ES2233923T3 - Proteinas modificadas y su uso para controlar infecciones viricas. - Google Patents

Proteinas modificadas y su uso para controlar infecciones viricas.

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ES2233923T3
ES2233923T3 ES92906661T ES92906661T ES2233923T3 ES 2233923 T3 ES2233923 T3 ES 2233923T3 ES 92906661 T ES92906661 T ES 92906661T ES 92906661 T ES92906661 T ES 92906661T ES 2233923 T3 ES2233923 T3 ES 2233923T3
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Robert Walter Jansen
Dirk Klaas Fokke Meijer
Grietje Molema
Erik Desire Alice De Clercq
Rudi Wilfried Jan Pauwels
Dominique Schols
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Rijksuniversiteit Groningen
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A PREPARACIONES FARMACEUTICAS QUE SON ADECUADAS PARA TRATAR Y CURAR INFECCIONES VIRALES, INCLUYENDO ENFERMEDADES DE INMUNODEFICIENCIA TALES COMO INFECCIONES POR RETROVIRUS, INCLUYENDO EL SIDA Y ENFERMEDADES RELACIONADAS CON EL SIDA; Y QUE PUEDEN TAMBIEN USARSE PARA INHIBIR LA FUSION DE CELULAS INFECTADAS CON VIRUS CON CELULAS NO INFECTADAS, DICHAS PREPARACIONES CONTIENEN PROTEINAS MODIFICADAS O POLIPEPTIDOS COMO SUSTANCIA ACTIVA O SUSTANCIA QUE CONTRIBUYE A LA ACCION O COMO PORTADOR PARA OTRAS SUSTANCIAS, QUE SON TAMBIEN ACTIVAS, DICHAS PROTEINAS MODIFICADAS O POLIPEPTIDOS HAN ADQUIRIDO UNA CARGA NEGATIVA NETA ADICIONAL MEDIANTE LA DERIVACION DE SUS GRUPOS DE AMINO Y/U OTROS GRUPOS BASICOS FUNCIONALES CON UN REAGENTE QUE EVITA LA PROTONACION DE LOS AMINOACIDOS BASICOS Y/U OTROS GRUPOS FUNCIONALES BASICOS O REEMPLAZA DICHOS AMINOACIDOS BASICOS Y/U OTROS GRUPOS FUNCIONALES BASICOS POR UNO O MAS GRUPOS FUNCIONALES QUE TENGAN UNA CARGA NEGATIVA, LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A LAS PROTEINAS MODIFICADAS Y A LOS PEPTIDOS MISMOS Y A LAS PREPARACIONES Y A SU USO.

Description

Proteínas modificadas y su uso para controlar infecciones víricas.
La invención se refiere a preparaciones farmacéuticas que son adecuadas para tratar o curar infecciones víricas, incluida la gripe y enfermedades de inmunodeficiencia como infecciones por retrovirus, incluyendo el SIDA y enfermedades relacionadas con el SIDA, y que pueden también ser usadas para inhibir la fusión de células infectadas por virus con células no infectadas, estas preparaciones contienen proteínas o polipéptidos modificados como sustancia activa o sustancia que contribuye a la acción o como excipiente para otras sustancias, que son también activas.
El uso de glicoproteínas como excipientes específicos de células para 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT) se describe en la publicación por Molema, G., Jansen, R.W., Pauwels, R., De Clerq, E., y Meijer, D.K.F. in Biochem. Pharmacol. parte 40, nº. 12, págs. 2603-2610 (1990). Hasta la fecha la AZT es el único agente registrado para el tratamiento del SIDA. La AZT bloquea la síntesis de ADN vírico en las células infectadas. Aunque el SIDA no tenga cura, el agente prolonga el índice de longevidad. Desafortunadamente, la AZT también ataca a células saludables y en consecuencia da lugar a un gran número de efectos secundarios indeseables. Estos efectos secundarios surgen en particular en tejidos en los una gran cantidad de ADN es producida, por ejemplo en la médula ósea. Según la publicación anteriormente mencionada, se propone dirigir la AZT a células diana con la ayuda de una molécula portadora. Según la publicación anteriormente mencionada, las conjugaciones de albúmina (HSA) y azúcares, por ejemplo manosa, fucosa, galactosa y glucosa, son preparadas y evaluadas por su actividad anti-VIH en combinación con AZTMP (AZT fosforilada hasta la forma monofosfato). Se supone que la molécula portadora libera la sustancia activa después de que el conjugado de glicoproteina y sustancia activa ha sido absorbido por la célula diana.
