CN109675042B - 用于治疗和/或预防流感的组合物、方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗和/或预防流感的组合物、方法和用途。所述组合物包含经酸酐处理的蛋白质和另一种用于治疗和/或预防流感的药物。本发明制备的酸酐化蛋白是酸酐化的乳球蛋白，在体外实验中可以广谱地抑制多种亚型流感病毒感染细胞；在动物体内实验中，其具有显著的预防和治疗流感病毒感染的作用。流感病毒具有亚型多、突变率高的特点，使广谱性抗流感制剂的开发十分重要。酸酐化蛋白不仅可抑制多种季节性流感病毒的感染，而且对高致病性禽流感病毒H7N9和曾引起大流行的流感病毒H1N1(2009)也有显著的抑制作用，提示它可被开发成为高效、广谱地防治流感病毒的生物制剂。

Description

用于治疗和/或预防流感的组合物、方法和用途

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，具体地涉及经酸酐处理的蛋白质抑制流感病毒的方法和用途。

背景技术

流感病毒与流感疫情

流行性感冒(Influenza)，是由流感病毒(Influenza viruses,IVs)感染引起的，可引起急性呼吸道感染，主要是口、咽、支气管甚至肺部的不适，特征是突发高热、咽痛、咳嗽、流涕和肌肉关节痛等，严重的将导致死亡。世界卫生组织在2018年底的统计结果显示，每年仅因季节性流感引起的呼吸道疾病，就会造成全球范围内29万到65万人死亡。历史上四次大规模流感的爆发，每年的季节性流感和新型流感的突发与流行，提示着流感病毒对人类健康有持续性的威胁。

流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，是一种高突变率、高致病性的RNA病毒。流感病毒根据核蛋白和基质蛋白抗原决定簇的不同，可划分为甲(A)、乙(B)、丙(C)和丁(D)四个亚型，甲、乙、丙型三种流感病毒都可感染人，其中，甲型流感病毒主要感染人、猪、马和禽类，乙型主要感染人和猪，丙型只感染人，丁型主要感染猪和牛。甲型流感病毒变异性强，是引起人类中流感大流行的原因。甲型流感病毒表面主要有两种糖蛋白，分别是血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)，根据它们抗原性的不同，血凝素HA可被划分为18个亚型H1～H18，神经氨酸酶NA可被划分为11个亚型N1～N11。流感病毒的命名是由HA和NA的组合决定的，例如高致病禽流感H7N9，其命名就是根据重组病毒的HA为H7亚型，NA为N9亚型。

人感染的流感病毒，主要通过空气飞沫等，以人传人的方式传播。禽类流感病毒由于与人流感病毒的唾液酸受体偏好性不同，禽类病毒优先与α2,3-唾液酸受体结合，人类适应的病毒与α2,6-唾液酸受体特异性结合，由于人上呼吸道只分布有α2,6-唾液酸受体，因此禽流感病毒不易传染到人类。但近几年爆发的禽流感病毒H5N1和H7N9，提示了新发的，特别是高致病性的流感病毒，可不受受体局限而感染人类，致人感染致死的风险大大增加。

流感病毒的防控现状和关键科学问题

季节性流感每年发生，接种疫苗仍是预防流感最好的办法。但为应对高变异的流感病毒每年需要重新接种，且疫苗有效性的检验需要三至六个月；疫苗对流感抗原具有选择特异性，对季节性流感的预测往往不准，保护作用受限；且疫苗对于儿童和老人等免疫功能低下人群的保护效果不佳。此外，目前可用的流感疫苗仅能抵抗部分甲型和乙型流感病毒毒株，对于H5N1和H7N9等高致病性禽流感病毒的疫苗尚未批准，这使得流感疫苗的应用有很大的局限性。研究新型的、高效广谱的流感疫苗来抵抗高变异的流感病毒，一直是领域难点。

流感病毒感染后治疗主要依赖的已批准药物有离子通道阻滞剂、神经氨酸酶抑制剂和RNA酶抑制剂等。离子通道阻滞剂烷胺类药物，如上市药物金刚烷胺(amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)，此类药物通过阻断M2离子通道来阻止病毒脱衣壳，以影响病毒的复制过程。离子通道类药物有很多缺陷，如对甲型流感病毒外的病毒无效，出现病毒耐药株及药物本身对中枢神经系统有副作用等，目前已很少应用于流感病毒的治疗。神经氨酸酶抑制剂，如扎那米韦(zanamivir)、奥司他韦(oseltamivir)、拉那米韦(laninamivir)和帕拉米韦(peramivir)，则是通过阻止流感病毒与细胞唾液酸受体结合后的切割，使病毒不能从被感染的宿主细胞中释放，因而可特异性抑制流感病毒。神经氨酸酶抑制剂在使用过程中，已出现多种流感病毒的耐药株，例如奥司他韦在使用两天后就有耐药性产生，帕拉米韦的治疗效果因耐药等问题受限制等。RNA聚合酶抑制剂Xofluza是最新被批准上市的药物，它作用于流感病毒复制周期的早期阶段，通过抑制cap-依赖型核酸内切酶(cap-dependentendonuclease)，来抑制流感病毒的复制。此类药物对H5N1和H7N9病毒有一定的抑制作用，但是否能对未来的新变异的流感病毒起到抑制作用，尚未证实。流感病毒的高突变特征，决定了开发有效的广谱性抗流感药物的重要性。因此，如何获得高效的且广谱性抗流感病毒的新型药物仍然是研究领域的关键科学问题之一。

发明内容

本发明工作基础

姜世勃教授及其科研团队在抗HIV-1病毒的研究中发现，牛β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)被3-羟基-邻苯二甲酸酐(3-hydroxy phthalic anhydride,HP)修饰后可以抵抗HIV-1病毒入侵细胞，此研究是蛋白类抗病毒药物研究领域的新进展。科研团队在其后证实经HP修饰的β-LG对单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)和人类乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)有抑制作用，而酸酐化修饰后的蛋白质对中东呼吸综合征冠状病毒(Middle east respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)等病毒却没有显著活性。后续研究发现，经马来酸酐(maleicanhydride，缩写为ML)修饰的人血清白蛋白(human serum albumin，缩写为HSA)可抑制人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,RSV)的感染；经HP修饰的人血清白蛋白可抑制埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)的感染。这些研究提示我们，酸酐化蛋白是否具有抑制感染的作用，仍然有病毒间的差异性存在。发掘酸酐化蛋白的抗病毒潜能，并探究酸酐化蛋白对不同病毒有抑制活性和无显著活性的机制，对蛋白类药物抗病毒作用的研究具有重要意义。

流感病毒HA蛋白是病毒表面分布最多的糖蛋白，是流感病毒入侵细胞时起关键作用的部分，若能阻断HA蛋白与细胞上受体的结合，也就能在最早阶段阻断流感病毒感染靶细胞。本发明制备的生物制剂基于以上机理，通过修饰后蛋白与HA蛋白相互作用，阻断HA与唾液酸受体的结合，抑制流感病毒感染细胞，从而起到抗病毒的作用。

经实验验证，本发明制备的蛋白在体内外实验中均可有效地抵抗多种流感病毒的感染，且在体外实验中显示了高的安全性，提示其可作为候选药物用于流感患者的治疗；本发明制备的蛋白是以β-LG蛋白电荷修饰为基础的，通过物理作用结合流感病毒血凝素HA，以达到抑制病毒感染的目的，因而不易产生耐药株。

