KR100416912B1 - Ｊ300동충하초로부터 분리 및 정제한3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산, 이를 포함하는 항 ｈｉｖ 활성을 갖는 약제학적 조성물,ａｉｄｓ 치료제 및 ａｉｄｓ 치료보조식품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 J300동충하초로부터 분리 및 정제한 항 HIV 활성을 갖는 화학식 1의 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산, 및 상기 물질을 포함하는 항 HIV제, AIDS 치료제 및 AIDS 치료보조식품에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 항 HIV 활성물질을 유기합성하는 방법에 관한 것이다.

Description

Ｊ300동충하초로부터 분리 및 정제한 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산, 이를 포함하는 항 ＨＩＶ활성을 갖는 약제학적 조성물, ＡＩＤＳ 치료제 및 ＡＩＤＳ 치료보조식품 {3-[5-(methoxy-ethyl)-3,6-dioxo-piperazin-2-yl]-propionic acid extracted and purified from the J300 Dong Chung Ha Cho, and pharmaceutical composition having anti-HIV activity, a agent for treating ＡＩＤＳ and supplementary food containing the same}

본 발명의 목적은 J300동충하초에서 분리 및 정제된 항 HIV 활성의 물질인 화학식 1의 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

또 다른 본 발명의 목적은 상기 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산을 포함하는 항 HIV제, 항 AIDS제 및 AIDS 치료 보조식품를 제공하는 것이다.

동충하초는 예로부터 신비의 명약으로 분류되어 왔고, 특히 진시황의 불로장생 명약으로 사용하였다는 설화가 있다. 최근 서울대 천연물과학연구소의 연구에 의하면, 동충하초에는 항 피로효과, 면역증강효과 및 항암효과 등 다양한 효과가 있는 것으로 나타났다. 동충하초의 이러한 복합적 효능은 동충하초가 유용한 물질을 다양하게 함유하고 있거나 인체의 항상성에 직간접적으로 관여하는 것으로 추정된다.

UNAIDS와 WHO에 의하면 1997년 말 현재 전세계적으로 3천만 명 이상의 사람이 HIV에 감염되었다고 한다. 1997년 한해에만 새롭게 감염된 사람의 숫자가 580만 명으로 그들 중 59만 명이 어린이라고 추정하고 있다. 이러한 증가추세가 지속될경우 2000년에는 HIV 감염인원이 4천만 명이나 될 것으로 추정한다.

이러한 HIV 감염자의 90% 이상이 개발도상국가에 살고 있고, 이들 대부분은 자신이 감염되었는지도 모르고 있는 실정이 문제의 심각성을 더해주고 있다.

특히 사하라사막 인근 아프리카 지역에 감염자의 63%가 분포되어 있으며 인도와 태국의 감염자 증가율은 대단히 심각하여 전 세계의 이목이 집중되고 있다. 인도의 경우는 봄베이 지역 매춘부들의 50% 정도가 HIV에 감염되어 있는 것으로 나타났으며, 직업을 따라 이동하는 노동자들과 트럭운전사들에 의해 HIV 감염이 시골지역으로 급속하게 확산되고 있는 실정이다.

태국은 AIDS 예방법의 교육으로 감염율을 둔화시키는데 어느 정도 성과를 거두고 있으나 아직도 매년 6,400 여명의 HIV 감염 어린이가 태어나는 등 심각한 상황은 변함이 없다.

소련의 붕괴 이후 동구권에 대해서도 심각한 우려의 목소리가 높다. 이 지역에 대한 정확한 통계가 알려져 있지는 않지만 매춘업에 대한 선호도를 고려할 때 심각한 상황일 것으로 예상된다. 중국의 경우도 1993년에 10,000명의 환자로 보고되었는데 불과 2년사이 10배가 증가하는 등 경각심이 고조되고 있다.

우리나라의 경우는 85년도에 감염자가 23명으로 보고된 이래 1998년 6월 811명으로 늘어났고, 현재도 증가하고 있다.

따라서 AIDS를 퇴치하는 것은 국내는 물론 세계적인 관심사로서 부작용 없고 치료효과가 높은 새로운 의약품 개발이야말로 인류 전체의 숙원이라 할 수 있다.

AIDS는 1981년 최초의 AIDS 환자가 보고된 후, 1984년 AIDS 환자로부터 AIDS바이러스인 HIV를 분리함으로써 HIV가 AIDS의 중요한 병원인으로 확인되었다. 따라서, 전 세계적으로 AIDS 치료를 위한 항HIV 물질을 개발하는데 총력을 기울여왔다. 이 결과로 1987년 AIDS 치료제의 대명사처럼 불리는 AZT가 개발된 이래 1999년 2월 현재 미 FDA의 허가를 받고 시판 중에 있는 AIDS 치료제는 13종에 이르고 있다. 그러나, 기존의 모든 AIDS 치료제는 이를 투여하였을 때 예외 없이 내성 바이러스가 출현되었고 정도의 차이는 있지만 부작용증이 나타나는 등 명백한 한계성이 드러났다. 이 한계성을 극복하거나 완화할 수 있는 새로운 AIDS 치료제의 개발을 위해 국내 제약업계는 물론 전 세계의 제약업계 및 관련 연구기관에서 활발한 연구가 진행 중에 있다.

HIV(Human Immunodeficiency Virus)는 1984년 AIDS 환자로부터 처음 분리해 냄으로써 AIDS 병원체임이 밝혀졌다. 발견초기에는 HIV 감염이 동성연애자나 일부국가에만 국한 된 것으로 오해된 적도 있지만, 이제는 모든 사람을 위협하는 세계적 전염병으로 확인되어 심각한 사회적 문제로 대두되고 있다.