El uso de polímeros de fenilo sulfatado en preparaciones para el tratamiento de infecciones de retrovirus se describe en EPA 384.532. Los polímeros de fenilo sulfatado mencionados en esta publicación son alcoholes sulfatados de polifenilo, copolímeros sulfatados de ácido (met)acrílico y alcohol fenílico y sus sales farmacéuticamente aceptables. Estas sustancias activas reducen la citopatogenicidad del VIH-1 en células MT-4 y la expresión antigénica del VIH-1 en células CEM. También son activas contra la replicación del VIH-2. Además, se inhibe la formación de células gigantes (células sincitiales multinucleares), generadas por VIH-1, y la adsorción de fragmentos de VIH en células CD-4 positivas.
La invención se refiere a preparaciones farmacéuticas que son adecuadas para tratar o curar infecciones víricas y enfermedades de inmunodeficiencia como infecciones por retrovirus, incluido el SIDA y enfermedades relacionadas con el SIDA, y que pueden también ser usadas para inhibir la fusión de células infectadas por virus con células no infectadas, estas preparaciones contienen proteínas o polipéptidos modificados como sustancia activa o sustancia que contribuye a la acción o como excipiente para otras sustancias, que son también activas, estas proteínas o polipéptidos modificados han adquirido una carga negativa neta adicional por derivación de sus grupos amino y/u otros grupos funcionales básicos con un agente reactivo que impide la protonación de aminoácidos básicos y/u otros grupos funcionales básicos o reemplaza dichos aminoácidos básicos y/u otros grupos funcionales básicos por uno o más grupos funcionales que tienen una carga negativa, la prolongación del tiempo de retención del derivado de proteínas o polipéptidos comparado con el de proteínas o polipéptidos no convertidos a un derivado siendo de al menos 9 minutos, el tiempo de retención estando determinado mediante FPLC en una columna de intercambio aniónico.
La presente invención se basa en la conclusión de que existe una correlación entre la carga negativa de las proteínas o polipétidos modificados y la actividad antivírica. Cuanto más negativa es la sustancia activa, más grande es la actividad antivírica, en particular la actividad anti-VIH.
La patente EP Al 406.416 expone un agente anti-VIH que contiene como ingrediente activo una proteína plasmática modificada con un ácido dicarboxílico, p. ej. anhídrido maléico o anhídrido succínico, convirtiendo de ese modo los grupos amino de modo que su polaridad cambie de positiva a negativa.
Como ya se ha dicho, la "carga negativa neta adicional" puede ser cuantificada basándose en el tiempo de retención. Este tiempo de retención está determinado, por ejemplo, según el método cromatográfico siguiente:
- preparar una solución de una sustancia que debe evaluarse en una concentración de 1 mg/ml de un tampón Tris.HCl (0.02 M) con un pH de 7.5 (tampón A).
- inyectar 100 \mul de la muestra en un sistema FPLC (Cromatografía Rápida Líquida Proteínica) de Pharmacia, Woerden, Países Bajos, que está provisto de una columna de intercambio aniónico mono-Q^{R}-HR 5/5 de Pharmacia.
- eluir a razón de 0.25 ml/min usando un gradiente del 100% del tampón A al 100% del tampón B, consistente en un tampón A + 1 M de NaCl, en 30 minutos.
- medir el tiempo de retención.
