전성을 증명한다.

1. 바이러스 억제 효능

a.) 시험관내 HIV-1 인테그라제 분석: HIV-1 인테그라제의 활성을 모니터하기 위한 시험관내 분석은 다음에 기재한 바와 같이 발전하였다. 이들 분석에서는 정제된 재조합 HIV-1 인테그라제, 및 바이러스 DNA의 LTR 단부에 상응하는 올리고뉴클레오티드 기질을 이용한다. 이들 분석은 생체내에서 일어나는 실제 기능적인 사건을 반영한다. 형광측정 [리(Lee) 등 (1995), Analytical Biochemistry 227, 295-301] 및 방사선 분석은 둘 모두 이전에 간행된 시험관내 분석을 개선한다 [리 등 (1995), Biochemistry 34, 10205-10214; 리 등 (1995), Biochemistry 34, 10215-10223]. 효소 제조 방법을 변형시켜 HIV-1 인테그라제 샘플의 기능적 특성을 개선시킨다 [리 및 한(Han) (1996), Biochemistry 35, 3837-3844; 리 등 (1997) Biochemistry]. 분석 및 샘플 제조를 이렇게 변형시켜 생체내에서 일어나는 사건을 더 잘 반영하는 시험관내 분석을 제공하였다. 따라서, 시험관내 분석의 결과는 인테그라제에 대한 잠재적인 억제제를 탐색할 때 바이러스 감염성의 매우 유용한 예고자이다.

HIV-1 인테그라제 활성을 억제하는 다양한 추출물 분획의 활성을 평가하는데 있어서, 먼저 추출물 분획을 적절한 부피의 0.1% NH₄OH (w/v)에 용해시켜 최종 농도를 1 ㎖ 당 각 분획 15 ㎎로 하였다. 이어서, 이들 샘플을 10,000 rpm으로 30분 동안 원심분리시켰다. 펠렛이 형성되면, 상청액을 회수하여 건조시킨 다음 0.1% NH₄OH에 재용해시켰다. 생성된 용액은 추출물 분획의 원액이었다. 이들 원액으로 다음 희석액: 1:10, 1:50, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 및 1:10,000을 제조하였다. 1 ㎕의 이들 각 희석액을 각각 75, 15, 7.5, 3.75, 2.5, 1.875, 1.5, 1.25, 1.07, 0.9375, 0.833, 0.75, 0.375, 0.25, 0.1875, 0.15 및 0.075 ㎍/㎖의 최종 농도에 상응하는 각 반응 혼합물 (총 부피 20 ㎕)에 첨가하였다. 이어서, 앞서 기재된 바와 같이 시험을 수행하였다 [리 등 (1995), Biochemistry 34, 10205-10214; 리 등 (1995), Biochemistry 34, 10215-10223; 리 및 한 (1996), Biochemistry 35, 3837-3844].

각 분획의 IC50과 IC90을 측정하기 위해, 겔을 인이미저 (phosphorimager) 스크리닝에 노출시키고, 분해 %를 분자 운동 인이미저에 의해 측정하였다. 포지티브 대조군의 분해 %에서 각 분획의 분해 %를 빼고, 이 값을 포지티브 대조군의 분해 %로 나누어 억제 %를 측정하였다. 이어서, 이들 값을 농도 및 측정된 IC 50과 IC 90의 함수로서 플롯팅하였다. 분획 I (출발 물질), 분획 XVII (투석액) 및 분획 VIII (산 침전으로부터 상청액)의 활성을 비교하였다. 분획 VIII은 매우 적은 활성을 갖는 반면, 분획 XVII은 출발 물질(분획 I) 보다 전체 활성이 개선된 것을 나타낸다. 다른 모든 분획의 IC50과 IC90을 다음 표들에 요약하였다.