HIV는 분류학상 레트로바이러스에 속하며, 그 중에서도 렌티바이러스(lentivirus)그룹으로 세분되어 진다. HIV 입자는 직경이 10마이크론 정도로서 외부는 일반 세포막과 같이 인지방(phospholipid)으로 쌓여져 있고, 내부에는 RNA로 된 바이러스 게놈 2개가 단백질 주머니(capsid, core protein)안에 보호되어 있다. 이러한 HIV 게놈은 10개의 유전자로 구성되어 있는데 이는 게놈 전체 크기에 비해 많은 유전자를 가지고 있는 편이다.

이러한 HIV 감염은 바이러스 표면에 있는 표피 단백질(envelop protein:gp120)과 표적세포 표면에 있는 수용체가 접합됨으로써 이루어진다. 이 수용체는 CD4 항원으로 불리우는 세포 표면 단백질 분자로서, 세포 표면에 이 CD4 항원을 많이 표함하고 있는 CD4 세포(helper T cell)나 마크로파지가 HIV의 주요 표적이 되는 원인이다. 이 바이러스와 세포의 접합에 의해 바이러스의 인지방 껍질은 세포 표면에 융합되고, 바이러스의 게놈과 핵 단백질은 세포안으로 들어가게 된다. 이 때, 바이러스 게놈은 바이러스 입자에 있던 역전사효소에 의해 RNA에서 DNA로 바뀐 후, 세포핵 내로 운송되어 숙주세포의 게놈속으로 삽입된다. 이 과정은 레트로바이러스만 가지는 특성 중의 하나이다. HIV는 숙주세포내 가장 안전한 곳에 이렇게 은신하면서 생장에 필요한 모든 기작과 자원을 세포로부터 지원받는다. 또한 상황과 조건에 따라 증식을 억제 또는 촉진하면서 면역체 등으로부터 자신을 보호하며 생존한다.

AIDS 바이러스는 크게 나누어서 HIV-1과 HIV-2 두 종류가 있다. HIV-1은 한국을 포함한 여러 국가의 환자들에게서 발견되므로 AIDS 바이러스의 대명사로 불리운다. 서아프리카 지역 환자들에게 주로 발견되는 HIV-2는 게놈의 염기배열이 HIV-1과는 55% 정도만 동일하고, 원숭이 AIDS 바이러스인 SIV(Simian Immunodeficiency Virus)와 오히려 더 유사하다. HIV-2의 독성은 HIV-1보다 대체로 약하다고 알려져 있다.

HIV는 유전적으로 뿐만 아니라 생물학적으로도 매우 다양하다. 여러 AIDS 환자들에게서 분리해 낸 HIV의 염기서열이 각각 다른 것은 물론, 동일한 환자에게 채취한 것이라도 병의 진행상태에 따라 바이러스의 염기서열이 서로 다르다. 심지어는, 바이러스를 일정한 시간에 동일한 환자로부터 분리할 경우, 조직부위에 따라 염기서열이 다른 바이러스가 검출된다. 이렇게 다양한 염기서열은 바이러스의 다양한 생물학적 특성을 결정짓는데 많은 연관이 있다. 염기서열이 다른 바이러스마다 특정 세포에 대한 감염선호성, 증식율, 바이러스 생산 정도, 세포에 대한 독성, 다핵거대세포 형성율, 잠복기와 활성유기, 중화항체에 대한 민감도 등이 각각 다르다.

이렇게 다양한 생물학적 특성과 AIDS 발병과의 연관성에 대한 현재까지의 연구결과에 따르면, 초기 환자에게서 분리된 바이러스는 대개 다핵거대세포를 형성하지 않으며(NSI: Nonsyncytia-Inducing), 마크로파지를 선호해서 감염한다. 그러나 AIDS 말기로 진행될수록 다핵거대세포 형성 능력(SI: Syncytia-Inducing)이 증가하고, 마크로파지 대신 헬퍼 T 세포를 선호해서 감염하는 바이러스로 변한다. 이는 HIV의 생물학적 특성과 병발생은 무관하지 않다는 것을 시사한다.

HIV에 감염된 후 1주일 정도에 바이러스의 증식이 왕성해서 환자의 혈액에서 쉽게 바이러스가 검출될 수 있다. 이 단계를 바이러스혈증(viremia)이라고 한다. 이 바이러스는 1-2주일 내에 분리가 어려울 정도로 급격히 감소된다. 이런 잠복기 상태를 상당기간 유지하다가 AIDS로 진행되면서 다시 바이러스 증식이 활발하여져서 바이러스혈증 상태로 된다. 최근 폴리머라제 연쇄중합반응을 이용한 연구 결과, 잠복기 중에서도 계속해서 바이러스가 만들어진다는 보고가 있어 주목받고 있다.

CD4 세포는 처음 바이러스혈증 기간 중에 갑자기 그 숫자가 줄었다가, 바이러스 증식이 줄어들면서 다시 일정치로 회복하게 된다(건강한 사람: 500-1000 CD4 cells/mm³). 이 후 여러 해에 걸쳐 CD4 세포가 서서히 감소하여 혈액 1mm³당 200개 이하로 떨어지게 되면 ARC(AIDS-related Complex)나 AIDS로 진행된다. AIDS 환자에게는 기회성 감염의 확률이 높아져서 주폐포자층(Pneumocysitis carinii) 폐렴 등에 걸려 죽게 된다.