La "carga negativa adicional" puede también ser cuantificada de otro modo, es decir basándose en la carga negativa teórica de la red. Este valor teórico se calcula multiplicando el número de grupos derivatizados por el cambio de carga por grupo derivatizado, más la carga del material precursor. En el caso de los polipéptidos cargados negativamente o proteínas modificadas según la invención, la carga negativa neta será inferior a -60 y, por ejemplo, del orden de magnitud de -60 a -300 e inferior.
El criterio de la carga negativa neta teórica está ilustrado con referencia a los ejemplos siguientes.
En el compuesto Suc-HSA (un producto de reacción de albúmina de suero humano y anhídrido succínico) que puede ser usado según la invención, todos 61 positivo NH_{2} + de lisina han sido reemplazados por grupos negativos de COO^{-}. Así, hay un cambio de carga de 2 por lisina. La carga teórica de este compuesto es por lo tanto: -15 (de la albúmina original o HSA)+(2x -61)= -137. En el caso de la albúmina de suero bovino (BSA) el valor para el material Suc-BSA sería -140 ya que el valor de la carga en la BSA original es -15.
Suc-HSA, el producto de reacción de albúmina de suero humano y anhídrido succínico que puede ser usado según la invención, tiene una carga negativa teórica neta de -137 (=-15 + 61 X -2).
Aco-HSA, el producto de reacción de albúmina de suero humano y anhídrido aconítico (anhídrido del ácido cis o trans prop-1-eno-1,2,3-tri-carboxílico) que puede ser usado según la invención, tiene una carga negativa teórica neta de -198 (= -15 + (61 x -2)).
La carga negativa para el producto de la reacción muy estable de albúmina y anhídrido del ácido propano-1,2,3-tricarboxílico, que será preferido, es similar.
Además, la prolongación del tiempo de retención comparado con el de la HSA, determinado bajo las condiciones de cromatografía descritas, es 13 minutos para Aco-HSA y 11.5 minutos para Suc-HSA.
Además, la carga teórica en las proteínas/polipéptidos se calcula como el promedio de la carga en todos los aminoácidos presentes en la molécula (aproximadamente 600 aminoácidos en el caso de la albúmina de suero).
Es también posible introducir tres o más grupos carboxilo por grupo amino/grupo básico en los precursores que pueden ser usados según la presente invención. Por supuesto, se obtienen después los materiales activos con una carga negativa aún más alta y una prolongación del tiempo de retención que es incluso superior al valor anteriormente mencionado.
Las proteínas o polipéptidos modificados que contienen una carga negativa adicional neta y pueden ser usadas en las preparaciones farmacéuticas según la invención se denominan "polipéptidos con carga negativa" en el resto de esta descripción. Los compuestos de este tipo son generalmente hidrosolubles y pueden existir en forma iónica.
Los polipéptidos cargados negativamente son preferiblemente poliaminoácidos y proteínas de plasma modificado, como albúmina y glicoproteínas \alpha-ácidas ("orosomucoides"). Los polipéptidos que tienen un peso molecular del orden de magnitud de aproximadamente 70,000 son adecuados. No obstante, el peso molecular puede también ser considerablemente más alto o más bajo; el factor importante es que una estructura de un polipéptido polianiónico esté presente en la molécula.
Se ha descubierto que la lisina e histidina son preferidas como grupos para ser derivatizados en los polipéptidos cargados negativamente para ser usados según la invención. El grupo que contiene nitrógeno en la lisina es un grupo amino, mientras que el grupo que contiene nitrógeno en la histidina está considerado como "otro grupo funcional básico". Además, por ejemplo, la polilisina puede también ser usada con éxito según la invención.
Los productos químicos estándar que son capaces de introducir una carga negativa adicional neta en el precursor se utilizan para preparar el derivado. Preferiblemente, no obstante, se usan aldehídos, anhídridos, cloruros de ácido e iso(tio) cianatos. Se ha descubierto que unos agentes reactivos de este tipo producen polipéptidos cargados negativamente que proporcionan una preparación farmacéutica con una acción sobresaliente contra los trastornos y condiciones anteriormente mencionados.
Las sustancias siguientes pueden ser mencionadas como ejemplos de reactivos para preparar derivados de proteínas o polipéptidos.