시험관내 HIV-1 인테그라제 활성에 대한 흐름도 1의 다양한 SY ＆ SM 분획의 억제 활성

SM 분획	IC₅₀(㎍/㎖)	IC₉₀(㎍/㎖)
I	2.8	3.5
III	2.1	4.0
SY 분획
I	1.2	2.5
II	1.2	2.5
III	1.9	2.5
IV	1.9	2.5
V	1.9	2.8
VI	1.8	5.0
VII	1.2	2.5
VIII	8.0	15.0
IX	2.5	7.0
X	N.D.	N.D.
XI	0.9	3.5
XII	4.0	8.0

시험관내 HIV-1 인테그라제 활성에 대한 흐름도 2의 다양한 SY 분획의 억제 활성

분획	IC₅₀(㎍/㎖)	IC₉₀(㎍/㎖)
XIII	1.9	4.0
XIV
XV	1.4	3.1
XVI
XVII	0.85	1.6
XVIII	2.2	5.0
XIX
XX
XXI	2.4	4.0
XXII	2.4	7.0
XXIII	1.5	4.0
XXIV	1.5	4.0

이들 데이타는 가장 큰 억제를 보이는 분획들이 산 침전법으로 얻은 침전임을 나타낸다. 산 침전을 반복한 후 염기로 용해시키고 투석하면, 이 과정이 불활성 화합물을 계속 제거하기 때문에 분획에서 항인테그라제 활성이 개선된다. 침전이 형성된 낮은 pH 용액에 대한 상청액은 최소 활성을 보인다. 또한, 1000의 분자량 컷오프를 갖는 막으로 투석하면, 산 침전으로부터의 투석 및 비투석 분획이 모두 활성을 갖는 것을 보여준다.

비투석 분획은 1000 달톤 보다 작은 분자를 갖지 않는 것으로 기대될 수 있지만, 이 분획의 질량 분광은 이 분획이 1000 달톤 보다 작은 분자를 함유하는 것을 보여준다. 이에 대한 설명으로는 투석을 77% 에탄올 중에서 수행하며, 이는 공극 크기를 감소시켜 투석을 시간 의존 과정으로 하기 때문일 수 있다. 그러나, 투석 분획들도 또한 억제 활성을 가지므로, 가장 큰 억제성 분자가 1000 달톤 보다 작다는 것을 제외하지는 않는다.

b.) 시험관내 역전사효소 분석: 시험관내 인테그라제 분석의 분획 VII의 동일한 희석액을 사용하여 몰로니(Moloney) 쥐 백혈병 바이러스 (MMLV) RNaseH' 역전사효소 (Gibco BRL)에 대한 효능을 측정하였다. 이 분석은 역전사효소에 의한 폴리 rA-RNA 템플레이트로부터 폴리 dT-DNA의 합성 및 RNA/DNA 하이브리드 듀플렉스 형성시 (³H)dTTP의 혼입에 기초한다. 이 절차는 알도비니(Aldovini) 및 월커 (Walker)의 문헌[Techniques in HIV Research (1990) p. 98]에 기술되어 있다. 반응액 50㎕ 당 10 단위의 역전사효소를 사용하여, 삽입되고 유리 필터에 결합된 (³H)dTTP의 양을 정량하였다. 분획 VII의 희석액을 3회씩 분석하였고, 각각 28 및 1.7 ㎍/㎖의 IC90 및 IC50을 나타냈다. MMLV 역전사효소에 대한 IC50은 HIV-1 인테그라제에 대한 값에 상당하지만 IC90은 약 10배 더 크다. 이 결과는 분획 VII의 활성 성분이 항역전사효소 활성을 갖지만, 이 분획이 인테그라제를 억제하는 것 만큼 역전사효소를 억제하는데 효과적이지는 않다는 것을 지시한다. 또한, HIV-1 RT (Boehringer Mannheim)를 역전사효소 분석에 의해 분석하였다. 이 분석에서 각각 52 ㎍/㎖ 및 12 ㎍/㎖의 IC90 및 IC50을 나타냈다.

c.) 생체내 FIV 모델: 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV) 모델은 HIV 감염에 대해 사용하기 위한 약물을 연구하기 위한 허용되는 동물 모델이다. FIV는 고양이로부터 단리된 T 세포-지향성 렌티바이러스이다. FIV와 HIV 인테그라제들 사이의 높은 동질성으로 인해 FIV는 생물학적으로 및 생화학적으로 HIV와 유사하다. FIV로 감염된 고양이는 고양이 후천성 면역결핍 증후군 (FAIDS)를 발병하며, 이는 사람에서 완전히 발병된 AIDS와 유사하다.

