JP2004538334A - Ｈｉｖ感染の治療に使用される薬剤とその成分と使用法 - Google Patents
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Abstract
HIV感染の治療に使用する融合阻害剤は、次のアミノ酸配列から構成される。
X−SWETWEREIENYTKQIYKILEESQEQQDRNEKDLLE−Z
式中、Xはアミノ基又は−X1−X2であり、ここでX1はアミノ基、X2はアセチル基、疎水基、又は高分子キャリア基のいずれかである。Zはカルボニル基又は−Z1−Z2であり、ここでZ1はカルボニル基、Z2はアミノ基、第3ブチロキシカルボニル基、疎水基、又は高分子キャリア基のいずれかである。当該阻害剤はHIV感染に対して強力な抑制作用を有する。
X−SWETWEREIENYTKQIYKILEESQEQQDRNEKDLLE−Z
式中、Xはアミノ基又は−X1−X2であり、ここでX1はアミノ基、X2はアセチル基、疎水基、又は高分子キャリア基のいずれかである。Zはカルボニル基又は−Z1−Z2であり、ここでZ1はカルボニル基、Z2はアミノ基、第3ブチロキシカルボニル基、疎水基、又は高分子キャリア基のいずれかである。当該阻害剤はHIV感染に対して強力な抑制作用を有する。
Description
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2001年8月29日付けの中国特許出願第01 1 39085.7号、現在の中国特許第ZL 01 1 30985.7号、2002年6月6日付けのPCT特許出願第PCT/CN02/00405の恩恵を主張するものであり、参照することでその内容の全てを本明細書に取り入れることとする。
【０００２】
本発明は、HIV感染の治療に使用できる融合阻害剤に関連するものである。
【背景技術】
【０００３】
１．HIVとAIDSの流行
ヒト免疫不全ウィルス（HIV）という病原性レトロウイルスは、後天性免疫不全症候群（AIDS）を引き起こす可能性がある（Barre−Sinossi, F. 他、1983, Science 220: 868−870）。大食細胞やニューロン、その他の細胞もHIVに感染する可能性があるが（Maddon他、1986, Cell 47:333−48）、CD4+リンパ細胞がHIV感染の主な対象細胞である（Dalgleish, A.らによる、1984, Nature 312:767−8）。何故なら、HIVはCD4+細胞の表面に存在するCD4分子に対して強い親和性を持っているからである。HIVはヒトに感染すると、体内で多数のCD4+細胞を破壊するため、体は免疫機能を失い始め、従ってAIDS患者は様々な感染症、神経機能異常、腫瘍などを非常に起こしやすい。患者は症状に苦しみ、結果的に死に至る（Levy, J.A.編: Acute HIV infection and susceptible cells、発行元：アメリカ、2000年、63−78ページ）。
【０００４】
AIDSの流行性感染は、その重い症状と死亡率の高さのため、ヒトの健康を脅かす主な死亡原因のひとつとなった。今まで全世界においてHIVに感染した人の数は57,900,000人にのぼり、過去10年間で21,800,000人がAIDSで死亡している。5,300,000人が2000年に新たにHIVに感染したことが判明した。中国では、HIV感染が急速に広がっている。専門家によると、大人・子供を含めて、2000年にHIV感染者人口は800,000−1,000,000人を超えていると考えられている（WHO Report 2000, UNAIDS 及び WHO）。
【０００５】
現在、少なくとも２種類のHIVが確認されている。HIV−1（Gallo, R.他、1984, Science 224:500−503）とHIV−2（Clavel, F.他、1986, Science 223:343−346）である。どちらのウイルスも遺伝的異質性が高い。HIV−1だけ見ても、少なくとも11種類の遺伝子型がある（A−J及びOの亜型）（Jonassen, T.O.他、1997, Virol 223:343−346）。HIV−1のE亜型は、主に中央アフリカ、タイ、インド、ベトナム、カンボジア、マレーシア、ミャンマー、中国、西半球に広がっている（WHO Report 1996年）。中国で見られるHIV亜型は、主にB、E、C亜型である（Yu, E. S. 他、1996, American J. Public Health 86 (8 Pt1):116−22）。
【０００６】
HIVの繁殖サイクルには幾つかの重要なステップがある。まず、エンベロープ糖タンパクgp120がT4 リンパ球の表面にあるCD4分子との特定の結合によって宿主の細胞膜に連結する。ケモカインコレセプタの助けにより、ウイルスエンベロープは宿主の細胞膜に融合する（Berger, E.A.他、1999, Ann. Rev. Immunol., 17:657−700）。融合過程後、ヌクレオカプシドに閉じ込められたHIVビリオンはカプシドを取り除かれ、ウイルス核酸が剥き出しになった状態で宿主細胞に入る。ウイルスの逆転写酵素がHIVの一鎖のRNAを一鎖のDNAへ転写する触媒として働き、前記一鎖のDNAは細胞ポリメラーゼの触媒作用で二鎖のDNAに変換される。この二鎖のDNAは細胞質内で自由に存在することもでき、ウイルスのインテグラーゼによって宿主染色体DNAにプロウイルスとして取り込まれることもできるので、HIV潜伏感染を引き起こす（Roe, T.他、1997, J. Virol. 71(2): 1334−40）。プロウイルスは宿主染色体から切り離すことはできず、非常に安定しており、宿主染色体の複製とともに繁殖する。HIV mRNAが大きなポリプロテインに変換された後、ウイルスプロテアーゼがポリプロテインを切断してプロセシングし、熟成されたウイルス構造タンパク質を形成させる（Xiang, Y. & Leis, J., 1997, J. Virol. 71(3):2083−91）。最後に、この構造タンパク質とHIV核酸が集合して新しいウイルス顆粒に変わり、出芽によって細胞の外へ放出される（Kiss−Lazozlo, Hohn, T., 1996, Trends in Microbiology 4(12) : 480−5）。
【０００７】
これらをまとめると、HIV複製の重要なステップは、1) 融合過程における宿主細胞への結合と侵入、2) 逆転写と取り込み、3) タンパク質変換とプロセシング、4) ウイルス集合と放出、となる。
【０００８】
２．HIV感染の治療
何年もの間、効果的な治療及び予防法を探す努力が行われてきたが、AIDSに効くワクチンや治療法は未だに存在していない。
【０００９】
理想的なワクチンは、無害であり且つ粘膜や血液中に中和抗体と持続性の免疫反応を誘発することができなくてはならない（Levy, J.A., Levy, J.A., 1988, Trens Med.Rev. 2:265−71 ）。現在世界中で開発されているHIVワクチンの多くは、まだ動物実験の段階にある。HIV膜タンパク質gp160及びgp120に対するワクチンは臨床実験の第1、第2、第3段階まで進んだが、実験結果は思わしくない。実験において動物のHIV感染を防ぐのに有効だったワクチンの多くは、人間には効果がない（McElrath, M.J.他、1996, Pro. Natl. Acad. Sci. USA 93:3972−77）。科学者たちがHIVワクチン研究においてほとんど進歩を遂げていない理由には、HIVの遺伝物質が複雑で、様々な種類があることが挙げられる（Bloom, B.R., 1996, Science 272:1888−1900）。
【００１０】
世界で承認されているAIDS抗薬は、二つのカテゴリーに分類される。HIV逆転写阻害剤（Charles, C.J.他、1996, JAMA 276:146）とHIVプロテアーゼ阻害剤（Miles, S.A.他、International AIDS Society USA 4(3):15）である。いずれもHIV感染の後期の段階である転写と新しいウイルスの集合に対する薬である。周知の「カクテル療法」は、この両方の阻害剤を組み合わせた治療法である（Lafeuillade, A.他、1997, J. Infect. Dis. 175:1051−55）。
【００１１】
逆転写阻害剤には、AZT、 ddI、 ddC、 3TC、 d4Tなどがあるが、これらは薬物耐性、即ちウイルスが薬に対して鈍感になり、効果的な抑制ができる薬剤濃度が数倍もしくは10倍にまで跳ね上がること（Vella, S. とFloridia, M.による、1996, International AIDS Society USA 4 (3): 15）、をいずれ引き起こす。この薬物耐性にはHIVの高い突然変異率が関係している。人体では1個のHIVウイルスが毎日108〜1010個の新しいウイルス顆粒を生み出し、その突然変異率は1回の複製サイクルにつき3x105に上る。アミノ酸の発現に影響を及ぼす多くのミスセンス突然変異は、エンベロープタンパク質や調節遺伝子内で起こることがある。HIV株の中には、特定の遺伝子のアミノ酸配列において突然変異率が40%にまで上るものもある（Myers, G とMontaner J. G. による、1992, Ther Retroviridae vol. 1, Plenum Press, New York 51−105）。その結果、逆転写阻害剤は、敏感なウイルス株の制御に加え、突然変異の前後に存在する耐性を持ったウイルス株の増殖を助けることにより薬物耐性を起こす。
【００１２】
さらに、全ての逆転写阻害剤にはその服用量により特定の毒性がある。症状は、脊髄の抑圧、嘔吐、肝機能異常、筋肉虚弱、末梢神経系の疾患、膵臓の炎症などである。多数の患者がこれらの副作用のために治療を見合わせなければならない（Fischl, M.A.他、1987, N. Engl. J. Med. 317:185−91; Lenderking, W.R.他、1994, N. Engl. J. Med. 330: 738−43）。
【００１３】
薬物耐性はまた、プロテアーゼ阻害剤においても大きな問題となっている。ウイルスプロテアーゼ遺伝子の突然変異により、現在AIDSの治療に使用されている全てのプロテアーゼ阻害剤において薬物耐性が起こった（Condra, J. H. 他、1995, Nature 374:569−71）。プロテアーゼ阻害剤の副作用には、肝機能異常、胃腸の不快感、腎臓結石、口周りの麻痺、脂肪代謝異常、精神障害などがある（Deeks 他、1997, JAMA 277:145−53）。
【００１４】
要するに、現在使われている抗HIV薬のほとんどは毒性が高く、薬物耐性を引き起こす。従って、HIV感染の治療には未だに大きな障害がある。HIV感染の治療のためにより効果的で毒性の低い新薬が至急必要とされている。
【００１５】
新薬はHIV複製サイクルの異なる段階で新しいターゲットに対して開発され得る。最近、HIVとAIDSに関する綿密な研究の末に新しいメカニズムの抗AIDS薬が数種類開発された。これらの薬には、新しいHIV逆転写阻害剤とHIVプロテアーゼ阻害剤、及びここに挙げる他のターゲットに向けて作られた抗HIV剤が配合されている（De, C.E.、2000, Rev. Med. Virol. 10(4) :255−77）。
【００１６】
1) ラウリル硫酸ナトリウム、ブドウ糖硫酸塩、ヘパリンなどのウイルス吸収剤は、多価陰イオン基の作用によりHIVエンベロープ上のgp120とリンパ球との結合を妨害することができる。しかし、これらの吸収剤は特異性に乏しく毒性が高い。ウイルス負荷を増加させてしまうものもある（Baba, M. 他、1988, Pro. Natl. Acad. Sci. USA. 85:6132−6）。
【００１７】
2) 可溶性CD4は、gp120が宿主細胞と結合するのを防ぐのに使用される。組み換え可溶性CD4の中には、gp120が細胞膜のCD4分子に接触する前にウイルス顆粒を結合し、HIV感染を防ぐものもある。しかし、これらの組み換え可溶性CD4は、数人の患者から単離されたHIV−1株には全く効果がないようである。さらに、臨床実験ではその抗ウイルス作用に関する確かな証拠は得られなかった（Gomatos, P.J. 他、1990, J. Immunol. 144:4183−8）。
【００１８】
3) RANTES、MIP−1α、CCR5と結合したMIP−1β、CXCR4と結合したSDFなどのケモカイン及びその類似物は、HIVが宿主細胞に侵入するのを防ぐのに使用することができる。これらはHIV gp120と細胞ケモカインコレセプタ間の釘植をこぞって遮るだけでなく、細胞に対するこのコレセプタの発現を抑えることによりHIV侵入ポイントを制限することもできるであろう。最新のケモカインコレセプタ遮断剤としては、ALX40−4CとT22のような正帯電小型ペプチドや、AMD3100、TAK−779、トリコサンシンなどの化合物がある。
【００１９】
4) 可溶性CD4−IgGはin vitroにおいてはHIV複製を抑制し得るが、臨床試験では確かな抗ウイルス作用は確認されていない。
【００２０】
5) 2,2'−ジチオビスベンズアミド(DIBA)やアザジカーボンアミドなどの薬剤は、NCp7亜鉛フィンガー部位との相互作用により、ウイルスの集合と分解を妨害することができる。
【００２１】
6) gp41又はその類似物の一部は融合阻害剤として使用できる。例えば、T−20はウイルスが細胞に侵入するのを遮断することができる（Jiang, S. 他、1993, Nature 365:113）。
【００２２】
7) CGP64222、フルオロキノロンK−12、EM2487などのウイルスのmRNA逆転写酵素阻害剤
【００２３】
8) カルボニルJ、[N, N'−ビス(2−(5−ヒドロキシ−7−ナフタリンスルホン酸)尿素]、の誘導体などのインテグラーゼ阻害剤は、HIVが宿主リンパ球のゲノムに自身のゲノムを取り込ませるのを防ぐことができる（Maurer K 他、2000, Bioorg Chem 28(3):140−155）。
【００２４】
３．細胞へのウイルス侵入を阻止する融合阻害剤
多くの生物学的プロセスには、粘膜融合が関与している。真核細胞においては、エンドサイトーシス、分泌、膜成分の再循環などといった、細胞膜の融合が絶えず起こっている（White, J. M., 1992 , Science 258:917−24）。特有の細胞における融合の例として、調節融合ホルモン（regulated fusion hormone）、酵素、神経伝達物質の分泌がある。より顕著な例としては、生殖細胞や筋肉細胞の融合が挙げられる。
【００２５】
本発明の一実施形態によると、抗融合薬や抗細胞膜融合薬は２つ以上の生物学的膜の融合を抑制する物質である。本発明の一実施形態によると、２つ以上の生物学的膜は、細胞膜やウイルスエンベロープなどの、細胞又はウイルスの構造を有している。本発明の一実施形態によると、抗ウイルス剤は、ウイルスと細胞との融合や細胞と細胞との融合の抑制など、細胞がウイルスに感染するのを抑える化合物である。本発明の一実施形態によると、感染は、細胞のエンベロープウイルス感染、並びに、例えば細菌の接合時に起こるプロセスなどの、ウイルスと細胞との融合に類似するその他のプロセスに関係している。
【００２６】
結論として、膜融合はエンベロープウイルスが宿主細胞を攻撃して侵入する重要なステップである（Weissenhorn, W. 他、1997, Nature 387:426−30）。本発明の抗HIV薬であるFusonexとその誘導体は、ウイルスが宿主細胞に侵入するのを防ぐ融合遮断剤である。
【００２７】
融合プロセスは、HIVエンベロープの糖タンパクによって制御されている。糖タンパクの前駆体は、多糖類をもつgp160である。ウイルス繁殖期に、gp160は特定のプロテアーゼによって２つのサブユニットに加水分解される。エンベロープの外にあるgp120と、膜貫通型タンパク質であるgp41である。加水分解後、gp120とgp41はまだ非共有結合により結合しており、ウイルス顆粒の外で三量体として重合される。膜貫通型タンパク質gp41は、その外側ドメインが螺旋形の強い構造となっているものであり、非常に効率的な膜融合発生メカニズムを有しており、細胞膜の融合プロセスにそれを直接関わらせるために、細胞のゲートを開く重要な分子として知られている（Ferrer, M. 他、1999, Nat. Struct. Biol. 6(10):953−60、 Zhou, G.他、2000, 1:Bioorg. Med. Chem. 8(9):2219−27）。
【００２８】
ウイルスと細胞との間で融合が起こる時、gp41のコア（ｃｏｒｅ）は６つの螺旋形の束から構成されており、Ｎ末端及びＣ末端ヘリックスがHIVエンベロープを細胞膜に固定する３つのヘアピンのように配列することが結晶回折分析により確認されている。gp41三量体は、ウイルスが宿主細胞に侵入するのを助ける融合孔を形成するが（Chan, D.C.他、1997, Cell 89:263−73）、一方でそれは感染した細胞から新たに出芽した遊離ウイルス顆粒表面上において、元の不安定な非融合形態で存在する。初めに、N末端ヘリックスがC末端ヘリックスに包囲され、N末端の融合部分が隠れる。ウイルス表面のgp120が細胞膜のCD4レセプタ及びケモカインコレセプタと結合した後、レセプタによって誘引されるgp41の形態変化が起きるが、これは、N末端がウイルス表面を超えて宿主の細胞膜にまで伸びるというものである。この時、gp41は不安定な元の非融合形態からプロヘアピン中間形態へと変換される。gp41のC末端とNペプチドが結合すると、三量体構造のうち疎水性のN末端コアが露出し、プロヘアピン中間体はよりエネルギー安定性の高いヘアピン形態へと変換され、この時までにウイルスエンベロープは細胞膜と融合している（Jones, P.L. 他、1998, J. Biol. Chem. 273:404）。
【００２９】
最初に発見された融合阻害剤は、gp41のＣ末端（127−162）から抽出された36アミノ酸からなるペプチドT−20であり、その配列は次の通りである。
X−YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF−Z
【００３０】
T−20は、gp41 のC末端と構造が似ているため、T−20は、Ｎ末端の融合部分と結合するにあたり、gp41のCペプチドと競い合うことができる。Ｔ細胞の表面では、T−20は、極低濃度において、HIVのgp41と宿主細胞膜との融合を阻害することができる（IC50はnMの範囲内）（Jiang, S. 他、1993, Nature 365:113、 Wild, C.T. 他、1994, Pro. Natl. Acad. Sci. USA. 91:9770−74）。何分間も続くプロヘアピン状態においては、T−20は、gp41のC末端がそのN末端の融合部分と結合するのをとても効果的に遮断し、ウイルスエンベロープと細胞膜の間にヘアピンが作られるのを妨げる（Klinger, Y と Shai, Y.による、 2000 , J. Mol. Biol. 295:163−8）。
【００３１】
融合阻害剤は細胞膜上で作用するため、機能させるために細胞内部に投与する必要がない。これと比較して、現在治療に使われている抗HIV薬は全て宿主細胞のウイルス感染における中期又は後期の段階で作用しており、侵入するHIVの複製を抑制させ得るためにはまず細胞内に投与しなければならない。さらに、gp41の疎水性コアのアミノ酸配列はほとんど変化せず、これは、ウイルスが融合阻害剤に対して薬物耐性を発現しそうにないことを示唆している。in vitroでの実験において、T−20は特にHIVが細胞へ侵入するのを妨ぎ得ることが分かった。一方、臨床試験の第１、第２段階ともに、AIDS患者がT−20の投与によく耐え得ることを示している。T−20は脊髄に対する毒性を全く持たず、ほとんどの副作用は軽度又は中程度である。一日200mgの服用で、T−20はほとんどの患者のHIV負荷を大幅に減少させ、うち30%の患者はHIV負荷が検知レベル（400/ml未満）未満にまで下がった。その上、T−20はまた、すでに薬物耐性を起こしてしまったHIV患者にも効果がある。報告によれば、数人の患者に関しては、CD4+細胞の数が、T−20使用後に増殖した（Kilby, J.M. 他、1998, Nat. Med. 4:1302−1307）。T−20の長期投与はT−20に対する特定の抗体を生み出し、AIDS患者がT−20に対する耐性を持ってしまうのではと懸念されていた。しかしそれにもかかわらず、数週間にわたる実験中ずっと、T−20は抗ウイルス作用を維持した（Pilcher, C.D. 他、1999, AIDS 13(15):2171−4）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
現在臨床で用いられているHIV逆転写阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤に比べ、融合阻害剤T−20はより効果的で、毒性が低く、まだ薬物耐性は全く起こっていない。しかしながら、T−20の臨床服用量は一日当たり200mgと多く、これは安定性が低く、抗融合力価が低いことを示している。それに加え、T−20のそのような多い服用量のために、局部反応を起こした患者もいた（Kilby, J.M. 他、1998, Nat. Med. 4:1302−1307）。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
本発明の一実施形態よると、融合阻害剤は、36個のアミノ酸残基からなる特定のペプチドであって、該ペプチド両端に末端キャッピング基が付加されているものである。
【００３４】
本発明は次の技術概要を提供する。
【００３５】
本発明の好ましい一実施形態によると、当該融合阻害剤は、HIV膜貫通型の糖タンパクgp41から抽出されたペプチドである。本発明のさらに好ましい実施形態によると、このペプチドはSEQ ID NO.:1 に規定されているアミノ酸配列を有し、それは次の通りである。
