JPH06505264A - 修飾タンパク質およびそれを用いたウイルス感染症を制御するための医薬製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 修飾タンパク質およびそれを用いたウィルス感染症を制御するための医薬製剤本 発明は、インフルエンザ、およびエイズとエイズ関連疾患を含むレトロウィルス 感染症を包含する免疫不全疾患を治療もしくは治癒させるのに遺し、かつウィル スに感染した細胞が未感染の細胞と融合するのを阻害するのにも使用できる医Ｎ 製剤に関し、その医薬製剤は、活性物質もしくは活性作用に寄りする物質、また は活性を有する他の物質の担体として、修飾タンパク質もしくは修飾ポリペプチ ドを含有している。

３°−アジド−３゛−デスオキシチミジン（ＡＺＴ）に用いる細胞特異的担体と して糖タンパク質を使用することは、Ｍｏｌｅｍａ、　Ｇ、、Ｊａｎｓｅｎ　Ｒ ，Ｗ、、Ｐａｕｗｅｌｓ　Ｒ，、ＤｅＣｌｅｒｑ　Ｅ、およびＭｅｉｊｅｒ　Ｄ 、に、Ｐ、の刊行物であるＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、パート４０ 、°１２号、２６０３〜２６１０頁（１９９０）に開示されている。今日までの ところＡＺＴはエイズの治療に用いる唯一の登録薬剤である。ＡＺＴは感染細胞 中でウィルスＤＮＡの合成を阻害する。エイズは治癒しないけれども、このＮ剤 は平均余命を延長する。

あいにく、ＡＺＴは健康な細胞も曹ずので多くの不快な副作用が生じる。これら の副作用は、特に、大量のＤＮＡを産生ずる組織、例えば骨髄に現れる。上記の 刊行物によれば、担体分子によって標的細胞にＡＺＴを導くことが提案されてい る。上記刊行物によれば、アルブミン（Ｈ３Ａ）と糖類、例えばマンノース、フ コース、ガラクトースおよびグルコースとの接合体を製造し、ＡＺＴＭＰ　（リ ン酸化して−リン酸エステルの形態にしたＡＺＴ）と組み合わせてその抗ＨＩ　 Ｖ活性が試験されている。塘タンパク質と活性物質の接合体が標的細胞に吸収さ れると、担体分子は活性物質を放出すると推定される。

レトロウィルス感染症を治療するのに用いる製剤に硫酸化フ５ニルポリマーを用 いることが、オランダ特許−第８９００４４２号に開示されている。この刊行物 に記載されている硫酸化フェニルポリマーは、硫酸化ポリフェニルアルコール類 、（メタ）アクリル酸とフェニルアルコールの硫酸化コポリマー類およびその医 薬として許容される塩である。これらの活性物質は、ＭＴ−４１１ｍにおける旧 シー１の細胞変性作用およびＣＥＭ綱胞細胞ける旧％Ｌ、１の抗原発現を減少さ せる。またこれらの物質は、ＨＩＶ−２の複製に抵抗する活性も持っている。そ の上、１（ＩＶ−１が生成する巨細胞（多核シンチウム細胞）の形成と、ＨＴＶ フラグメントのＣＤ−４ポジテイブ細胞（ＣＤ−４ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ＩＩ胞） への吸着が阻害される。

本発明は、ウィルス感染症、およびエイズとエイズ関連疾患を含むレトロウィル ス感染症のような免疫不全疾患を治療もしくは治癒させるのに適し、かつウィル スに感染した細胞が未感染の細胞と融合するのを阻害するのにも使用できる医Ｎ ｌｌ剤に関し、その製剤は、活性物質もしくは作用に寄与する物質、または活性 である他の物質の担体として、修飾クンバク質もしくは修飾ペプチドを含有して いる。そして、その修飾タンパク質と修飾ポリペプチドは、そのアミノ基および ／または他の塩基性官能基を、塩基性アミノ酸および／または他の塩基性官能基 のプロトン化を防止するか、または前記塩基性アミノ酸および／または他の塩基 官能基を負の電荷を有する１つ以上の官能基で置換する薬剤で誘導体化すること によって追加の正味の負の電荷を獲得しており、そのタンパク質もしくはポリペ プチドの誘導体の保持時間は、誘導体に変換されていないタンパク質もしくはポ リペプチドに比べて少なくとも９分間延長されている。なおこの保持時間は、ア ニオン変換カラムでＦＰＬＣによって測定される。

本発明は、修飾タンパク質もしくは修飾ポリペプチドの負の電荷と抗ウィルス活 性の間に相関関係があることを発見したことに基づいている。活性物質の負の電 荷が大きければ大きいほど、抗ウィルス活性、特に抗ＨＩＶ活性が大きくなる。

先に述べたように、“追加の正味の負の電荷°は、保持時間に基づいて定量する ことができる。この保持時間は、例えば下記のクロマトグラフィー法によって測 定される。

−ｐ）１７．５のトリス・ＩＩｃＩ緩衡液（０，０２Ｍ）　（緩衝ｉＩＩ！Ａ） のＩＩＩＩ当りｌ　ｍＨの濃度の被験物質溶液をｌｌ躾する。

一上記試料１００μ＋を・オランダ、　Ｗｏｅｒｄｅｎ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ 社が市販してＧＡるＦＰＬＣ装置（Ｆａｓｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｑｕｉｄ　 Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）に注入する。なおこの装置はＰｂａｒ醜ａｃｉ ａ社市販の−ｏｎｏ−Ｑ”　−１（ＲＳ１５アニオン変換カラムを備えている。