감염초기 증식이 증가되었던 HIV가 급속히 감소되는 시기와 CD8 세포가 증가하는 시기가 일치하는데, CD8 T 세포는 세포의 생장을 억제시키거나 바이러스에 감염된 세포를 선별해서 죽이는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 초기 감염된 바이러스에 대해서는 CD8 세포가 중요한 면역효과를 나타내는 것으로 보여진다. 항체는 시기적으로 바이러스가 감소된 이후에 생성된다. 감염 초기부터 AIDS 발병까지 계속해서 CD8 세포와 항체 등이 존재하지만 이미 그 기능을 잃었거나 변질되었고, 심지어는 바이러스 감염을 오히려 촉진시키기도 한다. 감염 초기 항바이러스 효과가 분명히 있었던 면역체계가 어떻게 그 기능을 잃게 되는가는 아직도 풀어야할 숙제이다. 인간에게만 발병되는 AIDS의 특수성 때문에 HIV의 발병원인에 대한 이해는 지극히 초보적인 단계라 할 수 있다. CD4 세포의 감소가 면역결핍증을 일으키는 직접적인 원인이 된다는 것에는 학자들 모두가 공감하나, HIV가 CD4 세포를 어떻게 감소시키는가에는 많은 이견이 있다. 그 감소에 대한 설명으로 다핵거대세포 형성, 삽입되지 않은 바이러스 DNA의 축적, 숙주세포막 구조에 영향, 프로그램된 세포사멸을 유기, 감염세포로부터 독성물질의 분비, 자기면역에 의한 세포파괴 등 많은 이론들이 제시되어 있다. 그러나, 생체내에서 실제로 일어나는 사실로 증명된 것은 아직 아무 것도 없다. 원숭이와 원숭이 AIDS 바이러스 SIV를 이용하여 HIV 병발생 과정에 대해 많은 연구가 진행되고 있지만 괄목할 만한 새로운 발견은 없다.

AIDS 약의 대명사처럼 불리우는 AZT(Zidovudine)는 HIV 역전사효소의 기능을 억제하는 약으로서 그 효과에 대해 가장 많이 연구되었다. 감염초기에 사용할 경우, 임상상태를 어느 정도 호전시키기는 하였으나, 환자의 생명을 연장시키는데는 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다. 골수에 독성을 미치는 등의 부작용이 있고, 장기간 사용시 내성을 갖춘 바이러스가 출현하는 등 AIDS 치료제로서 분명한 한계가 있다. 같은 기능의 약으로서 FDA의 승인을 받은 DDI, DDC, d4T 등도 역시 내성 바이러스가 생겼으나, 독성은 AZT보다 덜한 것으로 나타났다. 이런 약들을 복합적으로 사용할 경우, 독성과 내성 바이러스 출현을 낮추거나 억제할 수 있을 뿐만 아니라 치료효과를 높일 수 있다는 이론이 최근에 제기되었다. 이 가정을 검증하기 위해 여러기관에서 임상실험 결과 어느 정도 긍정적인 평가를 얻고 있다.

이외에도 바이러스 생장을 억제하기 위해 기발한 많은 방법들이 개발되어 효능을 검증 중에 있다. 예를 들어, 바이러스가 세포에 접합하는 것을 억제하는 방법, 바이러스에 감염된 세포만 선별해서 죽이는 방법, 바이러스 생장에 중요한 효소기능을 억제하는 약(protease, integrase, tat inhibitor, rev inhibitor), 사이토카인을 이용한 치료법, CD8 세포를 주입하는 법, 유전자 치료법 등이다.

HIV의 백신 개발에도 많은 진전이 있었다. 죽은 바이러스 또는 살아있지만병발생 능력을 없앤 바이러스(attenuated virus)를 사용하는 방법, 유전공학적 방법을 이용하여 바이러스의 특정 단백질을 표현시킨 후 이를 사용하는 방법(subunit vaccine), 항이디오타입 항체, DNA 유전자를 직접 주사하는 법 등 매우 다양하게 개발되고 있다. 백신개발의 근본적인 문제점은 바이러스가 지나치게 다양하다는 것에 있다. 예를 들면 예방 접종 후, 백신 개발을 위해 사용하였던 원래의 바이러스를 사용하여 도전시키면 항체에 의해 바이러스의 생장이 억제되나, 환자에게서 새롭게 채취한 감염세포나 바이러스로 도전시킬 때는 전혀 억제하지 못했다. 이러한 바이러스의 다양성을 극복해야 하는 것이 숙제로 남아 있다. 체액면역을 이용한 백신개발 이외에 CD8 세포 등에 의한 세포면역과 점막 등에 존재하는 면역체계(mucosal immunity)를 이용한 백신을 개발하고, 이들을 혼합하여 사용할 경우 더 좋은 결과가 있을 것으로 예상된다.

상기와 같은 AIDS 치료제의 문제점, 즉 부작용증 및 내성 바이러스 출현이 적은 AIDS 치료제를 개발하는 것이 본 발명이 이루고자 하는 목적이다. 이를 위하여 본 발명자들은 J300동충하초의 추출물로부터 항 HIV 활성이 있는 분획을 결정하여 그 활성물질을 분석하고, 또한 이 항 HIV 활성물질을 유기합성함으로써 독성이 약하고 부작용증이 경미한 신규한 AIDS 치료제를 개발하였다.