本发明基于流感病毒的高突变性和高致病性以及流感病毒现有药物的耐药性和局限性，提出一种对多种亚型的季节性流感病毒和高致病性流感病毒有预防和控制作用的生物制剂的制备方法。

本发明的设计思路在于：蛋白上的碱性氨基酸通过含有特殊官能团的化合物-酸酐的作用而被修饰，酸酐使蛋白带上负电荷，能与病毒表面糖蛋白HA的受体结合域结合，而致流感病毒结合唾液酸受体的途径被阻断，使病毒不能黏附宿主细胞而进入细胞，从而起到阻断病毒感染的作用，实现广谱性抗多种流感病毒的目的。

基于这一目的，本发明的实施方案如下：

1.用于治疗和/或预防流感的组合物，其包含经酸酐处理的蛋白质和任选的另一种用于治疗和/或预防流感的药物，其中优选地所述药物选自：奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、拉那米韦、Xofluza、金刚烷胺和金刚乙胺；

其中所述经酸酐处理的蛋白质是通过将酸酐溶液与蛋白质溶液混合产生的，其中所述蛋白质选自：乳球蛋白，优选β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)，更优选牛β-乳球蛋白；白蛋白，优选牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白；RNA酶，优选RNA酶Ι；

2.根据项1所述的组合物，其中所述酸酐选自：3-羟基-邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐和马来酸酐。

3.根据项1或2所述的组合物，其中所述酸酐溶液是酸酐的二甲基亚砜溶液，优选地通过将所述酸酐的粉末溶解于二甲基亚砜获得；优选地酸酐溶液的浓度为0.5M以上，优选0.5M-10M，优选1M-5M，更优选1M。

4.根据项1-3中任一项所述的组合物，其中所述蛋白质溶液是蛋白质的磷酸盐溶液；

其中优选地，所述磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸钠和磷酸钾，优选磷酸氢二钠；

其中优选地，所述磷酸盐溶液的pH大于7，例如7.5-14，8-10，或8.5-9，优选8.5；

其中优选地，所述磷酸盐溶液中的蛋白质浓度为5mg/mL以上，10mg/mL-100mg/mL，20mg/mL-80mg/mL，或50mg/mL-70mg/mL，优选20mg/mL；

其中优选地，所述经酸酐处理的蛋白质通过将酸酐溶液加入蛋白质溶液，混匀后在将pH维持于大于7，例如7.5-14，8-10，或8.5-9，优选8.5的情况下温育足以使蛋白质被酸酐溶液完全修饰，如通过蛋白质中的精氨酸和赖氨酸的修饰率测定；然后纯化和任选浓缩经酸酐处理的蛋白质获得；

所述组合物的剂型选自：溶液、搽洗剂、喷雾剂、盥洗剂和干粉。

5.根据项1-4中任一项所述的组合物，其中所述流感病毒选自：禽流感假病毒、甲型流感和乙型流感，例如H7N9，甲型流感/Shanghai/4664T/2013(H7N9)；H5N1，甲型流感/QH/59/05(H5N1)，甲型流感/Thailand/Kan353/2004(H5N1)；H3N2，甲型流感/Guizhou/54/89(H3N2)；H1N1，甲型流感/Puerto Rico/8/1934(H1N1)，甲型流感/Shanghai/37T/2009(H1N1)和乙型流感/Florida/4/2006。

6.在体外使用经酸酐处理的蛋白质抑制流感病毒的方法，其中所述蛋白质选自：乳球蛋白，优选β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)，更优选牛β-乳球蛋白；白蛋白，优选牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白；RNA酶，优选RNA酶Ι，所述方法包括使经酸酐处理的蛋白质和任选地选自奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、拉那米韦、Xofluza、金刚烷胺和金刚乙胺的药物与流感病毒接触，所述经酸酐处理的蛋白质是通过用将酸酐溶液与蛋白质溶液混合产生的；

其中所述流感病毒在生物样品，如唾液、血液、血清、痰液中，在生物体，如哺乳动物，如人的表面上，或者在物品表面上。

7.根据项6所述的方法，其中所述酸酐选自：3-羟基-邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐和马来酸酐。

8.根据项6或7所述的方法，其中所述酸酐溶液是酸酐的二甲基亚砜溶液，优选地通过将所述酸酐的粉末溶解于二甲基亚砜获得；优选地酸酐溶液的浓度为0.5M以上，优选0.5M-10M，优选1M-5M，更优选1M；

其中优选地，所述蛋白质溶液是蛋白质的磷酸盐溶液；

其中优选地，所述磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸钠和磷酸钾；

其中优选地，所述磷酸盐溶液的pH大于7，例如7.5-14，8-10，或8.5-9，优选8.5；

其中优选地，所述磷酸盐溶液中的蛋白质浓度为5mg/mL以上，10mg/mL-100mg/mL，20mg/mL-80mg/mL，或50mg/mL-70mg/mL，优选20mg/mL；

其中优选地，所述经酸酐处理的蛋白质通过将酸酐溶液加入蛋白质溶液，混匀后在将pH维持于大于7，例如7.5-14，8-10，或8.5-9，优选8.5的情况下温育足以使蛋白质被酸酐溶液完全修饰的时间，如通过蛋白质中的精氨酸和赖氨酸的修饰率测定；然后纯化和任选浓缩经酸酐处理的蛋白质获得；

所述经酸酐处理的蛋白质的剂型为溶液、搽洗剂、喷雾剂、盥洗剂和干粉。

9.根据项6-8中任一项所述的方法，其中所述流感病毒选自禽流感假病毒、甲型流感和乙型流感，例如H7N9，甲型流感/Shanghai/4664T/2013(H7N9)；H5N1，甲型流感/QH/59/05(H5N1)，甲型流感/Thailand/Kan353/2004(H5N1)；H3N2，甲型流感/Guizhou/54/89(H3N2)；H1N1，甲型流感/Puerto Rico/8/1934(H1N1)，甲型流感/Shanghai/37T/2009(H1N1)和乙型流感/Florida/4/2006。

10.经酸酐处理的蛋白质和任选的另一种用于治疗和/或预防流感的药剂在制备用于预防和/或治疗受试者中的流感病毒感染的药物中的用途，其中所述经酸酐处理的蛋白质是通过将酸酐溶液与蛋白质溶液混合产生的，其中所述蛋白质选自：乳球蛋白，优选β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)，更优选牛β-乳球蛋白；白蛋白，优选牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白；RNA酶，优选RNA酶Ι；

其中所述酸酐选自：3-羟基-邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐和马来酸酐；

其中所述酸酐溶液是酸酐的二甲基亚砜溶液，优选地通过将所述酸酐的粉末溶解于二甲基亚砜获得；优选地酸酐溶液的浓度为0.5M以上，优选0.5M-10M，优选1M-5M，更优选1M；

其中所述蛋白质溶液是蛋白质的磷酸盐溶液；

其中优选地，所述磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸钠和磷酸钾，优选磷酸氢二钠；

其中优选地，所述磷酸盐溶液的pH大于7，例如7.5-14，8-10，或8.5-9，优选8.5；

其中优选地，所述磷酸盐溶液中的蛋白质浓度为5mg/L以上，10mg/L-100mg/L，20mg/mL-80mg/mL，或50mg/mL-70mg/mL，优选20mg/mL；