X−SWETWEREIENYTKQIYKILEESQEQQDRNEKDLLE−Z (SEQ NO.: 1)
【００３６】
当該ペプチド（以下の説明ではFusonexとも称される）においては、Xは、アミノ基又は−X1−X2であり、ここでX1はイミノ基で、X2はアセチル基、疎水基、又は高分子ベクター基である。疎水基は、カルボベンゾキシ基、ダンシル基、tert−ブチロキシカルボニル基又は9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基が望ましい。高分子ベクター基は、脂質−脂肪酸キレート、ポリエチレングリコール又は炭水化物である。
【００３７】
Zは、カルボキシ基又は−Z1−Z2であり、ここでZ1はカルボニル基、Z2はアミノ基、tert−ブチロキシカルボニル基、疎水基もしくは高分子ベクター基である。
【００３８】
本明細書で使用するとき、アミノ酸残基を表す一文字の記号は次のように定義される。
A アラニン
R アルギニン
N アスパラギン
D アスパラギン酸
C システイン
Q グルタミン
E グルタミン酸
G グリシン
H ヒスチジン
I イソロイシン
L ロイシン
K リシン
M メチオニン
F フェニルアラニン
P プロリン
S セリン
T トレオニン
W トリプトファン
Y チロシン
V バリン
【００３９】
本発明の好適な実施例では、X2又はZ2、もしくは両方が疎水基である。疎水基はカルボベンゾキシ基、ダンシル基、tert−ブチロカルボニル基、又は9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基である。
【００４０】
本発明の他の実施形態では、X2又はZ2、もしくは両方が高分子ベクター基である。高分子ベクター基は、脂質−脂肪酸キレート、ポリエチレングリコール、又は炭水化物である。
【００４１】
本発明のさらに好ましい一実施形態では、上記X2はアセチル基であり、Z2はアミノ基である。
【００４２】
本発明の一実施形態によると、AIDSに対する併用療法用調合物は、当該阻害剤に加え、逆転写酵素阻害剤、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、グリコシダーゼ阻害剤、ウイルスmRNAキャッピング阻害剤、アンフォテリシンB、抗HIV作用を有する、エステル結合の結合分子カスタノスペルミン、ヒドロキシウレア、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロンから成る群から選択される少なくとも1つの成分を含んでいる。
【００４３】
本発明の好ましい一実施形態によると、逆転写酵素阻害剤は、AZT（3'−アジド−2', 3'−ジデオキシシチジン）、ddI（2', 3'−ジデオキシイノシン）、ddC（2', 3'−ジデオキシシチジン）、ddA（2', 3'−ジデオキシアデノシン）、d4T（2', 3'−ジデオキシ−ジデオキシチミジン）、3TC、ネビラピン（Nevirapine）、アテビラピン（Atevirapine）、デラビルジン（Delavirdine）、PMEA、PMPA及び／又はロビライド（loviride）から成る群から選択される少なくとも1つである。グリコシダーゼ阻害剤は、SC−48334又はMDL−28574もしくは両方である。ウイルスのmRNAキャッピング阻害剤はリバビリン（ribovirin）である。
【００４４】
本発明はまた、HIV感染を治療するために当該阻害剤を注射、経口投薬処方、経直腸投薬処方又は経皮投薬処方により投与できるようにするものである。
【００４５】
当該阻害剤を含む調合物もまた、HIV感染を治療するために注射、経口投薬処方、経直腸投薬処方又は経皮投薬処方により投与できる。
【００４６】
当該阻害剤は、当分野では既知の代表的な技術や方法を用いて製造できる。例えば、小型のペプチドは、特定のベクター上で又は溶液中で合成することができる。比較的長いペプチドは、遺伝子組換え技術で製造したり、又はいくつかの別個の部分として合成してからそれぞれを連結させることができる。ペプチドをエンコードしたヌクレオチド配列は、当分野の技術者が精通している技術を用いて、合成及び／又は複製し、発現できる。
【００４７】
アミノ酸残基を連結させている当該阻害剤の1つ以上のペプチド結合を、（限定はしないが）イミノ、エステル、フタルヒドラジド、セミカルバジド、アゾ結合などを含む非ペプチド結合で置換することができる。この非ペプチド結合の置換反応は、当分野の専門家であれば常識として知っている。このペプチドはまた、他の化学基をアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に加えて合成することにより、安定性、生体利用効率、及び／又は抑制作用などを高めることもできる。例えば、カルボベンゾキシ、ダンシル、tert−ブチロキシカルボニル基などの疎水基をアミノ末端に加えることができ、アセチル又は9−フルオレニルメチルオキシカルボニルもまたアミノ末端に加えることができる。上記の疎水基、tert−ブチロキシカルボニル基又はアミノ基は、ペプチドのカルボキシ末端に加えることができる。さらに、ペプチドはその空間配座を変化させることにより合成することもできる。例えば、ペプチドの１つ以上のアミノ酸には、通常のL−異性体の代わりにD−異性体を使用することができる。また、本発明のペプチドの少なくとも1種類のアミノ酸残基は、安定性、生体利用効率、及び／又は融合抑制作用を高めるために、自然界には存在しない既知のアミノ酸で置換することができる。
【００４８】
さらに、上記ペプチドのいずれも、（限定はしないが）脂質−脂肪酸キレート、ポリエチレングリコール、又は炭水化物を含む共有結合を介して、それらのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に連結されている非ペプチド高分子ベクター基を持つことができる。
【発明の効果】
【００４９】
本発明は、HIV感染の治療のため、融合阻害剤に高い安定性と力価を与えるものである。本発明の融合阻害剤はAIDSの併用療法において、生産方法において、また、その他の用途において使用できる。本発明の融合阻害剤は、T20と比較してより効果的で、投与量が低く、よって毒性がより低いものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
gp 41の3次元構造分析に基づき、本発明は新規な融合阻害剤Fusonexを提供する。本発明に関連する抗ウイルス性ペプチドの詳細な説明を以下に示す。
【００５１】
1．Fusonexは36個のアミノ酸残基から構成されるポリペプチドである。Fusonex（SEQ ID NO.: 1）は、HIV−1（E亜型）膜貫通型タンパク質gp 41の外部ドメインにあるCペプチド部分（No.117からNo.151までのアミノ酸配列）（SEQ ID NO.: 2）から抽出され、この部分のアミノ酸配列は以下の通りである。
WIEWEREI SNYTNQIYEILTESQNQQDRNEKDLLE（SEQ ID NO.: 2）
【００５２】
2．安定性を高めるために通常セリンをα−ヘリックスのN末端に付加するため、N末端にS（セリン）を加える。
【００５３】
3．No. 118位置のI（イソロイシン）をE（グルタミン酸）に置き換えて、No. 122位置のR（アルギニン）と荷電−荷電相互作用を形成させ、α−ヘリックスの安定性を高める。
【００５４】
4．No. 119位置のE（グルタミン酸）をT（トレオニン）に置き換える。これはW（トリプトファン）117、 W120、 W60を含む疎水ポケットを覆うためである。
【００５５】
5．No. 125位置のS（セリン）をE（グルタミン酸）に置き換えて、No. 129位置のK（リシン）との荷電−荷電相互作用を形成させ、α−ヘリックスの安定性を高める。
【００５６】
6．No. 129位置のN（アスパラギン）をK（リシン）に置き換えて、No. 125位置のE（グルタミン酸）との荷電−荷電相互作用を形成させ、α−ヘリックスの安定性を高める。
【００５７】
7．No. 133位置のE（グルタミン酸）をK（リシン）に置き換えて、No. 136位置及びNo. 137位置のE（グルタミン酸）と荷電−荷電相互作用を形成させ、α−ヘリックスの安定性を高める。
【００５８】
8．No. 136位置のT（トレオニン）をE（グルタミン酸）に置き換えて、No. 133位置のK（リシン）との荷電−荷電相互作用を形成させ、α−ヘリックスの安定性を高める。
【００５９】
9．No. 140位置のN（アスパラギン）をE（グルタミン酸）に置き換えて、No. 144位置のR（アルギニン）との荷電−荷電相互作用を形成させ、α−ヘリックスの安定性を高める。
【００６０】
上記一連の変性後、新しいウイルス融合阻害剤Fusonexは次のアミノ酸配列で構成される。
SWETWEREIENYTKQIYKILEESQEQQDRNEKDLLE（SEQ ID NO.: 1）
【００６１】
本発明は、高力価の抗ウイルス作用を有するペプチド（Fusonex）を提供する。Fusonexは36個のアミノ酸を持ち、HIV−1（E亜型）膜貫通型糖タンパク質の外部ドメインにあるC末端アミノ酸配列（No. 117−151）から抽出される。本発明のポリペプチドFusonexは、非常に低い濃度でも、ウイルス−細胞間やウイルス感染細胞−未感染細胞間における融合プロセスを阻害することができる。侵入を防ぐことで、Fusonexはウイルスが細胞に侵入するのを防ぐとともに、ウイルスに感染した細胞から感染していない細胞へウイルスの拡散を阻止することができる。
【００６２】
ウイルス−細胞融合分析によると、Fusonexの融合抑制濃度は、T−20の20分の1である。従って、本発明のペプチドはHIV感染との闘いにおいてより効果的で、毒性はより低いはずである。高い安定性と効能のおかげで、本発明のペプチドはウイルス融合に対してT−20よりはるかに優れた阻害剤である。
【００６３】
Fusonexの抗ウイルス作用には、（限定はしないが）未感染のCD4+細胞やその他の細胞にHIVが広がるのを防ぐことが包含される。さらに、本発明の阻害剤の抗ウイルス作用には、宿主におけるいかなる免疫反応の誘出も必要ない。
【００６４】
本発明の阻害剤は、未感染細胞からヒト又はヒト以外のレトロウイルス（特にHIV）の伝播防止を含む膜融合抑制に関連するあらゆる生物学的分野に適用できる。本発明の好適な一実施形態によると、阻害剤Fusonexとその誘導体は、未感染のヒト又はヒト以外の細胞へのレトロウイルス（特にHIV）の伝播に対する阻害剤として使用することができる。
【００６５】
本発明の阻害剤はまた、巻かれたタンパク質ヘリックスの二次構造と関係のある細胞内部の生体作用を調節することもできる。本明細書で用いるとき、「調節する」とは、本発明のペプチドにより細胞内部の特定の生体作用の程度又は範囲を活性化もしくは抑制することを意味する（本発明のペプチドがない状況と比較して）。
【００６６】
本発明の阻害剤はまた、ウイルス融合抑制作用のある化合物、抗ウイルス化合物、細胞内での調節作用を有する化合物を特定するために用いることもできる。さらに、本発明のFusonexはまた、特定の生物学的ウイルスのタイプ、及び／又はウイルス亜型の診断にも適用できる。
【００６７】
本発明は新規な融合阻害剤Fusonexとその誘導体を提供する。本発明はまた、ウイルス感染、特にHIV感染の治療及び／又は予防において、他の抗ウィルス薬など、他の薬剤とFusonex又はその誘導体との共投与も提供する。これらの物質はウイルス融合阻害剤と同じ作用部位や機構を有してもよいし、有していなくてもよい。その結果、薬剤共投与によて、協同効果又は相乗効果を得ることができる。
【００６８】
本発明の一実施形態によると、Fusonex又はその誘導体は、（限定はしないが）同時投与、逐次投与、周期的投与、周期療法（例えば、ある抗ウイルス化合物を投与し、それから一定の期間内に第2の抗ウイルス化合物を投与し、この投与手順（即ち周期）を繰り返すことで、抗ウイルス療法で起こり得る薬物耐性を減少させる）を含む全てにおいて、他の薬剤と一緒に投与できる。
【００６９】
他の抗ウィルス薬とFusonex又はその誘導体との併用療法によって、有効服用量が減り、それによって抗ウイルス療法の毒性も低下させ得る新規な療法がもたらされる。さらに、薬剤の併用により、異なる機構を介して宿主細胞のウイルス感染を防ぐことができ、これは抗ウイルス有効性を高めるだけでなく、ウイルスがある療法のみに対する耐性を増加させることも防止する。従って、治療の成功率が上昇する。
【００７０】
本発明はまた、療法として、又はウイルス（特にHIV）感染の予防として、薬剤配合物及び調合物を提供する。この薬剤配合物は、有効量のFusonex又はその誘導体、少なくとも1つの他の薬剤、及び／又は薬理学的に許容されるベクターで構成される。
【００７１】
Fusonex又はその誘導体と併用される薬剤には、既知の、もしくは実験中のあらゆる薬剤が含まれる。本発明の好適な一実施形態によると、Fusonex又はその誘導体は、異なる機構を持つ他の薬剤とともに投与される。これらの薬剤には、（限定はしないが）サイトカインrIFNα、rIFNβ、...及びrIFNγ、...などの抗ウィルス薬；AZT、3TC、ddI、ddC、ネビラピン（Nevirapine）、アテビラピン（Atevirapine）、デラビルジン（Delavirdine）、PMEA、PMPA, ロビライド（loviride）、及びその他のジデオキシリボヌクレオシド又はフルオロジデオキシリボヌクレオシド、などの逆転写酵素阻害剤；サキナビル、リトナビル、インジナビル（Indinavir）、ネルフィナビル、及びVX−478などのウイルスプロテアーゼ阻害剤；ヒドロキシウレア；ウイルスリバビリン（viral ribovirin）などのウイルスmRNAキャッピング阻害剤；アンフォテリシンB；エステル結合の結合している抗ウイルス作用のあるカスタノスペルミン分子；糖タンパクプロセシング阻害剤；グリコシダーゼ阻害剤SC−48334及びMDL−28574；ウイルス吸収剤；CD4レセプタ遮断剤；ケモカインコレセプタ阻害剤；中和抗体；インテグラーゼ阻害剤及びその他の融合阻害剤、が含まれる。
【００７２】
従って、本発明は広範なウイルス（HIVを含む）感染の治療に対してより優れた抗ウイルス療法を提供する。さらに本発明は、Fusonex、その誘導体、少なくとも1つの異なる薬剤、及び／又は薬理学的に許容されるベクターの使用を含む、治療効果の向上を目的とする薬剤の共投与方法を提供する。それは、各療法のみに対してウイルスが耐性を高めるのを防ぐと同時に、薬剤の毒性を減少させ、治療係数を高めることができる。
【００７３】
本明細書で用いるとき、「ウイルス感染」とは、ウイルスが細胞に侵入する病的状態を指す。ウイルスが健康な細胞に侵入すると、宿主の繁殖メカニズムを利用して増殖し、最終的にその細胞を死滅させる。その細胞から出芽した後、それらの新たに形成された子孫ウイルスは、他の細胞に感染しつづける。ウイルス遺伝子の中には、プロウイルスの形態で宿主の染色体DNAと一体化することができるものもあり、これは潜伏感染と呼ばれる。このプロウイルスは宿主染色体の複製とともに増殖し、体内外の様々な要因により活性化された場合、感染者を病的状態に追いやる可能性がある。
【００７４】
本明細書で用いるとき、「ウイルス感染の治療又は予防」とは、ウイルスの複製及び拡散を抑制すること、宿主の中にウイルスが定住するのを防止すること、ウイルス感染が引き起こす症状を改善又は緩和することを意味する。有効な治療の指標には、ウイルス量の低下、死亡率の低下、及び／又は羅患率の低下などがある。
【００７５】
本明細書で用いるとき、「誘導体」とは、Fusonexの配列、同族体、類似体、又は一部を有しているか、又は1つ以上のアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失のある、Fusonexと同族の任意のペプチドを指す。
【００７６】
本明細書で用いるとき、「治療剤」とは、ウイルス感染又はウイルスが引き起こす病気の治療につながる任意の分子、化合物、又は薬剤、特に抗ウィルス薬を意味する。
【００７７】
本明細書で用いるとき、「共同作用」とは、ウイルス感染を治療又は予防するために、単に2つ以上の治療剤を用いる場合の累積作用よりも効果のある薬物共投与を意味する。共同作用は抗ウイルス薬の効果を高め、任意の1つの薬に対するウイルスの耐性を防止又は緩和することができる。
【００７８】
本願のペプチドは、ペプチド結合により2つ以上のアミノ酸が連結されている複合体である。ペプチドの名称は、それを構成するアミノ酸の数に関連している。例えば、ジペプチドは2つのアミノ酸残基を含んでおり、トリペプチドには3つが含まれている。10個以下のアミノ酸からなるペプチドはオリゴペプチドと呼ばれ、11個以上のアミノ酸を含むペプチドはポリペプチドと呼ばれる。
【００７９】
HIV及び他のウイルス感染の治療におけるFusonexの適用に関して、以下に説明する。
【００８０】
Fusonexは、抗ウイルス作用のあるポリペプチドである。本発明のペプチドには、Fusonex（gp41から抽出した、36個のアミノ酸からなるペプチド）、その一部、及び／又は類似物が包含される。これらのペプチドは、他のエンベロープウイルス中にも存在する。本発明のペプチドは、ヒトやその他の哺乳類のレトロウイルス、特にHIVの拡散を抑制することができる。
【００８１】
HIV及び他のウィルスは、感染時から２４時間１日中絶え間なく自身を複製する。従って、種々のウィルス感染段階において抗ウィルス薬を用いることが必要である。本発明はまた、ウィルス−細胞間融合及び細胞内でのウィルスの拡散を阻害するために、種々の抗ウィルス薬と組み合わせた当該ペプチドの共投与を提供する。
【００８２】
HIV感染の治療のための、Fusonexを含む薬剤の共投与に関して、以下に説明する。
【００８３】
Fusonexが作用する標的は、ウイルス表面の糖タンパクgp41である。Fusonexの機能メカニズムは、融合を阻害し、遊離ウイルスの顆粒が他の細胞に感染するのを防止したり、感染した細胞からウイルスが他の細胞に拡散するのを防ぐことである。
【００８４】
Fusonexを、他の標的を持つ1つ以上の異なる薬剤と共投与すると、累積作用あるいは共同作用を起こし得るものと考えられる。本発明は、Fusonex及びその誘導体を含む薬剤の共投与を提供する。薬剤の共投与により、有効服用量を減らすことができるだけでなく、抗ウイルス薬の毒性も低下させることができる。さらに、様々なメカニズムを介してウイルスを攻撃する効能が高まる。最後に、薬剤の共投与により、薬物耐性が発生する機会を防止又は低下させ得る。
【００８５】
本発明は、ヒトやその他の哺乳類のHIV感染のための治療方法を提供するものである。当該方法には、有効量のFusonex又はその誘導体と、望ましくは異なる抗ウイルス剤である少なくとも1つの薬剤を投与することが包含される。
【００８６】
本発明は、ウイルス感染（特にHIV感染）の治療のためのより良い方法を提供する。本発明はまた、HIV感染の治療のための薬剤配合物を提供し、当該薬剤配合物には有効量のFusonex又はその誘導体と、少なくとも1種類の異なる抗ウイルス化合物が含まれている。Fusonex及びその誘導体は、レトロウイルス阻害剤、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、サイトカイン、サイトカイン阻害剤、又はその他のウイルス融合阻害剤と一緒に使用することが望ましい。薬剤共投与は、ウイルスの複製と伝播を抑制するにあたり、より効果的となる。
【００８７】
本発明の方法には、Fusonex又はその誘導体のみの投与、Fusonex又はその誘導体と他の抗ウイルス薬との薬剤共投与が包含される。Fusonexと少なくとも1つの他の薬剤を同時に（混合しても別々に投与してもよい）、又は逐次的に（周期療法を含む）投与することができる。周期療法では、ある特定の時期に患者に抗ウイルス化合物を投与し、その後の別の時期に第2の抗ウイルス化合物を投与する。この投与順序（即ち周期）を繰り返して当該治療における毒性と薬物耐性を緩和させる。
【００８８】
本発明は、本発明のペプチドを最初に投与し、次に他の抗ウイルス薬を投与し、それからまた本発明のペプチド又は他のウイルス融合阻害剤を投与する、別の周期療法も提供する。従って、本発明の阻害剤又はその誘導体は、他の抗ウイルス薬と一緒に投与される。
【００８９】
「共投与」には、合剤療法として2つ以上の治療剤を使用することに加え、2つ以上の治療剤を同時にではあるが別々に使用することも包含される。例えば、1人の患者の異なる血管に投与するケースなどがある。「共投与」にはまた、薬物の順次投与、即ちある薬剤を投与した後に第2の薬剤を投与すること、も包含される。
【００９０】
Fusonexとの併用に好適な抗ウイルス薬は、以下の種々の形態でウイルスを攻撃することができる。逆転写酵素の阻害、ウイルスmRNAのキャッピング抑制、HIVプロテアーゼの阻害、タンパク質のグリコシル化阻害、インテグラーゼ阻害、及びウイルス融合の抑制、である。これらの攻撃形態に基づく薬剤には、（限定はしないが）rIFNα、rIFNβ、rIFNγを含むサイトカインなどの抗ウイルス薬；サイトカイン阻害剤；AZT, 3TC, ddI, ddC, d4T, ネビラピン（Nevirapine）、アテビラピン（Atevirapine）、デラビルジン（Delavirdine）、PMEA、 PMPA、ロビライド（loviride）、及びその他のジデオキシリボヌクレオシド又はフルオロジデオキシリボヌクレオシドなどの逆転写酵素阻害剤；サキナビル、リトナビル、インジナビル（Indinavir）、ネルフィナビル、VX−478などのウイルスプロテアーゼ阻害剤；SC−48334やMDL−28574などのグリコシダーゼ阻害剤；リバビリン（ribovirin）などのウイルスmRNAキャッピング阻害剤；アンフォテリシンB；抗ウイルス作用を持つ、エステル結合の結合分子カスタノスペルミン；ヒドロキシウレア；糖タンパクプロセシング阻害剤；グリコシダーゼ阻害剤SC−48334及びMDL−28574；ウイルス吸収剤；CD4レセプタ遮断薬；ケモカインコレセプタ阻害剤；中和抗体；インテグラーゼ阻害剤及びその他の融合阻害剤、が含まれる。