도 1은 J300동충하초부터 항 HIV 활성분획 Dong 1-2-4 (3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산을 함유하는 추출물)을 분리 및 정제하는 공정을 간략히 도시한 개략도이다.

도 2는 J300동충하초의 수 추출물 분획의 그래프로서, 항 HIV 활성물질이 존재함을 알 수 있다. 위에서 설명한 바와 같이 J300동충하초의 수 추출물의 농도를 높여감 따라 비례하여 항 HIV효과가 있는 것으로 나타났다. 그러나, 1.25x10^-1보다 높은 농도에서는 "Infected"와 "Uninfected" 모두 감소하는 추세로 나타났는데 이는 이 농도에서 세포독성이 있다는 의미이다.

도 2 내지 도 10 및 도 13에서 공통적으로 "Infected" (다이아몬드 표시)는 세포에 바이러스를 감염시킨 후 시약을 첨가한 것으로 시약에 의해 HIV의 세포 살상효과로부터 보호된 사항을 표시한 것이다. "Uninfected" (네모 표시)는 세포에 농도가 각각 다른 시약만을 첨가한 것으로 농도별 독성을 나타낸다. X좌표는 시료의 농도별 희석비율을 나타내는 것이고, Y좌표는 세포 생존률을 %로 나타낸 것이다.

도 3은 J300동충하초의 메탄올 추출물 분획의 그래프로서, 항 HIV 활성물질이 존재하지 않음을 알 수 있다. 이 그래프에서는 "Infected" 그래프가 활성이 있는 분획물이 있는 도 2의 경우와는 대조적으로 시료의 농도가 높아짐에 따라 비례하여 숙주세포가 보호되지 않는다. 따라서, 이 분획물에는 항 HIV효과가 없는 것으로 판정되었다.

도 4는 J300동충하초의 수 추출물 중 비 단백질층의 항 HIV 활성을 검색한 것이다. 항 HIV 활성이 우수함을 알 수 있다.

도 5는 J300동충하초의 수 추출물 중 1,000D이하 부분에 대한 활성을 검색한 결과이다. 항 HIV 활성이 우수함을 알 수 있다.

도 6은 J300동충하초의 수 추출물(J300W)의 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 스펙트럼의 결과를 도시한 것이다.

도 7는 J300동충하초 수 추출물과 세포를 30분간 인큐베이션한 후 바이러스를 감염시킨 결과의 그래프이다.

도 8은 세포를 바이러스로 감염시킨지 30분후 J300동충하초 수 추출물을 넣어 활성을 관찰한 그래프이다.

도 9은 J300동충하초 수 추출물의 경구투여시 마우스의 체중의 변화를 도시한 것이다.

도 10는 J300동충하초 수 추출물의 HIV 마우스에 대한 치사량을 도시한 그래프 및 J300동충하초 수 추출물을 투여한 마우스의 LD₅₀값을 나타낸 것이다.

도 11은 본 발명의 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산의 그래프로서, 항 HIV 활성을 알 수 있다.

도 12는 J300동충하초의 수 추출물 Dong 1-2-4의 활성물질의 구조를 분석하기 위한 1H NMR 결과를 도시한 것이다.

도 13는 J300동충하초의 수 추출물 Dong 1-2-4의 활성물질의 구조를 분석하기 위한 cosy 45의 결과를 도시한 것이다.

도 14는 J300동충하초의 수 추출물 Dong 1-2-4의 활성물질의 구조를 분석하기 위한 13C NMR 결과를 도시한 것이다.

도 15은 J300동충하초의 수 추출물 Dong 1-2-4의 활성물질의 구조를 분석하기 위한 Dept 결과를 도시한 것이다.

도 16는 J300동충하초의 수 추출물 Dong 1-2-4의 활성물질의 구조를 분석하기 위한 HSQC 결과를 도시한 것이다.

도 17는 J300동충하초의 수 추출물 Dong 1-2-4의 활성물질의 구조를 분석하기 위한 HMBC 결과를 도시한 것이다.

본 발명은 J300동충하초로부터 분리 및 정제한 항 HIV 활성물질인 하기 화학식 1의 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산을 제공하고, 이를 포함하는 항 HIV제, 항 AIDS제 및 AIDS 치료보조제로서 상기 활성물질을 포함하는 기능성 식품을 제공한다.

[화학식 1]

동충하초는 현재 세계적으로 300여 종이 보고되고 있으나 그 크기가 작고 자생하는 수가 적어 이용은 물론 연구에 필요한 시료확보도 불가능한 실정이다. 이에 농촌진흥청에서는 국내에 자생하는 여러 종의 동충하초를 채집하여 그 균을 순수분리한 다음 누에에 접종하여 대량생산하는 기술을 개발중에 있으며 2000년 말 현재 그 재배방법이 개발된 동충하초는 페실로마이세스 자포니카(Paecilomyces japonica)등 5종으로서 서울대학교 천연물과학연구소와의 공동연구 결과 동충하초의 우수한 효능을 입증하였다. 그 중에서도 특히 면역력을 증강시키는 효과가 크다는 점에 착안하여 한동대학교와 공동으로 동충하초의 항 HIV효능을 확인하기 위해 페실리로마이세스 자포니카(Paecilomyces japonica),페실로마이세스 파리노사(Paecilomyces farinosa),페실로마이세스 에스피(Paecilomycessp.) J300(J300동충하초) 등 3종의 동충하초를 진공동결건조하여 분말화한 다음 추출하여 항 HIV효능을 시험한 결과 오직 J300동충하초의 수 추출물에만 항 HIV활성이 있는 것으로 나타났다. J300동충하초란 보고된 바가 없는 새로운 종의 동충하초로서 본 발명자들이 농촌진흥청에서 최초로 분리하여 누에를 이용 생산한 동충하초를 말하며 분류학적으로는 불완전균류의 페실로마이세스 속에 속한다. 재배기술에 대하여는 국내와 미국, 일본, 중국등에 특허를 출원하여 2000년 말 현재 국내(NO : 제 0187897호)와 미국(NO : 제 5,930,310호)으로부터 특허를 등록 받은 상태이다.