其中优选地，所述经酸酐处理的蛋白质通过将酸酐溶液加入蛋白质溶液，混匀后在将pH维持于大于7，例如7.5-14，8-10，或8.5-9，优选8.5的情况下温育足以使蛋白质被酸酐溶液完全修饰的时间，如通过蛋白质中的精氨酸和赖氨酸的修饰率测定；然后纯化和任选浓缩经酸酐处理的蛋白质获得；

所述药物的剂型选自：溶液、搽洗剂、喷雾剂、盥洗剂和干粉；

其中优选地，所述流感病毒选自禽流感假病毒、甲型流感和乙型流感，例如H7N9，甲型流感/Shanghai/4664T/2013(H7N9)；H5N1，甲型流感/QH/59/05(H5N1)，甲型流感/Thailand/Kan353/2004(H5N1)；H3N2，甲型流感/Guizhou/54/89(H3N2)；H1N1，甲型流感/Puerto Rico/8/1934(H1N1)，甲型流感/Shanghai/37T/2009(H1N1)和乙型流感/Florida/4/2006；

其中优选地另一种用于治疗和/或预防流感的药剂选自：奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、拉那米韦、Xofluza、金刚烷胺和金刚乙胺；

其中所述受试者是哺乳动物，例如人。

在本发明中，根据蛋白质中的精氨酸和/或赖氨酸的修饰率测定，经酸酐处理的蛋白质是完全酸酐化的。

在本发明中，酸酐的终浓度选自3、6、12、24、36、48和60mM以上或3mM以上其他浓度，优选60mM。本发明还提供了治疗和/或预防流感的方法，包括提供上述经酸酐处理的蛋白质和任选的另一种用于治疗和/或预防流感的药剂。

本发明可以抵抗季节性流感和高致病性流感病毒感染宿主细胞，使流感病毒在入侵阶段被抑制，同时具有高的生物安全性、高的体内外保护效果，且制备简单快速，也可根据需要开发成不同剂型，可多方位应对新发与突发性流感的爆发。

附图简述

图1为制备禽流感假病毒A(H7N9)和A(H5N1)，扩增流感活病毒及药物抗病毒感染实验的简图。

图2为3HP-β-LG与流感病毒HA蛋白相互作用而抑制流感病毒感染机制的简图。

图3为不同3HP-β-LG的酸酐化修饰率的结果。

图4为BCA法标准曲线，用于测定本发明的经酸酐处理的蛋白质的浓度。

图5为3HP-β-LG抑制假病毒A(H5N1)/QH感染细胞的结果。

图6a-d为3HP-β-LG抑制甲(A)型流感病毒A(H3N2)、A(H1N1)/SH、A(H1N1)/PR8、和乙(B)型流感病毒B/Florida/4/2006感染细胞的结果。

图7a-f为3HP-β-LG在小鼠“攻毒与保护”实验中对甲(A)型流感病毒A(H1N1)/PR8、A(H3N2)和A(H7N9)病毒感染小鼠的预防作用。

图8：图8a-d为3HP-β-LG在小鼠“攻毒与保护”实验中对甲(A)型流感病毒A(H3N2)和A(H7N9)病毒感染小鼠的治疗作用。

图9：图9a和图9b为3HP-β-LG对A549和MDCK细胞毒性的结果。

其中，图表中以下：甲型流感influenza A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)简写为A(H7N9)；甲型流感influenza A/QH/59/05(H5N1)简写为A(H5N1)/QH，甲型流感influenzaA/Thailand/Kan353/2004(H5N1)简写为A(H5N1)/Thailand；甲型流感influenza A/Guizhou/54/89(H3N2)简写为A(H3N2)；甲型流感influenza A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)简写A(H1N1)/PR8；甲型流感/Shanghai/37T/2009(H1N1)简写为A(H1N1)/SH；乙型流感influenza B/Florida/4/2006仍为B/Florida/4/2006。类似的，实施例中适用。

具体实施方式

本发明提供了一种对多种亚型的季节性流感病毒和高致病性流感病毒有预防和控制作用的经酸酐处理的蛋白质的制备方法，步骤如下：

将3-羟基-邻苯二甲酸酐粉末溶解于二甲基亚砜中，配成1M的酸酐溶液；用十二水合磷酸氢二钠粉末配制pH 8.5的0.1M磷酸盐溶液，并将400mg牛β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)粉末溶解在20mL磷酸盐溶液中；将1M的250μL酸酐溶液加到β-LG溶液中，反复吹吸混匀，并使pH维持在9.0，孵育20分钟，共重复6次，最后一次在25℃放置1-2小时，使蛋白被完全修饰；用pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)透析酸酐化蛋白，期间换液2次，透析60小时将其中的杂质除去；其后，先用3KD超滤管浓缩，再用无菌0.45μm滤膜过滤，保存在4℃或-20℃；可根据需要做成其他剂型的产品。

其中，3-羟基-邻苯二甲酸酐可以用马来酸酐(maleic anhydride,ML)、琥珀酸酐(succinic anhydride,SU)替换。

牛β-乳球蛋白可以用人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、鸡卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)、RNA酶(RNase)，优选RNA酶Ι替换。

剂型可以做成溶液、搽洗剂、喷雾剂、盥洗剂和干粉等制剂种类。

蛋白质中的赖氨酸的修饰率指经酸酐处理的蛋白质中赖氨酸残基被修饰的百分比。可以通过对3HP-β-LG和未修饰的β-LG添加四硼酸钠溶液，然后添加2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-,TNBS)，最后添加终止反应，以420nm的吸光度测定波长来测定。具体地，分别用0.1M的pH 8.5磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠)稀释，终浓度为1mg/mL，加入96孔板中，25μL/孔，以不加蛋白的0.1M的pH 8.5磷酸盐缓冲液作为空白对照组，每个浓度设置3个重复；加入0.1M的四硼酸钠溶液，25μL/孔，室温静置5分钟；加入2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro benzene sulfonic acid,TNBS)(购自Sigma，货号424102),10μL/孔，反复吹吸混匀，室温静置5分钟；加入pH 8.5的缓冲液(0.1M磷酸氢二钠，1.5mM的亚硫酸钠)终止反应，100μL/孔；用酶标仪检测各孔在420nm的吸光度。计算赖氨酸的修饰率公式如下：赖氨酸修饰率(％)＝100×[1-(OD420nm实验组-OD420nm无蛋白本底对照组均值)/(OD420nm对照组均值-OD 420nm无蛋白本底对照组均值)]。

蛋白质中的精氨酸的修饰率指经酸酐处理的蛋白质中精氨酸残基被修饰的百分比。可以通过对3HP-β-LG和未修饰的β-LG添加0.5mM的ρ-HPG，调节pH值至碱性，例如pH 9，在室温避光孵育1-2小时，检测在340nm的吸光度来测定。具体地，将稀释的1mg/ml的3HP-β-LG和未修饰的β-LG加入96孔板中，40μL/孔，以不加蛋白的0.1M的pH 8.5磷酸盐缓冲液作为空白对照组，每个浓度设置3个复孔，加入0.5mM的ρ-HPG(购自Thermo，货号0021100)，60μL/孔，调节pH值至9.0，在室温避光孵育2小时；用酶标仪检测在340nm的吸光度。计算氨基酸修饰率公式如下：精氨酸修饰率(％)＝100×[1-(OD 340nm实验组-OD340nm无蛋白本底对照组均值)/(OD340nm对照组均值-OD340nm无蛋白本底对照组均值)]。

实施例

提供以下实施例以更好理解本发明。

实施例1.经酸酐处理的牛β-乳球蛋白的制备

(1)将3-羟基-邻苯二甲酸酐(3-hydroxy phthalic anhydride,HP)粉末(购自Sigma，货号320064)溶解于二甲基亚砜，配制成1M的酸酐溶液；

