JP2004501111A - 分子を細胞に送達するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

治療的分子に結合されたＶｐｒポリペプチドを含む組成物が提供される。好ましくは、Ｖｐｒは合成Ｖｐｒを含む。治療的分子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／または毒素を含む、Ｖｐｒまたはその断片に結合できる任意の分子を含み得る。本発明はさらに、分子を細胞に送達する方法を提供する。本方法は、分子に結合したＶｐｒポリペプチドを含む結合体と細胞を接触させる段階を含む。本発明は、細胞におけるトランスジーンの発現を調節する方法、被験者において標的細胞集団を殺す方法、細胞の放射線治療に対する感受性を増大させる方法、および細胞の増殖を阻害する方法をさらに含む。

Description

【０００１】
本出願は、２０００年５月２３日に出願された米国特許出願第６０／２０６，６１０号、２００１年２月９日に出願された同第６０／２６７，８２７号、および２００１年４月２０日に出願された同第０９／８３９，３２９号の優先権を主張する。これらの出願の全体は、参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本出願を通して様々な刊行物が参照される。ある例においては、参照は括弧内の数字によって示され、数字は本明細書の末尾に記載される対応する参照についての引用の一覧を指す。本発明が関係する最先端の技術をより完全に説明するために、これらの刊行物の全体の開示内容は、参照として本出願に組み入れられる。本出願は、１９９９年２月１９日および２０００年２月１７日に各々出願された、独国特許出願第１９９ ０８ ７５２．０号および同第１９９ ０８ ７６６．０号に、および、２０００年２月１７日に出願された、対応するＰＣＴ国際特許出願に関連する。これらの関連特許出願の各々の開示内容は、参照として本明細書に組み入れられる。
【０００３】
発明の技術分野
本発明は、分子を細胞に送達するための組成物および方法に関する。とりわけ、本発明は、その結合体が細胞の原形質膜に入ることができる、分子に結合されたＶｐｒポリペプチドまたはその断片に関する。組成物は、薬学的組成物およびワクチン組成物を含み、細胞の放射線治療に対する感受性を調節する方法、ならびに細胞の増殖およびアポトーシスを調節する方法を含む、様々な方法において使用できる。
【０００４】
発明の背景
ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）は、標準レトロウイルスのＧａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖタンパク質、ならびにＴａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、Ｖｉｆ、Ｎｅｆ、およびＶｐｒを含む、６つの制御タンパク質または補助タンパク質をコードするレンチウイルスである。組織培養におけるウイルスの複製に必須ではないが、後者の４つのタンパク質は高度に保存され、インビボにおいて、重要であるがよく理解されていない、ウイルス病原論に寄与する機能を果たす可能性が高い。〜１４ ｋＤａ、９６アミノ酸タンパク質であるＶｐｒは、霊長類レンチウイルスＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）の間において保存されており、これは、Ｖｐｒがインビボにおいてウイルスの生活環における重要な機能を果たすという見解を支持するものである。
【０００５】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）Ｖｐｒは、ウイルスの事前に組込まれた複合体の核への輸送に寄与し、感染した増殖Ｔリンパ球におけるＧ２細胞周期分裂停止を誘導する。原核細胞および真核細胞において、Ｖｐｒは有意に細胞傷害性であり、同種タンパク質複合体および異種タンパク質複合体を形成し、組換えＶｐｒの産生を制限する特徴がある。生物学的研究（２５、２６）および構造的研究（３２、３３、３４）のために、Ｖｐｒの部分的な配列は合成されてきたが、Ｖｐｒの全長の可溶性形態を化学的に合成するのは困難であることが証明された。他の研究者ら（２７）は、不完全な結合、マトリックス相互作用およびペプチド凝集をするその傾向により、Ｖｐｒの合成は困難であると報告した。例えば、ＨＩＶ−１_ＢＲＵ配列に由来するＶｐｒペプチドが合成されたが、不可逆的な凝集により産物の精製が妨げられた（３８、３９、４０）。そのような形態のＶｐｒの生物学的活性は、溶液中においては解析できなかった。結果として生じるタンパク質が水溶液中において可溶性かつ安定のままであるような、合成Ｖｐｒ（ｓＶｐｒ）の高収量の産生のためのプロトコールがなおも必要とされている。
【０００６】
さらに、分子を細胞に送達できる媒体がなおも必要である。Ｖｐｒが少なくとも２つの核局在化シグナルを含み（３、４、５、６、７）、分子を細胞の核に送達できると仮定して、Ｖｐｒの核への送達能を有するような、および、好ましくは変性する必要なく、効率よく原形質膜に入ることができるような媒体が望ましい。
【０００７】
発明の概要
本発明は、治療的分子に結合されたＶｐｒポリペプチドを含む組成物を提供することにより、上記の要求および他の要求を満たすものである。好ましい態様においては、Ｖｐｒは合成Ｖｐｒを含む。本明細書において説明される方法により産生される合成Ｖｐｒのように、合成Ｖｐｒは、好ましくは水溶液中において安定である。治療的分子は、第二ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／または毒素を含む、Ｖｐｒポリペプチドに結合できる任意の分子を含み得る。毒素は、標的細胞集団に対してのみ毒性であるように選択または改変できる。ある態様においては、標的細胞との接触により毒素の活性化を導くような様式で制御分子が影響されるように、制御分子に結合することにより、毒素または他の分子が改変される。例えば、制御分子は、標的細胞集団において発現されるプロテアーゼによって認識されうる。標的細胞との接触後、プロテアーゼはＶｐｒ−毒素結合体を切断し、その結果毒素の活性化が生じる。
【０００８】
本発明は、分子を細胞に送達するための方法をさらに提供する。本方法は、分子に結合されたＶｐｒポリペプチドを含む結合体と細胞を接触させる段階を含む。本発明は、細胞におけるトランスジーンの発現を調節するための方法をさらに提供する。本方法は、制御分子に結合されたＶｐｒポリペプチドと細胞を接触させる段階を含む。Ｖｐｒ：制御分子結合体は、細胞との接触後、細胞に入り、制御分子がトランスジーンの発現を調節する。さらに、本発明は被験者において標的細胞集団を殺す方法を提供する。本方法は、Ｖｐｒポリペプチド：毒素結合体を被験者に投与する段階を含む。ある態様においては、毒素は抗増殖作用物質であり、標的細胞集団は癌細胞である。標的細胞集団は、非標的細胞よりもＶｐｒによる形質導入に対する感受性が高い細胞タイプであってもよく、または非標的細胞よりも毒素に対する感受性が高い細胞タイプであってもよい。ある態様においては、毒素は制御分子にさらに結合される。標的細胞との接触後、制御分子は毒素の活性化を導くような様式で影響される。ある態様においては、標的細胞は、その発現が制御分子によって制御される、トランスジーンまたはトランスジーン産物を含むように改変されている。このようにして、本発明は、遺伝子治療プロトコールによって標的とされる細胞を殺すことにつながる、遺伝子治療の方法の関係において、トランスジーンの発現を調節するための方法を提供する。
【０００９】
本発明は、Ｖｐｒ、好ましくはｓＶｐｒを含む組成物をさらに提供する。そのような組成物は、薬学的組成物およびワクチン組成物を含み、様々な方法において使用できる。ある態様においては、本発明は、Ｖｐｒを被験者に投与する段階を含む、ある抗原に曝露された被験者においてその抗原に対する免疫応答を増強するための方法を提供する。Ｖｐｒは、Ｖｐｒポリペプチドであってもよく、単独で、抗原と共に、またはＶｐｒ：抗原結合体として投与できる。別の態様において、本発明は、Ｖｐｒポリペプチドを被験者に投与する段階を含む、被験者においてＨＩＶに対する免疫応答を増強するための方法を提供する。
【００１０】
さらに別の態様において本発明は、放射線治療に対する細胞の感受性を増大させるための方法を提供する。本発明はさらに、細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。本方法は、細胞をＶｐｒと接触させる段階を含む。Ｖｐｒは放射線と相乗作用し、細胞におけるＧ２分裂停止を起こし、それにより、悪性疾患、および制御異常の細胞増殖に関連する他の疾患の治療のような、放射線治療における使用のための放射線増感剤を提供する。Ｖｐｒはまた、単独で細胞増殖を阻害するよう作用でき、それにより、悪性疾患、乾癬、および制御異常な細胞増殖に関連する他の疾患のような、過増殖性細胞疾患の治療法を提供する。さらに、Ｖｐｒは、アポトーシスを誘導でき、したがって細胞を殺す方法において使用できる。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、培養培地に加えられた場合に、合成Ｖｐｒ（ｓＶｐｒ）が細胞に入り、この細胞への侵入が受容体非依存的な様式で起こるという知見に基づく。ｓＶｐｒは、変性を必要とせずに、ナノモル量において効率よく細胞に入る。Ｖｐｒは免疫原性であるため、またそれは細胞に形質導入するため、Ｖｐｒはワクチンとして（例えば、ＨＩＶワクチンとして）および／またはワクチンアジュバントとして使用できる。そのような使用のために、Ｖｐｒは単独で、またはタンパク質、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡのような第二の分子に結合して投与できる。本発明はさらに、Ｖｐｒが細胞の増殖を阻害し、アポトーシスを誘導し、また放射線と相乗作用して細胞のＧ２ 分裂停止を引き起こすという知見に関し、それにより、細胞増殖を阻害する方法、アポトーシスまたは細胞の致死を誘導する方法、および放射線治療に対する感受性を増大させる方法を提供する。
【００１２】
定義
本出願において使用される全ての科学的および技術的用語は、別途記載がない限り、当技術分野において共通に用いられる意味を有する。本出願において使用されるように、以下の用語または句は明記された意味を有する。
【００１３】
本明細書において使用されるように、「Ｖｐｒポリペプチド」とは、Ｖｐｒの細胞形質導入活性をもつタンパク質またはポリペプチドを意味する。Ｖｐｒポリペプチドおよびその機能的断片は、国際公開公報第９９／０９４１２号、ならびに１９９９年２月１９日および２０００年２月１７日にそれぞれ出願された、独国特許出願第１９９ ０８ ７５２．０号および同第１９９ ０８ ７６６．０号において、また２０００年２月１７日に出願された、対応するＰＣＴ国際特許出願において同定される。
【００１４】
本明細書において使用されるように、「被験者」または「宿主」とは、本発明に従って実施される治療のレシピエントを指す。被験者は任意の脊椎動物でありうるが、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物の場合、被験者は好ましくはヒトであるが、家畜、実験動物、またはペットも可能であってもよい。例えば、被験者は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、またはネコが可能である。