【００９１】
ポリペプチドFusonexの構造を、以下に説明する。
【００９２】
Fusonexペプチドは、HIV感染を抑制することができる非常に有効な融合阻害剤である。おそらくこれはFusonexがgp41とウイルスエンベロープ上で結びつき、ウイルスによる融合プロセスを阻害し得るためである。例えば、ウイルスタンパク質gp41の自然構造から融合構造への変化において、Fusonexはウイルスgp41の結合サイトを得るために競い合うことができ、その結果ウイルスと細胞との融合プロセスを無効にすることができる。
【００９３】
本発明のペプチドであるFusonexは、HIV−1膜貫通型タンパク質gp41のアミノ酸残基117−151から抽出され、３６個のアミノ酸から構成される。アミノ末端からカルボキシ末端までを読み取ると、Fusonexは次のようなアミノ酸配列を有する。
X−SWETWEREIENYTKQIYKILEESQEQQDRNEKDLLE−Z (SEQ ID NO.: 1)
【００９４】
さらに、本発明はまた、抗ウイルス作用を示すFusonexペプチド（SEQ ID NO.: 1）の一部も提供する。これらの切断されたFusonexペプチドは、4〜36個のアミノ酸を含んでいる（即ち、テトラペプチドから36アミノ酸ペプチドまで）。
【００９５】
「X」はアミノ基又は−X1−X2であり、ここでX1はイミノ基、X2は、（限定はしないが）カルボベンゾキシ、ダンシル、tert−ブチロキシカルボニル基、アセチル、及び9−フルオレニルメチルオキシカルボニル（FMOC）を始めとする疎水基、又は（限定はしないが）脂質−脂肪酸キレート、ポリエチレングリコール、炭水化物を始めとする共有結合した高分子ベクター基である。
【００９６】
Zはカルボキシ基又は−Z1−Z2であり、ここでZ1はカルボニル基、Z2はアミノ基、tert−ブチロキシカルボニル基、又は（限定はしないが）脂質−脂肪酸キレート、ポリエチレングリコール、糖質を始めとする高分子ベクター基である。
【００９７】
Fusonex及び切断されたFusonexに加え、本発明の阻害剤は、SEQ ID NO.: 1のペプチド、又は1つ以上のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失のあるSEQ ID NO.: 1のペプチドとすることができる。アミノ酸挿入物は、1つのアミノ酸残基又は2〜15個のアミノ酸からなる残基部分により構成することができる。1つ以上の挿入物を、Fusonex及びその一部、類似物、及び／又は同族体に取り込むことができる。
【００９８】
さらに、本発明の阻害剤には、Fusonex（SEQ ID NO.: 1）の同族体、Fusonex同族体の類似物、及び／又は抗ウイルス作用を示すFusonexの一部が包含される。本発明の阻害剤には、Fusonex、Fusonexの一部、Fusonexの類似物、切断されたFusonex同族体が包含される。これらの切断されたFusonexは、1つ以上のアミノ酸が取り除かれているFusonexペプチド配列から構成されており、得られるペプチドは最低4〜6個のアミノ酸を含んでいる。これらの切断されたFusonexには、上記ペプチド配列の１つの隣接部、又はより多くの未結合部が含まれることがある。
【００９９】
本発明の一実施形態によると、アミノ酸置換体は保護特性を有する。保護特性を持つアミノ酸置換体は、Fusonex（SEQ ID NO.: 1）ペプチド配列において、それらが取って代わるアミノ酸（1つ以上）に類似の電荷、サイズ、及び／又は疎水特性をもつアミノ酸からなる。
【０１００】
抗ウイルス薬とFusonexとの共投与に関して、以下に説明する。
【０１０１】
本発明の融合阻害剤は、その抗ウイルス効能を高めるために他の治療剤と一緒に投与することができる。本発明の好適な一実施形態によると、Fusonexは、（限定はしないが）逆転写酵素阻害剤、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、グリコシル化阻害剤などのような、ウイルス複製の全過程において異なる標的に作用する薬剤；ウイルス拡散の全過程において異なる標的に作用する抗ウイルス薬；同一分子の異なる部位に作用する抗ウイルス薬；薬物耐性の発生を防止又は削減することのできる抗ウイルス薬を含む、他の抗ウイルス薬とともに投与される。共投与の作用メカニズムと利点は、当分野のあらゆる科学的、技術的関係者が把握しておくべきである。
【０１０２】
本発明の阻害剤は、（限定はしないが）ヌクレオシド誘導体を含むレトロウイルス阻害剤と共に投与することができる。当該ヌクレオシド誘導体は、プリンヌクレオシド及びピリミジンヌクレオシドの改良誘導体である。これらの作用メカニズムは、RNAとDNAが合成されるのを防ぐものである。他のヌクレオシドに結合し得る3'置換基をもたない当該ヌクレオシド誘導体は、逆転写酵素の媒介によるcDNAの合成を抑制でき、それによってウイルスのDNA複製を停止させ得る。これが抗HIV治療剤となった理由である。例えば、AZT及びddTは、両方ともHIV−1の複製をin vivo及びin vitroにおいて抑制でき、HIV感染及びAIDSの治療薬として承認されている。しかし、治療にこれらの薬剤を使用することは、多くの副作用に加え、薬品耐性HIV株の大量繁殖を引き起こす可能性がある。
【０１０３】
本発明の阻害剤は、ヌクレオシド誘導体及び非ヌクレオシド誘導体と併用して投与できる。当該ヌクレオシド誘導体には、（限定はしないが）2', 3'−ジデオキシアデノシン（ddA）、2', 3'−ジデオキシグアノシン（ddG）、2', 3'−ジデオキシイノシン（ddI）、2', 3'−ジデオキシシチジン（ddC）、2', 3'−ジデオキシチミジン（ddT）、2', 3'−ジデオキシ−ジデオキシチミジン（d4T）、3'−アジド2', 3'−ジデオキシシチジン（AZT）が含まれる。本発明の一実施形態によると、当該ヌクレオシド誘導体はハロヌクレオシドであり、好ましくは、（限定はしないが）2', 3'−ジデオキシ−2'−フルオロアデノシン、2', 3'−ジデオキシ−2'−フルオロイノシン、2', 3'−ジデオキシ−2'−フルオロチミジン、2', 3'−ジデオキシ−2'−フルオロシチジンを始めとする2', 3'−ジデオキシ−2'−フルオロヌクレオチド、（限定はしないが）2', 3'−ジデオキシ−2', 3'−ジデヒドロ−2'−フルオロチミジン（Fd4T）を始めとする2', 3'−ジデオキシ−2', 3'−ジデヒドロ−2'−フルオロヌクレオチドが含まれる。より好ましくは、当該ヌクレオシド誘導体は、（限定はしないが）2', 3'−ジデオキシ−2'β−フルオロアデノシン（F−ddA）、2', 3'−ジデオキシ−2' β−フルオロイノシン（F−ddI）、2', 3'−ジデオキシ−2' β−フロオロシチジン（F−ddC）を始めとする、フッ素結合がβ型配座をとっている2', 3'−ジデオキシ−2'−フルオロヌクレオチドである。薬剤共投与により、ヌクレオシド誘導体の服用量を削減することができ、そのため抗ウイルス作用を維持しつつ毒性及びウイルスの薬物耐性を低下させることができる。
【０１０４】
本発明の好適な一実施形態によると、HIV感染治療のための、抗ウイルスペプチドとヌクレオチド誘導体の組み合わせには、有効服用量のFusonex又はその誘導体と、有効服用量のAZT、ddC、及び／又はd4Tが包含される。より好適な薬剤の組み合わせには、（限定はしないが）有効服用量のFusonex又はその誘導体と、ddT、及び／又は有効服用量の3TC、ビラミューン（Viramune）、レスクリプター（Rescriptor）、サスティバ（Sustiva）、ロビライド（Loviride）、ネビラピン（Nevirapine）、及びアテビルジン（Atevirdine）との組合せが包含される。
【０１０５】
Fusonex又はその誘導体はまた、（限定はしないが）ベンジルアシクロウリジン（BAU）、ベンゾキシベンジルアシクロウリジン（BBAU）、アメトベンジルアシクロウリジン（amethobezylacyclouridine）（AMBAU）、アメトベンゾキシベンジルアシクロウリジン（AMB−BAU）、ヒドロキシメチルベンジルアシクロウリジン（HMBAU）、ヒドロキシメチルベンゾキシベンジルアシクロウリジン（HMBAU）を始めとするアシクロウリジン化合物を含む、ウリジンリン酸化酵素の阻害剤と一緒に投与することもできる。
【０１０６】
Fusonex又はその誘導体はまた、（限定はしないが）rIFNα、rIFNβ、…rIFNγ、TNFα阻害剤、MNX−160、ヒトrインターフェロンαA、ヒトrインターフェロンβ、ヒトrインターフェロンγを始めとするサイトカインもしくはサイトカイン阻害剤と一緒に投与することができる。より好適な薬剤の共投与として、Fusonex又はその誘導体と有効量のβインターフェロンの組合せが挙げられる。
【０１０７】
プロテアーゼ阻害剤は、主にウイルスの集合時もしくは集合時後（即ちウイルスの出芽時）にウイルスが成長するのを防ぐ。プロテアーゼ阻害剤は、in vivo及びin vitroの両方において抗ウイルス作用を示す。プロテアーゼ阻害剤を投与した後、AIDS患者のHIVレベルは急激に減少し、彼らのCD4リンパ球の数は増加した（Deeks他、1997, JAMA 277:145−53）。ウイルス逆転写酵素阻害剤と融合阻害剤Fusonexの共投与は相乗効果を生み、満足のいく臨床結果をもたらす。本発明は、HIV感染を治療する方法を提供し、それは有効量のFusonex又はその誘導体と有効量のプロテアーゼ阻害剤との共投与であり、後者には（限定はしないが）インジナビル（Indinavir）、インビラーゼ（Invirase）、ノルビル（Norvir）、ビラセプト（Viracept）、アジェネラーゼ（Agenerase）が含まれる。
【０１０８】
Fusonex又はその誘導体はまた、ビラゾールなどの5'−mRNAのプロセシングを阻害する抗HIV薬と共投与することもできる。ビラゾールの機能メカニズムはまだ分かっていないが、グアニンと競ってmRNAキャップ構造を形成し、及び／又はこれらの分子のメチル化を阻害すると推測されている。Fusonexとビラゾールの間にはおそらく共同作用があると思われる。
【０１０９】
さらに、Fusonex又はその誘導体は、アンフォテリシンBと共投与することもできる。アンフォテリシンBは、ステロールと不可逆的に結合できるポリエン抗真菌性抗生物質である。アンフォテリシンB及びそのギ酸塩は、HIVを含む多くの脂質エンベロープウイルスに対して抑制効果がある。アンフォテリシンBはヒトの体に対して重度の毒性を持つが、そのギ酸塩ははるかに毒性が低い。従って、アンフォテリシンB又はそのギ酸塩はFusonex又はその誘導体とともに投与し、抗ウイルス共同効果を生み出すことができるので、臨床医師たちは抗ウイルス作用を損なうことなくアンフォテリシンB又はそのギ酸塩を低用量で使用することができる。
【０１１０】
Fusonex又はその誘導体は、糖タンパクプロセシングを抑制できる植物性アルカロイドである糖タンパクプロセシング阻害剤カスタノスペルミンと共投与することもできる。HIVエンベロープには2つの大きな糖タンパクgp120及びgp41が含まれている。タンパク質のグリコシル化は、gp120とCD4との相互作用において重要な役割を果たしている。カスタノスペルミン存在下で合成された子孫ウイルスの伝染力は親ウイルスより弱い。Fusonex又はその誘導体とカスタノスペルミンとの共投与は相乗効果をもたらすことができる。
【０１１１】
Fusonex又はその誘導体と上記抗ウイルス治療剤との共投与による治療効果は、当分野で一般に使われている方法で評価することができる。例えば、FusonexとAZTの配合効果は、（限定はしないが）細胞に対するHIV毒性の抑制、合胞体（synplasm）形成の阻害、逆転写酵素の作用の阻害、又はRNAもしくはタンパク質合成などを行うウイルスの能力の阻害を始めとする種々のin vitroでの実験を通して検証することができる。
【０１１２】
投与処方、投与量、投与手段に関して、以下に説明する。初めに薬剤の配合に関して説明する。
【０１１３】
本発明が提供するFusonex又はその誘導体と少なくとも1つの他の治療剤との組み合わせは、ヒト又はヒト以外のウイルス感染治療もしくは予防に利用することができる。本発明が提供する薬剤の共投与は、累積効果／共同効果をもたらすことができる。
【０１１４】
望ましい薬剤の組み合わせは、Fusonex又はその誘導体と、逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、mRNAプロセシング阻害剤、タンパク質グリコシル化阻害剤、ウィルス吸収剤、CD4レセプタ阻害剤、ケモカインコレセプタ阻害剤、中和抗体、インテグラーゼ阻害剤、（限定はしないが）スクレオシド類似体又は連鎖停止剤を始めとする他の融合阻害剤、ケモカインコレセプタ阻害剤AMD−3100（Tremblay, C. L.他、2000, J. AIDS 1:25(2)99−10）などの少なくとも1つの他の抗ウイルス薬とを含有している。
【０１１５】
本発明の一実施形態によると、Fusonex又はその誘導体と共投与できる治療剤として、（限定はしないが）2−デオキシ−D−グルコース（2dGlc）、デオキシノジリマイシンアシクログアノシン（deoxynojirimycinacycloguanosine）、ビラゾール（virazole）、リファジン（rifadin）、アダマンタナミン（adamantanamine）、リファブチン（rifabutine）、ガンシクロビル（ganciclover）（DHPG）、ファムシクロビル（famciclove）、ブシクロビル（buciclover）（DHBG）、フルオロヨードアラシトシン（fluoroiodearacytosine）、ヨードクスウリジン（iodoxuridine）、トリフルオロチミジン、ビダラビン（ara−A）、ara−AMP、ブロモビニルデオキシウリジン、ソリブジン（BV−arau）、l−b−D−グリコアラビノフラノシド−E−5−[2−ブロモビニル]ウラシル、アダマントエチルアミン（adamantethylamine）、ヒドロキシウレア、フェニル酢酸ヘプタンジオン（phenylacetic heptanedione）、ジアリルアミジン、(S) − (ρ−ニトロベンジル) −6−チオイノシン、フォスカネット（phosphonoformate）が挙げられる。本発明は、Fusonex又はその誘導体と、任意の上記化合物との薬剤配合物を提供する。
【０１１６】
さらに、本発明のペプチドはまた、HIVにさらされたがまだそれに感染していない人のための予防措置としても使用できる。このような予防措置の例には、（限定はしないが）ウイルスの母子間感染の予防、及びHIVに感染した血液、血液製剤、体液を扱う医療労働者の医療事故など他の状況におけるHIV感染の予防、が含まれる。これらの場合においては、本発明のペプチドを予防ワクチンとして使用することができる。本発明のペプチドで予防接種をすることにより、宿主はHIV感染を阻止し、HIVウイルスを中和する抗体を生み出す。
【０１１７】
本発明は、予防ワクチン接種概要を提供し、それは、HIVを中和する、例えばHIV感染を抑制する細胞の能力を発達させる、のに十分な免疫反応を引き出すために効果的な濃度で当該ペプチドを宿主に投与することを包含する。引き出された免疫反応は、当分野で周知の標準的な技術により検出することができる。本発明の一実施形態によると、ワクチンとして使用されるペプチドは筋肉注射により投与される。
【０１１８】
免疫反応を高めるために、本発明のペプチドは、（限定はしないが）水酸化アルミニウムなどの鉱物性ゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プロニック（Puronic）多価アルコール、ポリアニオン、その他のペプチド、油乳化剤、カルメット・ゲラン菌（BCG）やコリネ型菌などの人間が使う添加物を始めとする、いくつかの適切なアジュバントと共に投与することができる。上記ワクチンの投与経路として、（限定はしないが）経口、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、下皮、鼻腔内といった経路が挙げられる。
【０１１９】
Fusonexの投与量に関して、以下に説明する。
【０１２０】
ヒトなど哺乳類の急性ウイルス感染の治療には、ウイルスの複製を抑制するのに十分な有効量でFusonex又はその誘導体を投与すべきである。当該有効量は、生物学的半減期、生体利用効率、毒性などのパラメータを設定することを始めとする、一般に当業者には既知の方法で決定することができる。例として、Fusonexを1日につき0.2−10.0mg/kgずつ4〜52週間続けて注射することができる。望ましい用量は1日につき20mg〜200mgで、最も好適な用量は1日につき30mg〜80mgであり、投与期間は約52週間である。
【０１２１】
Fusonex又はその誘導体の投与間隔は、約2日〜1/4日の範囲であり、1日〜1/2日が最適である。最適な用量を投与すると、Fusonex又はその誘導体は、血漿中のピーク濃度1mg/ml〜10mg/mlを得られる。Fusonexの血中濃度は、以下のように決定することができる。適切な緩衝生理食塩水にFusonexが20％含まれる無菌注射を作り、継続的に注射した後にHPLCを用いて血中濃度を測定する。
【０１２２】
Fusonex又はその誘導体と共投与される際の、抗ウイルス薬などの治療剤の有効量は、当分野で周知の様々な抗ウイルス薬の推奨用量に基づいて決定することができる。共投与のための好適な用量は、個別投与のための文献推奨用量より、約10%〜50%少ない。医療専門家は、毒性反応が起こり始める用量に注意すべきである。骨髄、肝臓、及び／又は腎臓機能が損なわれた場合、又は深刻な薬物間相互作用が起きた場合、医師はどのように、いつ投与を保留又は停止するか、用量を減らすかを知っておくべきである。また、予想した臨床治療結果が得られない場合、医師はどのように用量を増やすかも知っておくべきである。
【０１２３】
効果的な治療用量とは、薬剤配合物によって、患者の状態が改善するか、又は生存期間が延長されるのに十分であるときの用量を意味する。この種の薬剤の毒性及び治療効果は、細胞培養又は動物実験という標準的な薬理学的方法によって決定することができる。例えば、当該方法は、中程度の致死量（LD50、実験コロニーの50％が死んだ量）と中程度の有効量（ED50、実験コロニーの50％が治癒した量）とを決定することである。治癒能力対毒性の比が治療係数であり、LD50／ED50と表すことができる。治療係数が高いほど、その化合物は良いということになる。細胞及び動物実験で得られた統計は、ヒトの用量範囲を推測するのに使用することができる。この種の化合物の用量は、特定の範囲の血中濃度、即ち、無毒もしくは低毒性でありつつED50よりも多いのが最適であり、こうして投与調合剤及び投与経路に応じて調節することができる。これらのデータに基づき、ヒトに使用する場合の用量を正確に決定できる。血漿中の薬物濃度はHPLCを用いて計測することができる。
【０１２４】
投与調合剤及び投与経路を以下に説明する。
【０１２５】
ウイルス感染、特にHIV感染治療のための投薬量を得るため、Fusonexもしくはその誘導体を含む薬剤配合物、又はある適切な担体もしくは賦形剤と共にFusonexもしくはその誘導体を含む薬剤配合物混合物を直に患者に投与する。本適用における調合剤及び投与技術は当業者には周知のものである。
【０１２６】
本発明のペプチドの抗ウイルス作用は、特定のペプチドが特定のウイルスのみを阻害するという亜型特異性を示すことができる。本発明のペプチドは、HIV−1に対して最も敏感で、そのような利点を診断試薬の分野に活用できる。例えば、このペプチドの抗HIV−1特異性は、特定の分離ウイルス株（HIV−1又はHIV−2）の種類を特定するのに使用することができる。例えば、Fusonexペプチドの存在下、未感染分離CD4+細胞を未知のウイルス株により感染させた後、その細胞を培養しつづける。その後、細胞浮遊物のレトロウイルス作用を検査し、もし当該作用が完全に抑制されていれば、このウイルス株はHIV−1ということになる。もし抑制されていない場合、又は僅かしか抑制されていない場合には、このウイルス株はおそらくHIV−1ではない。
【０１２７】
本発明はまた、本発明のペプチド及び／又は薬剤配合物に基づく系統的投与に用いる適切な投与調合剤を調合するための薬理学的に好ましい担体の使用を包含する。適切な担体と調合剤を用いることで、本発明のペプチド又は配合物、特に溶液として調合された配合物を、静脈注射を含むがこれに限定されない消化管外経路で投与することができる。本発明のペプチド又は配合物は、この分野では周知の薬理学的に好ましい担体を使用し、経口投与に適した溶液として調合することもできる。ペプチド又は配合物をタブレットやピル、カプセル、液体、ジェル、シロップ、スラリー、懸濁液、その他の投与調合剤に調合するには、適切な担体が必要である。
【０１２８】
本発明のペプチド及び薬剤配合物は、（限定はしないが）経口、直腸、透析膜、又は腸内投与；筋内、下皮、髄内、鞘内、直接心室内、静脈、腹腔内、鼻腔内、又は眼内を始めとする消化管外投与；経皮、局部、膣内投与などを含む、当業者には周知の経路によって投与することができる。投与調合剤として、（限定はしないが）タブレット、トローチ、粉末、懸濁液、坐剤、液剤、カプセル、糖衣、膏薬、マイクロモータ（micro−motor）が挙げられる。便宜上、本発明の薬剤配合物は、機械的な方法によって、1つ以上の生理学的に許容される担体を用いて、薬理学的に許容される任意の調合剤にすることができる。作用化合物の処理を助けるため、本発明の薬剤配合物に1つ以上の賦形剤及びアジュバントを含ませ得る。注射を容易に行うため、本発明のペプチド又は薬剤配合物は液剤、例えば生理食塩水として調合することができる。透析膜投与の場合、障壁を貫通する浸透剤を使用すべきであり、これらの浸透剤は当分野で一般に知られているはずである。
