KR19990044834A - 네가티브인자작용 억제제 - Google Patents

Abstract

부작용이 적고, 장기 투여 가능한 에이즈 발병 억제제, 구체적으로는 Nef단백질-Nef(네가티브인자, Negative factor)수용체 결합억제제, Nef수용체 발현억제제 등의 Nef작용 억제제를 제공한다. 본 발명 Nef 작용 억제제의 유효성분은 왁시니아바이러스 접종 염증조직 추출물이다. 왁시니아바이러스 접종 염증조직 추출물은 Nef를 통해 에이즈 발병을 억제하도록 새로운 작용기작에 기초한 신약제로서 유용성이 높은 것이고, 역전사효소 저해약이나 프로테아제 저해약 등의 바이러스 증식저지제의 병용에 대해서 더욱 높은 치료효과가 기대될 수 있다.

Description

네가티브인자작용 억제제

본 발명은 왁시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물의 새로운 약리작용에 관한 것으로, 구체적으로 왁시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물을 유효성분으로 함유하는 Nef단백질-Nef수용체 결합억제제, Nef수용체 발현억제제 등의 Nef작용 억제제에 관한 것이다.

레트로바이러스는 일반적으로 구조단백질(Gag, Pol, Env)을 공통의 골격으로 하지만, 이들에 더하여 조절단백질이나 부단백질을 종특이적인 단백질로서 복잡한 바이러스가 인간면역불완전바이러스(human immuno deficiency virus: HIV)이다. Nef는 부단백질의 하나로, 바이러스 복제사이클초기에 합성되고, HIV-1, HIV-2 및 SIV(셀면역불완전바이러스)에 특이적인 단백질이다. Nef는 발견당초는 바이러스 복제효율을 저하시키는 네가티브인자(negative factor)인 것으로, Nef로 명명되어지지만, 이 후, Nef결손인공변이 SIV의 아카게젤로의 감염실험의 연구결과로부터 HIV복제의 올바른 조절인자로서 작용하는 것이 시사되어 지고, 에이즈발명의 열쇠를 잡기 위한 중요한 인자로서 재인식되어지고 있다(세포공학 제16권, 제1호, 94-99항(1997년)).

상기 후지이들의 논문에 상세하게 설명되어 있지만, 생체 내에 있어서, Nef의 중요한 기능은 (1) 바이어스 복제의 증강, (2) CD4 다운레귤레이션, 및 (3) T세포상해능이다. 바이러스 감염에 관해서는 Nef는 세포막 결합성을 가지고, 바이러스의 세포로의 흡착, 진입에 필요하고, 바이러스 DNA 합성에 관여하는 것 등의 지식을 얻는다. 또한, T세포 상해성(傷害性)에 있어서는 말초혈 및 대장 림프절 CD4⁺T세포의 표면에 결합된 Nef를 항 Nef항체에 의해 교차결합하면, 포토시스가 생기는 등, HIV환자에 의해 CD4⁺T세포 소실의 Nef의 관여, 즉, 에이즈발병에는 Nef와 CD4⁺T세포 위의 Nef수용체와의 결합이 깊게 관여하는 것을 강하게 시사하고 있다. 더욱이, Nef가 사이토카인의 생산에 영향을 미치고 면역을 억제한다는 것을 시사하는 보고도 있다.

현재 사용, 개발 중의 에이즈치료약은 아지드티미딘, ddI 등의 역전사효소 저해약과 프로테아제 저해약이 대부분이고, 이들은 바이러스 그 자체의 증식을 저지하는 약제이다. 그 외에는 에이즈에 의해 저하된 면역기능을 증가시킨 면역증강제나 에이즈에 수반하는 잠복된 감염증이나 악성 종양에 대한 대처치료법을 목적으로 한 화학요법제가 있다. 상술한 Nef에 관한 지식을 가지고, Nef유도에 의해 T세포가 죽는 것을 저지하고 에이즈 발증을 억제하는 약제가 상기 역전사효소저해약이나 프로테아제 저해약과는 다른 작용기작에 의한 다른 종류의 새로운 에이즈발증 억제약으로서 주목받고 있다.

이미 알려진 에이즈 치료약인 역전사효소 저해약이나 프로테아제 저해약은 강한 부작용과 약제내성바이러스의 출현이 가장 문제가 되고 있지만, HIV 및 SIV에 특이적인 Nef를 통한 에이즈 발증 억제약은 이미 알려진 바이러스 증식저해약에 비해서 부작용이 적고, 또는 약제 내성바이러스로의 변이에 대응하는 등의 가능성이 있고, 이와 같은 새로운 작용기작에 기초한 에이즈 치료약, 특히 부작용이 적고, 장기투여 가능한 약제의 개발이 요구되고 있다. 본 발명자들은 왁시니아바이러스 접종염증조직 추출물의 약리활성에 관해서 각종 시험연구를 행한 결과, 상기 물질이 우수한 Nef와 Nef수용체의 결합억제작용 및 Nef수용체의 발현억제작용을 가지는 것을 발견하였다.