【００１５】
本明細書において使用されるように、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の文脈における「天然の」とは、野生型配列または変化させていない配列を指す。
【００１６】
本明細書において使用されるように、「類似コドン」とは、同じアミノ酸をコードするが、異なる塩基のトリプレットからなると考えられるコドンを意味する。
【００１７】
本明細書において使用されるように、「薬学的に許容される担体」とは、組成物の有効成分と組み合わされた場合に、成分に生物学的活性を維持させ、被験者の免疫系との混乱した反応を起こさないような、任意の材料を含む。例としては、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水乳液のような乳液、および様々なタイプの湿潤剤のような、標準的な薬学的担体のうち任意のものが含まれるが、これらに限定されない。エアロゾルまたは非経口投与のための好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水または標準（０．９％）生理的食塩水である。
【００１８】
よく知られた従来法によって、そのような担体を含む組成物が製剤化される（例えば、「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」， 第４３章， 第１４版， マック出版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ １８０４２， ＵＳＡ）を参照のこと）。
【００１９】
本明細書において使用されるように、「一つの（ａまたはａｎ）」とは、他に明らかに示されない限り、１つまたはそれ以上を意味する。
【００２０】
ｓＶｐｒ の構造および調製
本発明における使用のためのＶｐｒポリペプチドは、好ましくは合成Ｖｐｒ（ｓＶｐｒ）であり、最も好ましくは本明細書の実施例部分において開示される方法に従って調製されるｓＶｐｒの特徴をもつ。ｓＶｐｒの調製の他の方法が使用できるが、タンパク質の凝集を避けるよう注意すべきである。好ましくは、ｓＶｐｒは水溶液中において可溶性であり安定である。他の形質導入タンパク質とは異なり、ｓＶｐｒは尿素変性を必要としない。さらに、ｓＶｐｒの形質導入活性は尿素変性により増強されない。同様に、他の形質導入タンパク質とは異なり、Ｖｐｒは、タンパク質の他の部分の非存在下において機能するアルギニンに富む形質導入ドメインを含まない。ゆえに、その天然の状態におけるＶｐｒまたはｓＶｐｒが好ましい。しかし、当業者には、Ｖｐｒの生物学的活性に干渉せずに、置換および欠失を含むわずかな改変をＶｐｒに施すことができることが理解される。
【００２１】
投与および用量
本方法の好ましい態様においては、全身的、経腸的または局所的な経路を経て、ＶｐｒまたはＶｐｒ結合体が投与される。全身的経路の例には、皮内投与、筋内投与、皮下投与、および静脈内投与が含まれるがこれらに限定されない。局所的な経路の例には、鼻内投与、膣内投与、直腸内投与、気管内投与、経皮的投与、および眼への投与が含まれるがこれらに限定されない。経腸的経路の例には、経口投与および胃への投与が含まれるがこれらに限定されない。
【００２２】
ＶｐｒまたはＶｐｒ結合体は、処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）のための組成物として投与できる。処置には予防および治療（ｔｈｅｒａｐｙ）が含まれるため、本発明の組成物は薬学的組成物およびワクチン組成物の両方を含む。予防または治療は、一時点または複数時点において単回直接投与を行うことにより達成できる。投与はまた、単一部位または複数部位に対して送達することができる。
【００２３】
被験者は任意の脊椎動物でありうるが、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、およびヒツジの動物個体を含む。哺乳動物の場合、被験者は好ましくはヒトであるが、家畜、実験動物、またはペットも可能である。
【００２４】
本発明の状況においては、被験者に投与されるＶｐｒまたはＶｐｒ結合体の用量は、時間を経て被験者において有益な治療反応効果をもたらすのに、または症状を緩和するのに十分であるべきである。ゆえに、結合体または組成物は、疾患による症状および／または合併症を緩和、軽減、治癒、または少なくとも部分的に停止するのに十分な量で患者に投与される。これを達成するための十分な量は、「治療的に有効な用量」と定義される。
【００２５】
使用される剤形は、達成すべき臨床的な目標によって変化するが、適当な用量の範囲は、国際公開公報第９９／０９４１２号および米国特許第５，８０４，６０４号のような、Ｖｐｒおよび同様な分子に関連する他の参照への引用にたどることができる。本発明は、薬学的に許容できる担体を任意で含む、予防的組成物および治療的組成物の両方を提供する。本発明の結合体は、薬学的に許容できる従来の担体、および、例えばマイクロビーズ、ミクロスフェア、経口送達のために設計されたカプセル等を含む、様々な製剤として調製できる。結合体は任意に、被験者の状態の治療において有用な薬剤と共に投与できる。そのような付加的な作用物質は、別々に、または結合体組成物に含めて投与できる。
【００２６】
本開示により提供される開示内容を考慮して、臨床分野における当業者は、結合体の投与を従来の治療と組み合わせることを含む、本発明に係る組成物の投与についての適したパラメータに精通している、またはそれを容易に確かめることができると思われる。
【００２７】
方法
本発明は、分子を細胞に送達するための方法を提供する。本方法は、分子に結合されたＶｐｒポリペプチドを含む結合体に細胞を接触させる段階を含む。ｓＶｐｒは、新たに単離された始原ヒト細胞をナノモル濃度にて迅速且つ強固に形質導入するため、本発明の方法は、分子を細胞に送達するための魅力的かつ有効な手段を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、細胞におけるトランスジーンの発現を調節するための方法を提供する。本方法は制御分子に結合されたＶｐｒポリペプチドと細胞を接触させる段階を含む。Ｖｐｒ：制御分子結合体は、細胞と接触して細胞に入り、制御分子はトランスジーンの発現を調節する。
【００２９】
さらに、本発明は、被験者において標的細胞集団を殺すための方法を提供する。本方法は、Ｖｐｒポリペプチド：毒素結合体を被験者に投与する段階を含む。一つの態様において、毒素は抗増殖作用物質であり、標的細胞集団は癌細胞である。標的細胞集団は、非標的細胞よりもＶｐｒによる形質導入に対する感受性の高い細胞のタイプ、または、非標的細胞よりも毒素に対する感受性の高い細胞のタイプが可能である。ある態様においては、毒素は制御分子にさらに結合される。標的細胞との接触により、制御分子は毒素の活性化につながるような様式で影響される。ある態様においては、標的細胞は、その発現が制御分子により制御されるトランスジーンまたはトランスジーン産物を含むように改変されている。このようにして、本発明は、遺伝子治療プロトコールにより標的とされる細胞を殺すことに帰結する、遺伝子治療方法に関して、トランスジーンの発現を調節するための方法を提供する。また代替の態様においては、標的細胞集団を殺す方法は、Ｖｐｒポリペプチドを毒素または他の分子に結合することを必ずしも必要とせずに、Ｖｐｒポリペプチドを投与することを含む。ｓＶｐｒはアポトーシスを誘導し得るため、非標的細胞よりもＶｐｒ による形質導入に対する感受性の高い細胞が選択的に殺される。
【００３０】
ある態様において本発明は、被験者にＶｐｒを投与する段階を含む、ある抗原に曝露された被験者においてその抗原に対する免疫応答を増大させるための方法を提供する。ＶｐｒはＶｐｒポリペプチドが可能であり、単独で、抗原と共に、またはＶｐｒ：抗原結合体として投与できる。別の態様において本発明は、被験者にＶｐｒポリペプチドを投与する段階を含む、被験者においてＨＩＶに対する免疫応答を増大させるための方法を提供する。下記の実施例において議論されるように、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ３−リンパ球、ならびにＣＤ１４＋単球はｓＶｐｒによって同等に形質導入される。ゆえに、Ｖｐｒおよび／またはＶｐｒ：抗原結合体のこれらの細胞への送達は、ＨＩＶまたは他の抗原に対する免疫応答の誘導または増強において特に有用となり得る。
【００３１】
さらに別の態様においては、本発明は、細胞の放射線治療への感受性を増大させるための方法を提供する。本発明は、細胞の増殖を阻害するための方法をさらに提供する。本方法は、細胞をＶｐｒと接触させる段階を含む。Ｖｐｒは放射線と相乗作用し、細胞におけるＧ２ 分裂停止を起こし、それによって、悪性疾患および制御異常の細胞増殖に関連する他の疾患の治療法のような、放射線治療法における使用のための放射線増感剤を提供する。Ｖｐｒはまた、単独で細胞増殖を阻害するように作用でき、それにより、悪性疾患、乾癬、および制御異常の細胞増殖に関連する他の疾患のような過増殖性細胞疾患に対する治療法を提供する。さらに、Ｖｐｒはアポトーシスを誘導でき、したがって細胞を殺すための方法において使用できる。
【００３２】
実施例
以下の実施例は、本発明を例証し、当業者に同じものを作製および使用する支援をするために示される。実施例は、その他の点では、いかなる形であれ本発明の範囲を制限するものではない。
【００３３】
実施例１： ｓＶｐｒ の生産および生物学的活性
本実施例は、合成Ｖｐｒ（ｓＶｐｒ）の高収率生産のためのプロトコールを記載し、結果的に生じるタンパク質が、構造的研究に必要とされる比較的高いタンパク質濃度においてでさえ、水溶液中にて可溶性かつ安定のままであることを示す。円偏光二色性は、ｓＶｐｒが中性ｐＨにおいては構造をもたないことを示す。対照的に、酸性条件下（ｐＨ＜５．０）において、またはトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）の添加後には、ｓＶｐｒはα−ヘリックス構造をとる。動的光散乱により、ｓＶｐｒはＴＦＥ水溶液中においては二量体を形成し、純水中においては高次の凝集物を形成することが示される。Ｃ−末端断片、ｓＶｐｒ^{４７−９６}の解析により、α−ヘリックス形成および自己会合にこのサブドメインが関与することが示される。^１Ｈ ＮＭＲシグナルは、Ｎ−末端残基およびＣ−末端残基へ帰属させるが、分子の中心部分は自己会合により覆い隠されている。これらの知見から、インビボにおけるｓＶｐｒの折りたたみは、以前に説明されている相互作用細胞タンパク質および相互作用ウイルスタンパク質または相互作用核酸のような、構造を安定化する相互作用因子を必要とする可能性が示唆される。驚くべきことに、生物学的研究においては、細胞外培地からｓＶｐｒが細胞に有効に取り込まれ、また形質導入されたこれらの細胞の核に有効に輸送されることが認められた。細胞外へのｓＶｐｒの添加はまた、ＨｅＬａ細胞におけるＧ２細胞周期分裂停止も誘導する。併せて考えると、これらの知見により、ＨＩＶ感染した患者に認められるＶｐｒの循環形態が、広範囲の宿主標的細胞に対して生物学的な効果を与え得る可能性が提起される。