【０１２９】
本発明のペプチド又は薬剤配合物の経口投与調合剤は、固形賦形剤と一緒にすり潰して十分に分散した混合物とし、次いでそれを顆粒化しタブレット又は糖衣錠の核へと加工する。必要であれば、適切なアジュバントを当該混合物に加える。適切な賦形剤及び充填剤として、ラクトース、サッカロース、マンニトール、あるいはソルビコラン（sorbicolan）などの糖；コーンスターチ、小麦スターチ、米スターチ、片栗粉、グルテン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドンなどのフィブリン製品を使用できる。必要であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩などの錠剤分解物質も使用する。糖衣タブレットの核には適切なコーティングを施す必要がある。当該コーティングは、アラビアゴム、タルカム、ポリビニルピロリドン、カルボポルジェル、ポリエチレングリコール、酸化チタン、硝酸セルロース、及び適切な有機溶剤又は溶剤配合物を含有する濃縮砂糖溶液から作ることができる。作用化合物を識別又は示すために、タブレット又は糖衣タブレットのコーティングに種々の着色剤又は食用色素の配合物を加えることができる。
【０１３０】
経口投与用の投与調合剤には、グルテン及び例えばグリセリンやソルビン酸などの可塑剤からなる充填タイプのカプセル又は密封したソフトカプセルがある。充填タイプのカプセルには、ラクトースなどの充填剤、スターチなどの接着剤、及び／又はタルカムやステアレートなどの滑剤が含まれている。さらに、作用化合物を安定化させるために安定剤もまた使用することができる。ソフトカプセルに関しては、有効化合物を、脂肪油、液体オレフィン、あるいは液体状ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解又は懸濁させることができる。さらに安定剤を加えることもできる。経口投与用の全ての投与調合剤は、患者にとって便利であるべきである。実際の投与の場合には、上記薬剤配合物を、便利なトローチ投与調合剤に調合することができる。
【０１３１】
吸入投与の場合では、高圧パッケージもしくはアトマイザーを使用して、又はジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素もしくは他の適切なガスなどのいくつかの適切な圧縮不活性ガスを使用して、本発明のペプチド又は配合物をエアロゾルとして容易に放出することができる。高圧エアロゾルの場合、1つのバルブの計測放出量により投与量を定めることができる。グルテンカプセル、及び吸入器、吐出器として使用されるカートリッジは、ペプチド及び適切な粉末状の基質（ラクトースあるいはスターチなど）を含有する混合物として製造することができる。
【０１３２】
本発明のペプチド又は配合物は、消化管外投与用の投与調合剤に調合することができる。例えば、クラスター薬剤注射又は持続静注を始めとする注射用調合剤に調合することができる。注射用途のための調合物は、単位投与量の形態で包装できる。例えば、アンプルにそれを入れることができる。多量の調合剤もまた、アンプルや大用量容器に単位の形態で包装し、防腐剤を加えることができる。本発明の配合物は、油又は水を溶媒として懸濁液、溶液もしくは乳濁液という形態を取ることができ、懸濁剤、安定剤、及び／又は分散剤などの添加剤を含み得る。
【０１３３】
消化管外投与用の投与調合剤は、作用成分の水溶液、即ち水に溶解した形態とすることができる。作用成分の懸濁液も、適切な油状懸濁注射液として調合することができる。適切な親油性溶媒又はベクターとして、ギンゲリ油（gingeli oil）などの脂肪油、又はオレイン酸エチル、トリグルセリド、リポソームなどの合成脂肪酸エステルが挙げられる。注射用の水に似た懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビン酸アルコール、グルコサンなどの、懸濁液の粘性を高める物質を含むことができる。高濃度の溶液を調製するために、化合物の溶解度を高める適切な安定剤もしくは基質を上記懸濁液に含有させることができる。投与前に、粉末注射剤の作用成分を、ピレトゲン（pyretogen）のない注射剤用無菌水などの適切な溶媒に溶解させることができる。
【０１３４】
本発明のペプチド又は配合物は、坐剤又は持続浣腸などの直腸投与調合剤に調合することができる。カカオバターやその他のグリセリルエステルなどのよく使用される基質を用いて調合することができる。
【０１３５】
説明した投与調合剤の他に、当該ペプチド又は薬剤配合物は、下皮、筋内植付もしくは筋内注射にて投与できる長時間作用型の投与調合剤として調合することもできる。従って、当該ペプチド及びその誘導体あるいは薬剤配合物を適切なポリマー、疎水性物質（例えば油エマルジョンなど）、イオン交換クロマトグラフィー、又は難溶性塩などの難溶性誘導体を用いて調合することができる。
【０１３６】
本発明の疎水性ペプチド又は配合物用の薬物担体は、有機ポリマーと、水と溶け合う水相との共溶解システムであり、ベンジルアルコール及び非極性界面活性剤を含んでいる。当該共溶解システムは、VPD共溶解システムになりうる。VPDは、3％（W/V）のベンジルアルコール、8％（W/V）の非極性界面活性剤マルチエトキシアエーテル（multiethoxyaeter）、65％（W/V）のポリエチレングリコール300含有無水アルコールを含有している溶液であり、VPD共溶解システム（VPD:5W）は水に1対1の割合で薄めたVPDと5％のグルコースを用いて調製される。この種の共溶解システムは、全身投与において低毒性でありつつ、疎水性物質をより十分に溶解させる。その溶解度及び毒性が変化しない限り、共溶解システムの割合を大きく変えることができる。さらに、共溶解システムの構成要素もまた、変えることができる。例えば、低毒性の他の非極性界面活性剤を、マルチエトキシアエーテルの代わりに使用することができる。ポリエチレングリコールの割合も変えることができる。ポリビニルピロリドンなど、他の生物学的に混合するポリマーを、ポリエチレンの代わりにすることができる。他の糖やポリオーズ（polyose）を、グルコースの代わりに使用できる。
【０１３７】
薬剤配合物には、固相もしくはゲル相の賦形剤のような適切な担体も含まれ得る。これらの担体又は賦形剤として、（限定はしないが）炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、スターチ、セルロース誘導体、ゼラチン、あるいはポリエチレングリコールのようなポリマーが挙げられる。本発明の薬剤配合物にはまた、治療効果を得るために使用される有効量の作用成分の配合物も含まれる。有効量を決定する方法は、当分野において周知である。
【０１３８】
本発明のペプチドの使用に関して、以下に説明する。
【０１３９】
Fusonexペプチド（SEQ ID NO.: 1）は、効果的な抗ウイルス作用を示す。その結果、当該ペプチド又はその誘導体は、ヒトの、及びヒト意外のレトロウイルス阻害剤、特にHIV阻害剤として使用することができ、未感染の細胞にウイルスが拡散するのを防ぐことができる。
【０１４０】
本発明のペプチドは、（限定はしないが）HIV−1及びHIV−2株、ヒトT−リンパ球（HTLV−及びHTLV−II）を始めとするヒトレトロウイルスの拡散を抑制するために使用することができる。本発明のペプチドはまた、（限定はしないが）ウシ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ロイコウイルス、サル免疫不全ウイルス、白血病ウイルス、白血球ウイルス、ヒツジ進行性肺炎を始めとするヒト以外のレトロウイルスの拡散抑制にも使用することができる。
【０１４１】
本発明のペプチドはまた、おそらく、（限定はしないが）ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ジステンパーウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、及びインフルエンザウイルスを始めとする他のレトロウイルス及び／又は非レトロウイルスの拡散も抑制すると考えられる。
【０１４２】
さらに、本発明は上記レトロウイルスや非レトロウイルスによって引き起こされる病気を治療するための薬剤共投与における当該ペプチドの使用法も提供する。
【０１４３】
HIV抑制のための共投与における使用法について、以下に説明する。
【０１４４】
本発明は、Fusonexと他の治療剤との共投与を提供する。薬剤共投与により、合胞体の形成及びHIVの複製を防ぐことができ、患者の体内におけるHIVの繁殖を抑制できる。本発明の共投与はまた、HIV感染に関連した疾病を緩和又は治療するためにも使用することができる。例えば、HBV、EBV、CMV感染やその他の不慮の感染（TBを含む）を抑制するため、抗ウイルスペプチドFusonex又はその誘導体を抗真菌剤、抗生物質、その他の抗ウイルス薬と一緒に投与することができる。
【０１４５】
Fusonex又はその誘導体の最良の使用法は、HIV感染を抑制することである。共投与の有効量は、以下の方法に基づいて得ることができる。例えば、適切な担体中で薬剤を調合し、それを（限定はしないが）注射（静脈、腹腔内、筋内、下皮注射などのような）；口の粘膜、直腸、膣内上皮、咽頭鼻粘膜、腸内粘膜などの上皮又は粘膜吸収；経口；経皮又はその他の薬理学的に実現可能な経路を始めとする任意の適切な経路によって投与する。
【０１４６】
当分野の既存の薬剤と比較して、本発明のペプチドには次の利点がある。HIV粘膜融合抑制における大幅に改善された効能、より十分な安定性とより高い力価、である。効能が向上しており、投与量を削減できるので副作用も減る。
【０１４７】
本発明を例示する実施例を以下に示す。
【実施例１】
【０１４８】
実施例 1 ： Fusonex の製造及び精製
Fusonexは、431A型のバイオシステムポリペプチド合成装置を用いて合成した。この合成にはFast−Moc化学法を用い、標準的な固相合成技術を利用して、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル（FMOC）により保護されているアミノ酸を用いた。試薬には、TFA、水、5％硫化アニシル、2.5％ethylen disulfhydrate、及び0.8Mフェニルフェノール結晶が含まれる。
【０１４９】
Fusonexの生物学的半減期を延長するため、アミノ末端をアセチル化し、カルボキシ末端をアミド化した。当該ペプチドを、装置上の樹脂から自動的に解離させ、側鎖の大きい基は自動的に除去された。樹脂から解離して、未精製のFusonexペプチドを、容積にして4倍の冷えたエーテル中で20分間沈殿させた。遠心分離後、ペプチドを冷えたエーテル中で2度洗浄し、次いで24時間乾燥させた。
【０１５０】
未精製のFusonexペプチドをHPLCにより精製した。C18カラム（15μm 球形充填剤）を用いて、0.1％TFAを含有する水／アセトニトリル中でリニア溶離を実施した。精製されたFusonexペプチドの純度は分析HPLCにより計測したが、95％よりも高かった。最後に、Fusonexをアミノ酸配列と電子ジェット（electron jet）質量スペクトルにより確認した。精製したFusonexの分子量は、4641.24Dであった。
【実施例２】
【０１５１】
例 2 ： Fusonex の溶離実験
Fusonexの溶離実験に使用した方法は次の通りである。
【０１５２】
Superdex75クロマトグラフィーカラムを用いて、過剰のFusonex及びFusonexとgp41 Nペプチド（35−70）との複合体を溶離させた。溶離剤にはリン酸緩衝液を用いた。曲線を得るための全回収量は30mlであった。結果に基づいて、溶離プロファイル（図2）を作成し、Fusonexとgp41ペプチド（35−70）との複合体の溶離ピークは13.2ml位置にあり、Fusonex自体の溶離ピークは17.3ml位置にあることが判明した。
【実施例３】
【０１５３】
例 3 ： gp41 N ペプチドと複合化している Fusonex の構造決定
円偏光二色性スペクトルを用いて、gp41 Nペプチドと複合化しているFusonexの構造を決定した。まず、0.1M NaCl/20mMリン酸カリウム中で試料を25μM、pH7.4に希釈し、その後gp41 Nペプチドと複合化しているFusonexの二次構造をCDスペクトルにより決定した。分析は、Aviv 62A DS円偏光二色性スペクトル装置を用いて実施した。Fusonexとgp41 Nペプチド（35−70）とを含んだペプチド溶液を、200−260nmの波長帯内で計測した。
【０１５４】
円偏光二色性スペクトルの条件は、20℃、円偏光のbreathは1.5nmで、ステップは0.5nm、時定数は2.0秒、光セル長は10mmであった。3段階の多項式（three−level polynomial）を使用して、ブランクデータを修正した。試料温度は熱電ホルダーで維持し、誤差範囲は1℃以内であった。
【０１５５】
結果を、円偏光二色性（CD）スペクトル（図3）に示した。図3によると、Fusonexとgp41 Nペプチド（35−70）との複合体の二次構造は、100％α−ヘリックスであった。度数（θ）をスペクトルY軸の楕円率の単位として使用した。その楕円率θは、222nmにおいて約−40,000/度cm2 dmol− 1（図3）であった。
【実施例４】
【０１５６】
例 4 ： Fusonex 及び T − 20 の安定性の検証
本実験では、種々の温度におけるその溶解曲線を評価してポリペプチドの安定性を決定した。本実験は、Aviv 62A DS円偏光二色性スペクトル装置を用いて実施した。ペプチド溶液を加熱する温度範囲は、20℃〜95℃とした。
【０１５７】
本実験では、種々の温度における溶解曲線に基づいてポリペプチドの安定性を検証した。gp41 Nペプチドと複合化しているFusonexの50％溶解温度（黒丸で示した右側の曲線）は70℃で、gp41 Nペプチドと複合化しているT−20の50％溶解温度（白丸で示した左側の曲線）は51℃であった。他の条件が同じである場合、Fusonex複合体を溶解させるにはより高温にすることが必要となる。
【０１５８】
結果を、Fusonex複合体及びT−20複合体の溶解曲線（図4）に示した。図4から、Fusonexの方がT−20より安定性が高いことがわかった。
【実施例５】
【０１５９】
例 5 ： Fusonex の HIV − 1 感染に対する抑制作用
本実施例では、細胞−細胞の融合分析において、Fusonexがウイルス感染を非常に効果的に阻止することが分かった。同条件の融合分析において、FusonexのIC50は1.2±0.2nMであり、一方T−20のIC50は23±6nMであった。Fusonexの50％抑制濃度（IC50）は、T−20の50％抑制濃度の約20分の1であった。その高い力価によって、FusonexはHIVウイルスがヒトの細胞と融合するのを防止し、HIVに誘発された細胞間融合を抑制し、未感染細胞へのウイルス侵入を阻害するにあたり、より効果的であることが判明した。
【０１６０】
分析の詳細な説明は以下の通りである。
【０１６１】
Fusonexの抗ウイルス作用は、in vitroでの試験によって測定することができる。本発明では、ルシフェラーゼ実験を用いて、HIV−1 gp160HXBに誘発される合胞体形成を抑制するFusonexの能力を定量的に試験した。
【０１６２】
具体的な実験方法は以下の通りである。T7プロモータを複製箇所の上流配列pSP64に挿入し、ルシフェラーゼのレポーター遺伝子プラスミドPst7lucを構成する。脳脊髄心筋炎ウイルス（CMCV）の内部リボザイム侵入部位（IRES）を、ルシフェラーゼ遺伝子の5'−末端及びT7プロモータの下流部と結合させた。CD4遺伝子、T7ポリメラーゼ遺伝子、HIV−1 gp160HXB遺伝子を哺乳動物発現プラスミド（PMT3）にサブクローニングした。
【０１６３】
10cmの培養皿に、293T細胞をリン酸カルシウム法によって移した。gp160HXB遺伝子とT7ポリメラーゼ遺伝子を同量使用してエフェクター細胞をトランスフェクトし、pSP6とCD4遺伝子を用いてターゲット細胞をトランスフェクトした。gp160HXB遺伝子又はCD4遺伝子がない状態のPMT3プラスミドを、ネガティブな比較対照とした。
【０１６４】
DNA沈殿物を加えた後、非漿液性DMEMを洗浄処理した。細胞を9ml／皿の非漿液性DMEM中で、37℃において30〜40分間培養した。その後、細胞を全容ピペットで吸い上げながら皿の中でそっと上下に掻き混ぜ、それから遠心分離後沈殿した細胞を収集した。各皿の細胞を10％FBS含有DMEM 3〜4mlに再懸濁させ、十分に分散した状態を達成するため、エフェクター細胞を96ウェル培養プレート内でターゲット細胞（各45μl）と混合させた。
【０１６５】
まず、Fusonex又はT−20をDMSOに溶解させ、そして20倍希釈した。その溶液を原液として、使用する前に培地内で倍々希釈した。各ウェルに、10μl培地又はPBSを加え、又はFusonexもしくはT−20の希釈物をゼロから持続的に増加する濃度で加えた。ターゲット細胞、エフェクター細胞、及び融合阻害剤からなる混合物を撹拌した後、37℃において8時間培養させた。ルシフェラーゼ遺伝子を分析する前に、まずウェル中の培地を拭き取り、細胞を細胞溶解バッファ60μlに1：1の割合で溶解させた。溶解産物40μlを黒の96ウェル培養プレートの各ウェルに移し、100μlのフルオレセイン及びコエンザイムAを加えた。各濃度毎に3つの試料を繰り返した。黒の96ウェル培養プレートにルシフェラーゼ担体を加えた2分後、スペックスフルオロログ3蛍光光度計を用いて化学的蛍光強度を計測し、発光波長は552nm、スリット幅は7mmであった。各濃度における3つのデータから、平均及び標準偏差を算出した。
【０１６６】
本実験の抑制データは、単純な親和性バランス式（%ルシフェラーゼ作用＝100/(1+(C/IC50))に当てはめ、IC50の値を計上した。結果は、ウイルス融合に対するFusonex及びT−20の抑制分析（図5）に示した。図5は、Fusonex（丸）の50%抑制濃度（IC50）が、T−20（四角）のそれの約20分の1だということを示している。IC50値は、Fusonexでは1.2±0.2nMで、T−20では23±nMであった。即ち、Fusonexの融合抑制価は、T−20より20倍高かった。
【０１６７】
結論として、Fusonexは、両方の末端がキャッピングされており、36個のアミノ酸が特定の配列をなした化合物である。当該阻害剤やその配合薬は、HIV感染に対して強力な抑制作用があり、高い安定性及び力価も持ちあわせている。従って、治療効果を改善するとともに、用量は少量で済むため、副作用を抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】36個のアミノ酸で構成されたポリペプチドであるFusonexのアミノ酸配列（SEQ ID NO.: 1）を示している。Fusonexは、HIV−1 gp41 （E亜型）のC−ペプチドにおけるアミノ酸配列（117−151）（SEQ ID NO.: 2）から抽出される。全ての図において、上記の一文字の記号はアミノ酸を指している。
【図２】Fusonexの特徴的なピーク及びSuperdexクロマトグラフィカラムを用いて得られたFusonex 、及びFusonexとgp 41 N−ペプチド（35−70）との複合体の特徴的なピークを示す溶離プロファイルである。
【図３】Fusonexとgp 41 N−ペプチド（35−70）との複合体における高分子二次構造の円偏光二色性スペクトルである。
【図４】FusonexとT−20間の安定性を比較したものであり、右側の曲線（黒丸）がgp 41 N−ペプチドと複合化しているFusonexの溶解曲線、左側の曲線（白抜き丸）がgp 41 N−ペプチドと複合化しているT−20の溶解曲線である。35℃〜80℃の間では、同一温度の場合には、FusonexはT−20より安定していることが分かる。
【図５】FusonexとT−20の融合抑制作用を示している。本実験では、Fusonex（丸）とT−20（四角）の融合抑制作用の定量分析のためにルシフェラーゼの作用を用いた。細胞の融合はHIV−1 gp 160HXBにより誘発させた。gp 160HXB遺伝子を発現させるエフェクター細胞及びT7ポリメラーゼ遺伝子を、CD4遺伝子を発現させるターゲット細胞及びルシフェラーゼのレポーター遺伝子と融合する際に、ルシフェラーゼ遺伝子が発現し、化学的蛍光が放射される。本実験では、いかなる融合阻害剤も存在しない時の対照群のルシフェラーゼ作用を100％とする。HIV−1 gp 160HXBに誘発された細胞融合に対するFusonexとT−20の抑制作用を比較したところ、同濃度においてFusonexの方がT−20より優れた抑制作用を有することが分かる。
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2001年8月29日付けの中国特許出願第01 1 39085.7号、現在の中国特許第ZL 01 1 30985.7号、2002年6月6日付けのPCT特許出願第PCT/CN02/00405の恩恵を主張するものであり、参照することでその内容の全てを本明細書に取り入れることとする。
【０００２】
本発明は、HIV感染の治療に使用できる融合阻害剤に関連するものである。
【背景技術】
【０００３】
１．HIVとAIDSの流行