1. Anhídridos 1.1. Anhídridos de cadena linear, que no forman parte de la invención
Dan, por reacción con aminas en proteínas, enlaces de amida que no son protonados con un pH fisiológico.
NH_{3}^{+} \rightarrow amida neutra.
(cambio de carga de -1).
1.1.1. Anhídridos simétricos
Anhídrido acético 1
\vskip1.000000\baselineskip
1
Anhídrido propiónico
\vskip1.000000\baselineskip
2
Anhídrido butírico
\vskip1.000000\baselineskip
3
1.1.2. Anhídridos asimétricos
Anhídrido propiónico acético
\vskip1.000000\baselineskip
4
Anhídrido butírico acético
\vskip1.000000\baselineskip
5
1.2.1. Anhídridos cíclicos, que no forman parte de la invención
Dan, por reacción con aminas en proteínas, enlaces de amida que no son protonados con un pH fisiológico y además introducen un grupo carboxilo que es desprotonado con un pH fisiológico.
NH3^{+} \rightarrow amida neutra + grupo carboxilo negativo.
(cambio de carga de -2)
Anhídrido succínico
\vskip1.000000\baselineskip
6
Anhídrido maléico
7
Anhídrido glutárico
8
Anhídrido ftálico
9
1.2.2. Anhídridos cíclicos que tienen un grupo carboxilo adicional en el anillo
Dan, por reacción con aminas en proteínas, enlaces de amida que no son protonados con un pH fisiológico y además introducen dos grupos carboxilo que son desprotonados con un pH fisiológico.
NH_{3}^{+} \rightarrow amida neutra + 2 grupos carboxilo negativos.
(cambio de carga de -3).
anhídrido cis o trans-aconítico
10
11
2. Haluros ácidos (en general cloruros de ácido), que no forman parte de la invención
Dan, por reacción con aminas en proteínas, enlaces de amida que no son protonados con un pH fisiológico.
NH_{3}^{+} \rightarrow amida neutra.
(cambio de carga de -1).
Fluoruro de acetilo
12 
\newpage
Cloruro de acetilo
13
Bromuro de acetilo
14
Cloruro de propionilo
15
Cloruro de butirilo
16
Cloruro de estearilo
17
Fosgeno (cloruro de carbonilo)
18
cloruro de bencenosulfonilo
19
Ácido clorosulfónico
--- HO --- 
\melm{\delm{\para}{O}}{S}{\uelm{\para}{O}}
--- Cl
Los dos últimos dan un cambio de carga de -2 porque, además de la eliminación de la carga positiva del grupo amino, se introduce una carga negativa en el grupo sulfonilo.
3. Aldehídos que no forman parte de la invención
Dan iminas por reacción con aminas en proteínas.
NH_{3}^{+} \rightarrow imina neutral.
(cambio de carga de -1).
\newpage
Formaldehido
20
Acetaldheido
21
Propionaldehido
22
Butiraldehido
23
Valeraldehido
24
Caproaldehido
25
4. Isotiocianatos, que no forman parte de la invención
Dan, por reacción con aminas en proteínas, enlaces de tiocarbamilo que no son protonados con un pH fisiológico.
NH_{3}^{+} \rightarrow tiocarbamilo neutro.
(cambio de carga de -1).
Isotiocianato de benceno
\vskip1.000000\baselineskip
26
Isotiocianato de fluoresceína
\vskip1.000000\baselineskip
27 
\newpage
Isotiocianato de rodamina
28
Derivados de azúcar de para-Isotiocianatofenilo
29
5. Isocianatos, que no forman parte de la invención
Dan, por reacción con aminas en proteínas, enlaces de urea que no son protonados con un pH fisiológico.
NH_{3}^{+} \rightarrow urea neutra.
(cambio de carga de -1).
Isocianato de benceno
30
Los reactivos anteriormente mencionados para obtener proteínas o polipéptidos poli-aniónicos están lejos de completarse y se dan sólo unos ejemplos de los distintos grupos.