시험관내 세포에서 FIV 모델: 크란델-리스 (Crandell-Reese) 고양이 신장 (CrFK) 세포주는 FIV 감염에 감수성이고 바이러스 복제를 지지한다. CrFK 세포는 바이러스를 생산하고 FIV 감염에 대해 분석하기 위한 효과적인 수단이다. FIV는 FIV로 감염된 CrFK 세포에 대해 세포병원성은 아니지만, 조직 배양에서 FIV 감염에 대한 스크리닝을 위해 진단 분석이 이용가능하다. 연구에 의하면 FIV 감염을 예방하는 S.Y. 분획 I의 효능을 증명한다.

ED90 및 ED50의 측정: S.Y. 분획 I은 FIV 감염으로부터 CrFK 세포를 보호한다. CrFK 세포를 1×10⁵세포/T25 플라스크의 밀도로 3개씩 플레이팅시켰다. 세포 접착과 성장을 위해 24시간 배양한 후, 분획 I의 용액을 세포 배양물에 24시간 동안 적용하였다. 용액은 분획 I을 dH₂O에 100 ㎎/㎖의 농도로 용해시켜 제조하였다. 이어서, 샘플을 Ti45 로터에서 25℃에서 30분 동안 25,000 rpm으로 원심분리시켰다. 상청액을 제거하고, 3개의 1 ㎖ 분취액을 개방 진공 하에 원심분리하여 건조시켜 용액을 농도를 측정하였다. 분획 I을 dH₂O 또는 DMEM 중에 2 ㎎/㎖로 더욱 희석하고, 0.2 ㎛ 아세테이트 셀룰로스 필터를 통해 여과하고, 용기 무게를 공제한 대조군에 비해 건조 용질의 질량을 측정함으로써 농도를 측정하였다. 각 농도의 분획 I을 10% 태송아지 혈청을 함유한 DMEM 중에 용해시키고 세포 배양물에 첨가하였다.

분획 I의 존재 하에 세포를 24시간 배양한 후, FIV-AZR-1 (AZT 내성 균주)로 감염된 CrFK 세포로부터의 배양액을 FIV p26 포획 분석 (IDEXX systems, Inc. FIV PET CHEK)에 의해 FIV의 상대 역가에 대해 분석하였다. FIV를 630 ㎚에서 흡광도가 0.2의 값이 되도록 희석하였다. 1 ㎖의 FIV를 배양물에 1시간 동안 적용한 후 바이러스 상청액을 제거하고, 다양한 농도의 분획 I을 재적용하였다. 분획 I의 농도를 변화시키면서 세포 배양 배지를 제3일에 교체하였다. 6일의 마지막 날에, 0.2 ㎖의 세포 배양 배지를 FIV p26 포획 분석에 의해 FIV의 존재에 대해 분석하였다. FIV p26 포획 분석에서는 FIV에 대한 2종의 상이한 모노클론 항체를 사용하였고, 그 중 하나는 FIV를 포획하는 96-웰 평판의 웰에 고정되고, 다른 하나의 모노클론 항체는 양고추냉이 페록시다제 (HRPO)와 결합된다. 항-FIV p26-HRPO 모노클론 항체는 기질 (과산화수소 및 TMB 색원체)의 존재 하에 배지 내에 존재하는 FIV p26 항원의 양에 비례하는 색 신호를 발생한다. 색 신호는 630 ㎚의 흡광도에서 96 웰 평판 판독기로 판독한다. 100 ㎍/㎖ 정도의 높은 농도에서 분획 I은 FIV p26 포획 분석을 저해하지 않는다.