J300동충하초로부터 항 HIV 활성물질 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산의 정제 및 분리

3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산의 분리 및 정제과정을 구체적으로 서술한다.

(1) J300 동충하초 분말 2.63g에 대한 HP 20 흡착 크로마토그래피 (adsorption chromatography)를 실시하였다. 용리용매로 70℃의 100% 증류수, 50% aq. MeOH, 50% aq. 아세톤, 100% MeOH(메탄올), 100% 아세톤을 각각 사용하였으며, 이들 분획에 대한 항 HIV 효능을 검색한 결과 100% 증류수 추출물 분획에서만 항 HIV 효능이 있음을 확인하였다.

따라서, 항 HIV 효능이 확인된 100% 증류수를 용리용매로 사용하여 분획한 분획물을 용매를 제거한 후 얻은 분획물의 무게는 각각 2.55g(Dong-1), 0.390g(Dong-2), 0.044g(Dong-3), 0.030g(Dong-4), 0.015g(Dong-5), 0.004g(Dong-6), 0.003g(Dong-7) 이었다.

(2) 상기 분획물 중 Dong-1을 활성탄을 이용하여 재크로마토그래피를 실시하였으며, 용리용매로 100% 증류수를 사용하였다. 용매를 제거하고 얻어진 분획물의 양은 0.446g(Dong 1-1), 0.469g(Dong 1-2), 0.190g(Dong 1-3), 0.006g(Dong 1-4)이었다. 이 분획들에 대한 AIDS 활성을 재검색한 결과 Dong 1-1 및 Dong 1-2에서 강한 활성이 확인되었으며, Dong 1-2는 Dong 1-1 보다 1000배 정도 강하였다.

(3) 상기 Dong 1-2를 활성탄을 이용하여 재크로마토그래피하였으며, 용리용매로 100% 증류수를 사용하였다. 용매를 제거하고 얻어진 분획물의 양은 0.012g(Dong 1-2-1), 0.025g(Dong 1-2-2), 0.023g(Dong 1-2-3), 0.015g(Dong 1-2-4), 0.029g(Dong 1-2-5)이었다. 이 분획들에 대한 AIDS 활성을 재검색한 결과 Dong 1-2-4 및 Dong 1-2-5에서 강한 활성이 확인되었다.Dong 1-2-4 또는 Dong 1-2-5를 함유하는 활성탄 크로마토그래피의 100% 증류수 분획을 35% 수성 아세토니트릴에 각각 녹이고 HPLC(YMC amino column, 2 x 25 cm, 2 ml/min, MeOH) 분리를 시도하여 잔류시간(retension time) 10, 12, 14, 15, 18, 22, 29분에서 각각 9.9, 2.8, 10.9, 7.7, 32.7, 10.3, 21.4, 13.7mg을 얻었다. Rt 10분 피크(peak)는 글루탐산이 주성분으로 존재하고 트레오닌(threonine)이 소수성분으로 존재한다. Rt 12분 피크는 글루탐산과 트레오닌으로 구성되어 있다. Rt 14분 피크는 트레오닌의 OH기가 메톡시로 바뀐 물질이다. Rt 15분 피크는 프롤린이 주성분이고 트레오닌의 OH기가 메톡시기로 바뀐 물질과 글루타민이 소수성분으로 존재하는 것 같다. Rt 18분 피크는 아르기닌이 주성분이고 글루타민이 소수성분으로 존재하는 것 같으며 다른 밝혀지지 않은 성분들도 보인다. Rt 22분 피크는 알라닌이다. Rt 29분 피크는 글루탐산에서 아미노기가 먼 쪽의 카르복실산기가 에스테르화된 물질로 보인다.

계속해서 활성탄 크로마토그래피의 50% aq.MeOH 분획(Dong 1-2)도 40% 수성 아세토니트릴에 녹이고 마찬가지로 HPLC(YMC amino column, 2 x 25 cm, 2 ml/min, MeOH)로 분리를 시도하였다. 잔류시간 13, 13.5, 14.5 분에서 각각 21.6, 36.6, 93.6 mg이 얻어 졌다. Rt 13 분에서 얻어진 물질은 프롤린과 루이신의 디펩타이드 즉 루이실프롤린, Rt 13.5 분에 나타난 피크는 글리세롤, Rt 14.5 분에 나타난 피크는 당유도체로 판단되었다.