(2)用十二水合磷酸氢二钠粉末配制pH 8.5的0.1M磷酸盐溶液，并将400mg牛β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)粉末(购自Sigma，货号L8005)溶解于20mL磷酸盐溶液中；

(3)将250μL的1M酸酐溶液加入β-LG溶液中(步骤(2)中)，反复吹吸混匀，用1M的NaOH溶液调整到pH为8.5，25℃静置20分钟，重复6次，最后一次在25℃静置1-2小时，使蛋白被完全修饰；

(4)用pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)透析酸酐化蛋白，用3.5KD的透析袋进行透析，透析60小时将其中的杂质除去，期间换液2次；

(5)用3KD超滤管将酸酐化蛋白进行浓缩，并用BCA法定量蛋白浓度，用无菌0.45μm滤膜过滤后，保存在4℃或-20℃；

其中，(3)中所述β-LG蛋白是否完全修饰可通过分子量大小判断。经酸酐HP修饰后的β-LG，其分子量会增加，修饰完全后的β-LG分子量增到最大，不再增加，可在SDS-PAGE显示(图3)。

类似地，用马来酸酐(maleic anhydride,ML)或琥珀酸酐(succinic anhydride,SU)(购自Sigma，货号分别为603902和63200)替换步骤(1)中3-羟基-邻苯二甲酸酐，和/或用人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、鸡卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)或RNA酶Ι(RNaseΙ)(购自Sigma，货号分别是A9731，A1933，A5378和R4875)替换步骤(2)中的β-LG。制备出多种经酸酐化修饰后的蛋白：3HP-β-LG,3HP-HSA,3HP-OVA,ML-β-LG,ML-HSA,ML-OVA,SU-β-LG,3HP-BSA,SU-HSA,SU-OVA及3HP-RNaseΙ，除透析所用透析袋及浓缩选用超滤管的大小不同外，其制备条件与3HP-β-LG制备条件相同。其中，β-LG、ML-β-LG和SU-β-LG所用透析袋为3.5KD，超滤管为3KD；OVA、3HP-OVA、ML-OVA、SU-OVA、RNaseΙ和3HP-RNaseΙ所用透析袋为8KD，浓缩所用离心管为10KD；HSA、3HP-HSA、ML-HSA和SU-HSA所用透析袋为8KD，浓缩所用离心管为30KD。可将它们作为抑制流感假病毒A(H7N9)的药物，用于抗假病毒感染细胞抑制作用的检测。

实施例2.用BCA法检测酸酐化蛋白的浓度

(1)用PBS将待测实施例1中制备的酸酐化蛋白按照10倍，50倍，100倍的比例稀释；并用PBS溶液将2mg/mL的蛋白标准样品(BSA)进行稀释，使蛋白保持0，0.1，0.2，0.4，1，2mg/mL的浓度；

(2)将稀释后样品和不同浓度的标准品10μL分别加入96孔板中，每孔再加入15μL的PBS，设置3个复孔；

(3)将BCA检测试剂盒(购自Takara,货号T9300A)中的A液与B液按50:1的比例混合，每孔200μL加入待测样品和标准品中，反复吹吸混匀，在37℃避光孵育0.5小时；

(4)用酶标仪检测各样品在562nm处的吸光度；

(5)利用GraphPad Prism 5.0软件绘制标准品浓度与吸光度的散点图，并拟合出标准品曲线(图4)。

结果：利用Excel软件作图得出标准蛋白的浓度与吸光度对应的公式和R²值，根据公式可计算所测酸酐化蛋白的浓度。结果参见表1。数值以均值显示。

表1

实施例3.禽流感假病毒A(H7N9)和假病毒A(H5N1)的制备

制备过程可以参见Fei Y,Ye L,Yan G,et al.Intranasal vaccination ofrecombinant H5N1 HA1 proteins fused with foldon and Fc induces strong mucosalimmune responses with neutralizing activity:Implication for developing novelmucosal influenza vaccines[J].Human Vaccines,2015,11(12):2831-2838，该文献及其中引用的文献通过引用并入。具体如下：

(1)包装假病毒A(H7N9)所用的质粒分别是：包含H7N9的HA的质粒pVKD-HA(GenBank accession no.KC853228)，包含H7N9的NA的质粒pVKD-NA(GenBank accessionno.KC853231)和含荧光素酶报告基因的HIV骨架质粒pNL4-3.Luc.R^-E^-(购自NTCC典型培养物保藏中心，货号pNL4-3-Luc-R-E-(HIV-Luc))；其中，pVKD-HA和pVKD-NA质粒编码的HA和NA基因，是通过RT-PCR的方式，从流感病毒A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)获得(由上海市金山公共卫生临床中心提供，可参见Qiu C,Huang Y,Zhang A,et al.Safe Pseudovirus-based Assay for Neutralization Antibodies against Influenza A(H7N9)Virus[J].Emerging Infectious Diseases,2013,19(10):1685---1687，该文献及其中引用的文献通过引用并入；pVKD-HA和pVKD-NA质粒可以根据请求由该文献作者直接提供)；包装假病毒A(H5N1)/QH所用的质粒分别是：包含H5N1的HA QH-HA(GenBank accession no.ABE68921)的质粒、包含Thailand-HA(GenBank accession no.EF541411.1)的质粒(由美国纽约血液中心提供，可参见Du L,Zhao G,Zhang X,et al.Development of a safe and convenientneutralization assay for rapid screening of influenza HA-specificneutralizing monoclonal antibodies[J].Biochemical&Biophysical ResearchCommunications,2010,397(3):580)、包含NA Thailand-NA(GenBank accessionno.EF541471.1)的质粒(由美国纽约血液中心提供，可参见Liu S,Li R,Zhang R,etal.CL-385319 inhibits H5N1 avian influenza A virus infection by blockingviral entry.[J].European Journal of Pharmacology,2011,660(2-3):460.)和含荧光素酶报告基因的HIV骨架质粒pNL4-3.Luc.R^-E^-；以上质粒均可由美国纽约血液中心提供或可直接购买。

(2)将HEK293T细胞(人胚肾细胞，购自中国科学院细胞库，目录号GNHu43)用含10％胎牛血清购自Gibco，货号10270-106)的DMEM培养基(购自大连美仑生物，货号MB4372)培养于T75细胞培养瓶，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；待细胞长到50％～70％的汇合率进行转染，将A(H7N9)假病毒包装所用的HA质粒、NA质粒和HIV-1骨架质粒共同混合在1mL的0.9％NaCl溶液中，分别为10μg，10μg和20μg，将10μL的Vigofect转染试剂(购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司，货号T001)加入到另一支1mL的0.9％NaCl溶液中，室温静置5分钟，将Vigofect稀释液逐滴加入到质粒混合液中，室温静置15分钟，将其逐滴加入到HEK293T细胞中；

(3)转染6小时后替换成新鲜的含10％胎牛血清的DMEM培养基，48小时后收集细胞培养基上清，用离心机3000rpm离心20分钟后，将上清收集，并通过0.22μm的滤膜，分装保存于-80℃；