이 시험에서 분획 I은 CrFK 세포의 FIV 감염을 예방하는 데 있어서 5.0 ㎍/㎖의 ED₉₀및 2.5 ㎍/㎖의 ED₅₀을 보였다. 이 연구는 분획 I이 FIV 감염을 예방하는데 있어서 효과적일 것임을 증명한다.

치료 시간 경과의 측정: FIV에 노출된 세포의 치료에 요구되는 시간을 측정하기 위해, 다음 2가지 연구를 수행하였다. 첫번째 연구에서, 세포를 24시간 동안 1×10⁵세포/T25로 플레이팅시켰다. 한 군 (-24시간 군)을 FIV 감염 전에 50 ㎍/㎖의 분획 I로 처리하였다. 1시간 후, 모든 군을 FIV-AZR-1로 감염시켰다. 감염 1, 24, 36, 48, 60 및 72시간 후에 50 ㎍/㎖의 분획 I을 시험군에 적용하였다. 한 군은 분획 I로 처리하지 않았다. 모든 군의 배지를 FIV 감염 3일 후에 교체하고, 배지 중 FIV의 존재를 감염 7일 후에 분석하였다.

감염 전, 감염 1시간 후 및 24시간 후에 CrFK 세포를 분획 I로 처리하면, FIV 감염으로부터 세포가 완전히 보호되었다. 36시간 후에 처리하면 적은 비율의 세포가 감염되지만, 분획 I의 존재는 나머지 배양물이 감염되는 것을 방지하였다. 이러한 경향은 48, 60 및 72시간의 판독에서도 계속 관찰되었다. 72시간 후, 50% 까지의 FIV가 억제되었다. 이들 결과는 분획 I을 투여하면 처음 바이러스에 노출시킨 후 FIV 감염에 대해 보호하고 감염 정도를 감소시킬 수 있음을 증명한다.

두번째 연구에서, CrFK 세포를 상기 기재한 바와 같이 플레이팅시켰지만, 비처리 대조군을 제외한 모든 세포를 50 ㎍/㎖의 분획 I로 24시간 동안 처리하였다. 분획 I의 존재 하에 세포를 24시간 배양한 후, 세포를 1시간 동안 FIV-AZR-1로 감염시킨 다음 분획 I로 재처리하였다. 감염 24, 48 및 72시간 후, 세포 배양물에 보통 배지를 적용하였다. 감염 5일 후, 세포 배양물 배지를 FIV에 대해 분석하였다. 24시간 동안만 FIV 감염시킨 후 세포를 분획 I에 노출시키면 세포가 감염되는 것이 방지되었다. 이들 결과는 분획 I을 제거하여도 FIV 감염에 대한 보호가 제거되지는 않았음을 증명한다. 24시간 동안만 FIV 감염시킨 후 세포를 분획 I에 노출시키면 세포가 감염되는 것이 방지되었다. 따라서, 이 연구에서 감염 전부터 노출 24시간 후까지 감염에 대한 보호 시간(window)이 존재하는 것을 증명하였다. 이 결과는 분획 I이 레트로바이러스 억제제로서 작용하는 것을 나타낸다. 감염된 세포로부터 방출되는 바이러스가 비감염된 세포를 감염시키는 것을 방지하여 감염된 세포가 죽을 때 다른 세포는 감염되지 않으므로 치료적으로 유익하다. 이에 의해 감염의 전파가 방해되고, 바이러스 로드(load)가 감소된다.

2. 세포 배양물 독성

세포 배양물에서 분획 I의 독성을 평가하기 위해 다음 2가지 독성 연구를 수행하였다. 첫번째로, 분획 I의 독성을 융합 CrFK 세포 배양물 상에서 세포 사멸%에 의해 측정하였다. 두번째로, 분획 I의 독성을 CrFK 세포 성장의 억제에 의해 측정하였다.