＝１００％緩衡液Ａ−緩衡液Ａ＋Ｉ　Ｍ　Ｎａ（：Ｉで構成された緩衝液８１０ ０％の勾配液を用い、０．２５　ｍｌ／分の流量で３０分間溶離する。

−保持時間を測定する。

“追加の正味の負の電荷“は、別の方法でも定置することができる。すなわち理 論的な正味の負の電荷に基づいて定量できる。この理論値は、誘導体化された基 の数に、誘導体化された基１つ当りの電荷の変化を掛は算して、出発物質の電荷 に加算することによって計算される０本発明の負電荷のポリペプチド、すなわち 修飾タンパク質の場合、正味の負の電荷は−６０より低く、例えば−６０〜−３ ００以下の桁の値である。

理論正味負電荷の基準は、以下の実施例を参照して示す。

本発明によって用いることができる化合物の５ｕｅ−Ｉｓ＾（ヒト血清アルブミ ンと無水コハク酸の反応生成物）では、リシンの６１個の正のＮｔｂ　”はすべ ての負のＣ０〇−基で置換された。上記のように、１リシン当り２の電荷の変化 がある。それ故、この化合物の理論的電荷は、−１５（元のアルブミンすなわち ＩＳＡ由来）＋（２Ｘ−６１）−−１３７である。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ ）の場合、５ｕｃ−ＢＳＡ物質の値は、元のＢＳＡの電荷の値が−１８なので− １４０になる。

本発明によって使用できるヒト血清アルブミンと無水コハク酸の反応生成物は、 理論的な正味の負の電荷は−１３７（−−１５＋６１　Ｘ　−２）である。

本発明で使用することができるヒト血清アルブミンと無水アコニット酸（シス− もしくはトランス−プロペ−１−エン−１，２，３−）リカルボン酸の無水物） の反応生成物は、−１９８（−−１５＋（６１Ｘ−３）の理論正味負電荷を有す る。

アルブミンと無水プロペン−１，２，３−）リカルボン酸の非常に安定な反応生 成物の負の電荷は類似しており好ましいことである。

さらに、ＨＳＡと比べて延長された保持時間は、記載されたクロマトグラフィー の条件下で測定したが、Ａｃｏ−ｌ５Ａについては１３分間で５ｕｃ−８５Ａに ついては１１．５分間である。

さらに、タンパク質／ポリペプチドの理論電荷は、分子中に存在する全アミノ酸 の電荷の平均値として計算される（血清アルブミンの場合約６００個のアミノ酸 ）。

また１個のアミノ基／塩基性基当り３個以上のカルボキシル基を、本発明で用い ることができる出発物質に導入することもできる。勿論、さらに一層高い負の電 荷を有し、かつ保持時間を上記の値よりさらに大きく延長する活性物質が得られ る。

追加の正味負電荷を有し、かつ本発明の医薬製剤に使用できる修飾タンパク質も しくは修飾ポリペプチドは、本願では以後、“負電荷ポリペプチド（ｎｅｇａｔ ４ｖｅＩｙ　ｃｈａｒｇｅｄ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）”と呼ぶ、この櫂の 化合物は一般に水溶性でありイオンの形態で存在することができる。

この負電荷ポリペプチドは好ましくは、ポリアミノ酸、およびアルブミンとα− ＃槍タンパクｊｉ（“オロンムコイド）のような修飾血漿タンパク質である。

分子量が約７０．０００の桁のポリペプチドが適切である。しかし分子量はこの 値よりかなり大きくまたは小さくしてもよく、重要な因子は、ポリアニオンポリ ペプチド構造が分子内に存在していることである。

本発明で使用される負電荷ポリペプチドに誘導化される基としては、リシンとヒ スチジンが好ましいことが発見されたのである。リシンの窒素含有基はアミノ基 であり、一方ヒスチジンのｌｉ素含有基は“他の塩基性官能基”とみなされる。

さらに例えばポリリシンも本発明に成功裡に使用することができる。

出発物質に、追加の正味の負電荷を導入することができる標準の化学薬剤が、誘 導体を製造するのに使用される。しかし、アルデヒド類、無水物類、酸塩化物類 およびイソ（チオ）シアネート類を使う方が好ましい、この種の薬剤を使えば、 上記の障害と症状に対する顕著な作用を有する医薬製剤を提供する負電荷ポリペ プチドが得られることが見出されたのである。

タンパク質またはポリペプチドの誘導体を製造するのに用いる薬剤の例として、 下記の物質を挙げることができる。

１、無水物類 １．１．　直鎖無水物類 タンパク質中のアミンと反応することによって、生理的ｐＨにおいてプロトン化 されないアミド結合を提供する。

ＮＨ４−中性アミド （電荷の変化は−１） １．１．１．　対称無水物質 １．１．２．　非対照無水物類 １．２．１．　環式無水物類 タンパク質中のアミンと反応することによって、生理的ｐＨにおいてプロトン化 されないアミド結合を提供し、さらにそのアミド結合は生理的ｐＨにおいて脱プ ロトン化される１個のカルボキシル基を導入する。