마지막으로 HP 20 흡착 크로마토그래피로 분리하여 얻어진 50% aq.MeOH 분획(Dong 1-2)을 25% 수성 아세토니트릴에 녹이고 HPLC(YMC 아미노 컬럼, 2 x 25 cm, RI 측정기, 2 ml/min)로 분리를 시도하여 잔류시간 8, 10, 12, 19, 26, 32, 36 분에서 각각 2.4, 3.2, 5.0, 3.1, 7.2, 14.9, 6.7 mg이 분리되었다. 1H NMR 분석결과 Rt 10분에서 얻어진 피크는 데옥시아데노신과 티미딘의 3:2 혼합물로 여겨졌으며 Rt 12, 19, 26, 32, 36분에 얻어진 피크들은 각각 아데노신, 우리딘, 트립토판, 페닐알라닌, 구아노티딘(guanotidine)으로 판단되었다. HPLC한 후 확인할 수 없는 물질들의 혼합물이 잔사로 207.4 mg 얻어 졌다. 또한, 이들 아미노산 외에도 소량의 아미노산 치환체가 두 종류 있는 것이 NMR 연구 결과 밝혀졌다. 이 중 Rt 19분의 화합물이 글루탐산와 트레오닌의 디펩타이드 유도체(GT: 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산) (Dong 1-2-4)이고, Rt 26DML 화합물이 루이신과 프롤린으로 이루어진 디펩타이드 유도체(LP: 4-메틸-2-[(피롤리딘-2-카보닐)-2-아미노]-펜타논산) (Dong 1-2-5)이다.

J300동충하초의 항 HIV 활성검사 방법

활성물질의 안정성 검사

활성물질을 찾아내기 위해 활성이 안정하게 유지될 수 있는 최적의 조건을 찾아내고 분리정제 과정 중에 이 조건을 유지하는 것은 대단히 중요하다. 온도와 보존기간에 체계적으로 변화를 주어 활성의 정도를 측정하였다; 20℃, 4℃, 22℃ 및 37℃ 등에서 1 주일간 보관하였다가 활성검사를 실시하였다.

이 방법은 미 암연구소 (National Cancer Institute) 에서 개발되어 사용하고 있는 것으로, 처리한 시료에 의해 숙주세포가 HIV의 살상효과로부터 보호되는 세포생존정도를 측정함으로써, 시료의 항 HIV효과 유무 및 그 정도를 결정한다.

검사방법을 구체적으로 설명하면, 세포+HIV+시료를 넣고 1 주일 간 배양한 후 XTT 방법으로 세포의 생존정도를 측정한다. 이때 매 실험마다 다음과 같은 대조군을 첨가하여 J300동충하초의 분획구에 대한 활성여부를 판정하는 참고기준으로 삼았다.

(1) 세포만 첨가하여 배양시킨 대조군 : 양성 대조군으로서 이 대조군에서 나타난 세포의 생존상태를 세포 생존률 100%로 정한다.

(2) 세포+HIV 처리구 : 음성 대조군으로서 대부분의 세포가 HIV에 의해 살상 되는데 이를 세포생존율 0%로 정한다.

(3) 세포 + 각기 다른 농도의 시료를 첨가한 군 : 세포독성을 측정하기 위한 처리군이다

(4) 각 농도의 시료만 처리 : 시료에 의해 생겨지는 배경 색깔을 측정하기 위한 처리구이다.

(5) 세포+HIV+AZT : AZT는 이미 알려진 항 HIV 활성물질이므로 그래프 상 일정한 패턴이 예상된다. 이 패턴을 조사함으로써 실험을 위한 전조건의 적합성을 확인할 수 있는 처리구이다

이 실험에 사용한 바이러스는 HIV 발현에 중요한 유전자인tat와rev를 변형시켜 만든 돌연변이 바이러스이며, 숙주세포에서는 이 유전자들이 지속적으로 발현되어 해당 유전자 생성물을 만들 수 있도록 처리하였다. 이러한 유전 공학적인 처리를 통하여 HIV가 일반세포에서는 생장이 불가하고 특정 숙주세포에서만 자랄 수 있도록 하여 안전성이 매우 높은 특징이 있다.

이 실험에서 세포가 잘 자라고 죽는 것은 비색검정(colorimetric assay)를 사용했는데, 이는 테트라졸륨 염(MTT, XTT, WST-1)이 살아있는 세포에 의해서만 깨어져 색을 띤 불용성 구조인 포르마잔구조를 이루게 된다. 이때 생성된 포르마잔의 양을 ELISA를 통해 측정함으로서 살아있는 세포의 양을 정량할 수 있다.

사용된 시료는 HPLC한 각 단계의 동충하초 수 추출물 분획으로부터 유래된 물질이다. 본 발명의 물질인 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산을 사용한 실험결과가 도 11에 도시되어 있다.

항 HIV 활성물질과 비 활성물질의 검색결과 비교

J300동충하초의 분획물을 위에서 설명한 방법으로 검색하였을 때, 활성성분의 유무에 따라 다음과 같이 구별된다

숙주세포인 T세포에 HIV를 감염시키면, 대부분의 세포는 사멸하게 된다. 그러나, 시료에 항HIV효과가 있다면, 농도를 높여 첨가함에 따라 시료의 활성물질이 바이러스의 증식을 억제함으로써, 세포의 살상이 보호된다.

분리된 활성물질의 화학구조 결정

활성물질이 존재하는 최소단위의 분획물인 Dong 1-2-4를 사용하여 구성물질에 대한 화학적 구조를 밝히기 위해 NMR 분석방법을 사용하였다. 1H(Proton), Cosy45, 13C, DEPT, HSQC, HMBC 등의 기법을 사용하여 구조를 분석하였다. 분석 결과를 도 12 내지 도 17에 도시한다.