En el caso de todos los reactivos, los grupos funcionales aniónicos adicionales, como fosfatos, sulfatos y grupos carboxilo, pueden, donde sea posible, ser incorporados en la cadena de tal manera que se introduzcan cargas negativas adicionales.
Dado que la carga negativa neta adicional en los polipéptidos que son usados según la invención es trascendental para la acción, la proteína precursora o polipéptido precursor preferiblemente contiene tantos grupos como sea posible que pueden derivar y así adquirir una carga negativa adicional. Preferiblemente, los oligopéptidos naturales o sintéticos, que se usan como precursores, consisten en hasta más del 5%, en particular más del 15% e incluso más particularmente más del 25% de aminoácidos que contienen grupos amino funcionales u otros grupos básicos funcionales, por ejemplo la lisina e histidina anteriormente mencionada.
Las preparaciones según la invención pueden ser administradas por vía enteral o parenteral. Las preparaciones que pueden ser administradas parenteralmente o enteralmente pueden también ser preparadas a partir de preparaciones según la invención.
Las preparaciones medicinales que contienen los polipéptidos cargados negativamente según la invención pueden estar en forma de polvos, suspensiones, soluciones, pulverizadores, emulsiones, pomadas o cremas y pueden ser usados para aplicación tópica, para administración intranasal, rectal o vaginal, y también para administración oral o parenteral (intravenosa, intradérmica, intramuscular, intratecal, y similar). Estas preparaciones pueden ser preparadas combinando los polipéptidos cargados negativamente (por ejemplo mediante la mezcla, disolución o similar) con excipientes aceptables farmacéuticamente de un tipo neutro, como disolventes acuosos o no acuosos, estabilizadores, emulsionantes, detergentes y aditivos, y también, si se desea, con colorantes y sustancias aromáticas. La concentración del polipéptido cargado negativamente en la preparación según la invención puede variar sustancialmente y estar entre 0.001, preferiblemente 0.1, y 100%, dependiendo del modo de administración. Además, la dosis del polipéptido cargado negativamente que debe ser administrada puede, por ejemplo, estar entre 0.1 mg y 100 mg/kg de peso corporal.
La invención también se refiere al uso de sustancias que han adquirido una carga negativa neta adicional, tal como se ha definido anteriormente, como sustancia activa o como sustancia que contribuye a la acción, o como excipiente para sustancia activa al preparar preparaciones farmacéuticas que son adecuadas para tratar o curar infecciones víricas y enfermedades de inmunodeficiencia como infecciones de retrovirus, incluyendo el SIDA y enfermedades relacionadas con el SIDA, y que pueden ser usadas para inhibir la fusión de células infectadas con células no infectadas.
La invención también se refiere a un método para tratar enfermedades o trastornos provocados por infecciones de retrovirus como el SIDA y enfermedades relacionadas con el SIDA, o condiciones en las que se produce la fusión de virus con células o la fusión de células infectadas con virus o la fusión de células infectadas con virus con células no infectadas, usándose un método con el que una proteína o polipéptido también cargado negativamente tal como se ha definido anteriormente.
La invención también se refiere a un método para la preparación de proteínas y polipéptidos modificados, método con el que los grupos amino y/u otros grupos funcionales básicos de las proteínas o polipéptidos están derivatizados con un agente reactivo que impide la protonación de aminoácidos básicos, las proteínas o polipéptidos adquieren así una carga negativa neta adicional de manera que la prolongación del tiempo de retención del derivado de proteínas o polipéptidos, comparado con el de proteínas o polipéptidos no convertidos a un derivado es al menos de 9 minutos, el tiempo de retención estando determinado mediante FPLC (Cromatografía Rápida Líquida Proteínica) en una columna de intercambio aniónico.
La invención también se refiere a las nuevas proteínas o polipéptidos modificados, que comprenden una proteína o polipéptido donde los grupos amino y/u otros grupos funcionales básicos han sido reaccionados con un reactivo que impide la protonación de los aminoácidos básicos y/u otros grupos básicos o reemplaza dichos aminoácidos básicos y/u otros grupos básicos por uno o más grupos funcionales que tienen una carga negativa, la proteína o polipéptido modificado teniendo una carga negativa neta adicional, comparado con la proteína o polipéptido no modificados, de manera que la prolongación del tiempo de retención del derivado de proteínas o polipéptidos, comparado con el de la proteína o polipéptido no convertidos a un derivado, es al menos de 9 minutos, el tiempo de retención estando determinado mediante FPLC en una columna que contiene un intercambiador aniónico.