【００３４】
Ｖｐｒは、少なくとも２つの核局在化シグナルの存在を含む（３、４、５、６、７）、ウイルスの複製を促進し得る重要な生物学的特性をもつ。多くの動物レトロウイルスとは異なり、霊長類レンチウイルスは、分裂していない細胞において効率よく複製できる。Ｔ細胞におけるウイルス複製には必須ではないが、Ｖｐｒは、インビトロにて、末期に分化した単球／マクロファージにおけるウイルスの複製を有意に増加させ、これはその求核特性におそらく関連する機能であると考えられる（３）。Ｖｐｒは予め組込まれたウイルス複合体（ＰＩＣ）の輸送に関与し、核膜孔を通るその通過を促進すると考えられる。この輸送は同様に、ｐ１７^ｇａｇマトリックスおよびインテグラーゼタンパク質を含む、他の求核性ウイルスタンパク質の機能に関与しうる（８、９において総説される）。
【００３５】
Ｖｐｒはまた、感染した増殖ヒトＴ細胞においてＧ２細胞周期分裂停止を誘導する（８、１０、１１において総説される）。そのようなＧ２分裂停止は、ＬＴＲが司る転写により都合のよい細胞内環境を誘導する役割を果たし得る（１２）。実際、ウイルス粒子内には、プロウイルス由来タンパク質の新たな合成の前に、Ｇ２分裂停止を誘導するのに十分な量のＶｐｒが存在する（１３、１４）。Ｖｐｒに起因する他の生物学的活性には、イオンチャネル形成（１５）、様々な異種プロモーターの転写活性化（１６、１７、１８、１９）、グルココルチコイド受容体の共活性化（２０）、細胞分化の制御（１０）、およびアポトーシスの誘導（２１、２２）が含まれる。これら後者の機能の、ＨＩＶ複製生活環の維持、および感染した宿主における疾患の誘導についての重要性は不明のままである。
【００３６】
マクロファージにおけるＨＩＶ−１の複製におけるＶｐｒの関与から、小分子阻害剤を用いたＶｐｒの機能の選択的妨害から、新たなクラスの抗ウイルス剤を生み出し得ることが示唆される。しかし、有効なＶｐｒアンタゴニストのデザインには、その分子構造、機能、および作用様式についてのより詳しい知識が必要である。本質的に無制限の量の純粋かつ生物学的に活性なＶｐｒの利用可能性は、その生物学的機能についての理解における前進を確かに加速し、有効なアンタゴニストの開発を推進することが可能である。組換えＶｐｒは、組換えバキュロウイルスに感染させた昆虫の細胞において作製された。１００ ｐｇ／ｍｌという低い濃度において、組換えＶｐｒを細胞外に添加すると、白血病細胞系および始原末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の双方において、ＨＩＶ−１の複製が活性化される（２３、２４）。Ｖｐｒはまた、大腸菌において、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質として発現された（１５）。しかし、融合タンパク質からの切断後、または高濃度にて単離された場合、これらのＶｐｒ調製物はしばしば自然に凝集する。さらに、組換え遺伝学によるＶｐｒの生産は、原核細胞および真核細胞の双方において、タンパク質の細胞傷害性効果により制限される（２５、２６）。
【００３７】
本実施例は、合成Ｖｐｒ（ｓＶｐｒ）の生産、均質になるまでのその精製、およびＮ−末端配列決定、質量分析（ＭＳ）、およびゲル電気泳動によるこの合成タンパク質の特徴分析について説明する。さらに、様々な条件下の水溶液中におけるｓＶｐｒの挙動を、動的光散乱（ＤＬＳ）、円偏光二色性（ＣＤ）、および^１Ｈ 核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法により解析したものを表す。最終的に、本実施例は、ｓＶｐｒが細胞外培地から有効に取り込まれ、そのような形質導入された細胞の核に輸送され、Ｇ２細胞周期分裂停止を生じることを示す。
【００３８】
材料および方法
ペプチド合成および精製
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＭｉｌｌｉＧｅｎ ９０５０自動ペプチドシンセサイザーにおいて、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ法を用い、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｒ ＰＨＢ Ｓｅｒ（ｔＢｕ）Ｆｍｏｃ樹脂（容量０．１９ ｍｍｏｌ／ｇ）上、スケール０．０９ ｍＭにて合成を行った。以下の側鎖保護基を使用した：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルフォニル（Ａｒｇ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｔｒｐ， Ｌｙｓ）、ｔ−ブチルエーテル（Ｔｈｒ， Ｓｅｒ， Ｔｙｒ）、ｔ−ブチルエステル（Ａｓｐ， Ｇｌｕ）、およびトリチル（Ａｓｎ， Ｃｙｓ， Ｇｌｎ、およびＨｉｓ）。結合は、最後の３０アミノ酸について１−（１−ピロリジニル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ−［４，５−ｂ−］−ピリジン−１−イルメチレン）−ピロリジニウム ヘキサフルオロリン酸−Ｎ−オキシド（ＨＡＰｙＵ）が用いられたことを除き、Ｎ−［１Ｈ−ベンゾトリアゾル（１−イル）（ジメチルアミノ）メチレン］−Ｎ−メチルメタナミニウム ヘキサフルオロリン酸−Ｎ−オキシド（ＨＢＴＵ）を用いて行った。結合は、Ｎ−メチルピロリドンに溶解したＨＢＴＵを結合剤として使用し、最後の５６アミノ酸について単結合につき４５分、二重結合につき７５分のサイクル時間を適用し、１ ｍｍｏｌのＦｍｏｃアミノ酸を用いて行った。合成の最終部分の効率を上げるため、結合試薬としてＨＢＴＵの代わりにＨＡＰｙＵ（４８）を使用した。アスパラギン酸イミド（ａｓｐａｒｔｉｍｉｄｅ）の形成を避けるため、合成の全過程中において、ピペリジン／ＤＭＦ／ギ酸を用いて、Ｎ−末端のＦｍｏｃ基の脱解除を行った。アスパラギン酸イミドの副反応を避けるために、０．１ Ｍ ＨＣＯＯＨを含む、ＤＭＦに溶解した２０％のピペリジンを用いて、合成を完了する間、Ｆｍｏｃ基の脱保護を行った。５３分間にＡ１００％からＢ１００％とした直線勾配法を用い（Ａ、水１，０００ ｍｌ、ＴＦＡ ２ ｍｌ；Ｂ、アセトニトリル ５００ ｍｌ、水 １００ ｍｌ、ＴＦＡ １ ｍｌ）、流速１００ ｍｌ／分にて、λ＝２２０ ｎｍにおける分光測光によるモニタリングを行い、ＶＹＤＡＣ Ｃ１８カラム（４０×３００ ｍｍ、１５２０μ、３００ Å）上での逆相ＨＰＬＣにより、粗製タンパク質を精製した。４５分間に渡ってＢを１０％から１００％とした直線勾配法を用い、ＶＹＤＡＣ Ｃ１８カラム（４．６×２５０、５μ、３００ Å）上におけるＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｌ１０）により、分画を分析した。同じ条件下においてペプチドＶｐｒ^{４７−９６}を合成した。ペプチドＶｐｕ^{３２−８１}の合成については説明されている（３７）。
【００３９】
ｓＶｐｒ の蛍光標識
Ａｌｅｘａ ４８８標識キット（Ａ−１０２３５、モレキュラープローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））を用いてｓＶｐｒを標識した。製造業者の手順を以下のように改変した：２ ｍｇのｓＶｐｒを１ ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、キットから１バイアルの色素を加え、ジイソプロピルエチルアミンを用いてｐＨを８．５〜９．０に調整した。室温における２時間のインキュベーション後、反応物を水で希釈し、ｐＨを２．０に調整した。キットにて供給される樹脂上で標識されたｓＶｐｒを精製した。フローサイトメトリーについて、ＨＢＴＵおよびジイソプロピルエチルアミンを含むＤＭＦ中に溶解したペプチドと樹脂を一晩インキュベートすることにより、ペプチド合成の最終段階においてｓＶｐｒのＮ−末端ＮＨ_２上にて結合された、蛍光色素ビス−１，１’−（４−スルフォブチル）インドジカルボシアニン−５−カルボン酸（ナトリウム塩）を用いてｓＶｐｒを標識した。完了後、樹脂をＤＭＦおよび塩化メチレンで洗浄し、乾燥し、水に溶解した９０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および５％トリイソプロピルシランによって処理した。その後ＴＦＡを真空下で除去し、標準ＨＰＬＣ法により精製したジエチルエーテルを用いてｓＶｐｒを沈降した。この手法により、ペプチドの他の側鎖は機能的なまま、Ｎ−末端残基が選択的に標識され、樹脂になおも付着しながらペプチドの比較的容易な精製が行われる。Ｃｙ３と同様に、この新規の蛍光色素は５５０ ｎｍにおいて吸光し、５８５ ｎｍにおいて発光する。その合成の詳細は、他の部分において説明される。
【００４０】
ペプチド配列決定および質量分析
ｓＶｐｒについて、標準プロトコールに従い、アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４７３Ａ パルス液相シーケンサーにおいて、３０個の配列決定段階を完了した。陽イオンＥＳＩ質量スペクトルを、エレクトロスプレー源を備えた三連四重極型Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＴＳＱ ７００質量分析計において記録した。タンパク質サンプルを７０％のメタノール水溶液に溶解し、電圧５．５ ｋＶ、ＥＳ針を用いて、流速１μｌ／分にてエレクトロスプレーチェンバーに注入した。８〜１３の正の電荷をもつ多荷電分子イオンを示す実験スペクトルを、標準ソフトウェアを用いてデコンボリューションした。Ｎ_２レーザー（３３７ ｎｍ）を用いたブルカーリフレックス（Ｂｒｕｋｅｒ ｒｅｆｌｅｘ）ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ 質量分析計において、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ 質量スペクトルを記録した。
【００４１】
円偏光二色性（ ＣＤ ）分光法
１８０〜２６０ ｎｍの範囲のＪａｓｃｏ Ｊ−６００ ＣＤ分光偏光計において、０．５ ｍｍキュベットを用い、室温にてＣＤスペクトルを記録し、その結果得られた曲線を高周波フィルターを用いて平坦化した。ＶＡＲＳＥＬＥＣプログラムを用いて二次構造含量を定量した。
【００４２】
^１ Ｈ ＮＭＲ 分光法
タンパク質サンプルを、最終容量が０．６ ｍｌとなるように、１０％のＤ_２Ｏを含む、または容量パーセントで５０％の水溶性ＴＦＥ−Ｄ_２を含む蒸留水に溶解した。Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＤＭＸ ６００ ＮＭＲ分光計において、３００°Ｋにてスペクトルを記録した。^１Ｈスペクトルは、ナトリウム４，４−ジメチルｌ−４−シラペンタン−１−スルホン酸、または内部対照としての３．９５ ｐｐｍにおけるＴＦＥの残留メチレンシグナルを参照とした。混合時間１１０分の^１Ｈ ＣＯＳＹ（^１Ｈシフト相関分光法）ＴＯＣＳＹ（全相関分光法）、および混合時間２５０分のＮＯＥＳＹ（核オーバーハウザーおよび交換分光法）の２Ｄ位相敏感スペクトルを、スピニングせずに記録し、標準Ｂｒｕｋｅｒソフトウェアを用いて変換した。