ＮＨ３”→中性アミド＋負のカルボキシル基（電荷の変化は−２） １．２．２．　リング中に追加のカルボキシル基を冑する環式無水物類タンパク 質中のアミンと反応することによって、生理的ｐｌ＋においてプロトン化されな いアミド結合を提供し、さらにそのアミド結合は生理的ｐｉにおいて説プロトン 化される２個のカルボキシル基を導入する。

ＮＨ３゜−中性アミド＋２個の負のカルボキシル基（電荷の変化は−３） ２、酸ハロゲン化物！Ｉｔ（一般に酸塩基物類）タンパク質中のアミンと反応す ることによって生理的ｐｌ（においてプロトン化されないアミド結合を提供する 。

ＮＨｓ　’→中性アミド （電荷の変化は−１） −○ 塩化ステアリル　□ＣＨ３−ＩＣ＋２１１６−Ｃ，ｃ。

最後の２つの化合物は〜２の電荷の変化を与える。というのはアミノ基から正の 電荷を除くのに加ス、て負の電荷をスルホニル基に導入するからである、３、ア ルデヒド類 タンパク質中のアミンとの反応によってイミンを提供する。

ＮＨ３’→中性イミン （電荷の変化は−１） ４、　イソチオシアネート類 タンパク質中のアミンとの反応によって、生理的ｐＨにおいてプロトン化されな いチオカルバミル結合を提供する。

ＮＨ３’→中性のチオカルバミル （電荷の変化は−１） タンパク質中のアミンとの反応によって、生理的ｐＨにおいてプロトン化されな い尿素結合を提供する。

Ｎｌｆ、　”−中性原票 （電荷の変化は−１） ポリアニオンのタンパク質またはポリペプチドを得るのに用いる上記薬剤は、す べてを示したわけではなく、各種のグループの少数の例を示しているに過ぎない 。

すべての薬剤の場合、例えばリン酸基、硫酸基およびカルボキシル基のような追 加のアニオン１能基は、可能な場所に、追加の負の電荷を導入するような方式で 連鎖中に組み入れることができる。

本発明によって用いられるポリペプチドの追加の正味の負電荷は、その作用を得 るために非零に重要なので、出発物質のタンパク質もしくはポリペプチドは、誘 導体化することが可能で追加の負の電荷を獲得することができる基をできるだけ 多数もっていることが好ましい。天然もしくは合成のオリゴペプチドは、出発物 質として用いられるが、官能アミノ基もしくは他の官能塩基性基を有するアミノ 酸磨えば上記のりシンとヒスチジンで、５％以上、特に１５％以上、さらに待に ２５％以上が構成されているのが好ましい。

本発明の！１剤は、臘にもしくは非経口で投与することができる。非経口でもし くは腸に投与することができる製剤も、本発明の製剤から製造多゛ることができ る。

本発明の負電荷ポリペプチドを含有する医′Ｎ製剋は、散剤、懸濁液、水射、ス プレー剤、乳層、軟膏もしくＣコクリーム剤の形態でもよく、局所塗布；鼻腔内 、直腸内もしくは膣内への投与；および経口もしくは非経口（静脈内、皮膚内、 筋肉内、クモ股下腔内など）の投与に用いることができる。このような製剤は、 負電荷ポリペプチドと、水性もしくは非水性の溶媒、安定肩、乳化剤、界面活性 剤および添加剤のような中性タイプの医薬として許容される賦形剤および所望に より着色剤と芳譬物質とを組ろ合わせて（例えば混合もしくは熔解などを行なっ て）製造することができる。本発明の製剤における負１４荷ポリペプチドの濃度 はかなり変えることができ、投与の方式によって、０．００１、好ましくは０． １および１００％の間の範囲内にある。さらに、投与される負１１荷ポリペプチ ドの投与量は、例えば０．１〜１００　ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。

また本発明は、追加の正味の負の電荷を獲得した物質の上記のＭ途に間する。

すなわちウィルス感染症と、エイズおよびエイズ関連疾患を含むレトロウィルス 感染症のような免疫不全疾患の治療もしくは治癒に用いるのに適切でかつ感染細 胞が未感染細胞と融合するのを阻害するのに使用できる医薬製剤を製造する際の 、活性物質もしくは活性作用に寄与する物質として、または活性物質の担体とし ての用途である。

また本発明は、エイズおよびエイズ関連疾患のようなレトロウィルス感染症によ っておこる疾患もしくは陳富、またはウィルスと細胞の融合もしくはウィルス感 染Ｉｉ！胞と未感染ＩＩ胞との融合が起こす症状を治療する方法に関し、この方 法では上記定義の追加の負電荷を有するタンパク質またはポリペプチドが用いら れる。

また本発明は、修飾タンパク質または修飾ポリペプチドの製造方法に関し、この 方法では、タンパク質またはポリペプチドのアミノ基および７丈たは他の塩基性 官能基は塩基性アミノ酸のプロトン化を防止する薬剤で誘導体化され、そのタン パク質またはポリペプチドは、追加の正味の負の電荷を獲得して、タンパク質ま たはｆｔＪペプチドの誘導体の保持時間が誘導体に変換されていないタンパク質 またはポリペプチドに比べて少なくとも９分間延長される。なおこの保持時間は アニオン交換カラムでＦＰＬＣによって測定される。