ヒト免疫不全ウィルス（HIV）という病原性レトロウイルスは、後天性免疫不全症候群（AIDS）を引き起こす可能性がある（Barre−Sinossi, F. 他、1983, Science 220: 868−870）。大食細胞やニューロン、その他の細胞もHIVに感染する可能性があるが（Maddon他、1986, Cell 47:333−48）、CD4+リンパ細胞がHIV感染の主な対象細胞である（Dalgleish, A.らによる、1984, Nature 312:767−8）。何故なら、HIVはCD4+細胞の表面に存在するCD4分子に対して強い親和性を持っているからである。HIVはヒトに感染すると、体内で多数のCD4+細胞を破壊するため、体は免疫機能を失い始め、従ってAIDS患者は様々な感染症、神経機能異常、腫瘍などを非常に起こしやすい。患者は症状に苦しみ、結果的に死に至る（Levy, J.A.編: Acute HIV infection and susceptible cells、発行元：アメリカ、2000年、63−78ページ）。
【０００４】
AIDSの流行性感染は、その重い症状と死亡率の高さのため、ヒトの健康を脅かす主な死亡原因のひとつとなった。今まで全世界においてHIVに感染した人の数は57,900,000人にのぼり、過去10年間で21,800,000人がAIDSで死亡している。5,300,000人が2000年に新たにHIVに感染したことが判明した。中国では、HIV感染が急速に広がっている。専門家によると、大人・子供を含めて、2000年にHIV感染者人口は800,000−1,000,000人を超えていると考えられている（WHO Report 2000, UNAIDS 及び WHO）。
【０００５】
現在、少なくとも２種類のHIVが確認されている。HIV−1（Gallo, R.他、1984, Science 224:500−503）とHIV−2（Clavel, F.他、1986, Science 223:343−346）である。どちらのウイルスも遺伝的異質性が高い。HIV−1だけ見ても、少なくとも11種類の遺伝子型がある（A−J及びOの亜型）（Jonassen, T.O.他、1997, Virol 223:343−346）。HIV−1のE亜型は、主に中央アフリカ、タイ、インド、ベトナム、カンボジア、マレーシア、ミャンマー、中国、西半球に広がっている（WHO Report 1996年）。中国で見られるHIV亜型は、主にB、E、C亜型である（Yu, E. S. 他、1996, American J. Public Health 86 (8 Pt1):116−22）。
【０００６】
HIVの繁殖サイクルには幾つかの重要なステップがある。まず、エンベロープ糖タンパクgp120がT4 リンパ球の表面にあるCD4分子との特定の結合によって宿主の細胞膜に連結する。ケモカインコレセプタの助けにより、ウイルスエンベロープは宿主の細胞膜に融合する（Berger, E.A.他、1999, Ann. Rev. Immunol., 17:657−700）。融合過程後、ヌクレオカプシドに閉じ込められたHIVビリオンはカプシドを取り除かれ、ウイルス核酸が剥き出しになった状態で宿主細胞に入る。ウイルスの逆転写酵素がHIVの一鎖のRNAを一鎖のDNAへ転写する触媒として働き、前記一鎖のDNAは細胞ポリメラーゼの触媒作用で二鎖のDNAに変換される。この二鎖のDNAは細胞質内で自由に存在することもでき、ウイルスのインテグラーゼによって宿主染色体DNAにプロウイルスとして取り込まれることもできるので、HIV潜伏感染を引き起こす（Roe, T.他、1997, J. Virol. 71(2): 1334−40）。プロウイルスは宿主染色体から切り離すことはできず、非常に安定しており、宿主染色体の複製とともに繁殖する。HIV mRNAが大きなポリプロテインに変換された後、ウイルスプロテアーゼがポリプロテインを切断してプロセシングし、熟成されたウイルス構造タンパク質を形成させる（Xiang, Y. & Leis, J., 1997, J. Virol. 71(3):2083−91）。最後に、この構造タンパク質とHIV核酸が集合して新しいウイルス顆粒に変わり、出芽によって細胞の外へ放出される（Kiss−Lazozlo, Hohn, T., 1996, Trends in Microbiology 4(12) : 480−5）。
【０００７】
これらをまとめると、HIV複製の重要なステップは、1) 融合過程における宿主細胞への結合と侵入、2) 逆転写と取り込み、3) タンパク質変換とプロセシング、4) ウイルス集合と放出、となる。
【０００８】
２．HIV感染の治療
何年もの間、効果的な治療及び予防法を探す努力が行われてきたが、AIDSに効くワクチンや治療法は未だに存在していない。
【０００９】
理想的なワクチンは、無害であり且つ粘膜や血液中に中和抗体と持続性の免疫反応を誘発することができなくてはならない（Levy, J.A., Levy, J.A., 1988, Trens Med.Rev. 2:265−71 ）。現在世界中で開発されているHIVワクチンの多くは、まだ動物実験の段階にある。HIV膜タンパク質gp160及びgp120に対するワクチンは臨床実験の第1、第2、第3段階まで進んだが、実験結果は思わしくない。実験において動物のHIV感染を防ぐのに有効だったワクチンの多くは、人間には効果がない（McElrath, M.J.他、1996, Pro. Natl. Acad. Sci. USA 93:3972−77）。科学者たちがHIVワクチン研究においてほとんど進歩を遂げていない理由には、HIVの遺伝物質が複雑で、様々な種類があることが挙げられる（Bloom, B.R., 1996, Science 272:1888−1900）。
【００１０】
世界で承認されているAIDS抗薬は、二つのカテゴリーに分類される。HIV逆転写阻害剤（Charles, C.J.他、1996, JAMA 276:146）とHIVプロテアーゼ阻害剤（Miles, S.A.他、International AIDS Society USA 4(3):15）である。いずれもHIV感染の後期の段階である転写と新しいウイルスの集合に対する薬である。周知の「カクテル療法」は、この両方の阻害剤を組み合わせた治療法である（Lafeuillade, A.他、1997, J. Infect. Dis. 175:1051−55）。
【００１１】
逆転写阻害剤には、AZT、 ddI、 ddC、 3TC、 d4Tなどがあるが、これらは薬物耐性、即ちウイルスが薬に対して鈍感になり、効果的な抑制ができる薬剤濃度が数倍もしくは10倍にまで跳ね上がること（Vella, S. とFloridia, M.による、1996, International AIDS Society USA 4 (3): 15）、をいずれ引き起こす。この薬物耐性にはHIVの高い突然変異率が関係している。人体では1個のHIVウイルスが毎日108〜1010個の新しいウイルス顆粒を生み出し、その突然変異率は1回の複製サイクルにつき3x105に上る。アミノ酸の発現に影響を及ぼす多くのミスセンス突然変異は、エンベロープタンパク質や調節遺伝子内で起こることがある。HIV株の中には、特定の遺伝子のアミノ酸配列において突然変異率が40%にまで上るものもある（Myers, G とMontaner J. G. による、1992, Ther Retroviridae vol. 1, Plenum Press, New York 51−105）。その結果、逆転写阻害剤は、敏感なウイルス株の制御に加え、突然変異の前後に存在する耐性を持ったウイルス株の増殖を助けることにより薬物耐性を起こす。
【００１２】
さらに、全ての逆転写阻害剤にはその服用量により特定の毒性がある。症状は、脊髄の抑圧、嘔吐、肝機能異常、筋肉虚弱、末梢神経系の疾患、膵臓の炎症などである。多数の患者がこれらの副作用のために治療を見合わせなければならない（Fischl, M.A.他、1987, N. Engl. J. Med. 317:185−91; Lenderking, W.R.他、1994, N. Engl. J. Med. 330: 738−43）。
【００１３】
薬物耐性はまた、プロテアーゼ阻害剤においても大きな問題となっている。ウイルスプロテアーゼ遺伝子の突然変異により、現在AIDSの治療に使用されている全てのプロテアーゼ阻害剤において薬物耐性が起こった（Condra, J. H. 他、1995, Nature 374:569−71）。プロテアーゼ阻害剤の副作用には、肝機能異常、胃腸の不快感、腎臓結石、口周りの麻痺、脂肪代謝異常、精神障害などがある（Deeks 他、1997, JAMA 277:145−53）。
【００１４】
要するに、現在使われている抗HIV薬のほとんどは毒性が高く、薬物耐性を引き起こす。従って、HIV感染の治療には未だに大きな障害がある。HIV感染の治療のためにより効果的で毒性の低い新薬が至急必要とされている。
【００１５】
新薬はHIV複製サイクルの異なる段階で新しいターゲットに対して開発され得る。最近、HIVとAIDSに関する綿密な研究の末に新しいメカニズムの抗AIDS薬が数種類開発された。これらの薬には、新しいHIV逆転写阻害剤とHIVプロテアーゼ阻害剤、及びここに挙げる他のターゲットに向けて作られた抗HIV剤が配合されている（De, C.E.、2000, Rev. Med. Virol. 10(4) :255−77）。
【００１６】
1) ラウリル硫酸ナトリウム、ブドウ糖硫酸塩、ヘパリンなどのウイルス吸収剤は、多価陰イオン基の作用によりHIVエンベロープ上のgp120とリンパ球との結合を妨害することができる。しかし、これらの吸収剤は特異性に乏しく毒性が高い。ウイルス負荷を増加させてしまうものもある（Baba, M. 他、1988, Pro. Natl. Acad. Sci. USA. 85:6132−6）。
【００１７】
2) 可溶性CD4は、gp120が宿主細胞と結合するのを防ぐのに使用される。組み換え可溶性CD4の中には、gp120が細胞膜のCD4分子に接触する前にウイルス顆粒を結合し、HIV感染を防ぐものもある。しかし、これらの組み換え可溶性CD4は、数人の患者から単離されたHIV−1株には全く効果がないようである。さらに、臨床実験ではその抗ウイルス作用に関する確かな証拠は得られなかった（Gomatos, P.J. 他、1990, J. Immunol. 144:4183−8）。
【００１８】
3) RANTES、MIP−1α、CCR5と結合したMIP−1β、CXCR4と結合したSDFなどのケモカイン及びその類似物は、HIVが宿主細胞に侵入するのを防ぐのに使用することができる。これらはHIV gp120と細胞ケモカインコレセプタ間の釘植をこぞって遮るだけでなく、細胞に対するこのコレセプタの発現を抑えることによりHIV侵入ポイントを制限することもできるであろう。最新のケモカインコレセプタ遮断剤としては、ALX40−4CとT22のような正帯電小型ペプチドや、AMD3100、TAK−779、トリコサンシンなどの化合物がある。
【００１９】
4) 可溶性CD4−IgGはin vitroにおいてはHIV複製を抑制し得るが、臨床試験では確かな抗ウイルス作用は確認されていない。
【００２０】
5) 2,2'−ジチオビスベンズアミド(DIBA)やアザジカーボンアミドなどの薬剤は、NCp7亜鉛フィンガー部位との相互作用により、ウイルスの集合と分解を妨害することができる。
【００２１】
6) gp41又はその類似物の一部は融合阻害剤として使用できる。例えば、T−20はウイルスが細胞に侵入するのを遮断することができる（Jiang, S. 他、1993, Nature 365:113）。
【００２２】
7) CGP64222、フルオロキノロンK−12、EM2487などのウイルスのmRNA逆転写酵素阻害剤
【００２３】
8) カルボニルJ、[N, N'−ビス(2−(5−ヒドロキシ−7−ナフタリンスルホン酸)尿素]、の誘導体などのインテグラーゼ阻害剤は、HIVが宿主リンパ球のゲノムに自身のゲノムを取り込ませるのを防ぐことができる（Maurer K 他、2000, Bioorg Chem 28(3):140−155）。
【００２４】
３．細胞へのウイルス侵入を阻止する融合阻害剤
多くの生物学的プロセスには、粘膜融合が関与している。真核細胞においては、エンドサイトーシス、分泌、膜成分の再循環などといった、細胞膜の融合が絶えず起こっている（White, J. M., 1992 , Science 258:917−24）。特有の細胞における融合の例として、調節融合ホルモン（regulated fusion hormone）、酵素、神経伝達物質の分泌がある。より顕著な例としては、生殖細胞や筋肉細胞の融合が挙げられる。
【００２５】
本発明の一実施形態によると、抗融合薬や抗細胞膜融合薬は２つ以上の生物学的膜の融合を抑制する物質である。本発明の一実施形態によると、２つ以上の生物学的膜は、細胞膜やウイルスエンベロープなどの、細胞又はウイルスの構造を有している。本発明の一実施形態によると、抗ウイルス剤は、ウイルスと細胞との融合や細胞と細胞との融合の抑制など、細胞がウイルスに感染するのを抑える化合物である。本発明の一実施形態によると、感染は、細胞のエンベロープウイルス感染、並びに、例えば細菌の接合時に起こるプロセスなどの、ウイルスと細胞との融合に類似するその他のプロセスに関係している。
【００２６】
結論として、膜融合はエンベロープウイルスが宿主細胞を攻撃して侵入する重要なステップである（Weissenhorn, W. 他、1997, Nature 387:426−30）。本発明の抗HIV薬であるFusonexとその誘導体は、ウイルスが宿主細胞に侵入するのを防ぐ融合遮断剤である。
【００２７】
融合プロセスは、HIVエンベロープの糖タンパクによって制御されている。糖タンパクの前駆体は、多糖類をもつgp160である。ウイルス繁殖期に、gp160は特定のプロテアーゼによって２つのサブユニットに加水分解される。エンベロープの外にあるgp120と、膜貫通型タンパク質であるgp41である。加水分解後、gp120とgp41はまだ非共有結合により結合しており、ウイルス顆粒の外で三量体として重合される。膜貫通型タンパク質gp41は、その外側ドメインが螺旋形の強い構造となっているものであり、非常に効率的な膜融合発生メカニズムを有しており、細胞膜の融合プロセスにそれを直接関わらせるために、細胞のゲートを開く重要な分子として知られている（Ferrer, M. 他、1999, Nat. Struct. Biol. 6(10):953−60、 Zhou, G.他、2000, 1:Bioorg. Med. Chem. 8(9):2219−27）。
【００２８】
ウイルスと細胞との間で融合が起こる時、gp41のコア（ｃｏｒｅ）は６つの螺旋形の束から構成されており、Ｎ末端及びＣ末端ヘリックスがHIVエンベロープを細胞膜に固定する３つのヘアピンのように配列することが結晶回折分析により確認されている。gp41三量体は、ウイルスが宿主細胞に侵入するのを助ける融合孔を形成するが（Chan, D.C.他、1997, Cell 89:263−73）、一方でそれは感染した細胞から新たに出芽した遊離ウイルス顆粒表面上において、元の不安定な非融合形態で存在する。初めに、N末端ヘリックスがC末端ヘリックスに包囲され、N末端の融合部分が隠れる。ウイルス表面のgp120が細胞膜のCD4レセプタ及びケモカインコレセプタと結合した後、レセプタによって誘引されるgp41の形態変化が起きるが、これは、N末端がウイルス表面を超えて宿主の細胞膜にまで伸びるというものである。この時、gp41は不安定な元の非融合形態からプロヘアピン中間形態へと変換される。gp41のC末端とNペプチドが結合すると、三量体構造のうち疎水性のN末端コアが露出し、プロヘアピン中間体はよりエネルギー安定性の高いヘアピン形態へと変換され、この時までにウイルスエンベロープは細胞膜と融合している（Jones, P.L. 他、1998, J. Biol. Chem. 273:404）。
【００２９】
最初に発見された融合阻害剤は、gp41のＣ末端（127−162）から抽出された36アミノ酸からなるペプチドT−20であり、その配列は次の通りである。
X−YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF−Z
【００３０】
T−20は、gp41 のC末端と構造が似ているため、T−20は、Ｎ末端の融合部分と結合するにあたり、gp41のCペプチドと競い合うことができる。Ｔ細胞の表面では、T−20は、極低濃度において、HIVのgp41と宿主細胞膜との融合を阻害することができる（IC50はnMの範囲内）（Jiang, S. 他、1993, Nature 365:113、 Wild, C.T. 他、1994, Pro. Natl. Acad. Sci. USA. 91:9770−74）。何分間も続くプロヘアピン状態においては、T−20は、gp41のC末端がそのN末端の融合部分と結合するのをとても効果的に遮断し、ウイルスエンベロープと細胞膜の間にヘアピンが作られるのを妨げる（Klinger, Y と Shai, Y.による、 2000 , J. Mol. Biol. 295:163−8）。
【００３１】
融合阻害剤は細胞膜上で作用するため、機能させるために細胞内部に投与する必要がない。これと比較して、現在治療に使われている抗HIV薬は全て宿主細胞のウイルス感染における中期又は後期の段階で作用しており、侵入するHIVの複製を抑制させ得るためにはまず細胞内に投与しなければならない。さらに、gp41の疎水性コアのアミノ酸配列はほとんど変化せず、これは、ウイルスが融合阻害剤に対して薬物耐性を発現しそうにないことを示唆している。in vitroでの実験において、T−20は特にHIVが細胞へ侵入するのを妨ぎ得ることが分かった。一方、臨床試験の第１、第２段階ともに、AIDS患者がT−20の投与によく耐え得ることを示している。T−20は脊髄に対する毒性を全く持たず、ほとんどの副作用は軽度又は中程度である。一日200mgの服用で、T−20はほとんどの患者のHIV負荷を大幅に減少させ、うち30%の患者はHIV負荷が検知レベル（400/ml未満）未満にまで下がった。その上、T−20はまた、すでに薬物耐性を起こしてしまったHIV患者にも効果がある。報告によれば、数人の患者に関しては、CD4+細胞の数が、T−20使用後に増殖した（Kilby, J.M. 他、1998, Nat. Med. 4:1302−1307）。T−20の長期投与はT−20に対する特定の抗体を生み出し、AIDS患者がT−20に対する耐性を持ってしまうのではと懸念されていた。しかしそれにもかかわらず、数週間にわたる実験中ずっと、T−20は抗ウイルス作用を維持した（Pilcher, C.D. 他、1999, AIDS 13(15):2171−4）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
現在臨床で用いられているHIV逆転写阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤に比べ、融合阻害剤T−20はより効果的で、毒性が低く、まだ薬物耐性は全く起こっていない。しかしながら、T−20の臨床服用量は一日当たり200mgと多く、これは安定性が低く、抗融合力価が低いことを示している。それに加え、T−20のそのような多い服用量のために、局部反応を起こした患者もいた（Kilby, J.M. 他、1998, Nat. Med. 4:1302−1307）。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
本発明の一実施形態よると、融合阻害剤は、36個のアミノ酸残基からなる特定のペプチドであって、該ペプチド両端に末端キャッピング基が付加されているものである。
【００３４】
本発明は次の技術概要を提供する。
【００３５】
本発明の好ましい一実施形態によると、当該融合阻害剤は、HIV膜貫通型の糖タンパクgp41から抽出されたペプチドである。本発明のさらに好ましい実施形態によると、このペプチドはSEQ ID NO.:1 に規定されているアミノ酸配列を有し、それは次の通りである。
X−SWETWEREIENYTKQIYKILEESQEQQDRNEKDLLE−Z (SEQ NO.: 1)
【００３６】
当該ペプチド（以下の説明ではFusonexとも称される）においては、Xは、アミノ基又は−X1−X2であり、ここでX1はイミノ基で、X2はアセチル基、疎水基、又は高分子ベクター基である。疎水基は、カルボベンゾキシ基、ダンシル基、tert−ブチロキシカルボニル基又は9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基が望ましい。高分子ベクター基は、脂質−脂肪酸キレート、ポリエチレングリコール又は炭水化物である。
【００３７】
Zは、カルボキシ基又は−Z1−Z2であり、ここでZ1はカルボニル基、Z2はアミノ基、tert−ブチロキシカルボニル基、疎水基もしくは高分子ベクター基である。
【００３８】
本明細書で使用するとき、アミノ酸残基を表す一文字の記号は次のように定義される。
A アラニン
R アルギニン
N アスパラギン
D アスパラギン酸
C システイン
Q グルタミン
E グルタミン酸
G グリシン
H ヒスチジン
I イソロイシン
L ロイシン
K リシン
M メチオニン
F フェニルアラニン
P プロリン
S セリン
T トレオニン
W トリプトファン
Y チロシン
V バリン
【００３９】
本発明の好適な実施例では、X2又はZ2、もしくは両方が疎水基である。疎水基はカルボベンゾキシ基、ダンシル基、tert−ブチロカルボニル基、又は9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基である。
【００４０】
本発明の他の実施形態では、X2又はZ2、もしくは両方が高分子ベクター基である。高分子ベクター基は、脂質−脂肪酸キレート、ポリエチレングリコール、又は炭水化物である。
【００４１】