본 발명의 목적은 부작용이 적고 장기간 투여 가능한 에이즈 발증억제제, 구체적으로는 Nef단백질 결합억제제제, Nef수용체 발현억제제 등의 의약을 제공하는 것이다.

바이러스 등의 외계로부터의 침습이나 내적인 병태상태의 진행에 대해서, 과잉반응에 대한 억제작용과 기능저하에 대한 증강작용과 같은 이상성(二相性)을 사용하여, 생체는 그 항상성을 유지하고, 생체기능을 조정하여 정상화되기 때문에 각종 생체 기능조정물질을 생산하는 것이 알려지고 있다. 예를 들면, 왁시니아바이러스를 접종한 염증조직에 있어서, 생산된 생체기능조정물질, 상기 물질을 병태조직으로부터 추출하는 제조방법 및 그들의 약리활성에 있어서 각종 보고가 이루어지고 있다(특공소63-39572호 공보, 특공소63-25600호 공보, 특공평3-43279호 공보, 특허제2594222호 공보 등).

또한, 실제의 약품으로서는 왁시니아바이러스 접종 집토끼 염증피부추출물제제가 있다. 이 제제는 예를 들면, 의료약일본의약품집(1994년 8월판, 일본의약정보센타편, 약업시보사발행)의 1434항에 기재되어 있는 바와 같이 왁시니아바이러스를 접종한 집토끼의 염증피부조직으로부터 추출분리된 비단백성의 활성물질을 함유하는 약제이고, 요통증, 경견완(頸肩腕)증후군, 견관절주위염(肩關節周圍炎), 변형성관절증, 증후성신경통, 피부질환(습진, 피부염, 심마진)에 따르는 소양(搔痒), 알레르기성비염, 스몬후유증상의 냉감, 통증, 이상지각 등에 대한 적응이 인지되고, 피하, 근육주사, 정맥주사용의 주사제 및 정제가 의료용 의약품으로서 제조승인을 받아서 시판되고 있다.

본 발명 Nef단백질결합억제제 및 Nef수용체 발현억제제 의약의 유효성분은 상술한 바와 같은 왁시니아 바이러스 접종 염증조직으로부터 추출된 비단백성의 생체기능조정물질이고, 상기의 의료약일본의약품집에도 게재되어 있는 왁시니아바이러스 접종 집토끼염증피부추출물 제제는 의약품의 제조승인을 받아서 시판되고 있어서 입수가능하다. 또한, 상술한 특허공보 등의 문헌에 기재되어 있는 각종 왁시니아바이러스 접종염증조직추출물이 본 발명물질로서 이용될 때, 이들의 제조방법이나 바람직한 투여량 등도 문헌 중에 설명되어 있다.

환자에 대한 투여방법은 주사제에 의한 피하, 근육주사, 정맥주사 투여 및 정제에 의한 경구투여가 시판약제에서는 알려지고 있지만, 그 밖에 병환의 종류에 따라서, 그 치료에 적합한 상기 이외의 제형에 의한 투여방법도 가능하다. 투여량은 왁시니아바이러스 접종염증조직추출물의 종류에 의해서, 적당하게 설정할 수 있지만, 시판제제로 알려진 투여량은 상기 의료약일본의약품집(1434항)에 의하면, 기본적으로는 내복으로는 1일 16노이로트로핀단위(NU), 주사제로는 1일3.6 내지 7.2NU를 투여하도록 의료용의약품으로서는 나타내어지고 있지만, 병환의 종류, 중병도, 환자의 개인차, 투여방법, 투여기간 등에 의해서 적당하게 증감 가능하다.

이하에, 왁시니아바이러스 접종염증조직추출물의 새로운 약리작용에 관한 약리시험결과를 나타낸다.

[실시예]

(1) Nef의 T세포표면의 Nef수용체로의 결합억제작용

100㎕의 Molt-4크론 No.8 세포(1×10⁶)와 100㎕의 정제된 바큐로바이러스 유전자합성Nef단백질(300㎍/㎖)을 4℃에서 1시간 반응시킨다. 동일한 조작을 각종 농도의 피검약(0.1㎕)을 첨가한 시험계에서 행한다. 다음으로 0.5% 소혈청알부민함유인산완충액(PBS)에서 세포를 세정하고, 토끼항Nef단백질 IgG항체에서 4℃에서 1시간 반응 후, 세포를 세정한다. 마지막으로, 세포를 FITC표시 염소IgG항체에서 4℃, 30분간 반응하고, 세정 후, FACS-Caliber(벡튼-디킨슨사제)에서 양성세포수를 측정한다.

결과의 일례를 표1에 나타내지만, 본 발명물질(왁시니아바이러스 접종염증피부추출물제제: 상품명 노이로트로핀)은 용량의존적으로 Nef단백질의 T세포표면으로의 결합을 억제한다.