활성물질의 작용기전

활성물질이 세포내에서 작용하는가에 대한 것으로, 세포와 시료를 30분간 인큐베이션하고 바이러스를 감염시킨다. 세포에 동충하초 분획(Dong 1-2-4)을 함께 넣은 후 30분후 바이러스를 감염시킨 경우 활성을 나타내었다. 이 경우 시료가 세포막을 투과하여 세포안쪽에서 바이러스의 증식을 억제할 때 뿐만 아니라 세포막 밖에 붙어서 바이러스의 침입을 차단할 때도 이런 현상이 나타날 수 있다(도 9).

세포에 바이러스를 감염시킨 후 30분간 인큐베이션하고 추출물을 첨가한다. 만약 활성물질의 작용위치가 세포외부라면 항 HIV 효과가 나타나지 않을 것이고 세포내부의 경우에서만 활성이 나타날 것이다. 실험 결과 활성을 나타내었다. 이 경우는 세포와 바이러스의 충분한 감염 시간을 주고 시료를 첨가한 것으로 세포안에서 바이러스의 증식을 억제하는 것으로 판단된다(도 10).

트랜스지닉 마우스를 이용한 독성검사

HIV가 특이적으로 뇌에서만 발현되도록 유전공학적 처리를 한 트랜스지닉 마우스를 이용하여 in vivo 실험을 하였다.

본 발명에서 추출한 동충하초 추출물인 Dong 1-2-4를 경구 또는 정맥투여하는 방법으로 아급성 검사를 실시하였다. 경구투여의 경우 100mg 투여에서 체중의 증가가 정체되는 것으로 보아 마우스에 최소한의 독성이 나타나는 것으로 보이며, 외형적인 형태(운동성, 급식상태)는 없는 것으로 보인다. 투여 후 체중 변화 결과 40mg의 투여까지는 마우스에 이상이 없는 것으로 보인다(도 11).

정맥투여의 경우 50mg에서는 투여 직후 마우스가 죽었고, 25mg 투여의 경우에는 투여 후 1일 후에 체중 감소와 일부 마우스에서 평형감각을 잃어 드러누운 상태에 있었고, 나머지도 운동성이 완전히 소실된 상태로 있다가 3일만에 모두 죽었음. 25mg 및 10mg의 투여의 경우에 마우스는 외형상 털이 서는 등의 발영 반응 현상은 없었다. 2mg을 투여한 경우 외형적 문제는 보이지 않으나 체중 감소가 1일째 나타났고, 이후에 정상적으로 상승하였다(도 12).

본 발명은 하나 또는 그 이상의 무독성, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 보조제 또는 희석액, 또는 다른 활성성분과 함께 상기 화학식 1의 화합물을 치료학적으로 유효한 양으로 함유하는 항 AIDS제 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 오일 또는 수성매질에서 용액, 현탁액 또는 유화액의 형태가 되거나, 사용하기 전에 무균, 발열물질이 제거된 물로 녹여 사용하는 건조분말의 형태가 되어 경구용 제형, 피하주사, 정맥주사, 근육주사 등의 비경구형 제형으로 제형화할 수 있다.

경구용 제형의 경우, 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 부형제를 이용하여 공지의 방법으로, 예를 들면, 정제, 트로키제, 함당정제, 수성 또는 유성 현탁액, 분산가능 가루 혹은 입자, 유화액, 연질 혹은 경질 캡슐, 시럽, 일릭서와 같은 형태로 제제화되며, 이는 단위 투여량 형태 및 다용량 용기에 들어있다.

경구용 제형 중, 정제는 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘, 인산나트륨 등의 불활성 희석제; 옥수수, 녹말, 알긴산 등의 입자화제; 붕해제; 녹말, 젤라틴, 아카시아 등의 결합제; 스테아르산마그네슘(magnesium stearate), 스테아르산, 탈크 등의 윤활제와 같은 정제의 제조에 사용 가능한 부형제와 함께 섞여진 상태로 본 발명의 화합물을 가지고 있다. 정제는 코팅되지 않은 상태로 사용하거나, 위장관내의 흡수와 정제의 분해를 저해하기 위해 코팅하여 사용한다. 예를 들어, 글리세릴모노스테아레이트와 글리세릴디스테아레이트 등의 시간 저해 물질을 적용해도 좋다. 경질캅셀은 본 발명의 화합물을 탄산칼슘, 인산칼슘, 카올린 등의 불활성 고체 희석제에 섞은 것이고, 연질캅셀은 물이나 혼합이 가능한 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol), PEGs(polyethylene glycol), 에탄올 등의 용매와 땅콩기름, 액상 파라핀, 올리브 오일등의 기름 용매에 활성성분을 섞은 것이다.

수용성 현탁제는 수용성 현탁제 제조에 적당한 부형제와 활성 성분을 함께 혼합한 것으로, 부형제로는, 예를 들면, 나트륨카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시-프로필메틸셀룰로오스, 알긴산나트륨, 폴리비닐-피롤리돈, 트래거캔스검(gum tragacanth), 아카시아검(gum acacia) 등의 현탁화제; 폴리옥시에틸렌스테아레이트와 같은 지방산과 알킬렌 옥사이드를 축합한 화합물들; 헵타데카에틸렌옥시세탄올(heptadecaethyleneoxycetanol)과 같이 긴 지방산에 알킬렌 옥사이드를 축합한 화합물들; 폴리옥시에틸렌소르비톨모노올레이트와 같이 무수헥시톨(hexitol anhydride)과 지방산에서 유래한 부분 에스테르를 에틸렌 옥사이드와 축합한 화합물들; 습윤제; 또는 분산화제 등이 있다. 수용성 현탁제는 방부제, 착색제, 향신료, 감미료 등을 함유한다.