本発明のさらに好ましい一実施形態では、上記X2はアセチル基であり、Z2はアミノ基である。
【００４２】
本発明の一実施形態によると、AIDSに対する併用療法用調合物は、当該阻害剤に加え、逆転写酵素阻害剤、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、グリコシダーゼ阻害剤、ウイルスmRNAキャッピング阻害剤、アンフォテリシンB、抗HIV作用を有する、エステル結合の結合分子カスタノスペルミン、ヒドロキシウレア、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロンから成る群から選択される少なくとも1つの成分を含んでいる。
【００４３】
本発明の好ましい一実施形態によると、逆転写酵素阻害剤は、AZT（3'−アジド−2', 3'−ジデオキシシチジン）、ddI（2', 3'−ジデオキシイノシン）、ddC（2', 3'−ジデオキシシチジン）、ddA（2', 3'−ジデオキシアデノシン）、d4T（2', 3'−ジデオキシ−ジデオキシチミジン）、3TC、ネビラピン（Nevirapine）、アテビラピン（Atevirapine）、デラビルジン（Delavirdine）、PMEA、PMPA及び／又はロビライド（loviride）から成る群から選択される少なくとも1つである。グリコシダーゼ阻害剤は、SC−48334又はMDL−28574もしくは両方である。ウイルスのmRNAキャッピング阻害剤はリバビリン（ribovirin）である。
【００４４】
本発明はまた、HIV感染を治療するために当該阻害剤を注射、経口投薬処方、経直腸投薬処方又は経皮投薬処方により投与できるようにするものである。
【００４５】
当該阻害剤を含む調合物もまた、HIV感染を治療するために注射、経口投薬処方、経直腸投薬処方又は経皮投薬処方により投与できる。
【００４６】
当該阻害剤は、当分野では既知の代表的な技術や方法を用いて製造できる。例えば、小型のペプチドは、特定のベクター上で又は溶液中で合成することができる。比較的長いペプチドは、遺伝子組換え技術で製造したり、又はいくつかの別個の部分として合成してからそれぞれを連結させることができる。ペプチドをエンコードしたヌクレオチド配列は、当分野の技術者が精通している技術を用いて、合成及び／又は複製し、発現できる。
【００４７】
アミノ酸残基を連結させている当該阻害剤の1つ以上のペプチド結合を、（限定はしないが）イミノ、エステル、フタルヒドラジド、セミカルバジド、アゾ結合などを含む非ペプチド結合で置換することができる。この非ペプチド結合の置換反応は、当分野の専門家であれば常識として知っている。このペプチドはまた、他の化学基をアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に加えて合成することにより、安定性、生体利用効率、及び／又は抑制作用などを高めることもできる。例えば、カルボベンゾキシ、ダンシル、tert−ブチロキシカルボニル基などの疎水基をアミノ末端に加えることができ、アセチル又は9−フルオレニルメチルオキシカルボニルもまたアミノ末端に加えることができる。上記の疎水基、tert−ブチロキシカルボニル基又はアミノ基は、ペプチドのカルボキシ末端に加えることができる。さらに、ペプチドはその空間配座を変化させることにより合成することもできる。例えば、ペプチドの１つ以上のアミノ酸には、通常のL−異性体の代わりにD−異性体を使用することができる。また、本発明のペプチドの少なくとも1種類のアミノ酸残基は、安定性、生体利用効率、及び／又は融合抑制作用を高めるために、自然界には存在しない既知のアミノ酸で置換することができる。
【００４８】
さらに、上記ペプチドのいずれも、（限定はしないが）脂質−脂肪酸キレート、ポリエチレングリコール、又は炭水化物を含む共有結合を介して、それらのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に連結されている非ペプチド高分子ベクター基を持つことができる。
【発明の効果】
【００４９】
本発明は、HIV感染の治療のため、融合阻害剤に高い安定性と力価を与えるものである。本発明の融合阻害剤はAIDSの併用療法において、生産方法において、また、その他の用途において使用できる。本発明の融合阻害剤は、T20と比較してより効果的で、投与量が低く、よって毒性がより低いものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
gp 41の3次元構造分析に基づき、本発明は新規な融合阻害剤Fusonexを提供する。本発明に関連する抗ウイルス性ペプチドの詳細な説明を以下に示す。
【００５１】
1．Fusonexは36個のアミノ酸残基から構成されるポリペプチドである。Fusonex（SEQ ID NO.: 1）は、HIV−1（E亜型）膜貫通型タンパク質gp 41の外部ドメインにあるCペプチド部分（No.117からNo.151までのアミノ酸配列）（SEQ ID NO.: 2）から抽出され、この部分のアミノ酸配列は以下の通りである。
WIEWEREI SNYTNQIYEILTESQNQQDRNEKDLLE（SEQ ID NO.: 2）
【００５２】
2．安定性を高めるために通常セリンをα−ヘリックスのN末端に付加するため、N末端にS（セリン）を加える。
【００５３】
3．No. 118位置のI（イソロイシン）をE（グルタミン酸）に置き換えて、No. 122位置のR（アルギニン）と荷電−荷電相互作用を形成させ、α−ヘリックスの安定性を高める。
【００５４】
4．No. 119位置のE（グルタミン酸）をT（トレオニン）に置き換える。これはW（トリプトファン）117、 W120、 W60を含む疎水ポケットを覆うためである。
【００５５】
5．No. 125位置のS（セリン）をE（グルタミン酸）に置き換えて、No. 129位置のK（リシン）との荷電−荷電相互作用を形成させ、α−ヘリックスの安定性を高める。
【００５６】
6．No. 129位置のN（アスパラギン）をK（リシン）に置き換えて、No. 125位置のE（グルタミン酸）との荷電−荷電相互作用を形成させ、α−ヘリックスの安定性を高める。
【００５７】
7．No. 133位置のE（グルタミン酸）をK（リシン）に置き換えて、No. 136位置及びNo. 137位置のE（グルタミン酸）と荷電−荷電相互作用を形成させ、α−ヘリックスの安定性を高める。
【００５８】
8．No. 136位置のT（トレオニン）をE（グルタミン酸）に置き換えて、No. 133位置のK（リシン）との荷電−荷電相互作用を形成させ、α−ヘリックスの安定性を高める。
【００５９】
9．No. 140位置のN（アスパラギン）をE（グルタミン酸）に置き換えて、No. 144位置のR（アルギニン）との荷電−荷電相互作用を形成させ、α−ヘリックスの安定性を高める。
【００６０】
上記一連の変性後、新しいウイルス融合阻害剤Fusonexは次のアミノ酸配列で構成される。
SWETWEREIENYTKQIYKILEESQEQQDRNEKDLLE（SEQ ID NO.: 1）
【００６１】
本発明は、高力価の抗ウイルス作用を有するペプチド（Fusonex）を提供する。Fusonexは36個のアミノ酸を持ち、HIV−1（E亜型）膜貫通型糖タンパク質の外部ドメインにあるC末端アミノ酸配列（No. 117−151）から抽出される。本発明のポリペプチドFusonexは、非常に低い濃度でも、ウイルス−細胞間やウイルス感染細胞−未感染細胞間における融合プロセスを阻害することができる。侵入を防ぐことで、Fusonexはウイルスが細胞に侵入するのを防ぐとともに、ウイルスに感染した細胞から感染していない細胞へウイルスの拡散を阻止することができる。
【００６２】
ウイルス−細胞融合分析によると、Fusonexの融合抑制濃度は、T−20の20分の1である。従って、本発明のペプチドはHIV感染との闘いにおいてより効果的で、毒性はより低いはずである。高い安定性と効能のおかげで、本発明のペプチドはウイルス融合に対してT−20よりはるかに優れた阻害剤である。
【００６３】
Fusonexの抗ウイルス作用には、（限定はしないが）未感染のCD4+細胞やその他の細胞にHIVが広がるのを防ぐことが包含される。さらに、本発明の阻害剤の抗ウイルス作用には、宿主におけるいかなる免疫反応の誘出も必要ない。
【００６４】
本発明の阻害剤は、未感染細胞からヒト又はヒト以外のレトロウイルス（特にHIV）の伝播防止を含む膜融合抑制に関連するあらゆる生物学的分野に適用できる。本発明の好適な一実施形態によると、阻害剤Fusonexとその誘導体は、未感染のヒト又はヒト以外の細胞へのレトロウイルス（特にHIV）の伝播に対する阻害剤として使用することができる。
【００６５】
本発明の阻害剤はまた、巻かれたタンパク質ヘリックスの二次構造と関係のある細胞内部の生体作用を調節することもできる。本明細書で用いるとき、「調節する」とは、本発明のペプチドにより細胞内部の特定の生体作用の程度又は範囲を活性化もしくは抑制することを意味する（本発明のペプチドがない状況と比較して）。
【００６６】
本発明の阻害剤はまた、ウイルス融合抑制作用のある化合物、抗ウイルス化合物、細胞内での調節作用を有する化合物を特定するために用いることもできる。さらに、本発明のFusonexはまた、特定の生物学的ウイルスのタイプ、及び／又はウイルス亜型の診断にも適用できる。
【００６７】
本発明は新規な融合阻害剤Fusonexとその誘導体を提供する。本発明はまた、ウイルス感染、特にHIV感染の治療及び／又は予防において、他の抗ウィルス薬など、他の薬剤とFusonex又はその誘導体との共投与も提供する。これらの物質はウイルス融合阻害剤と同じ作用部位や機構を有してもよいし、有していなくてもよい。その結果、薬剤共投与によて、協同効果又は相乗効果を得ることができる。
【００６８】
本発明の一実施形態によると、Fusonex又はその誘導体は、（限定はしないが）同時投与、逐次投与、周期的投与、周期療法（例えば、ある抗ウイルス化合物を投与し、それから一定の期間内に第2の抗ウイルス化合物を投与し、この投与手順（即ち周期）を繰り返すことで、抗ウイルス療法で起こり得る薬物耐性を減少させる）を含む全てにおいて、他の薬剤と一緒に投与できる。
【００６９】
他の抗ウィルス薬とFusonex又はその誘導体との併用療法によって、有効服用量が減り、それによって抗ウイルス療法の毒性も低下させ得る新規な療法がもたらされる。さらに、薬剤の併用により、異なる機構を介して宿主細胞のウイルス感染を防ぐことができ、これは抗ウイルス有効性を高めるだけでなく、ウイルスがある療法のみに対する耐性を増加させることも防止する。従って、治療の成功率が上昇する。
【００７０】
本発明はまた、療法として、又はウイルス（特にHIV）感染の予防として、薬剤配合物及び調合物を提供する。この薬剤配合物は、有効量のFusonex又はその誘導体、少なくとも1つの他の薬剤、及び／又は薬理学的に許容されるベクターで構成される。
【００７１】
Fusonex又はその誘導体と併用される薬剤には、既知の、もしくは実験中のあらゆる薬剤が含まれる。本発明の好適な一実施形態によると、Fusonex又はその誘導体は、異なる機構を持つ他の薬剤とともに投与される。これらの薬剤には、（限定はしないが）サイトカインrIFNα、rIFNβ、...及びrIFNγ、...などの抗ウィルス薬；AZT、3TC、ddI、ddC、ネビラピン（Nevirapine）、アテビラピン（Atevirapine）、デラビルジン（Delavirdine）、PMEA、PMPA, ロビライド（loviride）、及びその他のジデオキシリボヌクレオシド又はフルオロジデオキシリボヌクレオシド、などの逆転写酵素阻害剤；サキナビル、リトナビル、インジナビル（Indinavir）、ネルフィナビル、及びVX−478などのウイルスプロテアーゼ阻害剤；ヒドロキシウレア；ウイルスリバビリン（viral ribovirin）などのウイルスmRNAキャッピング阻害剤；アンフォテリシンB；エステル結合の結合している抗ウイルス作用のあるカスタノスペルミン分子；糖タンパクプロセシング阻害剤；グリコシダーゼ阻害剤SC−48334及びMDL−28574；ウイルス吸収剤；CD4レセプタ遮断剤；ケモカインコレセプタ阻害剤；中和抗体；インテグラーゼ阻害剤及びその他の融合阻害剤、が含まれる。
【００７２】
従って、本発明は広範なウイルス（HIVを含む）感染の治療に対してより優れた抗ウイルス療法を提供する。さらに本発明は、Fusonex、その誘導体、少なくとも1つの異なる薬剤、及び／又は薬理学的に許容されるベクターの使用を含む、治療効果の向上を目的とする薬剤の共投与方法を提供する。それは、各療法のみに対してウイルスが耐性を高めるのを防ぐと同時に、薬剤の毒性を減少させ、治療係数を高めることができる。
【００７３】
本明細書で用いるとき、「ウイルス感染」とは、ウイルスが細胞に侵入する病的状態を指す。ウイルスが健康な細胞に侵入すると、宿主の繁殖メカニズムを利用して増殖し、最終的にその細胞を死滅させる。その細胞から出芽した後、それらの新たに形成された子孫ウイルスは、他の細胞に感染しつづける。ウイルス遺伝子の中には、プロウイルスの形態で宿主の染色体DNAと一体化することができるものもあり、これは潜伏感染と呼ばれる。このプロウイルスは宿主染色体の複製とともに増殖し、体内外の様々な要因により活性化された場合、感染者を病的状態に追いやる可能性がある。
【００７４】
本明細書で用いるとき、「ウイルス感染の治療又は予防」とは、ウイルスの複製及び拡散を抑制すること、宿主の中にウイルスが定住するのを防止すること、ウイルス感染が引き起こす症状を改善又は緩和することを意味する。有効な治療の指標には、ウイルス量の低下、死亡率の低下、及び／又は羅患率の低下などがある。
【００７５】
本明細書で用いるとき、「誘導体」とは、Fusonexの配列、同族体、類似体、又は一部を有しているか、又は1つ以上のアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失のある、Fusonexと同族の任意のペプチドを指す。
【００７６】
本明細書で用いるとき、「治療剤」とは、ウイルス感染又はウイルスが引き起こす病気の治療につながる任意の分子、化合物、又は薬剤、特に抗ウィルス薬を意味する。
【００７７】
本明細書で用いるとき、「共同作用」とは、ウイルス感染を治療又は予防するために、単に2つ以上の治療剤を用いる場合の累積作用よりも効果のある薬物共投与を意味する。共同作用は抗ウイルス薬の効果を高め、任意の1つの薬に対するウイルスの耐性を防止又は緩和することができる。
【００７８】
本願のペプチドは、ペプチド結合により2つ以上のアミノ酸が連結されている複合体である。ペプチドの名称は、それを構成するアミノ酸の数に関連している。例えば、ジペプチドは2つのアミノ酸残基を含んでおり、トリペプチドには3つが含まれている。10個以下のアミノ酸からなるペプチドはオリゴペプチドと呼ばれ、11個以上のアミノ酸を含むペプチドはポリペプチドと呼ばれる。
【００７９】
HIV及び他のウイルス感染の治療におけるFusonexの適用に関して、以下に説明する。
【００８０】
Fusonexは、抗ウイルス作用のあるポリペプチドである。本発明のペプチドには、Fusonex（gp41から抽出した、36個のアミノ酸からなるペプチド）、その一部、及び／又は類似物が包含される。これらのペプチドは、他のエンベロープウイルス中にも存在する。本発明のペプチドは、ヒトやその他の哺乳類のレトロウイルス、特にHIVの拡散を抑制することができる。
【００８１】
HIV及び他のウィルスは、感染時から２４時間１日中絶え間なく自身を複製する。従って、種々のウィルス感染段階において抗ウィルス薬を用いることが必要である。本発明はまた、ウィルス−細胞間融合及び細胞内でのウィルスの拡散を阻害するために、種々の抗ウィルス薬と組み合わせた当該ペプチドの共投与を提供する。
【００８２】
HIV感染の治療のための、Fusonexを含む薬剤の共投与に関して、以下に説明する。
【００８３】
Fusonexが作用する標的は、ウイルス表面の糖タンパクgp41である。Fusonexの機能メカニズムは、融合を阻害し、遊離ウイルスの顆粒が他の細胞に感染するのを防止したり、感染した細胞からウイルスが他の細胞に拡散するのを防ぐことである。
【００８４】
Fusonexを、他の標的を持つ1つ以上の異なる薬剤と共投与すると、累積作用あるいは共同作用を起こし得るものと考えられる。本発明は、Fusonex及びその誘導体を含む薬剤の共投与を提供する。薬剤の共投与により、有効服用量を減らすことができるだけでなく、抗ウイルス薬の毒性も低下させることができる。さらに、様々なメカニズムを介してウイルスを攻撃する効能が高まる。最後に、薬剤の共投与により、薬物耐性が発生する機会を防止又は低下させ得る。
【００８５】
本発明は、ヒトやその他の哺乳類のHIV感染のための治療方法を提供するものである。当該方法には、有効量のFusonex又はその誘導体と、望ましくは異なる抗ウイルス剤である少なくとも1つの薬剤を投与することが包含される。
【００８６】
本発明は、ウイルス感染（特にHIV感染）の治療のためのより良い方法を提供する。本発明はまた、HIV感染の治療のための薬剤配合物を提供し、当該薬剤配合物には有効量のFusonex又はその誘導体と、少なくとも1種類の異なる抗ウイルス化合物が含まれている。Fusonex及びその誘導体は、レトロウイルス阻害剤、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、サイトカイン、サイトカイン阻害剤、又はその他のウイルス融合阻害剤と一緒に使用することが望ましい。薬剤共投与は、ウイルスの複製と伝播を抑制するにあたり、より効果的となる。
【００８７】
本発明の方法には、Fusonex又はその誘導体のみの投与、Fusonex又はその誘導体と他の抗ウイルス薬との薬剤共投与が包含される。Fusonexと少なくとも1つの他の薬剤を同時に（混合しても別々に投与してもよい）、又は逐次的に（周期療法を含む）投与することができる。周期療法では、ある特定の時期に患者に抗ウイルス化合物を投与し、その後の別の時期に第2の抗ウイルス化合物を投与する。この投与順序（即ち周期）を繰り返して当該治療における毒性と薬物耐性を緩和させる。
【００８８】
本発明は、本発明のペプチドを最初に投与し、次に他の抗ウイルス薬を投与し、それからまた本発明のペプチド又は他のウイルス融合阻害剤を投与する、別の周期療法も提供する。従って、本発明の阻害剤又はその誘導体は、他の抗ウイルス薬と一緒に投与される。
【００８９】
「共投与」には、合剤療法として2つ以上の治療剤を使用することに加え、2つ以上の治療剤を同時にではあるが別々に使用することも包含される。例えば、1人の患者の異なる血管に投与するケースなどがある。「共投与」にはまた、薬物の順次投与、即ちある薬剤を投与した後に第2の薬剤を投与すること、も包含される。
【００９０】
Fusonexとの併用に好適な抗ウイルス薬は、以下の種々の形態でウイルスを攻撃することができる。逆転写酵素の阻害、ウイルスmRNAのキャッピング抑制、HIVプロテアーゼの阻害、タンパク質のグリコシル化阻害、インテグラーゼ阻害、及びウイルス融合の抑制、である。これらの攻撃形態に基づく薬剤には、（限定はしないが）rIFNα、rIFNβ、rIFNγを含むサイトカインなどの抗ウイルス薬；サイトカイン阻害剤；AZT, 3TC, ddI, ddC, d4T, ネビラピン（Nevirapine）、アテビラピン（Atevirapine）、デラビルジン（Delavirdine）、PMEA、 PMPA、ロビライド（loviride）、及びその他のジデオキシリボヌクレオシド又はフルオロジデオキシリボヌクレオシドなどの逆転写酵素阻害剤；サキナビル、リトナビル、インジナビル（Indinavir）、ネルフィナビル、VX−478などのウイルスプロテアーゼ阻害剤；SC−48334やMDL−28574などのグリコシダーゼ阻害剤；リバビリン（ribovirin）などのウイルスmRNAキャッピング阻害剤；アンフォテリシンB；抗ウイルス作用を持つ、エステル結合の結合分子カスタノスペルミン；ヒドロキシウレア；糖タンパクプロセシング阻害剤；グリコシダーゼ阻害剤SC−48334及びMDL−28574；ウイルス吸収剤；CD4レセプタ遮断薬；ケモカインコレセプタ阻害剤；中和抗体；インテグラーゼ阻害剤及びその他の融合阻害剤、が含まれる。
【００９１】
ポリペプチドFusonexの構造を、以下に説明する。
【００９２】
Fusonexペプチドは、HIV感染を抑制することができる非常に有効な融合阻害剤である。おそらくこれはFusonexがgp41とウイルスエンベロープ上で結びつき、ウイルスによる融合プロセスを阻害し得るためである。例えば、ウイルスタンパク質gp41の自然構造から融合構造への変化において、Fusonexはウイルスgp41の結合サイトを得るために競い合うことができ、その結果ウイルスと細胞との融合プロセスを無効にすることができる。
【００９３】
本発明のペプチドであるFusonexは、HIV−1膜貫通型タンパク質gp41のアミノ酸残基117−151から抽出され、３６個のアミノ酸から構成される。アミノ末端からカルボキシ末端までを読み取ると、Fusonexは次のようなアミノ酸配列を有する。
X−SWETWEREIENYTKQIYKILEESQEQQDRNEKDLLE−Z (SEQ ID NO.: 1)
【００９４】
さらに、本発明はまた、抗ウイルス作用を示すFusonexペプチド（SEQ ID NO.: 1）の一部も提供する。これらの切断されたFusonexペプチドは、4〜36個のアミノ酸を含んでいる（即ち、テトラペプチドから36アミノ酸ペプチドまで）。
【００９５】
「X」はアミノ基又は−X1−X2であり、ここでX1はイミノ基、X2は、（限定はしないが）カルボベンゾキシ、ダンシル、tert−ブチロキシカルボニル基、アセチル、及び9−フルオレニルメチルオキシカルボニル（FMOC）を始めとする疎水基、又は（限定はしないが）脂質−脂肪酸キレート、ポリエチレングリコール、炭水化物を始めとする共有結合した高分子ベクター基である。