피검약농도(NU/㎖)	0.1	0.05	0.025	0.0125	0.006
결합률(%)	54	62	70	92	100

(2) T세포표면 상의 Nef수용체 발현에 대한 억제작용

50㎕의 Molt-4크론 No.8 세포(1×10⁶)에 각종 농도의 피검약(0.1㎖)을 첨가하고, 96구멍 마이크로플래이트에서 10%송아지 혈청첨가 RPMI-1640배지에서 37℃, 72시간 배양한다. 세포를 세정한 후, 항Nef수용체모노크론항체(10㎍)와 20㎕의 0.1%소혈청알부민함유 PBS에 부유한 세포를 4℃에서 30분간 반응한다. 세정후, FACS-Caliber(벡튼-디킨슨사제)에서 양성세포수를 측정한다.

표2에 결과의 일례를 나타낸다. 그 결과, 피검약(본 발명물질)은 용량의존적으로 T세포표면상의 Nef수용체의 발현을 억제한다.

피검약농도(NU/㎖)	0.05	0.025	0.0125	0.006	0.003
Nef수용체발현률(%)	82	85	93	99	101

(3) HIV-1합포체 형성에 대한 저해작용

Nef수용체 양성인 50㎕의 비감염 Molt-4크론 No.8 세포(1×10⁵)을 Nef단백질이 세포표면에 발현되는 50㎕의 HIV-1(LAV-1주)지속감염 Molt-4세포(5×10⁴)과 함께 96구멍 마이크로플래이트에서 37℃, 48시간 배양하고, 형성된 합포체의 수를 현미경하에서 계측한다. 각종 농도의 피검약(0.1㎖)을 배양개시시에 첨가하여, 피검약의 합포체 형성억제작용을 측정한다. 또, 피검약의 합포체 형성능은 피검약 첨가시료에서의 측정치를 무첨가시료에서의 측정치에서 제외하여서 구한다.

상기 HIV감염 Molt-4세포를 사용한 HIV-1합포체 형성에 대하여, 특허제2594222호 공보의 실시예1 기재의 제조방법에 따라서 얻어진 본 발명물질은 0.006∼0.1㎎/㎖의 농도에서 용량의존적인 억제작용을 나타내고, 예를 들면 0.1㎎/㎖에서 16%까지 저하시킨다.

(4) HIV감염 Molt-4세포에서의 바이러스 생산에 대한 억제작용

50㎕의 Molt-4크론 No.8세포(1×10⁵)와 50㎕의 HIV-1(LAV-1주)을 M.O.I가 0.02에서 37℃에서 1시간 감염하고, 각종 농도의 상기와 동일한 피검약(0.1㎖)을 첨가한 후, 10일간 배양하고, 배양상청 중의 p24gag항원량을 측정하여 바이러스 생산량을 측정한다. p24항원은 다이나보트사제의 아보트항원측정키트(ELISA키트)로 측정한다.

그 결과, 본 발명 물질은 0.006∼0.1㎎/㎖의 농도에서 사용의존적으로 HIV생산을 억제하고, 예를 들면, 0.1㎎/㎖에서 45%까지 저하시킨다.

상기의 약리시험결과에서 나타나듯이, 본 발명물질은 Nef단백질의 T세포 표면으로의 결합을 억제하는 작용, 및 T세포표면 상의 Nef 수용체의 발현억제작용을 가지는 것을 나타내고 있다. Nef는 바이러스의 복제증강이나 감염세포의 합포체 형성에도 관여하는 것이 시사되고 있고, 본 발명 물질은 이들에 대한 억제작용도 상기의 약리시험결과와 같이 인지되는 것으로부터 본 발명 물질은 Nef를 통해서 에이즈 발증을 억제하도록 새로운 작용기작에 있어서 신약제로서 유용성이 높은 것을 나타내고 있다. 항에이즈전략으로서 각종 역전사효소저해약이나 프로테아제저해약이 개발되고 있고, HIV의 변이에 대응하기 위한 그들을 복수조합시킨 칵테일요법도 추진되고 있지만, 이들 바이러스 그 자체의 증식저지약에 더한 새로운 작용기작에 의한 약제가 요구되고 있고, 본 발명 약제는 새로운 에이즈발증억제약으로서 대단히 유지되는 것이다. 또한, 본 발명 Nef작용 억제제는 역전사효소저해약이나 프로테아제 저해약 등의 바이러스 증식저지제의 병용으로서 더욱 높은 치료효과가 기대될 수 있고, 대단히 유용성이 높은 것이다.

Claims (4)

1. 왁시니아바이러스접종 염증조직 추출물을 유효성분으로서 함유하는 Nef작용 억제제.
2. 제1항에 있어서, Nef단백질과 Nef수용체의 결합억제제인 것을 특징으로 하는 Nef작용 억제제.
3. 제1항에 있어서, Nef수용체 발현억제제인 것을 특징으로 하는 Nef작용 억제제.
4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 역전사효소저해약 및/또는 프로테아제 저해약과 병용해서 사용하는 것을 특징으로 하는 Nef작용 억제제.