また本発明は、アミノ基および／または他の塩基性官能基を、塩基性アミノ酸お よび／または他の塩基性基のプロトン化を防止するか、または前記塩基性アミノ 酸および／または他の塩基性基を負電荷を有する１つ以上の官能基でＷ換する薬 剤と反応させたタンパク質またはポリペプチドで構成された新規な修飾タンパク 質または修飾ポリペプチドに関し、この修飾されたタンパク質またはポリペプチ ドは、未修飾のタンパク質またはポリペプチドと比べると追加の正味の負電荷を 有し、その結果、そのタンパク質またはポリペプチドの誘導体は誘導体に変換さ れていないタンパク質またはポリペプチドに比べて保持時間が少なくとも９分間 延長されており１、その保持時間はアニオン交換体が入ったカラムでＦＰＬＣに よって測定される。

本発明によって、負電荷ポリペプチドが、とりわけ、シンシチウムの生成とつィ ルス細胞の融合を実質的に減少させ、ＣＤ４受容体の０ＫＴ４Ａエピトープに結 合せず、かつ抗ｌ１１）１２０と蒙＾ｂ　ｇｐ１２０の相互作用および非常に低 濃度のウィルスの結合作用に対してごくわずかの阻害作用を有する強力で選択性 の抗ＨＩＶｉであることが発見されたのである０本発明で用いられるかまたは製 造される負電荷ポリペプチドは、毒性は全くないかまたはごく低い。

本発明を下記の試験例を参照して説明する。

仄腋透 ホルムアルデヒドと無水コハク酸による負電荷アルブミン（ｆｏｒ■−ＨＳＡと ５ｕｃ４ＳＡ）の製造。

ＨＳＡ　５００−ｇを０．２　Ｍ　ＮａｚＣＯｓ溶液（ｐｔｌ　１０．０）５０ 　ｍｌに添加し、次にホルムアルデヒドを、最終濃度が出発物質に対して２０重 量％になるように添加した。生成した溶液を暗所で室温にて７２時間撹拌した。

不溶性の物質を除くために、溶液を、０．２μ園の微細孔を有するフィルターで 濾過し、セファデックスＧ２Ｓカラムで精製し、＾−１ｃｏｎ　”５ｔｉｒｒｅ ｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ’のＰＭＩＯ膜で蒸留水を使って洗浄 し、最終的に凍結乾燥してｆｏｒｍ４ｓＡを得た。

ＩＳＡ　５００　ｍｇを０．２−ＫＪＰＯａ溶液（ｐＨ８，０）５０　ｍｌに溶 解した。生成した溶液に固体の無水コハク［５００ｗａｇを添加し、無水コハク 酸が溶解するまで撹拌した。６Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを８．０〜 ８．５の間に保持した。　ｆｏｒｍ４ｓＡについて記載したのと同様にして精製 を実施した。純水の５ｕｃ−ＨＳＡが得られた。

上記の修飾アルブミンの追加の正味負電荷は、Ｐｈａｒ＋５ａｃｉａ社（オラン ダ、Ｗｏｅｒｄｅｎ）のｍｏｎｏ−Ｑアニオン交換カラムを用い、同Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ社のＦＰＩ、Ｃ装置（ＦａｓｔＰｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒ ｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって測定した。緩衝液Ａは、０．０２　Ｍ　）リ スーＨＣｌ緩衡？Ｉ！、（ｐＨ７，４）であり、緩衝液Ｂは緩衝液Ａ＋１阿Ｎａ Ｃｌで構成されていた。溶離は、１００％Ａ〜１００％Ｂの勾配液を用い、０． ２５　ｍｌ／分の流量で、３０分間行なった。被験物質の試料は緩衝液Ａ中にｌ −ｇ／ｍｌの量で溶解し、各場合１００μｌずつをＦＰＬＣ装置に注入した。

ＨＴＬＶ−１を保有するＴ、リンパ球細胞系由来のＭＴ−４細胞を抗ＨＴＶ−１ 試験に用いた。

このＭＴ−４細胞は、１０容量％の熱で不活性化したウシ胎児血清（Ｆ″ｃｓ） と２０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ　１６４０培地で培養し た。　ＭＯＬＴ−４細胞（クローン８、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５７巻、１１５９ 〜１１６２頁参照）をシンシチウム生成に関する試験に使用した。その細胞は、 ５％ＣＯ！の空気の湿潤雰囲気下３７℃の温度で保持した。

３〜４日毎に細胞を遠心分離し、新しい培養フラスコ（２Ｘ　１０’　１１１１ １／ｍｌ）に移した。その細胞はマイコプラズマの存在について定期的に分析し たが、常にマイコプラズマが存在しないことが見出された。

１１１Ｖ−１（ＩＩＩＶ−［１１１菌株）　ハ１ｌＩＶ−１が感染した［１ＵＴ −７８細胞の培養液カラ得り、コの培養液のウィルス力価はＭＴ−４細胞内で測 定した。そのウィルスは一７０℃で保管した。