【００９６】
Zはカルボキシ基又は−Z1−Z2であり、ここでZ1はカルボニル基、Z2はアミノ基、tert−ブチロキシカルボニル基、又は（限定はしないが）脂質−脂肪酸キレート、ポリエチレングリコール、糖質を始めとする高分子ベクター基である。
【００９７】
Fusonex及び切断されたFusonexに加え、本発明の阻害剤は、SEQ ID NO.: 1のペプチド、又は1つ以上のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失のあるSEQ ID NO.: 1のペプチドとすることができる。アミノ酸挿入物は、1つのアミノ酸残基又は2〜15個のアミノ酸からなる残基部分により構成することができる。1つ以上の挿入物を、Fusonex及びその一部、類似物、及び／又は同族体に取り込むことができる。
【００９８】
さらに、本発明の阻害剤には、Fusonex（SEQ ID NO.: 1）の同族体、Fusonex同族体の類似物、及び／又は抗ウイルス作用を示すFusonexの一部が包含される。本発明の阻害剤には、Fusonex、Fusonexの一部、Fusonexの類似物、切断されたFusonex同族体が包含される。これらの切断されたFusonexは、1つ以上のアミノ酸が取り除かれているFusonexペプチド配列から構成されており、得られるペプチドは最低4〜6個のアミノ酸を含んでいる。これらの切断されたFusonexには、上記ペプチド配列の１つの隣接部、又はより多くの未結合部が含まれることがある。
【００９９】
本発明の一実施形態によると、アミノ酸置換体は保護特性を有する。保護特性を持つアミノ酸置換体は、Fusonex（SEQ ID NO.: 1）ペプチド配列において、それらが取って代わるアミノ酸（1つ以上）に類似の電荷、サイズ、及び／又は疎水特性をもつアミノ酸からなる。
【０１００】
抗ウイルス薬とFusonexとの共投与に関して、以下に説明する。
【０１０１】
本発明の融合阻害剤は、その抗ウイルス効能を高めるために他の治療剤と一緒に投与することができる。本発明の好適な一実施形態によると、Fusonexは、（限定はしないが）逆転写酵素阻害剤、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、グリコシル化阻害剤などのような、ウイルス複製の全過程において異なる標的に作用する薬剤；ウイルス拡散の全過程において異なる標的に作用する抗ウイルス薬；同一分子の異なる部位に作用する抗ウイルス薬；薬物耐性の発生を防止又は削減することのできる抗ウイルス薬を含む、他の抗ウイルス薬とともに投与される。共投与の作用メカニズムと利点は、当分野のあらゆる科学的、技術的関係者が把握しておくべきである。
【０１０２】
本発明の阻害剤は、（限定はしないが）ヌクレオシド誘導体を含むレトロウイルス阻害剤と共に投与することができる。当該ヌクレオシド誘導体は、プリンヌクレオシド及びピリミジンヌクレオシドの改良誘導体である。これらの作用メカニズムは、RNAとDNAが合成されるのを防ぐものである。他のヌクレオシドに結合し得る3'置換基をもたない当該ヌクレオシド誘導体は、逆転写酵素の媒介によるcDNAの合成を抑制でき、それによってウイルスのDNA複製を停止させ得る。これが抗HIV治療剤となった理由である。例えば、AZT及びddTは、両方ともHIV−1の複製をin vivo及びin vitroにおいて抑制でき、HIV感染及びAIDSの治療薬として承認されている。しかし、治療にこれらの薬剤を使用することは、多くの副作用に加え、薬品耐性HIV株の大量繁殖を引き起こす可能性がある。
【０１０３】
本発明の阻害剤は、ヌクレオシド誘導体及び非ヌクレオシド誘導体と併用して投与できる。当該ヌクレオシド誘導体には、（限定はしないが）2', 3'−ジデオキシアデノシン（ddA）、2', 3'−ジデオキシグアノシン（ddG）、2', 3'−ジデオキシイノシン（ddI）、2', 3'−ジデオキシシチジン（ddC）、2', 3'−ジデオキシチミジン（ddT）、2', 3'−ジデオキシ−ジデオキシチミジン（d4T）、3'−アジド2', 3'−ジデオキシシチジン（AZT）が含まれる。本発明の一実施形態によると、当該ヌクレオシド誘導体はハロヌクレオシドであり、好ましくは、（限定はしないが）2', 3'−ジデオキシ−2'−フルオロアデノシン、2', 3'−ジデオキシ−2'−フルオロイノシン、2', 3'−ジデオキシ−2'−フルオロチミジン、2', 3'−ジデオキシ−2'−フルオロシチジンを始めとする2', 3'−ジデオキシ−2'−フルオロヌクレオチド、（限定はしないが）2', 3'−ジデオキシ−2', 3'−ジデヒドロ−2'−フルオロチミジン（Fd4T）を始めとする2', 3'−ジデオキシ−2', 3'−ジデヒドロ−2'−フルオロヌクレオチドが含まれる。より好ましくは、当該ヌクレオシド誘導体は、（限定はしないが）2', 3'−ジデオキシ−2'β−フルオロアデノシン（F−ddA）、2', 3'−ジデオキシ−2' β−フルオロイノシン（F−ddI）、2', 3'−ジデオキシ−2' β−フロオロシチジン（F−ddC）を始めとする、フッ素結合がβ型配座をとっている2', 3'−ジデオキシ−2'−フルオロヌクレオチドである。薬剤共投与により、ヌクレオシド誘導体の服用量を削減することができ、そのため抗ウイルス作用を維持しつつ毒性及びウイルスの薬物耐性を低下させることができる。
【０１０４】
本発明の好適な一実施形態によると、HIV感染治療のための、抗ウイルスペプチドとヌクレオチド誘導体の組み合わせには、有効服用量のFusonex又はその誘導体と、有効服用量のAZT、ddC、及び／又はd4Tが包含される。より好適な薬剤の組み合わせには、（限定はしないが）有効服用量のFusonex又はその誘導体と、ddT、及び／又は有効服用量の3TC、ビラミューン（Viramune）、レスクリプター（Rescriptor）、サスティバ（Sustiva）、ロビライド（Loviride）、ネビラピン（Nevirapine）、及びアテビルジン（Atevirdine）との組合せが包含される。
【０１０５】
Fusonex又はその誘導体はまた、（限定はしないが）ベンジルアシクロウリジン（BAU）、ベンゾキシベンジルアシクロウリジン（BBAU）、アメトベンジルアシクロウリジン（amethobezylacyclouridine）（AMBAU）、アメトベンゾキシベンジルアシクロウリジン（AMB−BAU）、ヒドロキシメチルベンジルアシクロウリジン（HMBAU）、ヒドロキシメチルベンゾキシベンジルアシクロウリジン（HMBAU）を始めとするアシクロウリジン化合物を含む、ウリジンリン酸化酵素の阻害剤と一緒に投与することもできる。
【０１０６】
Fusonex又はその誘導体はまた、（限定はしないが）rIFNα、rIFNβ、…rIFNγ、TNFα阻害剤、MNX−160、ヒトrインターフェロンαA、ヒトrインターフェロンβ、ヒトrインターフェロンγを始めとするサイトカインもしくはサイトカイン阻害剤と一緒に投与することができる。より好適な薬剤の共投与として、Fusonex又はその誘導体と有効量のβインターフェロンの組合せが挙げられる。
【０１０７】
プロテアーゼ阻害剤は、主にウイルスの集合時もしくは集合時後（即ちウイルスの出芽時）にウイルスが成長するのを防ぐ。プロテアーゼ阻害剤は、in vivo及びin vitroの両方において抗ウイルス作用を示す。プロテアーゼ阻害剤を投与した後、AIDS患者のHIVレベルは急激に減少し、彼らのCD4リンパ球の数は増加した（Deeks他、1997, JAMA 277:145−53）。ウイルス逆転写酵素阻害剤と融合阻害剤Fusonexの共投与は相乗効果を生み、満足のいく臨床結果をもたらす。本発明は、HIV感染を治療する方法を提供し、それは有効量のFusonex又はその誘導体と有効量のプロテアーゼ阻害剤との共投与であり、後者には（限定はしないが）インジナビル（Indinavir）、インビラーゼ（Invirase）、ノルビル（Norvir）、ビラセプト（Viracept）、アジェネラーゼ（Agenerase）が含まれる。
【０１０８】
Fusonex又はその誘導体はまた、ビラゾールなどの5'−mRNAのプロセシングを阻害する抗HIV薬と共投与することもできる。ビラゾールの機能メカニズムはまだ分かっていないが、グアニンと競ってmRNAキャップ構造を形成し、及び／又はこれらの分子のメチル化を阻害すると推測されている。Fusonexとビラゾールの間にはおそらく共同作用があると思われる。
【０１０９】
さらに、Fusonex又はその誘導体は、アンフォテリシンBと共投与することもできる。アンフォテリシンBは、ステロールと不可逆的に結合できるポリエン抗真菌性抗生物質である。アンフォテリシンB及びそのギ酸塩は、HIVを含む多くの脂質エンベロープウイルスに対して抑制効果がある。アンフォテリシンBはヒトの体に対して重度の毒性を持つが、そのギ酸塩ははるかに毒性が低い。従って、アンフォテリシンB又はそのギ酸塩はFusonex又はその誘導体とともに投与し、抗ウイルス共同効果を生み出すことができるので、臨床医師たちは抗ウイルス作用を損なうことなくアンフォテリシンB又はそのギ酸塩を低用量で使用することができる。
【０１１０】
Fusonex又はその誘導体は、糖タンパクプロセシングを抑制できる植物性アルカロイドである糖タンパクプロセシング阻害剤カスタノスペルミンと共投与することもできる。HIVエンベロープには2つの大きな糖タンパクgp120及びgp41が含まれている。タンパク質のグリコシル化は、gp120とCD4との相互作用において重要な役割を果たしている。カスタノスペルミン存在下で合成された子孫ウイルスの伝染力は親ウイルスより弱い。Fusonex又はその誘導体とカスタノスペルミンとの共投与は相乗効果をもたらすことができる。
【０１１１】
Fusonex又はその誘導体と上記抗ウイルス治療剤との共投与による治療効果は、当分野で一般に使われている方法で評価することができる。例えば、FusonexとAZTの配合効果は、（限定はしないが）細胞に対するHIV毒性の抑制、合胞体（synplasm）形成の阻害、逆転写酵素の作用の阻害、又はRNAもしくはタンパク質合成などを行うウイルスの能力の阻害を始めとする種々のin vitroでの実験を通して検証することができる。
【０１１２】
投与処方、投与量、投与手段に関して、以下に説明する。初めに薬剤の配合に関して説明する。
【０１１３】
本発明が提供するFusonex又はその誘導体と少なくとも1つの他の治療剤との組み合わせは、ヒト又はヒト以外のウイルス感染治療もしくは予防に利用することができる。本発明が提供する薬剤の共投与は、累積効果／共同効果をもたらすことができる。
【０１１４】
望ましい薬剤の組み合わせは、Fusonex又はその誘導体と、逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、mRNAプロセシング阻害剤、タンパク質グリコシル化阻害剤、ウィルス吸収剤、CD4レセプタ阻害剤、ケモカインコレセプタ阻害剤、中和抗体、インテグラーゼ阻害剤、（限定はしないが）スクレオシド類似体又は連鎖停止剤を始めとする他の融合阻害剤、ケモカインコレセプタ阻害剤AMD−3100（Tremblay, C. L.他、2000, J. AIDS 1:25(2)99−10）などの少なくとも1つの他の抗ウイルス薬とを含有している。
【０１１５】
本発明の一実施形態によると、Fusonex又はその誘導体と共投与できる治療剤として、（限定はしないが）2−デオキシ−D−グルコース（2dGlc）、デオキシノジリマイシンアシクログアノシン（deoxynojirimycinacycloguanosine）、ビラゾール（virazole）、リファジン（rifadin）、アダマンタナミン（adamantanamine）、リファブチン（rifabutine）、ガンシクロビル（ganciclover）（DHPG）、ファムシクロビル（famciclove）、ブシクロビル（buciclover）（DHBG）、フルオロヨードアラシトシン（fluoroiodearacytosine）、ヨードクスウリジン（iodoxuridine）、トリフルオロチミジン、ビダラビン（ara−A）、ara−AMP、ブロモビニルデオキシウリジン、ソリブジン（BV−arau）、l−b−D−グリコアラビノフラノシド−E−5−[2−ブロモビニル]ウラシル、アダマントエチルアミン（adamantethylamine）、ヒドロキシウレア、フェニル酢酸ヘプタンジオン（phenylacetic heptanedione）、ジアリルアミジン、(S) − (ρ−ニトロベンジル) −6−チオイノシン、フォスカネット（phosphonoformate）が挙げられる。本発明は、Fusonex又はその誘導体と、任意の上記化合物との薬剤配合物を提供する。
【０１１６】
さらに、本発明のペプチドはまた、HIVにさらされたがまだそれに感染していない人のための予防措置としても使用できる。このような予防措置の例には、（限定はしないが）ウイルスの母子間感染の予防、及びHIVに感染した血液、血液製剤、体液を扱う医療労働者の医療事故など他の状況におけるHIV感染の予防、が含まれる。これらの場合においては、本発明のペプチドを予防ワクチンとして使用することができる。本発明のペプチドで予防接種をすることにより、宿主はHIV感染を阻止し、HIVウイルスを中和する抗体を生み出す。
【０１１７】
本発明は、予防ワクチン接種概要を提供し、それは、HIVを中和する、例えばHIV感染を抑制する細胞の能力を発達させる、のに十分な免疫反応を引き出すために効果的な濃度で当該ペプチドを宿主に投与することを包含する。引き出された免疫反応は、当分野で周知の標準的な技術により検出することができる。本発明の一実施形態によると、ワクチンとして使用されるペプチドは筋肉注射により投与される。
【０１１８】
免疫反応を高めるために、本発明のペプチドは、（限定はしないが）水酸化アルミニウムなどの鉱物性ゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プロニック（Puronic）多価アルコール、ポリアニオン、その他のペプチド、油乳化剤、カルメット・ゲラン菌（BCG）やコリネ型菌などの人間が使う添加物を始めとする、いくつかの適切なアジュバントと共に投与することができる。上記ワクチンの投与経路として、（限定はしないが）経口、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、下皮、鼻腔内といった経路が挙げられる。
【０１１９】
Fusonexの投与量に関して、以下に説明する。
【０１２０】
ヒトなど哺乳類の急性ウイルス感染の治療には、ウイルスの複製を抑制するのに十分な有効量でFusonex又はその誘導体を投与すべきである。当該有効量は、生物学的半減期、生体利用効率、毒性などのパラメータを設定することを始めとする、一般に当業者には既知の方法で決定することができる。例として、Fusonexを1日につき0.2−10.0mg/kgずつ4〜52週間続けて注射することができる。望ましい用量は1日につき20mg〜200mgで、最も好適な用量は1日につき30mg〜80mgであり、投与期間は約52週間である。
【０１２１】
Fusonex又はその誘導体の投与間隔は、約2日〜1/4日の範囲であり、1日〜1/2日が最適である。最適な用量を投与すると、Fusonex又はその誘導体は、血漿中のピーク濃度1mg/ml〜10mg/mlを得られる。Fusonexの血中濃度は、以下のように決定することができる。適切な緩衝生理食塩水にFusonexが20％含まれる無菌注射を作り、継続的に注射した後にHPLCを用いて血中濃度を測定する。
【０１２２】
Fusonex又はその誘導体と共投与される際の、抗ウイルス薬などの治療剤の有効量は、当分野で周知の様々な抗ウイルス薬の推奨用量に基づいて決定することができる。共投与のための好適な用量は、個別投与のための文献推奨用量より、約10%〜50%少ない。医療専門家は、毒性反応が起こり始める用量に注意すべきである。骨髄、肝臓、及び／又は腎臓機能が損なわれた場合、又は深刻な薬物間相互作用が起きた場合、医師はどのように、いつ投与を保留又は停止するか、用量を減らすかを知っておくべきである。また、予想した臨床治療結果が得られない場合、医師はどのように用量を増やすかも知っておくべきである。
【０１２３】
効果的な治療用量とは、薬剤配合物によって、患者の状態が改善するか、又は生存期間が延長されるのに十分であるときの用量を意味する。この種の薬剤の毒性及び治療効果は、細胞培養又は動物実験という標準的な薬理学的方法によって決定することができる。例えば、当該方法は、中程度の致死量（LD50、実験コロニーの50％が死んだ量）と中程度の有効量（ED50、実験コロニーの50％が治癒した量）とを決定することである。治癒能力対毒性の比が治療係数であり、LD50／ED50と表すことができる。治療係数が高いほど、その化合物は良いということになる。細胞及び動物実験で得られた統計は、ヒトの用量範囲を推測するのに使用することができる。この種の化合物の用量は、特定の範囲の血中濃度、即ち、無毒もしくは低毒性でありつつED50よりも多いのが最適であり、こうして投与調合剤及び投与経路に応じて調節することができる。これらのデータに基づき、ヒトに使用する場合の用量を正確に決定できる。血漿中の薬物濃度はHPLCを用いて計測することができる。
【０１２４】
投与調合剤及び投与経路を以下に説明する。
【０１２５】
ウイルス感染、特にHIV感染治療のための投薬量を得るため、Fusonexもしくはその誘導体を含む薬剤配合物、又はある適切な担体もしくは賦形剤と共にFusonexもしくはその誘導体を含む薬剤配合物混合物を直に患者に投与する。本適用における調合剤及び投与技術は当業者には周知のものである。
【０１２６】
本発明のペプチドの抗ウイルス作用は、特定のペプチドが特定のウイルスのみを阻害するという亜型特異性を示すことができる。本発明のペプチドは、HIV−1に対して最も敏感で、そのような利点を診断試薬の分野に活用できる。例えば、このペプチドの抗HIV−1特異性は、特定の分離ウイルス株（HIV−1又はHIV−2）の種類を特定するのに使用することができる。例えば、Fusonexペプチドの存在下、未感染分離CD4+細胞を未知のウイルス株により感染させた後、その細胞を培養しつづける。その後、細胞浮遊物のレトロウイルス作用を検査し、もし当該作用が完全に抑制されていれば、このウイルス株はHIV−1ということになる。もし抑制されていない場合、又は僅かしか抑制されていない場合には、このウイルス株はおそらくHIV−1ではない。
【０１２７】
本発明はまた、本発明のペプチド及び／又は薬剤配合物に基づく系統的投与に用いる適切な投与調合剤を調合するための薬理学的に好ましい担体の使用を包含する。適切な担体と調合剤を用いることで、本発明のペプチド又は配合物、特に溶液として調合された配合物を、静脈注射を含むがこれに限定されない消化管外経路で投与することができる。本発明のペプチド又は配合物は、この分野では周知の薬理学的に好ましい担体を使用し、経口投与に適した溶液として調合することもできる。ペプチド又は配合物をタブレットやピル、カプセル、液体、ジェル、シロップ、スラリー、懸濁液、その他の投与調合剤に調合するには、適切な担体が必要である。
【０１２８】
本発明のペプチド及び薬剤配合物は、（限定はしないが）経口、直腸、透析膜、又は腸内投与；筋内、下皮、髄内、鞘内、直接心室内、静脈、腹腔内、鼻腔内、又は眼内を始めとする消化管外投与；経皮、局部、膣内投与などを含む、当業者には周知の経路によって投与することができる。投与調合剤として、（限定はしないが）タブレット、トローチ、粉末、懸濁液、坐剤、液剤、カプセル、糖衣、膏薬、マイクロモータ（micro−motor）が挙げられる。便宜上、本発明の薬剤配合物は、機械的な方法によって、1つ以上の生理学的に許容される担体を用いて、薬理学的に許容される任意の調合剤にすることができる。作用化合物の処理を助けるため、本発明の薬剤配合物に1つ以上の賦形剤及びアジュバントを含ませ得る。注射を容易に行うため、本発明のペプチド又は薬剤配合物は液剤、例えば生理食塩水として調合することができる。透析膜投与の場合、障壁を貫通する浸透剤を使用すべきであり、これらの浸透剤は当分野で一般に知られているはずである。
【０１２９】
本発明のペプチド又は薬剤配合物の経口投与調合剤は、固形賦形剤と一緒にすり潰して十分に分散した混合物とし、次いでそれを顆粒化しタブレット又は糖衣錠の核へと加工する。必要であれば、適切なアジュバントを当該混合物に加える。適切な賦形剤及び充填剤として、ラクトース、サッカロース、マンニトール、あるいはソルビコラン（sorbicolan）などの糖；コーンスターチ、小麦スターチ、米スターチ、片栗粉、グルテン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドンなどのフィブリン製品を使用できる。必要であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩などの錠剤分解物質も使用する。糖衣タブレットの核には適切なコーティングを施す必要がある。当該コーティングは、アラビアゴム、タルカム、ポリビニルピロリドン、カルボポルジェル、ポリエチレングリコール、酸化チタン、硝酸セルロース、及び適切な有機溶剤又は溶剤配合物を含有する濃縮砂糖溶液から作ることができる。作用化合物を識別又は示すために、タブレット又は糖衣タブレットのコーティングに種々の着色剤又は食用色素の配合物を加えることができる。
【０１３０】