(4)将MDCK细胞(犬肾上皮细胞，购自中国科学院细胞库，目录号GNO23)用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养于T75细胞培养瓶，置于37℃,5％CO₂的培养箱培养；用含有0.05％的EDTA的0.25％胰酶(购自LabServ公司，货号0458)37℃消化5分钟，使用量为1mL/1×10⁷细胞；用离心机800rpm离心3分钟后，用含有10％胎牛血清的DMEM重悬细胞，并于96孔板中铺板，1×10⁴/孔。待细胞长到70％汇合率，将假病毒用DMEM按2倍稀释的方式进行稀释，并最终加入MDCK细胞中，以不加假病毒的DMEM为对照，设置3个复孔；

(5)细胞培养12小时后换成新鲜的DMEM培养基，继续培养48小时后，先用PBS将细胞清洗一次，随后将5×细胞裂解液用水稀释(购自上海盛兆生物科技有限公司，货号E153A)为1×细胞裂解液，并加入细胞中，50μL/孔，室温裂解30分钟后，将细胞裂解物吹吸混匀并转移至96孔白底板内，40μL/孔；加入荧光素酶反应底物溶液(购自Promega,货号E1501)，50μL/孔，立即用酶标仪检测各孔在波长560nm荧光值，此过程避光操作；通过此步骤检测假病毒包装成功与否，包装成功的假病毒检测到高的荧光素酶信号，其读值高于无假病毒组细胞裂解物的50倍以上，用于进一步实验；

类似地，利用H5N1假病毒的包装所用质粒H5N1的HA质粒，H5N1的NA质粒和HIV-1骨架质粒共转染，获得H5N1假病毒。其中包装假病毒A(H5N1)/QH所用质粒为QH-HA,Thailand-NA和pNL4-3.Luc.R^-E^-，包装假病毒A(H5N1)/Thailand所用质粒为Thailand-HA,Thailand-NA和pNL4-3.Luc.R^-E^-。

流感病毒假病毒上因含有HA蛋白而具有单次感染MDCK细胞的能力，可以实现与细胞受体的结合，内吞和膜融合的过程，但其内核基因是HIV-1骨架质粒不携带完整包膜基因，因此不会包装出完整的流感病毒颗粒，不能形成二次感染，在流感病毒入侵抑制的研究中是非常重要且安全的工具。由于HIV-1骨架质粒慢病毒载体携带荧光素酶(Luciferase)报告基因，因此在感染进细胞内以后，通过检测报告基因的表达可判定假病毒进入细胞的程度，进而指示药物对假病毒感染细胞的抑制效果。示意图参见图1。

结果：该过程获得了假病毒A(H7N9)、假病毒A(H5N1)/QH和A(H5N1)/Thailand。

实施例4.利用鸡胚法扩增并制备流感病毒A(H3N2)，A(H1N1)/PR8，A(H1N1)/SH和B/Florida/4/2006病毒

(1)提前购买SPF级种蛋(购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)，要求9-11胚龄；

(2)利用照蛋灯，找到鸡胚的气室，并用铅笔标出边界；

(3)在生物安全柜中，用酒精将鸡蛋表面消毒，在鸡蛋气室中央稍偏侧1cm处刺破一个小孔；再用无菌注射器将200μL 1×10³TCID50的病毒液体注入，其中含有1mg/mL青霉素和1mg/mL链霉素；

(4)再用酒精棉球小心擦拭鸡蛋小孔周围，由内圈向外擦拭，待酒精自然挥发，利用无菌封口膜将鸡蛋的缺口封闭；然后将鸡蛋置于35℃培养72h，然后转移至4℃放置12h；

(5)在生物安全柜中，将鸡蛋中的病毒吸出，先用高速离心机6000rpm离心20分钟，再用蔗糖密度梯度法在超速离心机将病毒上清离心，30000rpm离心2小时，收集病毒沉淀，在冰上用PBS重悬并分装，保存在-80℃；示意图参见图1。

其中，甲(A)型流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)，甲(A)型流感病毒A/Guizhou/54/89(H3N2)，甲(A)型流感病毒A/Shanghai/37T/2009(H1N1)，乙(B)型流感病毒B/Florida/4/2006来源于BEI Resources(National Institute of Allergy andInfectious Diseases)。

结果：利用该方法获得了高滴度的流感病毒A(H1N1)/PR8，A(H3N2)，A(H1N1)/SH和B/Florida/4/2006病毒。

实施例5.检测酸酐化蛋白抑制假病毒A(H7N9)与抑制假病毒A(H5N1)感染细胞的能力

(1)将MDCK细胞用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养于T75细胞培养瓶，置于37℃含5％CO₂的培养箱中培养；用含有0.05％的EDTA的0.25％胰酶37℃消化5分钟，使用量为2mL/1×10⁷细胞；用离心机800rpm离心3分钟后，用含有10％胎牛血清的DMEM重悬细胞，并于96孔板中铺板，1×10⁴/孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；

(2)待细胞长到70％汇合率，可进行酸酐化蛋白抑制假病毒感染实验；将制备的3HP-β-LG溶液按5倍稀释的比例用无血清DMEM进行稀释，最高母液浓度保持在40μM；将未修饰的β-LG溶液作为药物阴性对照组，按照与3HP-β-LG同样的初始浓度和稀释倍数进行稀释；将梯度稀释后的3HP-β-LG和β-LG，分别与假病毒A(H7N9)按照1:1的比例进行混合，室温孵育半小时；

(3)将上述3HP-β-LG和假病毒A(H7N9)混合液每孔100μL加入到细胞中，每个稀释度设置3个复孔，同时设置无假病毒无药物的孔作为空白对照，设置有假病毒无药物的孔作为病毒感染阳性对照组；

(4)细胞培养12小时后换成新鲜的DMEM培养基，继续培养48小时后，先用PBS将细胞清洗一次，随后将5×细胞裂解液用水稀释为1×细胞裂解液，并加入细胞中，50μL/孔，室温裂解30分钟后，将细胞裂解物吹吸混匀并转移至96孔白底板内，40μL/孔；加入荧光素酶反应底物溶液，50μL/孔，立即用酶标仪检测各孔在波长560nm荧光值，此过程避光操作；

(5)利用Excel软件使用如下公式计算不同浓度的药物抑制对假病毒A(H7N9)的结果，并利用GraphPad Prism 5.0软件计算药物抗假病毒感染的半数抑制浓度(IC50)(表2)；数据以均值显示。

病毒感染抑制率(％)＝100×[(感染组-实验组)/(感染组-空白组)]

类似地，用表2中的其他酸酐化蛋白替换3HP-β-LG或用A(H5N1)/Thailand或假病毒A(H5N1)/QH假病毒替换上述A(H7N9)假病毒重复上述实验。其中，抑制假病毒A(H5N1)/Thailand实验中，3HP-β-LG最高母液浓度为40μM，5倍稀释；抑制假病毒A(H5N1)/QH实验中，3HP-β-LG最高母液浓度为40μM，4倍稀释；3HP-β-LG在与假病毒1：1混合后浓度将减半。

表2

结果：通过该方法，也可得ML-β-LG、SU-β-LG对假病毒A(H7N9)和假病毒A(H5N1)，及其他酸酐化蛋白对假病毒A(H7N9)的半数抑制浓度IC50值(表2，表2中的假病毒A(H5N1)指假病毒A(H5N1)/Thailand)。也可得3HP-β-LG对假病毒A(H5N1)/QH感染的抑制率与浓度的曲线，并计算相应的IC50值(图5)。其中，综合各酸酐化蛋白对假病毒A(H7N9)和A(H5N1)的抑制效果来看，3HP-β-LG均具有较好的保护效果，因此被择取用于抵抗流感病毒。推测3HP-β-LG具有广泛性抗流感病毒的作用。