本発明の負電荷ポリペプチドの抗ウィルス活性は、ＩＩＴ−４細胞中にウィルス が誘発した細胞変性性に対する阻害作用に基づいて測定し、３−　（４，５−ジ メチルティアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムプロミド 法（ＭＴＴ法）によって記録した。なおこの方法は、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　Ｍｅ ｔｈｏｄｓ、　２０巻、３０９〜３２１頁に記載されている。

シンシチウムの生成は以下のようにして測定した。修飾ポリペプチドをＲＰＭＩ で希釈し、微量滴定プレートのウェルに移した＃５Ｘ１０’のＩＩＩＶ−１！！ 染ＨＵＴ−７８細胞を、遊離ウィルス粒子を除くために予め２１１洗浄しておい て、ウェルに加え、続いて直ちに５Ｘ１０’のＭＯＬＴ−４細胞を添加し、最終 容積を２００μｌにした。この細ｉＩ混合物を、３７℃にてＣ−含有細胞インキ ユベーターで培養した。最初のシンシチウムが４〜６時間後に生成した。２４時 間後に、その細胞を顕微鏡検査とレーザー−７０−−サイトフルオログラフィ− （ｌａｓｅｒ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｈｙ）によって分析し た。

ウィルス吸着に関する検定は次のようにして行なった。

本発明の負電荷ポリペプチドが存在していないかまたは存在している条件下で、 ＭＴ−４細胞をＨＩＶ−１ピリオンに曝露した。３７℃にて３０分間インキュベ ートした後、細胞を洗浄して捕捉されていないウィルス粒子を除いた０次にその 細胞を、ＨＩＶ−１に対するポリクローナル抗体を用いて間接蛍光を得るために 染色し、その細胞に捕捉された■ｒｖ−ｉ粒子をレーザー・フロー・サイトフル オログラフィーで分析した。

ＣＤ４免疫蛍光検定法を、４２号Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡ　８ｆ４．３３２２〜３３２６頁に記載の方法を用いて行なった０本発明の 負電荷ポリペプチドが存在している場合と存在していない場合に、室温で種々の 期間、ＭＴ−４細胞をインキユベートした。

次にその細胞を、最適濃度のモノクローナル抗体０にＴ４Ａ−ＦＩＴＣ（ｏｒｔ ｈｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）または抗−１ｅｕ３ａ　−ＰＥで染色し、対照物 質（ＦＩＴＣで標識をつけたＩｇＧ　ＩおよびＰＥで標識を付けたＩｇＧＪ　（ Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて４℃で２０分間、”Ｓｉｍｕｌｔ ｅｓｔ免疫監視法１を実施し、ＰＢＳで一度洗浄し、０．５重量筋バラホルムア ルデヒドＰＢＳ溶液０．５　ｍｌで固定した。

上記の試験例によって、抗ウィルス活性と負電荷の間に明白な相関関係があるこ とが分かった。例えばアルブミンのりシン基を単にスクシニル化することによっ て、ＩＣ５ａが非常に低い（１μｇ／簡■）アニオン化合物が得られる。試験し た負電荷ポリペプチドのどれもが１０００μｇ／ｍｌまでの濃度で、細胞毒性で ないことが見出された。

Ａｃｏ−４ＩＳＡ物質を上記の方法と同様にして製造した。この物質の抗ＨＩＶ 活性は非常に高くてｒｃｓ。は０．００５６μｇ／−１である。それ故この化合 物は、５ｕｃ−ＵＳＡの１７５倍の活性を有し、現在知られている最も高い活性 の化合物の１つである（ＡＺＴの約２５倍の活性を有する）。

本発明の負電荷ポリペプチドは、例えば、１００μｇ／ｓ＋１の濃度で、ウィル スの吸着をごくわずかに阻害する。ちなみの硫酸デキストランは、２５μｇ／ｍ ｌの濃度で、事実上完全にウィルスの吸着を阻止した。

シンシチウムの生成は本発明の負電荷ポリペプチドによってかなり減少する。

例えば約２μｇ／＋＋Ｉに過ぎない１度で５０％まで減少する０例えば硫酸デキ ストランで同じ阻害作用を得るためには、２８μｇ／ｍｌの濃度が必要であり、 その量は、抗ウイルス検定法におけるそのＩＣｓ。値（０，６μｇ／ｍｌ）の約 ５０倍の量である。

０ＫＴ４Ａ　ｍＡｂはＣＤ４分子のエピトープに結合するので、ＨＩＶ吸着に応 答可能であり、Ｈｒ　Ｖ粒子がその細胞に結合するのを防止できることは知られ ている。

アラリントリカルボン酸（ＡＴＡ）はＣＤ４分子のこのエピトープと特異的な相 互作用を示し正の対照として使用した。　０ＫＴ４Ａ　ｍＡｂ−ＣＤ４相互作用 は、２５μｇ／ｍｌの濃度のＡＴＡによって完全に阻害された。本発明の負電荷 ポリペプチド（および硫酸デキストランも）は、１００μｇ／蒙１までの濃度で この相互作用に対して全く影響を与えなかったので、このことから、本発明の活 性物質はＣＤ４受容体のこのエピトープに結合しないと結論することができる。