【００４３】
光散乱測定法
ＤｙｎａＰｒｏ−８０１ 分子サイズ決定装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｚｉｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）においてＤＬＳを行った。水または５０％のＴＦＥ水溶液のいずれかにおいて、〜３ ｍｇ／ｍｌ（ｓＶｐｒ）または４ ｍｇ／ｍｌ（Ｖｐｒ^{４７−９６}）の濃度に調製したタンパク質溶液（２５０μｌ）を、０．１μｍのＷｈａｔｍａｎ膜フィルターを通して注入した。微細固体Ｇａ_１−ｙＡｌ_ｙＡｓ−ダイオードにより生じた半導体レーザー（７８０ ｎｍ、２５ ｍＷ）によってサンプルを照射した。サンプル内の粒子により９０°角において散乱させた光子を、アバランシェフォトダイオードによって収集し、散乱光の強度における時間依存的なゆらぎを解析した。製造業者のソフトウェア（Ｄｙｎａｍｉｃｓ、バージョン２．１）を用いて並進拡散係数Ｄ_Ｔを計算した。サンプルの多分散性の程度、および以下のストークス‐アインシュタインの式を用いて粒子の流体力学的回転半径Ｒ_Ｈを計算するために、Ｄ_Ｔをその後使用した：（Ｒ_Ｈ＝（ｋ_ｂＴ）^＊（６πηＤ_Ｔ）^−１， ｋｂ ＝ ボルツマン定数， Ｔ ＝ ケルビン（Ｋ）における絶対温度， およびη ＝ 溶媒粘度）。製造業者により提供される標準曲線（Ｍ_ｒ対 Ｒ_Ｈ）上にてＭ_ｒを計算した。各サンプルにつき連続した１０回の測定を行った。
【００４４】
抗体、 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 、ウエスタンブロット法、および免疫沈降法
ウサギポリクローナル抗血清、Ｒ−９６を、ｓＶｐｒを用いた免疫化により作製した。Ｔｒｉｔｏｎ洗浄緩衝液（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、６０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中においてｓＶｐｒの免疫沈降を実施し、非免疫ヒト血清およびウサギ血清を用いて予備精製し、引き続き、ＧａｍｍａＢｉｎｄ−Ｐｌｕｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズに事前に充填したＲ−９６抗体と共にインキュベーションを行った。Ｔｒｉｔｏｎ洗浄緩衝液により免疫沈降物を２回洗浄し、ＳＤＳ−ＤＯＣ緩衝液（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、３００ ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、０．１％ デオキシコール酸）により１回洗浄し、サンプル緩衝液（２％ＳＤＳ、１％メルカプトエタノール、１％グリセロール、６５ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ ６．８）中において９５℃にて１０分間沸騰し、１６％ＰＲＯＳＩＥＶＥ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において電気泳動を行った。ｐＮＬ４−３（４９）を用いてトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞においてウイルスストックを作製し、続いて、ＭＴ ４細胞を感染するために使用した。細胞培養上清からウイルス粒子をペレット化し（３０，０００ｘｇ、１．５時間、４℃）、スクロースクッション上にて精製した。イムノブロット法については、イムノビロン（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｌｏｎ）ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（イムノビロン社（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｌｏｎ））にサンプルを移した。膜をＲ−９６とインキュベートし、^１２５Ｉ標識したプロテインＧを用いて抗体の結合を測定した。
【００４５】
ｓＶｐｒ の細胞への取り込み
クロラミンＴ法を用いてｓＶｐｒおよびＶｐｕ^{３２−８１}をヨウ素化した。手短に言えば、５．５×１０^７Ｂｑ（１．５ ｍＣｉ）Ｎａ^１２５Ｉと〜２０μｇのペプチドを反応させた。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を飽和させたＤｏｗｅｘイオン交換カラムを通したゲル濾過クロマトグラフィーにより、フリーのヨウ素を除去した。細胞の取り込みの研究のために、２４ウェルプレート上にて、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、ラット卵黄絨毛癌Ｌ２−ＲＹＣ細胞を７５％の集密度まで増殖させた。生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ）により細胞を１回洗浄し、０．１％のＢＳＡおよび^１２５Ｉ標識したｓＶｐｒを補給した、または陰性対照として、^１２５Ｉ標識したＶｐｕ^{３２−８１}を補給した、無血清のＤＭＥＭにおいてインキュベートした。１８ ｋＢｑ／ｍｌの特定の活性において放射性のペプチドを培地に加えた。同時にまた、細胞を１００倍過剰な非標識ｓＶｐｒまたはＶｐｕ^{３２−８１}によって処理した。３７℃において特定の時間、細胞をインキュベートし、説明されたように（５０）、細胞内または細胞外の放射能の分布を測定した。手短に言えば、培地を取り除き、細胞層をＰＢＳで洗浄し、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ のＰＢＳ溶液を用いて細胞溶解した。培地および細胞層における放射能を３回測定した。ペプチドの細胞表面への非特異的な結合について補正するため、０分（放射性標識されたペプチドが３０秒未満培地に添加された時間）の時点で測定された細胞層の放射能を、細胞層において検出された放射能からバックグラウンドとして減算した。
【００４６】
細胞の局在性についての研究のために、ＨｅＬａ細胞（２×１０^６／ｍｌ）の上清、またはチェンバースライドにおいて培養されたヒトマクロファージの集密的単層のいずれかを、蛍光ｓＶｐｒ−４８８と共にインキュベートした。４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１％のパラホルムアルデヒドで１０分間固定し、封入した。蛍光追加型または走査型共焦点顕微鏡（モデルＭＲＣ−６００；Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｓ）により検体を調べた。無作為の、ＨＩＶ−１−血清陰性の健常ドナーの血液から、マクロファージを単離した。最初に、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＰＢＭＣを単離し、ＤＭＥＭ、１０％ ＦＣＳ、および１０％ヒト血清ＡＢ（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を含むスライドチェンバーにおいて増殖させた。１週間後、細胞を洗浄し、ｓＶｐｒに関する輸送の研究のために、単球由来のマクロファージの接着単層を使用した。ｓＶｐｒ−Ｃｙ３により形質導入された細胞数は、フローサイトメトリーにより評価された。
【００４７】
細胞周期解析
ＨｅＬａ細胞をｓＶｐｒ−Ｃｙ３と４８時間インキュベートし、トリプシン処理し、２％のホルムアルデヒド中にて３０分間固定し、引き続き、１ ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡおよび１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムのＰＢＳ溶液と共に３０分間インキュベートした。その後、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを用いて、固定した細胞における細胞ＤＮＡ容量を評価し、ＭｏｄＦｉｔ ＬＴプログラム（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析した。
【００４８】
結果
ｓＶｐｒ の合成および精製
単離物ＨＩＶ−１_{ＮＬ４−３}に由来する配列を用いて、全長Ｖｐｒの固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を行った（図１Ａ）。図１Ｂおよび図１Ｃにおいて、粗タンパク質産物および精製タンパク質産物のＨＰＬＣプロフィールが各々示される。近年報告された、異なるＨＩＶ−１単離物に由来するＶｐｒタンパク質の合成のためのＳＰＰＳ法（２７）とは対照的に、本手法は、本明細書にて説明されるように、結合剤、保護基、切断試薬、および結合反応の継続時間の使用に関連して最適化された。本プロトコールでは、不完全な結合および脱保護、樹脂マトリックスとの鎖間および鎖内反応、水素結合仲介のペプチド凝集、または側鎖反応のような、以前に報告された（２７）合成に関するいずれの問題にも遭遇せずに、再現性をもって高収率（通常１５％）の精製ｓＶｐｒを与えた。ｓＶｐｒの様々な断片もまた、同じＳＰＰＳプロトコールを用いて合成された。Ｔｙｒ−４７からＳｅｒ−９６の位置のｓＶｐｒ のＣ−末端ドメインを含む、ペプチドＶｐｒ^{４７−９６}のＨＰＬＣによる精製は、図１Ｇにて示される。
【００４９】
タンパク質配列決定、 ＭＳ 、およびウエスタンブロット法による ｓＶｐｒ の解析
精製ｓＶｐｒの同一性は、Ｎ−末端の３０アミノ酸の配列決定によって確証された。分子量の決定のために、陽イオンエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＭＳを使用した。実験データは、ｓＶｐｒについて計算された分子量１１３７７．９ Ｄａに正確に対応する、分子量１１３７７．９ Ｄａ（図１Ｅ）の分子イオンクラスターについての顕著な包絡線を与えるためにデコンボリューションした、よく定義付けされた多荷電スペクトル（図１Ｄ）を示した。さらにまた、ｓＶｐｒの正確な分子量が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化‐飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＳ（質量分析法）によって確立され、１１３７７．２ Ｄａにおいて顕著な分子イオンクラスターが示された（非表示）。要約すると、ＭＳおよび配列解析により、ｓＶｐｒが相同であることが示され、検出可能な副産物の証拠は全く示されなかった。同様の結果はまた、Ｃ−末端断片Ｖｐｒ^{４７−９６}についても得られた。ペプチドを均質になるまで精製し（図１Ｇ）、ＥＳＩ ＭＳにより正確な分子量５８２９．７ Ｄａを確立した（図１Ｆ）。
【００５０】