实施例6.利用蚀斑减少实验检测酸酐化蛋白抑制甲(A)型流感病毒的A(H3N2)，A(H1N1)/SH,A(H1N1)/PR8和乙(B)型流感病毒B/Florida/4/2006感染细胞的能力

以对A(H3N2)病毒的抑制作用为例：

(1)提前12小时将MDCK细胞铺板于12孔细胞培养板中，使用含10％胎牛血清DMEM培养基培养，密度1×10⁶个/孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；

(2)用DMEM培养基分别将蛋白3HP-β-LG和β-LG按照5倍稀释进行稀释，初始母液浓度为40μM；用含有2μg/mL TPCK处理的胰酶(TPCK-trypsin)(购自Sigma公司，货号T1426)的DMEM培养基稀释A(H3N2)病毒，使每孔最终感染的病毒为100-200PFU/mL之间；将稀释的3HP-β-LG和β-LG样品和稀释后病毒各600μL混合，37℃孵育1小时；

(3)先将MDCK细胞的培液上清吸出，再将病毒和药物混合物加入MDCK细胞中，1mL/孔，每个浓度设置3个复孔，只加入DMEM培养基的细胞一组作为空白对照组，细胞中加入相同病毒数目的一组作为感染阳性对照组，37℃孵育2小时，期间每15分钟晃动混匀一次；

(4)将预先配制并灭菌的3％低熔点琼脂(购自Invitrogen，货号16520050)用微波炉加热，冷却至37℃后与37℃预热的含2μg/mL TPCK-trypsin的DMEM混合，使琼脂的终浓度为1％；先将MDCK细胞上清吸出，再将37℃的1％低熔点琼脂加入细胞中，室温放置半小时后，将细胞置于37℃，5％CO₂培养箱继续培养；

(5)培养2-5天后，观察12孔板中出现明显的颗粒分明的乳白色斑点后，用含有4％多聚甲醛(购自国药集团，货号10010061)和0.5％结晶紫(购自大连美仑生物，货号MB4721)的溶液进行固定及染色，在室温放置4小时；

(6)将琼脂去除，并计数12孔板中未被着色的斑点数目；

病毒进入抑制率(％)＝100×[(感染阳性对照组斑点数均值-实验组各孔斑点数均值)/(感染阳性对照组斑点数均值-感染阴性对照组斑点数均值)]

(7)利用Excel软件统计各孔病毒斑点数目，并利用GraphPad Prism 5.0软件作出3HP-β-LG抗A(H3N2)病毒感染抑制率与浓度的曲线(图6a)并计算其半数抑制浓度(IC50)；数据以均值±标准差显示。

类似地，用甲(A)型流感病毒A(H1N1)/SH，A(H1N1)/PR8，乙(B)型流感病毒B/Florida/4/2006替换A(H3N2)病毒进行上述实验。其中，药物稀释时A(H1N1)/SH中蛋白3HP-β-LG的初始母液浓度为100μM，按照4倍稀释使用；A(H1N1)/PR8中蛋白3HP-β-LG的初始母液浓度为40μM，5倍稀释使用；B/Florida/4/2006中蛋白3HP-β-LG的初始母液浓度为80μM，2倍稀释使用；蛋白3HP-β-LG在与病毒1：1混合后浓度将减半。

结果：根据该方法可得3HP-β-LG抗A(H3N2)病毒感染抑制率与浓度的曲线，及对应的IC50(图6a)。同样，3HP-β-LG在甲型流感A(H1N1)/SH，甲型流感A(H1N1)/PR8及在乙型流感病毒B/Florida/4/2006的病毒感染抑制率也可以检测出(图6b、图6c和图6d)。这些结果表明，3HP-β-LG在多种流感病毒感染中都表现出抑制作用，3HP-β-LG广泛性抗流感病毒的作用被证实。

实施例7.酸酐化蛋白在小鼠模型上对A(H3N2)，A(H1N1)/PR8和A(H7N9)流感病毒感染的预防性作用的研究

以A(H1N1)/PR8流感病毒为例：

(1)购买SPF级的8周C57BL/6雌鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，将小鼠分成PBS组、给高剂量3HP-β-LG组和给低剂量3HP-β-LG组，在每只小鼠尾巴上做好标记；

(2)将3HP-β-LG用3KD超滤管浓缩，并用实施例1中所述方法检测蛋白浓度，并最终调节蛋白为40mg/mL；

(3)给小鼠称重，并按照170μL/20g(1％戊巴比妥钠/小鼠体重)的剂量用麻药进行腹腔注射；在小鼠攻毒前半小时，分别将20μL的浓度为40mg/mL的3HP-β-LG，20μL的浓度为20mg/mL的3HP-β-LG和PBS以滴鼻方式给药，双侧鼻孔滴鼻；其中给高剂量3HP-β-LG组每只小鼠给药40mg/kg(酸酐化蛋白重量/小鼠体重)，给低剂量3HP-β-LG组每只小鼠给药20mg/kg；

(4)将已知LD50的A(H1N1)/PR8流感病毒原液稀释成3×10⁴PFU/mL浓度，取15μL(即10LD50，致死剂量)的稀释后病毒液，以双侧鼻孔滴鼻的方式感染小鼠；

(5)每日称量小鼠体重并记录，连续15天；按如下公式计算小鼠体重变化：

体重变化(％)＝100×[(当日体重-首日体重)/首日体重]

(6)将体重降低25％及以上的小鼠计为死亡；利用Excel软件将小鼠体重数值统计并利用GraphPad Prism 5.0软件作图，得出小鼠体重变化图和存活率图(图7a-图7b)；数据以均值±标准差显示。

小鼠存活率(％)＝100×(组内存活小鼠个数/组内小鼠总数)

类似地，得到了3HP-β-LG单次给药对小鼠攻毒A(H3N2)和A(H7N9)病毒的动物保护的体重变化图和存活率图(图7c-图7f)；其中，对A(H1N1)/PR8病毒的实验分为PBS组、给高剂量3HP-β-LG组和给低剂量3HP-β-LG组(对应每组小鼠分别是6只、7只和8只)，对A(H3N2)病毒的实验分为PBS组、给高剂量3HP-β-LG组和给低剂量3HP-β-LG组(对应每组小鼠分别是6只、7只和7只)，给药方式及药物用量与A(H1N1)/PR8相同，病毒用量为15μL的2LD50用量；对A(H7N9)病毒的实验分为PBS组、给高剂量3HP-β-LG组和给低剂量3HP-β-LG组(对应每组小鼠分别是7只、7只和7只)，给药方式及药物用量与A(H1N1)/PR8相同，病毒用量为20μL的10LD50用量；

其中流感病毒A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)获自复旦大学生物安全三级实验室。

结果：根据A(H1N1)/PR8攻毒保护实验的体重变化图和存活率图，可知3HP-β-LG单次给药对小鼠攻毒A(H1N1)/PR8的预防作用中，给PBS组和给β-LG组小鼠存活率为0％，而给高剂量3HP-β-LG组小鼠存活率可达到100％，低剂量组为62.5％。同样，3HP-β-LG单次给药对小鼠攻毒A(H3N2)的预防作用中，给PBS组小鼠存活率为0％，而给高剂量3HP-β-LG组小鼠存活率可达到85.7％，低剂量组为85.7％。3HP-β-LG单次给药对小鼠攻毒A(H7N9)的预防作用中，给PBS组小鼠存活率为0％，而给高剂量3HP-β-LG组小鼠存活率可达到85.7％，低剂量组为71.4％。