LD₉₀및 LD₅₀의 측정: 융합 CrFK 세포에 대한 분획 I의 90% 및 50% 치사 투여량을 측정하기 위해, T25 플라스크마다 1×10⁶개의 세포를 플레이팅시켰다. 48시간 배양한 후, 1.6, 1.2, 1.0, 0.8, 0.4, 0.2, 0.1 및 0 ㎎/㎖의 분획 I의 용액을 10% FBS를 함유한 DMEM 중에 제조하여 각각의 3개씩의 배양물에 적용하였다. 분획 I의 존재 하에 세포를 72시간 배양한 후, 각 군 당 생존 세포의 수를 트리판 블루 배제 분석에 의해 측정하였다. CrFK 세포를 트립신으로 처리하고, 0.4% 트리판 블루에 1:1로 희석하였다. 혈구계 상에서 세포를 헤아림으로써 세포 수를 측정하였고, 이 분석에서 분획 I의 LD₉₀및 LD₅₀은 각각 1.6 ㎎/㎖ 및 0.8 ㎎/㎖임을 나타냈다. 치료 지수 (LD50/ED50) 범위는 320이다.

IC₅₀의 측정: 분획 I의 90% 및 50% 성장 억제 투여량을 측정하기 위해, CrFK 세포를 T25 플라스크마다 1×10⁵개씩 플레이팅시켰다. 24시간 후 0.8, 0.4, 0.3, 0.2, 0.15, 0.1, 0.08, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02 및 0 ㎎/㎖의 분획 I의 용액을 10% FBS를 갖는 DMEM 중에 제조하여 각각의 3개씩의 배양물에 적용하였다. 3일 및 6일에 배지를 교체하고, 각 군 당 생존 세포의 수를 상기 기재한 바와 같은 트리판 블루 배제 분석에 의해 측정하였다. 이 분석에서, 0.4 ㎎/㎖의 투여량에서 CrFK 세포 성장이 90% 억제되었고, 0.2 ㎎/㎖의 투여량에서 성장이 50% 억제되었다.

생체내 독성학: 생체내 모델에서 분획 I의 급성 독성을 평가하기 위해, 10 마리의 어린 암컷 Balb/C 마우스에 경구 개비지로 28일 동안 600 ㎎/㎏의 분획 I을 제공하였다. 10 마리 마우스 중 8 마리가 어떠한 병적 징후도 없이 생존하였다. 2 마리의 마우스는 부검으로 마우스에 분획 I을 경구 개비지로 투여할 때 사람의 기술적 과실로 죽은 것으로 확정되었다.

연구 결과는 기관 또는 혈액 중에 독성의 흔적이 없음을 증명한다. 연구 기간 동안 생존한 8 마리의 마우스로부터 기관 샘플을 수득하여 분석하였다 (Vet Research Inc.). 뇌, 갑상선, 기관, 흉선, 췌장, 골격근, 방광, 자궁 경부, 림프절, 신장, 비장, 심장, 폐, 간, 부신, 신장, 자궁, 림프절, 편위 및 선위, 소장 및 대장, 식도, 피부, 난소 또는 지방의 절편에서 독성의 현미경적인 증거가 발견되지 않았다. 또한, 연구 종료후 마우스 혈액 샘플에 대해 혈액 화학 분석을 수행하였다. 하기 표 4는 대부분의 혈액 성분이 정상 범위 내에 있음을 보여준다.