ｓＶｐｒの分子特性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりさらに特徴分析された（図２）。ｓＶｐｒの希釈物を分離し、Ｖｐｒ特異的抗体を用いたウエスタンブロット法により検出した。ウイルスＶｐｒとの比較のために、精製ＨＩＶ−１粒子の溶解物を並行して分析した（図２Ａ）。配列決定およびＭＳのデータと一致して、ｓＶｐｒは、〜１４ ｋＤａの明らかな分子量をもつ単一バンドとして移動し、それはウイルスＶｐｒの移動とほとんど見分けがつかなかった。ウエスタンブロット法（図２Ａ）、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるｓＶｐｒの直接銀染色（図２Ｂ）により、タンパク質分解または不完全な合成から生じ得るペプチド断片は検出されなかった。
【００５１】
単量体Ｖｐｒに加え、二量体および三量体と一致する、Ｍ_ｒ範囲における低いパーセンテージのｓＶｐｒが検出された。そのような候補オリゴマーは、レーン当たりのｓＶｐｒ が＞２５０μｇという濃度においてのみ検出された（図２Ａ）。（ＤＬＳにより下記に示されるように）ｓＶｐｒが多量体を形成するという事実は、化学的架橋によるＶｐｒオリゴマーについての過去の発表（２８）と一致する。これらの複合的な形態はウイルスＶｐｒ調製物には認められなかった（図２Ａ）。これらの結果は２つの可能性によって説明できる。第一に、ウエスタンブロット法による単量体ｓＶｐｒの検出に従い、解析された最高量のウイルスＶｐｒはレーン当たり〜１２５ ｎｇのｓＶｐｒに相当した；この濃度において、ｓＶｐｒの多量体は検出されなかった。第二に、Ｐｒ５５ Ｇａｇ ポリプロテインのＣ−末端ｐ６^ｇａｇドメインの間の物理的相互作用（２９、３０）は、Ｖｐｒの出芽ウイルス粒子への取り込みを司る（３１）。したがって、ウイルス調製物においては、少なくとも既知のＶｐｒ結合パートナーの１つであるｐ６^ｇａｇの存在が、単離されたｓＶｐｒについては明らかであった、ウイルスＶｐｒの同種オリゴマー形成を阻害する可能性がある。
【００５２】
Ｖｐｒは、分子間ジスルフィド結合形成に潜在的に関与し得る残基７６に１つのシステインを含む。ウイルスＶｐｒまたは組換えＶｐｒについては、ジスルフィド架橋二量体は報告されていないが、還元剤の非存在下におけるｓＶｐｒ のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、〜１０％の分子がジスルフィド結合二量体として存在し、これらの二量体の形成はジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加することにより阻害されることが示された（図２Ｂ）。
【００５３】
ｓＶｐｒはまた、ウサギにおいてポリクローナル抗Ｖｐｒ抗体を作製するために免疫原として使用された。ｓＶｐｒの鍵穴接着因子ヘモシアニンへの標準的な結合をしない場合、抗Ｖｐｒ抗体、Ｒ−９６の力価は有意に増加した。その結果生じるＲ−９６抗血清は、幾つかの異なるＨＩＶ−１単離物由来のＶｐｒタンパク質と反応し、ウイルス由来のＶｐｒおよび同等の能力をもつｓＶｐｒの双方に結合する。さらに、免疫沈降のためにＲ−９６を用いると、ｓＶｐｒはヒト血清中に希釈された１０ ｎｇ／ｍｌもの低い濃度で検出された（図２Ｃ）。併せて考えると、このことによって、ＨＩＶに感染した個体の血清サンプル中におけるウイルスＶｐｒの検出についての、Ｒ−９６の有用性が示される（２３）。
【００５４】
Ｖｐｒ の ＤＬＳ 解析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図２Ａ、Ｂ）および過去に公表された架橋に関するデータ（２８）は、単離されたＶｐｒはオリゴマー構造を形成する傾向があることを示唆する。化学的架橋による特定の折りたたみ状態の人工的な固定とは対照的に、溶液中のその動的状態におけるｓＶｐｒの多量体形成について研究するため、ＤＬＳを使用し、様々な溶液条件下におけるｓＶｐｒを調べた。純水中、ｐＨ調整をせずに（ｐＨ〜３．０）３．８ ｍｇ／ｍｌの濃度において、初期ＤＬＳデータのデコンボリューションにより、分子量が各々１２８ ｋＤａおよび８０７５ ｋＤａの複合体に対応して、およそ４．８ ｎｍおよび２６．２ ｎｍのＲ_Ｈ値（相対存在率１４％および８６％）を有する、少なくとも２つの主な成分の存在が示される。ゆえに、水溶液中において、ｓＶｐｒは高次凝集物（＞ ５００個）として存在しており、より小さなオリゴマーのパーセンテージは低かった。そのようなｓＶｐｒの高次複合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析できず、架橋により安定化できない。多くのｓＶｐｒが高分子量の凝集物として存在するにも関わらず、４ ｍｇ／ｍｌの高い濃度においてでさえ、ペプチドの沈降は認められなかった。
【００５５】
次に、ｓＶｐｒ の多量体が、分子内相互作用を促進し、Ｖｐｒクラスター形成を促進することが暗示された（３２）疎水性分子間相互作用を抑制する、ＴＦＥのような有機溶媒により減少され得るか否かを試験した。５０％ＴＦＥにおいて得られたＤＬＳデータは、ｓＶｐｒが、２．３ ｎｍの平均Ｒ_Ｈから１５％未満に偏った粒子サイズをもつ単一の分子種として存在することを示した。この値は２６ ｋＤａの分子量によく一致し、ＴＦＥが安定なｓＶｐｒ二量体の形成を誘導することを示す。ゆえに、ＴＦＥを添加することにより、高次凝集物の実質的な減少および二量体の形成が促進される。これは、凝集の傾向を弱める二次構造の変化によって、またはＴＦＥによる疎水性相互作用の抑制によって得られる。
【００５６】
近年、ｓＶｐｒ の第三のＣ−末端のα−ヘリックス内に位置する、ロイシンに富む（ＬＲ）ドメインが、Ｖｐｒの同種オリゴマー形成について分子的拘束を与えることが示唆された（３２）。したがって、Ｃ−末端断片、Ｖｐｒ^{４７−９６}もまた、自己会合する傾向があるか否かを調べた。純水中のＶｐｒ^{４７−９６}のＤＬＳ解析により、〜４３ ｋＤａの六量体粒子に対応する、〜３ ｎｍのＲ_Ｈ値をもつ単一成分（存在率９８．５％）が示された。５０％のＴＦＥの添加後、１つの主要な分子種（存在率９４．２％）であるモノマー（Ｒ_Ｈ＝１．２５， ６．２５ ｋＤａ）、および少量の二量体および三量体が検出された。これらのデータは、全長ｓＶｐｒのように、Ｃ−末端断片Ｖｐｒ^{４７−９６}は、溶媒の疎水性に依存するオリゴマー形成について固有の傾向を表すことを示す。
【００５７】
ＣＤ 分光法による ｓＶｐｒ の特徴分析
ｓＶｐｒにおける二次構造に対するＴＦＥの効果をさらに解析するため、様々な溶液条件下におけるＣＤ分光法によってペプチドを調べた。最初に、緩衝液を使わず、水単独中において、ｐＨ〜３．８にてｓＶｐｒを解析した。対応するＣＤ曲線により、２０８ ｎｍおよび２２２ ｎｍにおける負の楕円率、および、〜１９２ ｎｍにおける強い正のバンドが示された（図３Ａ）。これらの知見により、ＣＤスペクトルのデコンボリューションに従って、〜１８％を占める、有意な含量のα−ヘリックス構造の存在が示唆された。２０％までのＴＦＥの添加は、これらのヘリックス構造（らせん含量〜３１％まで）の初期の安定化をもたらした一方、ＴＦＥを６０％までさらに加えると、より小さな変化が誘導され、およそ５０％のＴＦＥにおいてらせん含量が最大となった。Ｖｐｒタンパク質断片に関する過去の研究（３２、３３、３４、３５）とは対照的に、本明細書において説明される知見は、ｓＶｐｒが純水中においてでさえ構造を有し、そのヘリックス構造はＴＦＥによって安定化されるが誘導はされないことを示唆する。
【００５８】
計算された塩基性等電点と比較して、Ｖｐｒが主に発現される細胞質ゾルまたは細胞の核における生理的ｐＨとは一致しないため、ｓＶｐｒの溶液が酸性ｐＨにおいてらせん立体配置をとることは驚くべきことであった。したがって、リン酸緩衝液（Ｐｉ）中、一定濃度において、ｐＨを３．９〜７．２に変化させてｓＶｐｒを解析した（図３Ｂ）。意外なことに、５．０までのｐＨの増加ではほとんど影響は見られなかった一方、中性のｐＨ ７．２において、タンパク質は完全にランダムな立体構造をとった。この推移は、およそ５．０の臨界ｐＨにおいて起こり、ＣＤ曲線はｐＨ ６．０において幾らか形を失い始めた（データ非表示）一方、構造の消失は中性のｐＨにおいて完全なものとなった。ＤＬＳによる測定と一致して、調べられたいずれの溶液条件下においても、ｓＶｐｒ の沈降は明らかに認められなかった。
【００５９】
中性ｐＨによるｓＶｐｒ構造に対する不安定化の効果が、酸性ｐＨにおいてペプチド構造に対してわずかな効果をもつと考えられる作用物質であるＴＦＥの添加によって逆転できるかどうかを、引き続き試験した。ｐＨ３．８において最大に近い効果をもっていた（図３Ａ）２０％のＴＦＥの添加では、中性ｐＨにおけるｓＶｐｒは安定化されなかった（図３Ｃ）。しかし、ＴＦＥがなくてはｓＶｐｒ が構造を全く示さない臨界中性ｐＨ（図３Ｂ）においてでさえも、５０％ものＴＦＥ濃度によって明らかに、ｓＶｐｒのヘリックス構造が存在するような環境が与えられた（図３Ｄ）。５０％のＴＦＥにおいては、ｐＨ ４から７．２への変化では、ＣＤ曲線に対して小さな影響しかなく、二次構造が完全なままに保たれ、より高いｐＨへの推移においてわずかにのみ不安定化されたことが暗示された（図３Ｄ）。
【００６０】
Ｖｐｒの５１−残基のＮ−末端断片の構造についての近年の研究では、二次構造に対するｐＨの変化の重要性が明らかにされなかった（３５）。これらの知見は、ｓＶｐｒのｐＨ依存的な折りたたみに寄与する構造モチーフ（図３）は、ＶｐｒのＣ−末端ドメイン内に位置する可能性があることを暗示した。この仮説を試験するため、断片Ｖｐｒ^{４７−９６}（図１Ｆ、Ｇ）の同一のＣＤ解析を行った（図４）。ｓＶｐｒと同様に、純水中においてＶｐｒ^{４７−９６}は酸性ｐＨ ４．１をとり、ｓＶｐｒ のように顕著ではないが、ヘリックス立体構造をもつ傾向があった（図４Ａ）。ＴＦＥを加えることによりらせん含量は増加したが、ｓＶｐｒとは対照的に、ＴＦＥ濃度に対し線形反応があり、それは９８％のＴＦＥにて最大に達した。ｓＶｐｒに関するように、Ｖｐｒ^{４７−９６}についてｐＨ依存的な折りたたみスイッチがｐＨ ５．０において認められた（図４Ｂ）。ＴＦＥの効果は、Ｖｐｒ^{４７−９６}のアンフォールディングが２０％ＴＦＥの添加によってある程度逆転できたため、ｓＶｐｒ の状況とはわずかに異なった（図５Ｃ）。再度、５０％ＴＦＥ溶液中において、中性ｐＨの不安定化効果はほとんどなかった（図５Ｄ）。ゆえに、Ｃ−末端断片の折りたたみは、全長ｓＶｐｒのものと同様な様式で溶媒条件における変化に反応した。
【００６１】
要約すると、溶液条件は、全長Ｖｐｒの構造に大いに影響を与え得る：ペプチドは中性ｐＨにおいては全く構造をもたない一方、ｐＨを臨界閾値のｐＨ ５．０まで下げることにより、またはＴＦＥのような膜模倣物を加えることにより、主にα−ヘリックスに相応する二次構造が安定化される。この現象は、少なくとも部分的には、ＶｐｒのＣ−末端に、最も高い可能性ではＬＲドメインに位置する構造に起因する可能性がある。
【００６２】
ｓＶｐｒ の ^１ Ｈ ＮＭＲ 分光法による特徴分析
ｓＶｐｒの構造は、様々な溶液条件下における^１Ｈ ＮＭＲ分光法によりさらに解析された。１Ｄおよび２Ｄ^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、ｐＨ ３．１の、塩類または緩衝液を全く加えない水単独中において、およびＴＦＥ／水（１：１）中において記録した。タンパク質の沈降の徴候が全くないｓＶｐｒの安定な溶液が、ＣＤ測定において使用されたものよりもかなり高い濃度で得られた。ｓＶｐｒの１Ｄスペクトル（図５）は、大多数は水単独中における線が最大幅であったが、いずれの溶液についても比較的広い線を示した。これは、５０％のＴＦＥ溶液中において、９．４〜９．９ ｐｐｍにおけるＴｒｐ−Ｎ^１Ｈシグナルについて１０〜１２ Ｈｚの線幅が測定されたスペクトルの低野領域において容易に認められる（図５Ｂ）が、純水中において得られたスペクトルにおいては、これらの線は認められなかった（図５Ｃ）。