这些证据表明，3HP-β-LG在小鼠实验中对几种流感病毒的预防中，都有显著的效果。数据以均值±标准差的方式呈现，经由t-test分析确定组间差异性是否具有统计学意义(NS，P＞0.05，两组差别无统计学意义；*，0.01＜P＜0.05，两组差别有显著意义；**，P＜0.01，两者差别有显著意义；***，P＜0.001，两者差别有显著意义)。

实施例8.酸酐化蛋白在小鼠模型中对A(H3N2)和A(H7N9)流感病毒感染后治疗效果的研究

以A(H3N2)病毒为例：

(1)购买SPF级的8周C57BL/6雌鼠，将小鼠分为PBS组和给3HP-β-LG组，在每只小鼠尾巴上做好标记；

(2)将小鼠称重，并按照170μL/20g(1％戊巴比妥钠/小鼠体重)的剂量用麻药进行腹腔注射；随后将A(H3N2)流感病毒原液稀释为1×10⁴PFU/mL浓度，取15μL(即2LD50，致死剂量)的稀释后病毒液以滴鼻的方式感染小鼠，双侧鼻孔滴鼻15μL；

(3)攻毒后4小时，将小鼠重新麻醉，再以滴鼻的方式给药3HP-β-LG蛋白，以40mg/kg(酸酐化蛋白重量/小鼠体重)的用量给药，使用浓度为40mg/mL；

(4)称量小鼠体重并记录，连续15天：

小鼠体重变化记录与分析与实施例7相同，可得出小鼠体重变化图和存活率图(图8a-b)；数据以均值±标准差显示。

类似地，获得了3HP-β-LG抗A(H7N9)病毒的动物保护的体重变化图和存活率图(图8c-d)。其中，对A(H3N2)病毒的实验分为PBS组和给3HP-β-LG组(每组小鼠分别是5只和6只)，对A(H7N9)病毒的实验分为PBS组和给3HP-β-LG组(对应每组小鼠分别是6只和6只)，给药方式及药物用量与A(H3N2)相同，病毒用量为20μL的10LD50用量；

结果：根据A(H3N2)攻毒保护实验的体重变化图与存活率图，可知3HP-β-LG对小鼠攻毒A(H3N2)的攻毒后4小时单次给药的实验中，PBS组的小鼠存活率为0％，给药组为83.3％。3HP-β-LG对小鼠攻毒A(H7N9)的攻毒后单次4小时给药的实验中，PBS组小鼠存活率为0％，给药组存活率为66.7％。这些证据表明，3HP-β-LG在小鼠实验中对几种流感病毒的治疗作用，都有显著的效果。

实施例9. 3HP-β-LG在A549细胞和MDCK细胞上细胞毒性的检测

3HP-β-LG对细胞活力的影响，检测如下：

(1)用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养MDCK细胞，提前12小时将细胞在96孔细胞培养板中铺板，细胞密度为5000个/孔，置于37℃含5％的CO₂的培养箱中培养；

(2)用DMEM培养基将3HP-β-LG和β-LG进行稀释，初始浓度均为40μM；先将MDCK细胞上清吸掉，并将3HP-β-LG和β-LG加入细胞中，100μL/孔，只加入DMEM培养基的细胞作为阳性对照组，以不加细胞的组作为无细胞空白对照组，每个浓度设置3个复孔，将细胞置于37℃培养48小时，不换液；

(3)将细胞培养基吸掉，将CCK-8试剂(购自同仁，货号JE603，日本)用DMEM培养基稀释后加入细胞中，100μL/孔，其中，每100μL的DMEM培养基含5μL CCK-8试剂，细胞在37℃继续培养2-3小时；

(4)用酶标仪检测各孔细胞的450nm吸光度值(OD)，并计算存活率：

活细胞比率(％)＝100×[(OD450nm实验组-OD450nm无细胞本底均值)/(OD450nm细胞对照组均值-OD450nm无细胞本底均值)]

其中步骤(1)中用A549细胞(腺癌人类肺泡基底上皮细胞，购自中国科学院细胞库，目录号TCHu150)代替MDCK细胞进行相同实验；

(5)根据CCK-8试剂测得的3HP-β-LG孵育后A549和MDCK细胞上的活细胞比率，用GraphPad Prism 5.0软件作出3HP-β-LG剂量对细胞活力影响的图(图9a-9b)。数据以均值±标准差显示。

结果：由细胞活力图9a-9b可知，在体外实验中，即使最高40μM浓度(大于100倍IC50)的3HP-β-LG显示出对MDCK细胞和A549细胞几乎没有细胞毒性，具有较好的生物安全性。

实施例10.检测蛋白β-LG经不同浓度的HP修饰后3HP-β-LG的氨基酸修饰率，及检测不同修饰率的3HP-β-LG抗A(H7N9)假病毒感染细胞抑制率

(1)用HP以不同的终浓度3、6、12、24、36、48和60mM，按照实施例1中的方法制备不同修饰率的3HP-β-LG，将HP酸酐溶液一次加入到40mg/mL的β-LG溶液，并在25℃孵育1-2小时；

(2)赖氨酸修饰率：将不同修饰率的3HP-β-LG(实验组)和未修饰的β-LG(对照组)分别用0.1M的pH 8.5磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠)稀释，终浓度为1mg/mL，加入96孔板中，25μL/孔，以不加蛋白的0.1M的pH 8.5磷酸盐缓冲液作为空白对照组，每个浓度设置3个复孔；加入0.1M的四硼酸钠溶液，25μL/孔，室温静置5分钟；加入2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro benzene sulfonic acid,TNBS)(购自Sigma，货号424102),10μL/孔，反复吹吸混匀，室温静置5分钟；加入pH 8.5的缓冲液(0.1M磷酸氢二钠，1.5mM的亚硫酸钠)终止反应，100μL/孔；用酶标仪检测各孔在420nm的吸光度；

(3)精氨酸修饰率：将(2)中稀释的1mg/ml的3HP-β-LG和未修饰的β-LG加入96孔板中，40μL/孔，以不加蛋白的0.1M的pH 8.5磷酸盐缓冲液作为空白对照组，每个浓度设置3个复孔，加入0.5mM的ρ-HPG(购自Thermo，货号0021100)，60μL/孔，调节pH值至9.0，在室温避光孵育2小时；用酶标仪检测在340nm的吸光度；

计算氨基酸修饰率公式如下：

赖氨酸修饰率(％)＝100×[1-(OD420nm实验组-OD420nm无蛋白本底对照组均值)/(OD420nm对照组均值-OD420nm无蛋白本底对照组均值)]

精氨酸修饰率(％)＝100×[1-(OD340nm实验组-OD340nm无蛋白本底对照组均值)/(OD340nm对照组均值-OD340nm无蛋白本底对照组均值)]

(4)利用Excel软件通过公式分别计算出酸酐化蛋白精氨酸和赖氨酸修饰率，并计算其抗流感假病毒A(H7N9)感染(实验过程参见实施例5)的半数抑制浓度(表3)；数据以均值显示。

类似地，可得到3HP-β-LG抗流感假病毒A(H5N1)/Thailand感染的半数抑制浓度(表3)。

表3

结果：可知不同终浓度的HP酸酐修饰β-LG，其赖氨酸和精氨酸的修饰率不同。不同修饰率的3HP-β-LG抗流感病毒的作用有很大的差别，随着酸酐修饰率的增加，抗流感病毒的IC50降低。说明酸酐化的蛋白具有抗病毒感染的作用，确实是由蛋白的酸酐修饰所引起，蛋白修饰越完全，抗病毒的效果越强。