永続的ニＨＩＶ−１ニ感染したＨＵＴ−７８１１胞と特異的抗ｇｐ１２０　ｍＡ ｂは、ｇｐ１２０ノＶ　３領域を認識しかつ巨細胞の生成に重要な役割を演じて おり、本発明の負電荷ポリペプチドとウィルスｇｐ１２０の直接相互作用の試験 に使用した。硫酸デキストランは濃度に依存する方式で抗ｇｐ１２０−＾ｂがｇ ｐ１２０に結合するのを阻害したが、含有量は抗ウィルス活性を有する量に等し いと言われている。本発明による負電荷ポリペプチドも、濃度に依存する方式で 抗ｇｐ１２０　ｓＡｂとｇｐ１２０の相互作用を阻害する。しかし、５０％阻害 するのに要する濃度は、ＩＣｓ＊の多数倍（Ｎえば１００倍）であるので、この ことから、ｇｐ１２０の遮蔽は、恐らく本発明の化合物の作用機序だけではない と結論することができる。

本発明の化合物の作用の機序は、ウィルスが、細胞と融合することと、感染細胞 が未感染細胞と融合することから生じる化合物と融合することを防止することに 基づいている。恐らく、これら化合物とウィルス融合タンパク質（たとえばＨｒ Ｖの場合のＧＰ４１）の相互作用はこの場合必須である。この作用機序は従来全 く報告されていなかった。

ウィルス　と　血作眉に関する　の　験の　法と結果添付した表１．２．３およ び４を説明する。

免疫不全症を起こすウィルスに対する、本発明の２つの物質（Ａｃｏ−ｆｌｓＡ と５ｃｕ−１１ＳＡ）の抗ウィルス活性を、他のポップニオン抗ウィルス化合物 である硫酸デキストランの活性と比較する。結論：本発明の物質は、ＩＩＩＶ− １，）ＩＩＶ−２、およびＦｒＶおよびＳ■Ｖに対して活性である。

抗ＨＩＶ−１試験はすでに記載した。

１１１Ｖ−２（ＬＡＶ−２ｔｏ＋＋　）　（Ｌ、　Ｉ’ｌｏｎｔａｇｎｉｅｒ博 士、フランス、パリから入手した）を持続的にＬＡＶ−２＋＋。。に感染したＭ ＯＬＴ−４１１胞の培地上澄み液から単離した。抗ＨＩＶ−２試験は抗ＨＩＶ− １試験と同じである。

ＦＩＶ−４８とＦＩＶ−１１３は、血清反応陽性のヤマネコの末梢単核血球から 単離した。

抗Ｆ［Ｖ試験はＥｇｂｅｒｊｎｋらの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ　８７巻、３０８７〜３０９１頁１９９０年）を用いて行なった 。

マイ（・ジノンで刺激したネコの胸ａＩ細胞を、種々の濃度の被験物質が存在ケ る１、６　ｅ＋ｓ”のりエル（１０１ｍ　ｍ　／ｓ＋　１　）中にプレートシ、 た。３７′ｃで１時間インキ１べ−１・した後、Ｉ−ＭＶを６ＸＩＯ’ｃ四の逆 転写ＨＭ　（ＲＴ）活性に対応する量で添加ｊ５た。３７℃で１時間インキュベ ートシた後、培地を種々の１度の被験物質を含有する新しい培地と取り替えた。

、Ｊ−澄み液のＲＴ活性を、３７℃７４〜・６日間培養した後測定し、た（表２ 参照）。

本発明の２つの物質（Ａｃｏ−１１ＳＡと５ｕｃ−ＩＳＡ）のＤＮＡウィルスρ 対する抗ウィルス活性を、他のポリアニオン抗ウィルス化合物である硫酸デキス トランの活性と比較している。＆！！論は、本発明の物質は、硫酸デキストラン と真なり被験ＤＮＡウィルスに対して全（活性がないということである。

抗ＣＭＶ試験：ヒト胚芽肺（ＨＥＬ）ｍ維芽細胞を、１０％ウシ胎児血清、１％ Ｌ−グルタミンおよび０．３％炭酸水素ナトリウムを添加したＭＥＭ培地で培養 した。モのｍ胞に、１００　ＰＦＩＩ（プラーク形成単位）のヒトサイトメガロ ウィルス（ＣＭＶ、菌株ＡＤ１６９とＤａｖｉｓ菌株）を感染させた。同時に、 被験物質を種々の濃度で添加した。ウィルスによって起こるウィルスプラークの 形成と細胞死を、５ｎｏｅｃｋら、３２巻、１８３９〜１８４４頁１９８８年に 記載されているのと同様にして測定した（表２参照）。

本発明の２つの物質（Ａｃｏ−ＦＩＳＡと５ｕｅ−ＩＳＡ）のＲＮＡウィルスに 対する抗ウィルス活性を、他のポリアニオン抗ウィルス化合物である硫酸デキス トランの活性と比較している。結論は次のとおりである。すなわち本発明の物質 はインフルエンザウィルスを除いて被検ＲＮＡウィルスに対して全く活性がない 、一方硫酸デキストランはＶＳＶとシンドビスウイルスに対してのみ活性を持っ ている。