【００６３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（図２Ｂ）は、ｓＶｐｒの小部分がジスルフィド結合二量体を形成することを示した。しかし、ＮＭＲスペクトルにおいては、等モル量のＤＴＴの添加により、目に見える変化は与えられず、分子の大多数はジスルフィド結合二量体として存在しないことが示唆された。だが、ＮＭＲデータがｐＨ〜３のタンパク質溶液を用いて得られた一方、ＳＤＳ−ＰＡＧＥはｐＨ ６．８において実施されたことを留意しなければならない。したがって、タンパク質−タンパク質相互作用を示唆する、シグナルの広がり（図５）は、Ｃ−末端におけるロイシンジッパーモチーフが関与した、非共有結合による会合から生じる可能性が非常に高い（３２）。
【００６４】
１Ｄおよび２Ｄ ＮＭＲスペクトル（図５および図６）は、さらなる現象を示す：純水および５０％のＴＦＥ溶液の双方において、タンパク質は特に広い線を示すある領域をもつ一方、分子の少なくとも幾つかの部分は、より鋭い線をもたらすように比較的柔軟性であると考えられる。ゆえに、異なる等高レベルにおける２Ｄ ＴＯＣＳＹスペクトルを調べることにより（図６）、分解可能なスピン系をもつ幾つかの残基があることが示唆される。５０％のＴＦＥ中におけるｓＶｐｒのＮＯＥＳＹスペクトルは、これらのシグナルがタンパク質の最初の７ Ｎ−末端（Ｇｌｕ−２からＧｌｎ−８）および５ Ｃ−末端（Ｇｌｙ−９２からＳｅｒ−９６）残基に属することを示す（図６Ａ）。同様に、水単独中における低濃度のｓＶｐｒにおいて、Ｃ−末端残基Ｇｌｙ−８２からＴｈｒ−８４およびＧｌｙ−９２からＡｒｇ−９５が、明らかに同定された（図６Ｂ）。
【００６５】
細胞外 ｓＶｐｒ は細胞を形質導入し、核に局在化する
ＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質のように、細胞外Ｖｐｒは生物学的活性をもつことが示された。組換えＶｐｒまたは高度のＨＩＶ−１量を表す患者の血清から単離されたＶｐｒは、感染した細胞系および始原ヒトＰＢＭＣの両方において、ウイルスの複製を増強する（２３、２４）。さらに、細胞培養培地に加えられた組換えＶｐｒは、グルココルチコイド様の効果を及ぼすと考えられる（２２）。しかし、ウイルス粒子フリーのＶｐｒが実際に細胞に入るかどうか、または代わりに細胞表面受容体に結合し様々なシグナリングカスケードを開始するかどうかは正式には決定されなかった。これらの疑問を解決するために、およびｓＶｐｒの生物学的活性を試験するために、ｓＶｐｒの細胞への取り込みおよび細胞下の局在化について研究された。マクロファージおよびＨｅＬａ細胞の両方において、ペプチドの潜在的な取り込みおよび細胞下の局在化をモニタリングするため、ペプチドを蛍光物質Ａｌｅｘａ−４８８により標識した（ｓＶｐｒ−４８８）。これらの研究は、細胞外培地へのその添加に続いて、ｓＶｐｒ−４８８が有効に細胞に入り（タンパク質形質導入と呼ばれる）、さらに、これらの形質導入された細胞の核に蓄積されることを明らかにした（図７）。この細胞内染色パターンは、１０倍高い濃度の標識対照ペプチド（ｐ６^ｇａｇ−４８８）、または結合していない蛍光色素そのものには認められなかった。共焦点顕微鏡により、ＨｅＬａ細胞においては、形質導入されたペプチドｓＶｐｒ−４８８は時には細胞質ゾルスポットに集中する一方、ペプチドの大部分は明らかに核に局在化されると考えられることが明らかになった（図７Ｃ、Ｄ）。これらのデータは、ｓＶｐｒがＨＩＶ−１の複製を活性化し、出芽ＨＩＶ−１ウイルス粒子に特異的に取り込まれるという予備観察と併せて、ｓＶｐｒがウイルスＶｐｒのものと同様の生物学的活性を有する証拠を提供する。
【００６６】
ｓＶｐｒ の受容体非依存的な取り込み
次に、ｓＶｐｒの取り込みの特異性について解析した。Ｖｐｒは陽イオンであるため、その取り込みが、様々な組織において発現され、正に荷電した分子に結合する細胞表面受容体であるメガリン（３６）により仲介される可能性が考えられた。多量のメガリンを発現する、癌細胞系Ｌ２−ＲＹＣにおいては、有意な、かつ時間依存的なｓＶｐｒの取り込みが認められた（図８）。２時間以内に細胞内ｓＶｐｒのレベルは最高の８〜１０％に達し、引き続き１６時間まで一定のプラトーとなった。このプラトーは、放射能の取り込みと分泌の間の定常状態を反映し得る。対照的に、全長ｓＶｐｒと同じ条件下において合成され、同様の二次構造因子を含む５０アミノ酸対照ペプチドＶｐｕ^{３２−８１}（３７）は、有効に内在化されなかった（図８）。ＨｅＬａ細胞においても同様な結果が得られた。
【００６７】
さらに、^１２５Ｉ標識したｓＶｐｒの取り込みは、１００倍過剰な非標識ｓＶｐｒによっては阻害されず（図８）、このことにより、この過程が可飽和受容体系に関わらないか、または非常に高い容量の受容体系によって仲介されることが示唆された。
【００６８】
ｓＶｐｒ は効率よく形質導入され、 Ｇ２ 細胞周期分裂停止を誘導する
ＨＩＶ−１ Ｖｐｒをコードする発現ベクターを用いた、様々な増殖ヒト細胞のトランスフェクションにより、トランスフェクションされた大多数の細胞においてＧ２細胞周期が生じる（１０）。ｓＶｐｒの求核特性を考え、細胞外から加えられたｓＶｐｒ を用いて形質導入された細胞が、同様の細胞周期分裂停止を受けるかどうかを調べた。ＨｅＬａ細胞をＣｙ−３様蛍光物質で標識したｓＶｐｒとインキュベートし、それにより形質導入された細胞の有効な選別がなされた。ｓＶｐｒ−Ｃｙ３を２、５、および１０μｇ／ｍｌの濃度で加えた場合、フローサイトメトリー法により、培地からのｓＶｐｒ−Ｃｙ３の用量依存的な取り込み（各々細胞の７１％、９２％、および９７％）が明らかになった（図９Ａ）。２μｇ／ｍｌのｓＶｐｒ−Ｃｙ３と共に細胞をインキュベートし、蛍光に基づいて選別した場合、陽性細胞の３０％が細胞周期のＧ２／Ｍ期において分裂停止した。対照的に、形質導入しない細胞集団の１３％のみの細胞がＧ２／Ｍにあった（図９Ｂ）。これらのデータは、ｓＶｐｒが生物学的に活性であり、感受性の細胞においてＧ２細胞周期分裂停止を誘導できることを示唆する。
【００６９】
考察
全長 Ｖｐｒ の合成
Ｖｐｒの生物学的研究および構造的研究は、凝集を導く同種分子相互作用および異種分子相互作用に関与するＶｐｒの固有の傾向による、精製タンパク質の限られた利用可能性により妨げられてきた。生物学的研究（２５、２６）および構造的研究（３２、３３、３４）のために、Ｖｐｒの部分的配列は合成されたが、可溶性形態の全長のＶｐｒを化学的に合成することは困難であることが証明された。例えば、ＨＩＶ−１_ＢＲＵ配列に由来するＶｐｒペプチドが合成されたが、不可逆的な凝集により産物の精製は不可能であった（３８、３９、４０）。そのような形態のＶｐｒの生物学的活性は溶液中においては解析できなかった。ファーウエスタンブロット法により、ＳＤＳ−変性Ｖｐｒのウイルスヌクレオキャプシドｐ７^ＮＣとの結合が示され（３９）、その発見はウイルス由来のＶｐｒについては再現されなかった（３０）。本明細書にて説明される最適化ＳＰＰＳプロトコールにより、構造的および生物学的解析のために十分な量の可溶性Ｖｐｒが合成される。このアプローチはまた、原核細胞または真核細胞のいずれかにおいてＶｐｒが発現される場合の細胞傷害性効果、およびそれに伴って得られる低収量（２１、２２、２５）を妨げる。不完全な結合、マトリックス相互作用およびペプチド凝集をするその傾向により、Ｖｐｒは合成するのが難しいことが他の研究者らによって主張された（２７）が、付加的な側鎖保護を行わない、最適化した、Ｆｍｏｃを用いた化学法の本使用によっては、これらの困難には遭遇しなかった。
【００７０】
ｓＶｐｒ の構造およびオリゴマー形成に溶液条件が与える影響
Ｖｐｒの構造的および機能的ドメインを同定および特徴分析するために、幾つかの試みが行われてきた。このタンパク質は、少なくとも４つの別個のドメインを含むと考えられる：負に荷電したＮ−末端、３つのヘリックス（Ｎ−末端のα−１およびα−２およびＣ−末端のα−３）からなる中央ドメイン、および正に荷電したＣ−末端（図１Ａ）。最もよく特徴付けられた領域であるα−３（残基５３〜７８）は、自己会合に関わる短いロイシンジッパー様モチーフを含むロイシンに富むドメインと重なる（３２、４１）。機能的ドメインの決定の多くは主に突然変異解析に由来し、多様な結果により理解しづらくなっている。Ｖｐｒ長に渡る突然変異はこのタンパク質の様々な特性を変化し得るが、核への局在化および細胞周期分裂停止は、Ｖｐｒにおける異なるドメインによるものと決定された（４、２５、３４、４１、４２）。Ｖｐｒ断片の構造的解析は、ＣＤ分光法およびＮＭＲ分光法によった。全ての場合において、構造安定化効果を与えることのできる適切な溶液条件を得るために、膜模倣有機溶媒ＴＦＥまたはミセル溶液を使用した。構造的な詳細は報告されていないが、ＨＩＶ−１_ＢＲＵに基づく全長ｓＶｐｒについては、３０％のＴＦＥ中において研究されている（２７）。
【００７１】
水のみにおける、および５０％のＴＦＥ中における、ｓＶｐｒについての最初のＮＭＲ実験では、分子の中央部分から^１Ｈシグナルについての線の広がりが同定され、２Ｄデータにより、限られた数のみのＣ−末端残基またはＮ−末端残基の連続帰属がなされた。ｓＶｐｒの折りたたみ特性に関するさらなる洞察を深めるために、様々な溶液中においてｓＶｐｒ のＤＬＳおよびＣＤ試験を行った。純水において、および、他の結合パートナーの非存在下においては、ｓＶｐｒは低いｐＨにおいて有意な量のα−ヘリックス構造を保存する大きな複合体を形成した。ｐＨが５．０を超えると、構造はランダムとなった。意外なことに、このｐＨ誘導のスイッチは、ＴＦＥの添加により最小限にされた。ゆえに、ＴＦＥはｓＶｐｒに対し３つの顕著な効果をもつ：それは、大きな複合体の形成を阻害し、低いｐＨにおいて二次構造を安定化し、この二次構造を生理的ｐＨにおける崩壊から保護する。これらの特徴は、細胞タンパク質およびウイルスタンパク質（８にて総説される）を含む、またはＨＩＶ−１由来のＤＮＡ（３２、４３）さえも含む、他の分子と相互作用するＶｐｒの傾向と一致する。これらの相互作用は、ＴＦＥまたはｐＨと同様に、Ｖｐｒの構造および折りたたみを安定化する可能性がある。
【００７２】
ｓＶｐｒ の細胞への取り込みおよび核へのトランスロケーション
重要なのは、ｓＶｐｒ がウイルス由来のＶｐｒに特有なものと同様の生物学的活性を示すことを証明することであった。実際、ｓＶｐｒ は、ウイルス由来のＶｐｒまたはトランスフェクションされた細胞において発現されたＶｐｒと同様の求核特性を示した。さらに、ｓＶｐｒも、ヒト細胞においてＧ２細胞周期分裂停止を誘導した。おそらく最も驚くべきは、細胞培養の細胞外培地に加えられた場合でさえ、ｓＶｐｒ がこれらの効果を媒介したことであった。生物学的機能は細胞外Ｖｐｒによるものであったが、Ｖｐｒが実際にウイルスの状況に非依存的に細胞に入れるかどうかは知られていなかった。これらの知見は、Ｖｐｒの単離された分子のみが有効に細胞を形質導入でき、生物学的効果を及ぼすことができることの最初の証拠である。