Según la invención, se ha descubierto que los polipéptidos cargados negativamente son, entre otras cosas, agentes anti-VIH potentes y selectivos que reducen sustancialmente la formación de sincitios y la fusión virus-células, no se enlazan con el epitopo OKT4A del receptor CD4 y tienen sólo una acción inhibitoria ligera en la interacción de anti-gp120 y mAb gp120 y la unión de células y virus con concentraciones muy bajas. Los polipéptidos cargados negativamente usados o preparados según la invención no tienen o sólo tienen una toxicidad baja.
La invención está ilustrada con referencia a la investigación descrita abajo.
Investigación Preparación de albúmina cargada negativamente con la ayuda de formaldehído y anhídrido succínico (forma-HSA y suc-HSA)
500 mg de HSA fueron disueltos en 50 ml de 0.2 M de Na_{2} CO_{3} (pH 10.0), formaldehído fue añadido para dar una concentración final del 20% en peso, en base al material precursor, y la solución formada fue agitada en la oscuridad durante 72 horas a temperatura ambiente. Con el objetivo de eliminar el material insoluble, la solución fue filtrada a través de un filtro con aberturas de 0.2 \mum, purificada en una columna Sephadex G25, lavada con agua destilada en una membrana PM10 en un "Concentrador de Células Agitadas" Amicon y, por último, liofilizada, obteniéndose forma-HSA.
500 mg de HSA fueron disueltos en 50 ml de 0.2 M de K2 HPO4 (pH 8.0). 500 mg de anhídrido succínico sólido fueron añadidos y la solución fue agitada hasta disolver el anhídrido succínico. El pH fue mantenido entre 8.0 y 8.5 usando 6 M de hidróxido sódico. La purificación se efectuó como se describe para forma-HSA. Se obtuvo suc-HSA pura.
La carga negativa neta adicional de la albúmina modificada fue determinada con la ayuda de un sistema FPLC (Cromatografía Rápida líquida Proteínica) de Pharmacia, Woerden, Países Bajos, usando una columna de intercambio aniónico mono-Q de Pharmacia. El tampón A fue un tampón 0.02 M de Tris.HCI (pH 7.4) y el tampón B consistió en un tampón A más 1 M de NaCl. La elución se efectuó a razón de 0.25 ml/ minutos, usando un gradiente del 100% de A al 100% de B en 30 minutos. Las muestras de la sustancia que debían ser investigadas fueron disueltas en una cantidad de 1 mg/ml en un tampón A y en cada caso 100 \mul fueron inyectados en el sistema de FPLC.
Las células MT-4 de una línea celular de linfocitos de tiroxina portadora de HTLV-I fueron usadas para la prueba anti-VIH-1. Las células MT-4 fueron cultivadas en un medio RPMI 1640, completado con el 10% por volumen de suero fetal de ternera inactivado por calor (FCS) y 20 \mug/ml de gentamicina. Las células MOLT-4 (clone 8, ver J.Virol. 57, 1159-1162) fueron usadas para la prueba sobre la formación de sincitios . Las células fueron mantenidas en una atmósfera húmeda de CO_{2} al 5% en aire a una temperatura de 37ºC. Todas las células de 3-4 días fueron centrifugadas y transferidas a nuevos frascos de cultivo (2x10^{5} células/ml). Las células fueron analizadas periódicamente por la presencia de micoplasma: hallándose siempre que estaban libres de micoplasma.
Se obtuvo VIH-1 (cepa HTLV-III_{B}) a partir del fluido de cultivo de células HUT-78 infectadas con VIH-1. La titulación de virus del fluido de cultivo fue determinada en células MT-4 . El virus fue conservado a -70ºC.