Claims (41)

1.在体外使用经酸酐处理的蛋白质抑制流感病毒的方法，其中所述蛋白质是β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, β-LG)，且所述酸酐是3-羟基-邻苯二甲酸酐；其中所述流感病毒在生物样品中或者在物品表面上；其中所述经酸酐处理的蛋白质通过将酸酐溶液加入蛋白质溶液，混匀后在将pH维持于8.5的情况下温育足以使蛋白质被酸酐溶液完全修饰，其通过蛋白质中的精氨酸和赖氨酸的修饰率测定；然后纯化和浓缩经酸酐处理的蛋白质获得。

2.权利要求1的方法，所述方法包括使经酸酐处理的蛋白质与流感病毒接触。

3.权利要求1的方法，所述方法包括使经酸酐处理的蛋白质和选自奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、拉那米韦、Xofluza、金刚烷胺和金刚乙胺的药物与流感病毒接触。

4.权利要求1的方法，其中酸酐的终浓度是60 mM。

5.权利要求1的方法，其中所述流感病毒在唾液、血液、或痰液中。

6.权利要求2的方法，其中所述酸酐溶液是酸酐的二甲基亚砜溶液。

7.权利要求6的方法，其中通过将所述酸酐的粉末溶解于二甲基亚砜获得酸酐溶液。

8.权利要求7的方法，其中酸酐溶液的浓度为0.5 M以上。

9.权利要求8的方法，其中酸酐溶液的浓度为0.5 M-10 M。

10.权利要求9的方法，其中酸酐溶液的浓度为1 M-5 M。

11.权利要求10的方法，其中酸酐溶液的浓度为1 M。

12.权利要求2的方法，其中所述蛋白质溶液是蛋白质的磷酸盐溶液。

13.权利要求12的方法，其中所述磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸钠和磷酸钾。

14.权利要求13的方法，其中所述磷酸盐是磷酸氢二钠。

15.权利要求13的方法，其中所述磷酸盐溶液的pH大于7。

16.权利要求15的方法，其中所述磷酸盐溶液的pH为7.5-14。

17.权利要求16的方法，其中所述磷酸盐溶液的pH为8-10。

18.权利要求17的方法，其中所述磷酸盐溶液的pH为8.5-9。

19.权利要求18的方法，其中所述磷酸盐溶液的pH为8.5。

20.权利要求12的方法，其中所述磷酸盐溶液中的蛋白质浓度为5 mg/mL以上。

21.权利要求20的方法，其中所述磷酸盐溶液中的蛋白质浓度为10 mg/mL-100 mg/mL。

22.权利要求21的方法，其中所述磷酸盐溶液中的蛋白质浓度为20 mg/mL-80 mg/mL。

23.权利要求22的方法，其中所述磷酸盐溶液中的蛋白质浓度为50 mg/mL-70 mg/mL。

24.权利要求23的方法，其中所述磷酸盐溶液中的蛋白质浓度为20 mg/mL。

25.权利要求1的方法，其中所述经酸酐处理的蛋白质的剂型为溶液、搽洗剂、喷雾剂、盥洗剂或干粉。

26.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述流感病毒选自甲型流感和乙型流感。

27.权利要求26的方法，其中所述流感病毒选自H7N9甲型流感/Shanghai/4664T/2013、H5N1甲型流感/QH/59/05、甲型流感/Thailand/Kan353/2004、H3N2甲型流感/Guizhou/54/89、H1N1甲型流感/Puerto Rico/8/1934、甲型流感/Shanghai/37T/2009和乙型流感/Florida/4/2006。

28.权利要求1的方法，其中所述流感病毒在血清中。

29.经酸酐处理的蛋白质在制备用于预防和/或治疗受试者中的流感病毒感染的药物中的用途，其中所述经酸酐处理的蛋白质是通过将酸酐溶液与蛋白质溶液混合产生的，其中所述蛋白质是β-乳球蛋白，且所述酸酐是3-羟基-邻苯二甲酸酐；其中所述经酸酐处理的蛋白质通过将酸酐溶液加入蛋白质溶液，混匀后在将pH维持于8.5的情况下温育足以使蛋白质被酸酐溶液完全修饰，其通过蛋白质中的精氨酸和赖氨酸的修饰率测定；然后纯化和浓缩经酸酐处理的蛋白质获得。

30.经酸酐处理的蛋白质和另一种用于治疗和/或预防流感的药剂在制备用于预防和/或治疗受试者中的流感病毒感染的药物中的用途，其中所述经酸酐处理的蛋白质是通过将酸酐溶液与蛋白质溶液混合产生的，其中所述蛋白质是β-乳球蛋白，且所述酸酐是3-羟基-邻苯二甲酸酐；其中所述经酸酐处理的蛋白质通过将酸酐溶液加入蛋白质溶液，混匀后在将pH维持于8.5的情况下温育足以使蛋白质被酸酐溶液完全修饰，其通过蛋白质中的精氨酸和赖氨酸的修饰率测定；然后纯化和浓缩经酸酐处理的蛋白质获得。

31.权利要求29或30的用途，其中所述药物的剂型选自：溶液、搽洗剂、喷雾剂、盥洗剂和干粉。

32.权利要求29或30的用途，其中所述流感病毒选自甲型流感和乙型流感。

33.权利要求32的用途，其中所述流感病毒选自H7N9甲型流感/Shanghai/4664T/2013、H5N1甲型流感/QH/59/05、甲型流感/Thailand/Kan353/2004、H3N2甲型流感/Guizhou/54/89、H1N1甲型流感/Puerto Rico/8/1934、甲型流感/Shanghai/37T/2009和乙型流感/Florida/4/2006。

34.权利要求30的用途，其中另一种用于治疗和/或预防流感的药剂选自：奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、拉那米韦、Xofluza、金刚烷胺和金刚乙胺。

35.权利要求29或30的用途，其中所述受试者是哺乳动物。

36.权利要求35的用途，其中所述哺乳动物是人。

37.用于治疗和/或预防流感的组合物，其包含经酸酐处理的蛋白质和另一种用于治疗和/或预防流感的药物，其中所述蛋白质是β-乳球蛋白，且所述酸酐是3-羟基-邻苯二甲酸酐；其中所述经酸酐处理的蛋白质通过将酸酐溶液加入蛋白质溶液，混匀后在将pH维持于8.5的情况下温育足以使蛋白质被酸酐溶液完全修饰，其通过蛋白质中的精氨酸和赖氨酸的修饰率测定；然后纯化和浓缩经酸酐处理的蛋白质获得。

38.权利要求37的组合物，其中所述药物选自：奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、拉那米韦、Xofluza、金刚烷胺和金刚乙胺。

39.权利要求37的组合物，其中所述组合物的剂型选自：溶液、搽洗剂、喷雾剂、盥洗剂和干粉。

40.权利要求37-39中任一项的组合物，其中所述流感病毒选自：甲型流感和乙型流感。

41.权利要求40的组合物，其中所述流感病毒选自：H7N9甲型流感/Shanghai/4664T/2013、H5N1甲型流感/QH/59/05、甲型流感/Thailand/Kan353/2004、H3N2甲型流感/Guizhou/54/89、H1N1甲型流感/Puerto Rico/8/1934、甲型流感/Shanghai/37T/2009和乙型流感/Florida/4/2006。

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