【００７３】
ＨＩＶタンパク質Ｔａｔもまた、有効なタンパク質形質導入ドメインを含むことが示された（４４、４５）。近年、インビボにおける研究にて、Ｔａｔが、脳を含む異なる一連の細胞において、Ｔａｔに融合された様々なタンパク質の細胞への取り込みを促進できることが示された（４６、４７）。この知見は、ＶｐｒおよびＴａｔがタンパク質形質導入特性を共有することを示唆する。Ｖｐｒの異常な双極子特性が、Ｃ−末端塩基性残基と協働して、膜リン脂質上の電荷へのＶｐｒの結合を制御し、Ｖｐｒに存在する両親媒性ヘリックスによって細胞への取り込みが仲介され得る可能性が高い。Ｔａｔの形質導入ドメインは、近年、Ｖｐｒの塩基性Ｃ−末端の中央にあるモチーフＲＱＲＲＡＲに非常によく似た配列ＹＧＫＫＲＲＱＲＲＲに位置付けられた（４４）。興味深いことに、このアルギニンに富むドメインは、新たな、低エネルギーの、ＲａｎＧＴＰ非依存的な、核への輸送経路による、異種細胞質タンパク質の核へのトランスロケーションには十分である（４）。Ｖｐｒ内に含まれる、少なくとも２つの輸送シグナル、即ち、ロイシンに富むヘリックスからなるもの、および、塩基性Ｃ−末端領域に存在するものがあることが提案された（４）。
【００７４】
細胞のｓＶｐｒによる形質導入は、タンパク質を細胞質ゾルおよび核に送達するための新規の方法を提供する。これは、設計タンパク質を治療的作用物質として細胞を形質導入する、形質導入の可能な働きに新たな次元を加える。さらに、この送達系は、ナノモル濃度のｓＶｐｒにて非常に効率がよく、Ｔａｔ仲介の形質導入の効率を急速に上げる手順である（４７）変性段階を必要としない。ｓＶｐｒがその求核特性を維持し、形質導入された細胞においてＧ２細胞周期分裂停止を誘導できることは注目すべきである。これらの知見により、インビボにおいて、細胞外Ｖｐｒは生物学的に活性であり、ＨＩＶに感染できない標的宿主細胞さえも標的とすることができるという意見への支持が加えられる。
【００７５】
ｓＶｐｒは非常に免疫原性が高い。ｓＶｐｒは、Ｖｐｒと反応する、高力価および広域反応性であるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生じるために使用された。さらに、ｓＶｐｒは、始原細胞におけるＨＩＶ−１の複製を活性化し、ウイルス粒子に有効に取り込まれる。これにより、ｓＶｐｒが細胞外培地から取り込まれ、核に局在化し、Ｇ２細胞周期分裂停止を誘導するという知見と共に、調製されたペプチドが生物学的活性を示すことの確信が生み出される。有意な量の生物学的に活性なｓＶｐｒの利用可能性は、このウイルスタンパク質の明確な機能、その作用機序、およびＨＩＶ病原論へのその寄与を明らかにすることを目指すさらなる研究を可能にすると考えられる。
【００７６】
実施例 ２ ： ＨＩＶ−１ に感染した細胞および感染しない細胞における、 ｓＶｐｒ の生物学的活性のさらなる解明
タンパク質の形質導入とは、受容体非依存的かつエネルギー非依存的な過程において、生体膜を通過する能力である。ＶｐｒのＣ−末端部分のヘリックス車輪モデルにおける整列により、特徴付けられた他の形質導入タンパク質の形質導入ドメインと同様な、アルギニンに富む表面が明らかになった。トリプシン非感受性により決定される、ｓＶｐｒの細胞への取り込みは、４℃において有効に起き、これはショウジョウバエのアンテナペディア、ＨＳＶ ＶＰ２２、およびＨＩＶ Ｔａｔタンパク質について以前に説明されたタンパク質形質導入と一致する特性である。
【００７７】
本実施例は、迅速なタンパク質形質導入についてｓＶｐｒが最適化され、ＨＩＶ−１に感染した細胞および感染していない細胞において生物学的に活性であることを示す。手短に言えば、この結果により、以下のことが示される：（１）推定上の形質導入ドメインをｓＶｐｒ分子の残りから分離することにより、形質導入できる機能的Ｖｐｒではなくなる；（２）尿素変性はｓＶｐｒ の形質導入特性を増強しない；（３）ｓＶｐｒは、新たに単離された始原ヒト細胞をナノモル濃度にて迅速かつ強固に形質導入する；（４）ＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ３−リンパ球およびＣＤ１４＋単球はｓＶｐｒによって同等に形質導入される；および（５）ｓＶｐｒは培養されたＴ細胞においてアポトーシスを誘導する。
【００７８】
全長Ｖｐｒは化学的に合成され、蛍光標識され、逆相ＨＰＬＣによって精製され、様々な細胞培養の細胞外培地に加えられた。ｓＶｐｒの細胞への取り込みをモニタリングするため、フローサイトメトリーおよび蛍光追加型顕微鏡を使用した。細胞周期の異なる期内における細胞の分布を、ＤＮＡのＴｏ−Ｐｒｏ−３ 色素染色法によって調べ、引き続きフローサイトメトリー法を行った。結果は図１０〜２９において要約される。
【００７９】
意外にも、ｓＶｐｒ の形質導入ドメインをマッピングする試験により、以前に同定された形質導入タンパク質とは対照的に、ｓＶｐｒは、タンパク質の他の部分の非存在下において機能する、アルギニンに富む形質導入ドメインを表さないことが明らかになった。ｓＶｐｒ断片、特にｓＶｐｒ の残基１〜４７および５２〜９６の形質導入能を調べ、これらの断片が全長ｓＶｐｒの形質導入能を欠くことが明らかになった（図２８）。全長ｓＶｐｒ、または少なくとも推定上の形質導入ドメインのみより多くの部分が、効率のよいタンパク質形質導入に必要であると考えられる。
【００８０】
さらに、尿素変性がその形質導入特性を増強しないという点において、ｓＶｐｒは他の形質導入タンパク質とは異なる（図１１）。併せて考えると、これらの結果は、Ｖｐｒはその天然の状態において、その形質導入特性について最適化できることを示唆し、ＨＩＶの生物学におけるその潜在的な重要性をさらに強調するものである。
【００８１】
さらに、ｓＶｐｒは、新たに単離した始原ヒト細胞をナノモル濃度にて迅速かつ強固に形質導入する（図２４）。新たに単離した混合細胞集団の解析により、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ３−リンパ球およびＣＤ１４＋単球は、ｓＶｐｒ により同等に形質導入されることが明らかである（図１６Ａ〜Ｈ；図２６）。形質導入されたヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、細胞周期のＧ２期において蓄積する（図１５Ａ〜Ｅ）。加えて、全長ｓＶｐｒは、培養Ｔ細胞においてアポトーシスを誘導することが認められた（図２５）。さらに、形質導入されたｓＶｐｒは、単球由来のマクロファージの核において集中し、これらの細胞においてＶｐｒを欠くＨＩＶウイルスの複製を有意に増加する（図１０Ａ〜Ｂおよび図２３Ａ〜Ｄ）。
【００８２】
これらの研究により、ＨＩＶ−１ Ｖｐｒは、限られたエネルギー条件下において、明らかな受容体非依存性および迅速な取り込みを含む、タンパク質形質導入についての最適化がなされることが示される。そのようなタンパク質形質導入特性は、ＨＩＶに、ウイルスに直接感染していない宿主細胞に対してその影響を拡張させる可能性がある。図２２は、Ｖｐｒの相対位置を示す、ＨＩＶ−１ゲノムの概要説明である。Ｖｐｒは、多量体形成する可能性の高い、９６アミノ酸、１４ ｋＤの小さなタンパク質である。Ｖｐｒは、ＨＩＶ−１粒子に含まれ、ｐ６^Ｇａｇに結合し、ｐ６^Ｇａｇとの相互作用を通して、高いストイキオメトリーでウイルス粒子に取り込まれる。その構造は、ＣＤおよびＮＭＲによって推測され、ロイシンに富む２つのヘリックス、およびＣ−末端のアルギニンに富むドメインを含むことが認められた。それはインビボにおいて高度に保存されたＯＲＦをもち、少なくとも２つのＮＬＳシグナルを含む：１〜７１（β−Ｇａｌ；ＢＳＡ）および７３〜９６（β−Ｇａｌ）。Ｖｐｒは、ウイルスの事前に組込まれた複合体の核ターゲティングに寄与する可能性の高い、少なくとも２つの核局在化シグナルを含む。
【００８３】
参考文献

【００８４】
当業者には、前述の説明において開示された概念および特定の態様が、本発明の同じ目的を実行するために、改変する、または他の態様をデザインするための基礎として容易に利用できることが認識されると思われる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ〜Ｇ。ｓＶｐｒおよびＣ末端断片Ｖｐｒ^{４７−９６}の合成、精製、およびＭＳ解析。（１Ａ）単離物ＨＩＶ−１_{ＮＬ４−３}に由来するｓＶｐｒの主要な配列は、Ｖｐｒ断片において同定された二次構造モデルの下に示される（３２、３５）。末端における正または負に荷電した残基およびヘリックス構造、ならびにＶｐｒのオリゴマー形成におそらく関与すると考えられるロイシンに富む（ＬＲ）ジッパー様モチーフが示される。２１４ ｎｍにおけるＵＶ検出を用いた、逆相アセトニトリル勾配ＨＰＬＣにより得られた、粗精製（１Ｂ）または精製された（１Ｃ）ｓＶｐｒのクロマトグラムが示される。精製ｓＶｐｒの陽イオンＥＳＩ 質量スペクトル：多荷電イオンの分布を示す、実験に基づく質量スペクトル（１Ｄ）。１１３７７．９ Ｄａにおける分子イオンの強度の包絡線（ｉｎｔｅｎｓｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ）を示す、デコンボリューションした質量スペクトル（１Ｅ）。精製したＶｐｒ^{４７−９６}の実験に基づくＥＳＩ 質量スペクトル（１Ｆ）およびクロマトグラム（１Ｇ）。
【図２】図２Ａ〜Ｃ。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット法、および免疫沈降法によるｓＶｐｒの特徴分析。（２Ａ）レーン当たり２５０ ｎｇから６０ ｎｇへのｓＶｐｒ、または２０μｌから５μｌのＨＩＶ−１ウイルス粒子の溶解物の一連の希釈を、１６％ゲル上にてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、Ｒ−９６抗体を用いて染色した。抗体の結合はＥＣＬ反応により視覚化した。分子量標準マーカータンパク質の位置は左に示され、ｓＶｐｒの単量体および二量体の位置は右に示される。（２Ｂ）２５０ ｍＭ ＤＤＴの存在下または非存在下における、２５０ ｎｇおよび１００ ｎｇのｓＶｐｒを分離した後の銀染色した１８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（２Ｃ）ｓＶｐｒ（０．１〜１０ ｎｇ）をヒト血清と混合し、Ｒ−９６抗体を用いて免疫沈降した。１４％ゲル上においてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより免疫沈降物を分離し、エレクトロトランスファーし、検出のためにＲ−９６抗体および^１２５Ｉ−プロテインＧを用いたウエスタンブロット法により分析した。右の図においては、ウエスタンブロット解析の前に、ｓＶｐｒ（レーン当たり０．０１〜１０ ｎｇ）をゲルにおいて直接分離した。２日間の曝露のオートラジオグラムが両図において示される。
【図３】図３Ａ〜Ｄ。ｓＶｐｒ の遠紫外線ＣＤスペクトル。スペクトルは純水中異なるＴＦＥ濃度にて（３Ａ）、およびＰｉ緩衝液単独において（３Ｂ）または２０％ＴＦＥ（３Ｃ）もしくは５０％ＴＦＥ（３Ｄ）と共に、異なるｐＨ値にて記録された。