ポリオウィルス、コクサラキーウィルス、ＶＳＶ、シンドどスウイルス、セムリ キ森林熱ウィルス、レオウィルス、パラインフルエンザウィルス、ＨＳＶ−１、 ＨＳＶ−２およびＶＭＷに対する物質の活性は以下のようにして測定した。

集密細胞培養物（Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞および一次ウサギ腎臓細胞）に、 各種の濃度の被験物質の存在下、ＣＣＩＤ５＊　（５０％細胞培養感染投与量） の１００倍の各種ウィルスを接種した。１時間後に培地を、被験物質だけが各種 濃度で依然として存在している培地で取り替えた。ウィルスによって起こる細胞 死の測定は、ｖＳｖＣ−１）いては感染ｚ、、−て−から１−２日後、コクサノ キーウイルス、セムリキ森林熱？λイルスおよびポリオウィルスについては感染 してから２日後、Ｉｓシー１、ｌｌ５Ｖ−２およびシンドとスウイノトス４”つ いては感染してから２〜３０後、ならびにノぐラインフルコンザラ・イルスおよ びレオウィルスについては感染り丁から６日後に行なつ。

た。

センダイウィルスとインフルエンザウィルスに対する被験物質の活性庖、ウィル ス膜と赤血球ゴーストおよびリポソーム２の融合ならびにウィルス膜とＩＩＨＸ −２ｉ細胞もしくは１．！、Ｃ−ＭＫＪＩＩ胞との融合を測定することによって 決定した。Ｒｌｇ−デクエンチング法（Ｒ＋ｓ−ｄｅｑｕｅｎｃｈｉｎｇ　ｍｅ ｔｈｏｄ）をこの目的に使用した。なおこの方法は、Ｈｏｅｋｓ　ｔｒａら、Ｒ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３！、５６７５〜５６８１頁１９８４年：およびＳ 、　０ｈｋｉ、　［１゜Ｄｏｙｌｅ、　Ｔ、Ｄ、　Ｆｌａｎａｇａｎ、　Ｓ、’ ｐｒ、　ＨｕｉおよびＥ、　Ｍａｙｈｅｉｉｍ集”　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｃ ｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｆｕｓｉｏｎ”　（米国、ニューヨ ーク、Ｐｌｅｎｕ＋ｍ　Ｐｒｅｓｓ社、１９８８年）４４１〜４５０頁の一１ｌ ｄｓｃｈｕｔらの報告に記載されている。

この方法を要約すると、次のとおりである。インフルエンザウィルスとセンダイ ウィルスにＲＩ％で標識を付けた。これによって蛍光の７０％の自己クエンチン グが起こった＊　Ｉ？＋ｓで標識を付けたウィルスの濃厚懸濁液３５μｌを、リ ポソームと各種細胞の赤血球ゴース）　（ＩＩＥＰＩＥｓ緩衡液中）が入ってい るキューペットに導入して、融合によって起こる蛍光の増大デクエンチングがオ ンラインで測定された（励起５６０　ｒｉｍ、放出５９０　ｎｍ）　、同じ方法 を、各種の濃度の被験物質の存在下で実施した。

硫酸デキストランおよびヘパリンのような他のポリアニオン抗ウィルス化合物に は、著しい負の副作用として、重大な抗凝血活性がある０本発明の物質にはこの 副作用がない、　Ａｃｏ−ｌ５Ａだけが、例えば１００μｇ／ｍｌという高濃度 （すなわち抗ウイルス濃度の１０，０００倍を越える濃度）でわずかに抗凝血活 性がある。

ｌニ レトロウィルスに対するポリアニオン化合物の阻害作用（ＩＣ５゜μｇ／ｍ１） ）１１Ｖ−１）１１Ｖ−２ＦＩＶ　Ｓ［ＶＳｕｃ−ＩＳＡ　Ｏ，９７８＜０．１ 　＋十−活性が測定された。

ＮＤ−測定されなかった。

紅 ＤＮＡウィルスに対するポリアニオン化合物の阻害作用（ＩＣｓ。μｇ／儒１） １（ＳＶ−Ｉ　ＨＳＶ−２ＨＳＶ　ｆｉｅｌｄ　ＶＭＷ　ＣＭＶＴに− 盈ｌ ＲＮＡウィルスの複製に対するポリアニオン化合物の阻害作用（４Ｃｓ。μｇ／ ■ｌ）ウィルス　ＡＣＯ−ＩＳＡ　０５ コクサフキーウイルス　＞４００　＞４００ンンドビスウイルス　＞４００　２ ．０セムリキ森林熱ウイルス　＞４００　＞４００レオウイルス　＞４００　＞ ４００ バラインフルエンザウイルス　＞４００　＞４００インフルエンザウイルス　０ ．８　＞４００センダイウイルス　＞４００　＞４００表土 化合物の抗凝血作用［ＡＰＴＴ　（ｓｅａ）として測定１濃度（μｇ／ｍｌ）　 硫酸デキストラン　５ｕｃ−ＵＳＡ　Ａｃｏ４ＳＡ　ヘノでリン１００　＞４０ ０　３７．７　５１．１　＞４００１０　６９．４　３３．０　３３．０　２２ ０５　４９．０　３７．２　３６．２　１４０３　４３．６　３５．８　３５． ９　６５１　３７．４　３６．２　３７．０　４０．５０．１　３７．６　３８ ．０　３７．８　４０．３０．０１　３８．０　３９．０　３６．８　３８．４ 化合物はｐＨ７，２のＰＢＳに溶解し、その溶液３０μｌを血漿２７０μｌに添 加した。