표준 혈액 화학값 및 실험값

시험 성분	고-저값	평균±표준 편차	값
글루코스 (㎎/㎗)	124-250	185±75	정상
크레아틴 (㎎/㎗)	0.21-0.66	0.71±0.21	높음
총 단백질 (g/㎗)	3.95-6.21	4.6±0.44	정상
알부민 (g/㎗)	2.58-4.58	3.11±0.23	정상
총 빌리루빈 (㎎/㎗)	0.04-0.74	0.19±0.09	정상
칼슘 (㎎/㎗)	8.2-12.6	8.8±0.37	낮은 정상
무기 인 (㎎/㎗)	6.0-10.0	10.45±7.3	높음
알칼리 포스파타제 (IU/L)	45-175	51.4±32.5	낮은 정상
ALT (GPT) (IU/L)	24-77	27.4±10.0	낮은 정상
AST (GOT) (IU/L)	53-269	162.8±110.5	정상
나트륨 (mEq/L)	115-189	147.6±3.7	정상
칼륨 (mEq/L)	5.1-10.4	7.8±2.4	정상
클로라이드 (mEq/L)	82-114	117±5.3	높음

다른 대규모 연구에서 마우스 모델에서 분획 I의 급성 독성을 평가하였다. 이는 분획 I의 농도에서 1 보다 큰 로그 차이에 장기간 노출시킨 잠재적인 위험/부작용을 평가하기 위해 설계되었다. 이 연구는 각각 12 마리의 Balb/C 마우스의 다음 8군으로 구성하였다.

군	성별	처리
1	암컷	물
2	암컷	500 ㎎/㎏
3	암컷	100 ㎎/㎏
4	암컷	25 ㎎/㎏
5	수컷	물
6	수컷	500 ㎎/㎏
7	수컷	100 ㎎/㎏
8	수컷	25 ㎎/㎏

맹검 연구로, 500, 100 및 25 ㎎/㎏(동물 체중)의 분획 1을 28일 동안 매일 12 마리 Balb/C 마우스의 8군에 손으로 구속하여 경구 개비지로 투여하였다. 소집단 (4 마우스)에서 매주 혈액 샘플을 수집하고 혈액 화학 분석을 위해 모았다. 28일 후, 마우스를 마취시키고 심장 천공에 의해 수혈하였다. 미분 및 SMAC24 생화학적 혈청 분석을 이용하여 CBC을 위해 개별적인 마우스 혈액을 수집하였다. 조직병태 진행과 평가를 위해 조직 샘플을 취했다. 혈액 또는 조직 샘플의 분석에서 독성의 증거는 전혀 발견되지 않았다.

본 발명의 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체 중에서 투여할 수 있다. 활성제로서 추출물 중 ≤3500 달톤의 분자를 함유하는 조성물은 10 nM 내지 1000 nM의 혈중 농도를 얻기에 충분한 투여량으로 투여하여야 한다. 조성물이 추출물 중 보다 큰 분자를 함유할 때, 10000 nM 까지의 혈중 농도를 얻기 위한 투여량을 투여하여야 한다. 일반적으로, SY 추출물은 SM 추출물의 투여량의 약 1/5를 필요로 한다. SY 추출물을 사용하는 경우, 1 nM 정도로 낮은 혈중 농도가 충분할 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구, 전신 또는 외용 투여할 수 있다. 경구 투여용 조성물은 액체 형태 또는 정제 또는 캡슐제로서 투여할 수 있다. 비경구 투여를 위해, 염수, 글루코스 및 인산염 완충 염수 등과 같은 담체를 사용할 수 있다. 중추신경계로 투여하기 위해, 조성물을 뇌척수액에 투여할 수도 있다. 척추내 투여를 위해, 비경구 투여용 담체, 특히, 물 중 글루코스 또는 염수와 같은 담체가 적합하다. 조성물은 또한 막 장벽을 가로질러 전달을 증진시키기 위해 리포좀 중에 제조할 수 있다. 물론, 정맥내, 근육내, 피하 또는 척추내 투여용 조성물을 포함하는 비경구용 조성물은 멸균 용액제로서 제공될 것이다.