【図４】図４Ａ〜Ｄ。純水中において異なるＴＦＥ濃度にて（４Ａ）記録された、および、Ｐｉ緩衝液単独（４Ｂ）、または２０％ＴＦＥ（４Ｃ）もしくは５０％ＴＦＥ（４Ｄ）中において異なるｐＨ値にて記録された、Ｖｐｒ^{４７−９６}の遠紫外線ＣＤスペクトル。
【図５】図５Ａ〜Ｃ。ｓＶｐｒ の１Ｄ ^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。（５Ａ）５０％ＴＦＥ中における^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。（５Ｂ）同じスペクトルの低野領域。（５Ｃ）水のみにおけるｓＶｐｒ の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルの対応する低野領域。
【図６】図６Ａ〜Ｂ。ｓＶｐｒ の２Ｄ ^１Ｈ ＴＯＣＳＹスペクトル。５０％ＴＦＥ中における（６Ａ）および水のみにおける（６Ｂ）、ｓＶｐｒ の２Ｄ ＴＯＣＳＹスペクトルのＮＨ領域は、鋭いシグナルを示すことが表された。シグナルの帰属は本文中において説明されるものである。
【図７】図７Ａ〜Ｄ。ｓＶｐｒ−４８８の細胞の取り込みおよび細胞内局在化。０．１μｇ／ｍｌの濃度における、蛍光標識されたペプチドｓＶｐｒ−４８８を、ヒトマクロファージ（７Ａおよび７Ｂ）またはＨｅＬａ細胞（７Ｃおよび７Ｄ）に加えた。４８時間後、細胞を固定し、位相差顕微鏡（７Ａ）および蛍光追加型顕微鏡（７Ｂ）によって、または位相差（７Ｃ上）もしくは蛍光追加（７Ｃ下、および７Ｄ）を用いた走査型共焦点顕微鏡によって調べた。
【図８】ｓＶｐｒの受容体非依存的な取り込み。^１２５Ｉ標識したｓＶｐｒまたはＶｐｕ^{３２−８１}（対照）と共に、６０〜１２０分間、Ｌ２細胞をインキュベートし、細胞層および培地における放射能の分布を３回測定した。並行して、^１２５Ｉ標識したｓＶｐｒ および１００倍モル過剰の非標識ｓＶｐｒと細胞を、１２０分間インキュベートした。
【図９】図９Ａ〜Ｂ。ｓＶｐｒによる形質導入およびＧ２細胞周期分裂停止の誘導。（９Ａ）ｓＶｐｒ−Ｃｙ３または同様に標識したｐ６^ｇａｇ−Ｃｙ３を指示濃度で含む培地において、ＨｅＬａ細胞をインキュベートし、固定し、ヨウ化プロピジウムを用いて染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ｓＶｐｒ−Ｃｙ３の用量依存的な取り込みがあった一方、ｐ６^ｇａｇ−Ｃｙ３では細胞の染色が認められなかった。（９Ｂ）２μｇ／ｍｌのｓＶｐｒ−Ｃｙ３とインキュベートされたＨｅＬａ細胞の細胞周期の分析により、Ｇ２／Ｍ期における、Ｃｙ３−陰性細胞より有意に多いＣｙ３−陽性細胞が示される。
【図１０】図１０Ａ〜Ｅ。ｓＶｐｒの、細胞の形質導入および核への輸送。（１０Ａ〜Ｂ）標準顕微鏡を用いて視覚化されたマクロファージ。（１０Ｃ〜Ｅ）共焦点顕微鏡を用いて視覚化されたＨｅＬａ細胞。
【図１１】もはや形質導入しない、尿素変性したＶｐｒ−β−ガラクトシダーゼ。棒グラフは、Ｍ９−ＦＩＴＣ対照、および尿素処理した、もしくはしていないＶｐｒ−β−ｇａｌ ＦＩＴＣについての ＦＩＴＣ＋細胞のパーセントを示す。
【図１２】図１２Ａ〜Ｆ。ｓＶｐｒは細胞外画分から細胞内へ形質導入する。グラフは、擬似物（Ａ）、Ｃｙ３単独（Ｂ）、ｐ６^ｇａｇ−Ｃｙ３（２５μｇ／ｍｌ）（Ｃ）、ｓＶｐｒ−Ｃｙ３（２μｇ／ｍｌ）（Ｄ）、ｓＶｐｒ−Ｃｙ３（５μｇ／ｍｌ）（Ｅ）、およびｓＶｐｒ−Ｃｙ３（１０μｇ／ｍｌ）（Ｆ）に曝露された細胞についての計数をプロットする。
【図１３】図１３Ａ〜Ｂ。ｓＶｐｒはＧ２細胞周期分裂停止を誘導する。ｓＶｐｒ−Ｃｙ３を用いて形質導入された細胞（Ｂ）では、Ｃｙ３陰性細胞（Ａ）に比較して、Ｇ２／Ｍにある細胞がより大きな割合を示す。
【図１４】図１４Ａ〜Ｄ。ｓＶｐｒは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を用量依存的な様式で形質導入する。ＳＳＣ高は、３０μｇ／ｍｌのｐ６（Ａ）、７．５μｇ／ｍｌのｓＶｐｒ（Ｂ）、１５μｇ／ｍｌのｓＶｐｒ（Ｃ）、および３０μｇ／ｍｌのｓＶｐｒ（Ｄ）について、ＦＬ１−Ｈ：Ａｌｅｘａ−４８８の関数としてプロットされる。
【図１５】図１５Ａ〜Ｅ。ｓＶｐｒはＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を形質導入し、用量依存的なＧ２細胞周期分裂停止を誘導する。ｓＶｐｒ亜集団は、ＦＬ１−Ｈ：Ａｌｅｘａ−４８８に基づいて同定される（１５Ａ）。ｓＶｐｒの用量依存的なＧ２分裂停止は、形質導入されていない細胞集団（１５Ｂ）、形質導入された亜集団Ａ（１５Ｃ）、形質導入された亜集団Ｂ（１５Ｄ）、および形質導入された亜集団Ｃ（１５Ｅ）について、ヨウ化プロピジウムにより示されるように、Ｇ１／Ｇ０にある細胞数対Ｇ２／Ｍにある細胞数の比較により示される。
【図１６】図１６Ａ〜Ｈ。ｓＶｐｒは、健常なドナーから新たに単離された末梢血単核細胞を形質導入する。３０μｇ／ｍｌのｐ６−Ｃｙ３（１６Ａ〜Ｄ）、または、３０μｇ／ｍｌのｓＶｐｒ−Ｃｙ３（１６Ｅ〜Ｈ）への曝露に続き、ドナーＡ〜Ｄから単離されたＰＢＭＣについて、ＦＬ４−Ｈ：Ｃｙ３の関数としてＳＳＣ高が示される。
【図１７】ｓＶｐｒは新たに産生されたＨＩＶ−１ウイルス粒子に取り込まれる。異なる濃度のｓＶｐｒに曝露されたＨＩＶ−１ウイルス粒子と比較する、抗Ｖｐｒおよび抗ｐ２４抗体を用いたウエスタンブロットが示される。
【図１８】電荷特性に基づくタンパク質の形質導入のポテンシャルモデルを示す概要図；デロッシ（Ｄｅｒｏｓｓｉ）ら， ＪＢＣ １９９６ ２７１：１８１８８から適用。
【図１９】図１９Ａ〜Ｂ。ｓＶｐｒの細胞の取り込みは競合実験において阻害されない。細胞の取り込みのパーセントは、^１２５Ｉ標識したｓＶｐｒおよびＶｐｕ^{３２−８１}について、６０分および１２０分にてプロットされ、１００×非標識ｓＶｐｒを加えた際の取り込みと比較される。
【図２０】提唱されるＨＩＶ−１ Ｖｐｒの二次構造を示す概要図。
【図２１】この概略図に示されるように、ＶｐｒのＣ−末端の輸送シグナルは、２つの部分からなり、アルギニンに富むモチーフを含む。
【図２２】ＨＩＶ−１の他の構成要素に相関してＶｐｒの位置を示すＨＩＶ−１の概略図。
【図２３】図２３Ａ〜Ｄ。細胞外培地へのｓＶｐｒの添加は、マクロファージにおけるＨＩＶ−１ΔＶｐｒの複製を増強する。ｓＶｐｒ^１−９６を添加した、または添加していない、野生型（Ａ）およびΔＶｐｒ（Ｂ〜Ｄ）について、感染後日の関数としてＲＴ活性がプロットされる。
【図２４】Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞によるｓＶｐｒの取り込みは迅速である。擬似物、ｐ６対照、およびｓＶｐｒ について、５分、１５分、および３０分におけるＣｙ３−陽性細胞のパーセントがプロットされる。５分において、７５％を超える細胞において取り込みが認められる。
【図２５】ｓＶｐｒはＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞においてアポトーシスを誘導する。アポトーシス細胞のパーセントが、対照、Ｖｐｒおよびｐ６による処理後日の関数としてプロットされる。３日後までに、ｓＶｐｒで処理したおよそ９０％の細胞がアポトーシスとなる。
【図２６】ｓＶｐｒは複数の細胞タイプを形質導入する。ｐ６（対照）またはｓＶｐｒで処理したＣＤ３−、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ１４＋細胞について、Ｃｙ３−陽性細胞のパーセントがプロットされる。
【図２７】ｓＶｐｒは４℃において細胞に入る。３７℃または４℃において、トリプシンの存在下または非存在下において、トランスフェリンまたはｓＶｐｒで処理した細胞についての幾何平均蛍光がプロットされる。
【図２８】ｓＶｐｒの断片は形質導入しない。トリプシンの存在下または非存在下において、３７℃または４℃におけるｓＶｐｒ^１−４７またはｓＶｐｒ^{５２−９６}に曝露された細胞についての幾何平均蛍光がプロットされる。
【図２９】α−へリックス車輪モデルによって予測されるように、ＮＬ４−３ ＶｐｒのＣ−末端ドメインにおけるアルギニン残基が共通な面上に整列していることの概要説明。

Claims (34)

1. 治療的分子に結合されたＶｐｒポリペプチドを含む組成物。
2. Ｖｐｒが合成Ｖｐｒを含む、請求項１記載の組成物。
3. 合成Ｖｐｒが水溶液中において安定である、請求項２記載の組成物。
4. 治療的分子がポリペプチドを含む、請求項１記載の組成物。
5. 治療的分子がポリヌクレオチドを含む、請求項１記載の組成物。
6. ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項５記載の組成物。
7. 治療的分子が毒素を含む、請求項１記載の組成物。
8. Ｖｐｒポリペプチドが全長Ｖｐｒ^１−９６を含む、請求項１記載の組成物。
9. 分子に結合されたＶｐｒポリペプチドを含む結合体と細胞を接触させる段階を含む、分子を細胞に送達する方法。
10. 分子が細胞の核に送達される、請求項８記載の方法。
11. Ｖｐｒが合成Ｖｐｒを含む、請求項８記載の方法。
12. 合成Ｖｐｒが水溶液中において安定である、請求項１１記載の方法。
13. Ｖｐｒポリペプチドが全長Ｖｐｒ^１−９６を含む、請求項８記載の方法。
14. 分子がポリペプチドを含む、請求項８記載の方法。
15. 分子がポリヌクレオチドを含む、請求項８記載の方法。
16. ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項１５記載の方法。
17. 分子が毒素を含む、請求項８記載の方法。
18. 細胞が癌細胞である、請求項８記載の方法。
19. 細胞が病原体に感染される、請求項８記載の方法。
20. 病原体がウイルス、細菌、または寄生生物である、請求項１９記載の方法。
21. ウイルスがレンチウイルスまたはレトロウイルスである、請求項２０記載の方法。
22. レンチウイルスがＨＩＶである、請求項２１記載の方法。
23. 細胞がトランスジーンを発現するように遺伝学的に改変される、請求項８記載の方法。
24. 毒素に結合されたＶｐｒポリペプチドを被験者に投与する段階を含む、被験者において標的細胞を殺す方法。
25. Ｖｐｒポリペプチドが全長Ｖｐｒ^１−９６を含む、請求項２４記載の方法。
26. 毒素が制御分子にさらに結合され、それにより標的細胞との接触が制御分子に影響を及ぼし、毒素の活性化につながる、請求項２４記載の方法。
27. 標的細胞が癌細胞である、請求項２４記載の方法。
28. 標的細胞が病原体に感染される、請求項２４記載の方法。
29. Ｖｐｒポリペプチドと細胞を接触させる段階を含む、細胞増殖を阻害する方法。
30. Ｖｐｒポリペプチドが全長Ｖｐｒ^１−９６を含む、請求項２９記載の方法。
31. 細胞を放射能と接触させる段階をさらに含む、請求項２９記載の方法。
32. Ｖｐｒを含む組成物を被験者に投与する段階を含む、被験者における制御異常の細胞増殖に関連する疾患を治療する方法。
33. Ｖｐｒを含む組成物を被験者に投与する段階を含む、放射線治療を受ける被験者における放射線治療に対する感受性を増大させる方法。
34. 放射線治療の１週間以内に組成物が投与される、請求項３３記載の方法。

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