対照として、ＰＢ３３０　μｌを血１１２７０μｌに添加したが３８．０秒とい うＡＰＴＴ値が得られた。

ＡＰＴＴ−活性化部分トロンボブラステン時間（ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｐａｒｔ ｉａｌ　ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎｔｉｍｅ　（秒） ＡＰＴＴは標準の方法を用い電気機械的に測定した。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成　５年　９月１０ 日口。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．インフルエンザ、ならびにエイズとエイズ関連疾患を含むレトロウイルス感 染症のような免疫不全疾患を包含するウイルス感染症を治療するかまたは治癒さ せるのに適し、かつウイルス感染細胞が未感染細胞と融合するのを阻害するのに 使用できる医薬製剤であって； 活性物質もしくは活性作用に寄与する物質または活性を有する他の物質の担体と して、修飾タンパク質または修飾ポリペプチドを含有し；その修飾タンパク質ま たは修飾ポリペプチドは、そのアミノ基および／または他の塩基性官能基を、塩 基性アミノ基および／または他の塩基性官能基のプロトン化を防止する薬剤、ま たは前記塩基性基を負の電荷を有する１つ以上の官能基で置換する薬剤て誘導体 化することによって追加の正味の負電荷を獲得しており、そのタンパク質または ポリペプチドの誘導体の保持時間が、誘導体に変換されていないタンパク質また はポリペプチドと比べて少なくとも９分間延長され、その保持時間は、アニオン 交換カラムでＦＰＬＣによって測定される医薬製剤。
2. ２．誘導体化される基がリシンおよびヒスチジンの残基であり、薬剤がアルデヒ ド、無水物、酸塩化物およびイソ（チオ）シアネートから選択される請求項１記 載の製剤。
3. ３．タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸が、官能アミノ基または塩基性基 を有するアミノ酸で５％以上、好まじくは１５％以上、特に２５％以上構成され ている請求項１記載の製剤。
4. ４．修飾タンパク質または修飾ポリペプチドが、ポリアミノ酸、およびアルブミ ンとα−酸糖タンパク質のようなポリアミノ酸や修飾血漿タンパク質から得られ た請求項１〜３のいずれか１つに記載の製剤。
5. ５．誘導体に変換されるタンパク質が血清アルブミンであり、かつ薬剤がシス− 無水アゴニット酸である請求項１〜４のいずれか１つに記載の製剤。
6. ６．腸内もしくは非経口に投与可能か、または加工して腸内もしくは非経口に投 与できる製剤を提供できる請求項１〜５のいずれか１つに記載の製剤。
7. ７．追加の正味の負電荷を獲得した活性物質が０．１〜１００％の量で存在する 請求項１〜６のいずれか１つに記載の製剤。
8. ８．ウイルス感染症ならびにエイズとエイズ関連疾患を含むレトロウイルス感染 症のような免疫不全症を治療するか、または治癒させるのに適し、かつウイルス 感染細胞が未感染細胞と融合するのを阻害するのに使用できる医薬製剤を製造す る際の、活性物質もしくば活性作用に寄与する物質または活性物質の担体として の、特許請求の範囲１〜７のいずれかに定義された、追加の正味の負電荷を獲得 した物質の用途。
9. ９．エイズおよびエイズ関連疾患のようなレトロウイルスが起こす疾患もしくは 阻害、またはウイルスと細胞の融合またはウイルス感染細胞と未感染細胞の融合 が起こる症状を治療する方法であって、請求項１〜７のいずれかに定義されてい る追加の負電荷を有するタンパク質またはポリペプチドが用いられる方法。
10. １０．修飾タンパク製と修飾ポリペプチドの製造方法であって；タンパク質また はポリペプチドのアミノ基および／または他の塩基性官能基が、塩基性アミノ基 および／または他の塩基性基のプロトン化を防止する薬剤、または前記塩基性基 を負電荷を有する１つ以上の官能基で置換する薬剤で誘導体化され、タンパク質 またはポリペプチドが追加の正味の負電荷を獲得し、その結果タンパク質または ポリペプチドの誘導体の保持時間が、誘導体に変換されていないタンパク質また はポリペプチドと比較して少なくとも９分間延長され、その保持時間がアニオン 変換カラムでＦＰＬＣによって測定されることを特徴とする方法。
11. １１．アミノ基および／または他の塩基性官能基を、塩基性アミノ基および／ま たは他の塩基性がプロトン化するのを防止する薬剤、または前記塩基性基を、負 の電荷を有する１つ以上の官能基で置換する薬剤と反応させたタンパク質もしく はポリペプチドからなり、未修飾のタンパク質またはポリペプチドと比べて追加 の正味の負電荷を有し、そのタンパク質またはポリペプチドの誘導体の保持時間 が、誘導体に変換されていないタンパク質またはポリペプチドに比べて少なくと も９分間延長され、その保持時間がアニオン交換カラムでＦＰＬＣによって測定 される修飾タンパク質または修飾ポリペプチド。