외용 투여를 위해, 조성물은 거즈 또는 스폰지와 같은 고체 지지체 상에서 투여할 수 있다. 예를 들면, 그러한 고체 지지체는 치료제를 제공하기 위해 질 또는 직장 내에 삽입시킬 수 있다. 본 발명의 활성제는 또한 감염에 대한 보호를 강화하기 위해 콘돔에 적용할 수도 있다. 조성물은 또한 외용 투여를 위해 로션 또는 고약 형태로 제조할 수 있다. 활성제는 예를 들면, 좌제, 관장제 또는 관주제 형태로 질 또는 직장에 적용할 수 있다.

본 발명의 활성제는 pH≤3에서 수용액으로부터 침전하고 pH 4 내지 6에서 재용해되는 살비아 속의 모든 분획을 포함하지만, 이전에 항레트로바이러스 활성을 가진 것으로 보고되지 않았던 살비아 윤나넨시스의 모든 수용성 추출물도 본 발명에 포함되며, 상기 모든 추출물은 놀랍게도 예상외로 높은 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.

조성물은 미스트(mist)로서 비내 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 겔 또는 로션 형태로 외용 투여할 수도 있다.

또한, 활성 분획을 동결건조시키고 바이알에 넣을 수 있다. 그 후, 동결건조된 물질을 용해시켜 투여형을 제공할 수 있다. 또한, 동결건조된 물질은 경비 투여를 위해 간단히 코로 흡입시킬 수 있다.

본 발명의 활성제는 또한 음료 또는 음식물 중에서 투여할 수도 있다. 예로서, 고양이 백혈병 바이러스를 치료하거나 예방하기 위해 고양이 먹이에 추출물을 넣을 수 있다.

Claims

살비아 윤나넨시스 (Salvia yunnanensis)의 수용성 추출물.
제약학적으로 허용되는 담체 내에, 활성제로서 제1항의 수용성 추출물을 함유하는 조성물.
제약학적으로 허용되는 담체 내에, pH≤3에서 수용액으로부터 침전하는 살비아 속의 추출물 (상기 침전은 pH 6에서 수용액에 본질적으로 완전히 용해하는 특성을 갖고, 상기 활성제는 ≤3500 달톤의 분자량을 갖는다)을 항바이러스 유효량 함유하는 조성물.
제3항에 있어서, 캡슐 또는 정제 형태의 조성물.
제3항에 있어서, 멸균 용액 형태의 조성물.
제3항에 있어서, 고체 지지체 상의 조성물.
바이러스 억제 유효량의 제3항의 조성물을 바이러스로 감염되거나 감염되기 쉬운 포유동물에 투여함으로써, 폴리머라제, 역전사효소, 인테그라제 또는 인테그라제 유사 활성에 의해 복제하는 바이러스에 의해 유발되는 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법.
바이러스 억제 유효량의 제2항의 조성물을 바이러스로 감염되거나 감염되기 쉬운 포유동물에 투여함으로써, 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 활성제가 ≤1000 달톤의 분자로 이루어지는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 활성제가 ≤1000 달톤의 분자로 이루어지는 조성물.
≤3500 달톤의 분자량을 갖는, 본질적으로 pH ≤3에서 수용액으로부터 침전 (이 침전은 pH ≤6에서 수용액에 용해하는 특성을 갖는다)하는 살비아로부터의 분획으로 이루어진 살비아 종의 추출물.
제11항에 있어서, ≤1000 달톤의 분자량을 갖는 추출물.
제7항에 있어서, 상기 감염이 레트로바이러스에 의해 유발되는 방법.
제8항에 있어서, 상기 감염이 레트로바이러스에 의해 유발되는 방법.
제7항에 있어서, 상기 조성물을 경비 투여하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 조성물을 경구 투여하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 조성물을 고체 지지체 상에서 투여하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 바이러스 감염이 인테그라제를 생산하거나 인테그라제 유사 활성을 갖는 단백질을 생산하는 바이러스에 의해 유발되는 방법.
제8항에 있어서, 상기 바이러스 감염이 인테그라제를 생산하거나 인테그라제 유사 활성을 갖는 단백질을 생산하는 바이러스에 의해 유발되는 방법.