유성 현탁제는 올리브유, 세사미유(sesami oil) 등의 식물성 오일 또는 액상파라핀 같은 광물성 오일에 활성 성분을 현탁시킨 것으로, 예를 들어 비즈왁스, 경화 파라핀, 세틸 알코올 등의 농후제(thickening agent)를 함유한다. 또한, 방부제, 착색제, 향신료, 감미료 등을 함유하는데, 이러한 조성은 비타민 C 같은 항산화제를 가하여 보존할 수 있다.

분산성의 파우더와 입자는 분산화제, 습윤제, 현탁화제, 보존제 등을 넣어 함께 혼합한 상태로 활성 성분을 가지고 있다. 적절한 분산화제, 습윤제나 현탁화제는 앞서 이미 언급한 것을 예로 들 수 있다. 부가적인 부형제는, 예를 들어, 감미료, 향신료, 착색제 등이 있다.

유중수형 유화액은 올리브유 같은 식물성 기름 또는 액상 파라핀 같은 광물성 오일을 유상으로 하고, 대두레시틴(soy bean lecithin) 등의 자연산 인지질, 소르비탄모노올레이트와 같은 무수헤시톨이나 지방산의 에스테르에서 유래된 것, 리옥시에틸렌소르비톨모노올레이트와 같이 무수헥시톨(hexitol anhydride)과 지방산에서 유래한 부분 에스테르를 에틸렌 옥사이드와 축합한 화합물들을 유화제로하여 활성성분을 유화시킨 것이다.

시럽과 일릭서는 글리세롤, 프로필렌글리콜, 소르비톨, 슈크로스 등의 감미료와 함께 활성성분을 혼합한 것이다.

비경구형 제형은 멸균된 주사 가능 용액 혹은 무독성의 사용가능한 희석제나 용매, 예를들어 1,3-부탄디올 등의 용매에 활성성분을 현탁시킨 현탁액으로 제제화하여 주사한다. 사용 가능한 부형제나 용매중에는 물, 링거액 그리고 등장성 식염수 용액이 있다. 또한, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 같은 공용매를 사용할 수 있다. 또한, 멸균된 비휘발성 오일을 관습적으로 용매 혹은 현탁 용매로 사용할 수 있다. 이런 목적으로 섞는 무자극, 비휘발성 오일(bland fixed oil)은 합성 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 사용한다. 또한, 올레인산과 같은 지방산을 주사제 마련에 사용할 수 있다. 좌제 형태는 약물을 상온에서는 고체였다가 직장내의 온도에서는 액체가 되어 직장내에서 녹아 약물을 방출하게 하는 적절한 무자극성 부형제, 예를 들면, 코코아버터, 폴리에틸렌글리콜과 혼합하여, 제제화한 후, 직장에 투여한다.

본 발명의 조성물을 사용하여 질병을 치료하는 경우, 활성성분 물질의 용량은 환자의 나이, 체중, 일반적 건강 상태, 성, 식사, 투여시간, 배설 속도, 약물 병용, 치료하는 동안의 질병의 정도 등에 따라 다르지만, J300동충하초 분말을 경구투여할 경우 체중 60kg인 사람을 기준으로 일일 1 내지 3g 까지를 매일 사용할 수 있다. 한편, 한가지 제형을 결정짓기 위해 담체 물질과 섞는 본 발명의 화합물의 양은 투여 경로별 방식과 치료하는 환자에 따라 달라진다.

본 발명의 J300동충하초에서 분리된 항 HIV 활성물질인 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산을 식품 첨가물로서 첨가한 AIDS 치료보조식품은 당업자라면 통상적으로 생각할 수 있는 음료 형태와 같은 임의의 식품 형태로 제조될 수 있을 것이다.

본 발명의 J300동충하초에서 분리된 항 HIV 활성물질인 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산은 천연물에서 정제한 것으로써 통상적인AIDS 치료제보다 독성이 약하여 부작용이 적으며, 천연물에서 추출한 특성상 식품첨가물로도 첨가될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (12)

1. 하기 화학식 1의 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산:

   [화학식 1]
2. 동충하초 분말을 물로 추출하는 단계;

   상기 동충하초의 물 추출물을 용리용매로 증류수를 사용하여 HPLC(고작위액체크로마토그래피)를 수행하는 단계;

   상기 증류수 분획을 용리용매로 메탄올을 사용하는 HPLC를 이용하여 분리하는 단계; 및

   상기 메탄올 분획을 활성탄 크로마토그래피하여 분리하는 단계;

   를 포함하는, J300 동충하초로부터 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산을 분리정제하는 방법.
3. 활성성분으로 제 1항에 의한 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산의 유효량을 함유하는 항 HIV용 약제학적 조성물.
4. 제 1항에 의한 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일] -프로피온산을 치료학적 유효량으로 함유하는 AIDS 치료용 조성물.
5. 제 1항에 의한 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산을 포함하는 AIDS 치료용 보조식품.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 제 2항에 의한 분리정제 방법으로 제조한 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1의 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산:

   [화학식 1]
10. 활성성분으로 제 9항에 의한 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산의 유효량을 함유하는 항 HIV용 약제학적 조성물.
11. 제 9항에 의한 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일] -프로피온산을 치료학적 유효량으로 함유하는 AIDS 치료용 조성물.
12. 제 9항에 의한 3-[5-(메톡시-에틸)-3,6-디옥소-피페라진-2-일]-프로피온산을 포함하는 AIDS 치료용 보조식품.