経口投与用の投与調合剤には、グルテン及び例えばグリセリンやソルビン酸などの可塑剤からなる充填タイプのカプセル又は密封したソフトカプセルがある。充填タイプのカプセルには、ラクトースなどの充填剤、スターチなどの接着剤、及び／又はタルカムやステアレートなどの滑剤が含まれている。さらに、作用化合物を安定化させるために安定剤もまた使用することができる。ソフトカプセルに関しては、有効化合物を、脂肪油、液体オレフィン、あるいは液体状ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解又は懸濁させることができる。さらに安定剤を加えることもできる。経口投与用の全ての投与調合剤は、患者にとって便利であるべきである。実際の投与の場合には、上記薬剤配合物を、便利なトローチ投与調合剤に調合することができる。
【０１３１】
吸入投与の場合では、高圧パッケージもしくはアトマイザーを使用して、又はジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素もしくは他の適切なガスなどのいくつかの適切な圧縮不活性ガスを使用して、本発明のペプチド又は配合物をエアロゾルとして容易に放出することができる。高圧エアロゾルの場合、1つのバルブの計測放出量により投与量を定めることができる。グルテンカプセル、及び吸入器、吐出器として使用されるカートリッジは、ペプチド及び適切な粉末状の基質（ラクトースあるいはスターチなど）を含有する混合物として製造することができる。
【０１３２】
本発明のペプチド又は配合物は、消化管外投与用の投与調合剤に調合することができる。例えば、クラスター薬剤注射又は持続静注を始めとする注射用調合剤に調合することができる。注射用途のための調合物は、単位投与量の形態で包装できる。例えば、アンプルにそれを入れることができる。多量の調合剤もまた、アンプルや大用量容器に単位の形態で包装し、防腐剤を加えることができる。本発明の配合物は、油又は水を溶媒として懸濁液、溶液もしくは乳濁液という形態を取ることができ、懸濁剤、安定剤、及び／又は分散剤などの添加剤を含み得る。
【０１３３】
消化管外投与用の投与調合剤は、作用成分の水溶液、即ち水に溶解した形態とすることができる。作用成分の懸濁液も、適切な油状懸濁注射液として調合することができる。適切な親油性溶媒又はベクターとして、ギンゲリ油（gingeli oil）などの脂肪油、又はオレイン酸エチル、トリグルセリド、リポソームなどの合成脂肪酸エステルが挙げられる。注射用の水に似た懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビン酸アルコール、グルコサンなどの、懸濁液の粘性を高める物質を含むことができる。高濃度の溶液を調製するために、化合物の溶解度を高める適切な安定剤もしくは基質を上記懸濁液に含有させることができる。投与前に、粉末注射剤の作用成分を、ピレトゲン（pyretogen）のない注射剤用無菌水などの適切な溶媒に溶解させることができる。
【０１３４】
本発明のペプチド又は配合物は、坐剤又は持続浣腸などの直腸投与調合剤に調合することができる。カカオバターやその他のグリセリルエステルなどのよく使用される基質を用いて調合することができる。
【０１３５】
説明した投与調合剤の他に、当該ペプチド又は薬剤配合物は、下皮、筋内植付もしくは筋内注射にて投与できる長時間作用型の投与調合剤として調合することもできる。従って、当該ペプチド及びその誘導体あるいは薬剤配合物を適切なポリマー、疎水性物質（例えば油エマルジョンなど）、イオン交換クロマトグラフィー、又は難溶性塩などの難溶性誘導体を用いて調合することができる。
【０１３６】
本発明の疎水性ペプチド又は配合物用の薬物担体は、有機ポリマーと、水と溶け合う水相との共溶解システムであり、ベンジルアルコール及び非極性界面活性剤を含んでいる。当該共溶解システムは、VPD共溶解システムになりうる。VPDは、3％（W/V）のベンジルアルコール、8％（W/V）の非極性界面活性剤マルチエトキシアエーテル（multiethoxyaeter）、65％（W/V）のポリエチレングリコール300含有無水アルコールを含有している溶液であり、VPD共溶解システム（VPD:5W）は水に1対1の割合で薄めたVPDと5％のグルコースを用いて調製される。この種の共溶解システムは、全身投与において低毒性でありつつ、疎水性物質をより十分に溶解させる。その溶解度及び毒性が変化しない限り、共溶解システムの割合を大きく変えることができる。さらに、共溶解システムの構成要素もまた、変えることができる。例えば、低毒性の他の非極性界面活性剤を、マルチエトキシアエーテルの代わりに使用することができる。ポリエチレングリコールの割合も変えることができる。ポリビニルピロリドンなど、他の生物学的に混合するポリマーを、ポリエチレンの代わりにすることができる。他の糖やポリオーズ（polyose）を、グルコースの代わりに使用できる。
【０１３７】
薬剤配合物には、固相もしくはゲル相の賦形剤のような適切な担体も含まれ得る。これらの担体又は賦形剤として、（限定はしないが）炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、スターチ、セルロース誘導体、ゼラチン、あるいはポリエチレングリコールのようなポリマーが挙げられる。本発明の薬剤配合物にはまた、治療効果を得るために使用される有効量の作用成分の配合物も含まれる。有効量を決定する方法は、当分野において周知である。
【０１３８】
本発明のペプチドの使用に関して、以下に説明する。
【０１３９】
Fusonexペプチド（SEQ ID NO.: 1）は、効果的な抗ウイルス作用を示す。その結果、当該ペプチド又はその誘導体は、ヒトの、及びヒト意外のレトロウイルス阻害剤、特にHIV阻害剤として使用することができ、未感染の細胞にウイルスが拡散するのを防ぐことができる。
【０１４０】
本発明のペプチドは、（限定はしないが）HIV−1及びHIV−2株、ヒトT−リンパ球（HTLV−及びHTLV−II）を始めとするヒトレトロウイルスの拡散を抑制するために使用することができる。本発明のペプチドはまた、（限定はしないが）ウシ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ロイコウイルス、サル免疫不全ウイルス、白血病ウイルス、白血球ウイルス、ヒツジ進行性肺炎を始めとするヒト以外のレトロウイルスの拡散抑制にも使用することができる。
【０１４１】
本発明のペプチドはまた、おそらく、（限定はしないが）ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ジステンパーウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、及びインフルエンザウイルスを始めとする他のレトロウイルス及び／又は非レトロウイルスの拡散も抑制すると考えられる。
【０１４２】
さらに、本発明は上記レトロウイルスや非レトロウイルスによって引き起こされる病気を治療するための薬剤共投与における当該ペプチドの使用法も提供する。
【０１４３】
HIV抑制のための共投与における使用法について、以下に説明する。
【０１４４】
本発明は、Fusonexと他の治療剤との共投与を提供する。薬剤共投与により、合胞体の形成及びHIVの複製を防ぐことができ、患者の体内におけるHIVの繁殖を抑制できる。本発明の共投与はまた、HIV感染に関連した疾病を緩和又は治療するためにも使用することができる。例えば、HBV、EBV、CMV感染やその他の不慮の感染（TBを含む）を抑制するため、抗ウイルスペプチドFusonex又はその誘導体を抗真菌剤、抗生物質、その他の抗ウイルス薬と一緒に投与することができる。
【０１４５】
Fusonex又はその誘導体の最良の使用法は、HIV感染を抑制することである。共投与の有効量は、以下の方法に基づいて得ることができる。例えば、適切な担体中で薬剤を調合し、それを（限定はしないが）注射（静脈、腹腔内、筋内、下皮注射などのような）；口の粘膜、直腸、膣内上皮、咽頭鼻粘膜、腸内粘膜などの上皮又は粘膜吸収；経口；経皮又はその他の薬理学的に実現可能な経路を始めとする任意の適切な経路によって投与する。
【０１４６】
当分野の既存の薬剤と比較して、本発明のペプチドには次の利点がある。HIV粘膜融合抑制における大幅に改善された効能、より十分な安定性とより高い力価、である。効能が向上しており、投与量を削減できるので副作用も減る。
【０１４７】
本発明を例示する実施例を以下に示す。
【実施例１】
【０１４８】
実施例 1 ： Fusonex の製造及び精製
Fusonexは、431A型のバイオシステムポリペプチド合成装置を用いて合成した。この合成にはFast−Moc化学法を用い、標準的な固相合成技術を利用して、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル（FMOC）により保護されているアミノ酸を用いた。試薬には、TFA、水、5％硫化アニシル、2.5％ethylen disulfhydrate、及び0.8Mフェニルフェノール結晶が含まれる。
【０１４９】
Fusonexの生物学的半減期を延長するため、アミノ末端をアセチル化し、カルボキシ末端をアミド化した。当該ペプチドを、装置上の樹脂から自動的に解離させ、側鎖の大きい基は自動的に除去された。樹脂から解離して、未精製のFusonexペプチドを、容積にして4倍の冷えたエーテル中で20分間沈殿させた。遠心分離後、ペプチドを冷えたエーテル中で2度洗浄し、次いで24時間乾燥させた。
【０１５０】
未精製のFusonexペプチドをHPLCにより精製した。C18カラム（15μm 球形充填剤）を用いて、0.1％TFAを含有する水／アセトニトリル中でリニア溶離を実施した。精製されたFusonexペプチドの純度は分析HPLCにより計測したが、95％よりも高かった。最後に、Fusonexをアミノ酸配列と電子ジェット（electron jet）質量スペクトルにより確認した。精製したFusonexの分子量は、4641.24Dであった。
【実施例２】
【０１５１】
例 2 ： Fusonex の溶離実験
Fusonexの溶離実験に使用した方法は次の通りである。
【０１５２】
Superdex75クロマトグラフィーカラムを用いて、過剰のFusonex及びFusonexとgp41 Nペプチド（35−70）との複合体を溶離させた。溶離剤にはリン酸緩衝液を用いた。曲線を得るための全回収量は30mlであった。結果に基づいて、溶離プロファイル（図2）を作成し、Fusonexとgp41ペプチド（35−70）との複合体の溶離ピークは13.2ml位置にあり、Fusonex自体の溶離ピークは17.3ml位置にあることが判明した。
【実施例３】
【０１５３】
例 3 ： gp41 N ペプチドと複合化している Fusonex の構造決定
円偏光二色性スペクトルを用いて、gp41 Nペプチドと複合化しているFusonexの構造を決定した。まず、0.1M NaCl/20mMリン酸カリウム中で試料を25μM、pH7.4に希釈し、その後gp41 Nペプチドと複合化しているFusonexの二次構造をCDスペクトルにより決定した。分析は、Aviv 62A DS円偏光二色性スペクトル装置を用いて実施した。Fusonexとgp41 Nペプチド（35−70）とを含んだペプチド溶液を、200−260nmの波長帯内で計測した。
【０１５４】
円偏光二色性スペクトルの条件は、20℃、円偏光のbreathは1.5nmで、ステップは0.5nm、時定数は2.0秒、光セル長は10mmであった。3段階の多項式（three−level polynomial）を使用して、ブランクデータを修正した。試料温度は熱電ホルダーで維持し、誤差範囲は1℃以内であった。
【０１５５】
結果を、円偏光二色性（CD）スペクトル（図3）に示した。図3によると、Fusonexとgp41 Nペプチド（35−70）との複合体の二次構造は、100％α−ヘリックスであった。度数（θ）をスペクトルY軸の楕円率の単位として使用した。その楕円率θは、222nmにおいて約−40,000/度cm2 dmol− 1（図3）であった。
【実施例４】
【０１５６】
例 4 ： Fusonex 及び T − 20 の安定性の検証
本実験では、種々の温度におけるその溶解曲線を評価してポリペプチドの安定性を決定した。本実験は、Aviv 62A DS円偏光二色性スペクトル装置を用いて実施した。ペプチド溶液を加熱する温度範囲は、20℃〜95℃とした。
【０１５７】
本実験では、種々の温度における溶解曲線に基づいてポリペプチドの安定性を検証した。gp41 Nペプチドと複合化しているFusonexの50％溶解温度（黒丸で示した右側の曲線）は70℃で、gp41 Nペプチドと複合化しているT−20の50％溶解温度（白丸で示した左側の曲線）は51℃であった。他の条件が同じである場合、Fusonex複合体を溶解させるにはより高温にすることが必要となる。
【０１５８】
結果を、Fusonex複合体及びT−20複合体の溶解曲線（図4）に示した。図4から、Fusonexの方がT−20より安定性が高いことがわかった。
【実施例５】
【０１５９】
例 5 ： Fusonex の HIV − 1 感染に対する抑制作用
本実施例では、細胞−細胞の融合分析において、Fusonexがウイルス感染を非常に効果的に阻止することが分かった。同条件の融合分析において、FusonexのIC50は1.2±0.2nMであり、一方T−20のIC50は23±6nMであった。Fusonexの50％抑制濃度（IC50）は、T−20の50％抑制濃度の約20分の1であった。その高い力価によって、FusonexはHIVウイルスがヒトの細胞と融合するのを防止し、HIVに誘発された細胞間融合を抑制し、未感染細胞へのウイルス侵入を阻害するにあたり、より効果的であることが判明した。
【０１６０】
分析の詳細な説明は以下の通りである。
【０１６１】
Fusonexの抗ウイルス作用は、in vitroでの試験によって測定することができる。本発明では、ルシフェラーゼ実験を用いて、HIV−1 gp160HXBに誘発される合胞体形成を抑制するFusonexの能力を定量的に試験した。
【０１６２】
具体的な実験方法は以下の通りである。T7プロモータを複製箇所の上流配列pSP64に挿入し、ルシフェラーゼのレポーター遺伝子プラスミドPst7lucを構成する。脳脊髄心筋炎ウイルス（CMCV）の内部リボザイム侵入部位（IRES）を、ルシフェラーゼ遺伝子の5'−末端及びT7プロモータの下流部と結合させた。CD4遺伝子、T7ポリメラーゼ遺伝子、HIV−1 gp160HXB遺伝子を哺乳動物発現プラスミド（PMT3）にサブクローニングした。
【０１６３】
10cmの培養皿に、293T細胞をリン酸カルシウム法によって移した。gp160HXB遺伝子とT7ポリメラーゼ遺伝子を同量使用してエフェクター細胞をトランスフェクトし、pSP6とCD4遺伝子を用いてターゲット細胞をトランスフェクトした。gp160HXB遺伝子又はCD4遺伝子がない状態のPMT3プラスミドを、ネガティブな比較対照とした。
【０１６４】
DNA沈殿物を加えた後、非漿液性DMEMを洗浄処理した。細胞を9ml／皿の非漿液性DMEM中で、37℃において30〜40分間培養した。その後、細胞を全容ピペットで吸い上げながら皿の中でそっと上下に掻き混ぜ、それから遠心分離後沈殿した細胞を収集した。各皿の細胞を10％FBS含有DMEM 3〜4mlに再懸濁させ、十分に分散した状態を達成するため、エフェクター細胞を96ウェル培養プレート内でターゲット細胞（各45μl）と混合させた。
【０１６５】
まず、Fusonex又はT−20をDMSOに溶解させ、そして20倍希釈した。その溶液を原液として、使用する前に培地内で倍々希釈した。各ウェルに、10μl培地又はPBSを加え、又はFusonexもしくはT−20の希釈物をゼロから持続的に増加する濃度で加えた。ターゲット細胞、エフェクター細胞、及び融合阻害剤からなる混合物を撹拌した後、37℃において8時間培養させた。ルシフェラーゼ遺伝子を分析する前に、まずウェル中の培地を拭き取り、細胞を細胞溶解バッファ60μlに1：1の割合で溶解させた。溶解産物40μlを黒の96ウェル培養プレートの各ウェルに移し、100μlのフルオレセイン及びコエンザイムAを加えた。各濃度毎に3つの試料を繰り返した。黒の96ウェル培養プレートにルシフェラーゼ担体を加えた2分後、スペックスフルオロログ3蛍光光度計を用いて化学的蛍光強度を計測し、発光波長は552nm、スリット幅は7mmであった。各濃度における3つのデータから、平均及び標準偏差を算出した。
【０１６６】
本実験の抑制データは、単純な親和性バランス式（%ルシフェラーゼ作用＝100/(1+(C/IC50))に当てはめ、IC50の値を計上した。結果は、ウイルス融合に対するFusonex及びT−20の抑制分析（図5）に示した。図5は、Fusonex（丸）の50%抑制濃度（IC50）が、T−20（四角）のそれの約20分の1だということを示している。IC50値は、Fusonexでは1.2±0.2nMで、T−20では23±nMであった。即ち、Fusonexの融合抑制価は、T−20より20倍高かった。
【０１６７】
結論として、Fusonexは、両方の末端がキャッピングされており、36個のアミノ酸が特定の配列をなした化合物である。当該阻害剤やその配合薬は、HIV感染に対して強力な抑制作用があり、高い安定性及び力価も持ちあわせている。従って、治療効果を改善するとともに、用量は少量で済むため、副作用を抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】36個のアミノ酸で構成されたポリペプチドであるFusonexのアミノ酸配列（SEQ ID NO.: 1）を示している。Fusonexは、HIV−1 gp41 （E亜型）のC−ペプチドにおけるアミノ酸配列（117−151）（SEQ ID NO.: 2）から抽出される。全ての図において、上記の一文字の記号はアミノ酸を指している。
【図２】Fusonexの特徴的なピーク及びSuperdexクロマトグラフィカラムを用いて得られたFusonex 、及びFusonexとgp 41 N−ペプチド（35−70）との複合体の特徴的なピークを示す溶離プロファイルである。
【図３】Fusonexとgp 41 N−ペプチド（35−70）との複合体における高分子二次構造の円偏光二色性スペクトルである。
【図４】FusonexとT−20間の安定性を比較したものであり、右側の曲線（黒丸）がgp 41 N−ペプチドと複合化しているFusonexの溶解曲線、左側の曲線（白抜き丸）がgp 41 N−ペプチドと複合化しているT−20の溶解曲線である。35℃〜80℃の間では、同一温度の場合には、FusonexはT−20より安定していることが分かる。
【図５】FusonexとT−20の融合抑制作用を示している。本実験では、Fusonex（丸）とT−20（四角）の融合抑制作用の定量分析のためにルシフェラーゼの作用を用いた。細胞の融合はHIV−1 gp 160HXBにより誘発させた。gp 160HXB遺伝子を発現させるエフェクター細胞及びT7ポリメラーゼ遺伝子を、CD4遺伝子を発現させるターゲット細胞及びルシフェラーゼのレポーター遺伝子と融合する際に、ルシフェラーゼ遺伝子が発現し、化学的蛍光が放射される。本実験では、いかなる融合阻害剤も存在しない時の対照群のルシフェラーゼ作用を100％とする。HIV−1 gp 160HXBに誘発された細胞融合に対するFusonexとT−20の抑制作用を比較したところ、同濃度においてFusonexの方がT−20より優れた抑制作用を有することが分かる。
Claims (7)
- 以下のアミノ酸配列
X−SWETWEREIENYTKQIYKILEESQEQQDRNEKDLLE−Z (SEQ ID NO.: 1)
〔式中、Xはアミノ基もしくは−X1−X2であり、ここでX1はイミノ基、X2はアセチル基、疎水基、高分子キャリア基からなる群から選択される。Zはカルボキシ基又は−Z1−Z2であり、ここでZ1はカルボニル基、Z2はアミノ基、tert−ブチロキシカルボニル基、疎水基、及び高分子キャリア基からなる群から選択される〕からなるHIV感染治療のための融合阻害剤。 - 前記疎水基が、カルボベンソキシ、ダンシル、tert−ブチロキシカルボニル、9−フルオレニルメチルオキシカルボニルからなる群から選択され、前記高分子キャリア基が、脂質−脂肪酸キレート、ポリエチレングリコール、炭水化物からなる群から選択される請求項１に記載の融合阻害剤。
- X2がアセチル基であり、Z2がアミノ基である請求項１に記載の融合阻害剤。
- 請求項１から３の何れか１つに記載の融合阻害剤と、逆転写酵素阻害剤、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、グリコシダーゼ阻害剤、ウイルスmRNAキャッピング阻害剤、アンフォテリシンB、抗HIV作用を有するエステル結合の結合分子、ヒドロキシウレア、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロンからなる群から選択される少なくとも１つの成分とからなるHIV感染治療のための配合剤。
- 前記逆転写酵素阻害剤が、AZT、 ddI、 ddC、 ddA、 d4T、 3TC、 ネビラピン（Nevirapine）、アテビラピン（Atevirapine）、デラビルジン（Delavirdine）、PMEA、PMPA、 ロビライド（loviride）からなる群から選択される少なくとも1つの成分であり、前記ウイルスプロテアーゼ阻害剤が、アキナリル（Aquinarir）、リトナビル（Ritonavir）、インジナビル（Indinavir）、ネルフィナビル（Nelfinavir）、VX−478からなる群から選択される少なくとも1つの成分であり、前記グリコシダーゼ阻害剤が、SC−48334もしくはMDL−28574又はその両方であり、前記ウイルスmRNAキャッピング阻害剤が、リバビリン（ribovirin）である請求項４に記載の配合剤。
- 筋肉内、静脈内、皮下、経口、直腸、経皮に投与される請求項１に記載の融合阻害剤。
- 筋肉内、静脈内、皮下、経口、直腸、経皮に投与される請求項４に記載の配合剤。
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