La actividad antivírica de los polipéptidos cargados negativamente fue determinada en base al efecto inhibitorio en la citopatogenicidad inducida por virus en células MT-4 y fue registrada con la ayuda del método de bromuro 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,5-difeniltetrazolio (MTT), que está descrito en J.Virol. Methods 20, 309-321.
La formación de sincitios fue determinada como sigue. Los polipéptidos modificados fueron diluidos en RPMI y transferidos a los pozos de placas de microtitulación. 5x10^{4} células HUT-78 infectadas por VIH-1, que han sido lavadas previamente dos veces para eliminar partículas libres de virus, fueron luego añadidas a los pocillos, inmediatamente seguido de la adición de 5x10^{4} células MOLT-4, obteniéndose un volumen final de 200 \mul. Las mezclas de células fueron cultivadas a 37ºC en una incubadora de células que contiene CO_{2}. Los primeros sincitios fueron formados después de 4-6 horas. Después de 24 horas las células fueron analizadas por examen microscópico y citofluorografía por flujo de láser.
El ensayo sobre la adsorción de virus se efectuó como sigue.
Las células MT-4 fueron expuestas a viriones de VIH-1 en ausencia o presencia de los polipéptidos cargados negativamente según la invención. Tras la incubación durante 30 minutos a 37ºC, las células fueron lavadas para eliminar las partículas de virus no enlazadas. Las células fueron luego tintadas para la fluorescencia indirecta usando un anticuerpo policlonal para VIH-1, y las partículas de VIH-1 enlazadas a las células fueron analizadas por citofluorografía por flujo de láser.
El ensayo de inmunofluorescencia de CD4 se efectuó usando el método descrito en Nº. 42 Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86, 3322-3326. Las células MT-4 fueron incubadas durante varios períodos a temperatura ambiente en ausencia y presencia de un polipéptido cargado negativamente. Las células fueron luego teñidas con concentraciones óptimas de los anticuerpos monoclonales OKT4A-FITC (ortodiagnósticos) o anti-leu3a-PE y "Control inmunológico Simultest" con material de control (IgG_{1} marcado FITC e IgG_{2} marcado PE) (Becton Dickinson) durante 20 minutos a 4ºC, lavadas una vez en PBS y fijadas en 0.5 ml del 0.5% en peso de paraformaldehido en PBS.
Las investigaciones anteriormente descritas mostraron que existe una correlación clara entre la actividad antivírica y la carga negativa. Por ejemplo, por simple succinilación de los grupos de lisina de albúmina se obtiene un compuesto aniónico que tiene un IC_{50} muy bajo (1 \mug/ml). Ninguno de los polipéptidos cargados negativamente evaluados resultó ser citotóxico en concentraciones de hasta 1000 \mug/ml.
El material Aco-HSA fue preparado de forma análoga al método anteriormente descrito. La actividad anti-VIH de este material es altísima: IC_{50} = 0.0056 \mug/ml. Este compuesto es en consecuencia 175 veces más activo que Suc-HSA y es uno de los compuestos más activos conocido actualmente (aproximadamente 25 veces más activo que
AZT).
Los polipéptidos cargados negativamente según la invención inhiben la adsorción de virus sólo en un grado ligero, por ejemplo en una concentración de 100 \mug/ml. Por comparación: sulfato de dextrano inhibió la adsorción de virus prácticamente por completo con una concentración de 25 \mug/ml.
La formación de sincitios es considerablemente reducida por los polipéptidos cargados negativamente según la invención, por ejemplo al 50% con una concentración de sólo aproximadamente 2 \mug/ml. Con el objetivo de obtener una inhibición similar con, por ejemplo, sulfato de dextrano, se requiere una concentración de 28 \mug/ml, esta cantidad es aproximadamente 50 veces superior a su IC_{50} en el ensayo antivírico (0.6 \mug/ml).
Es conocido que OKT4A mAb se enlaza con un epítopo de la molécula CD4, que es responsable de la adsorción del VIH y puede prevenir el enlace de partículas de VIH con las células. El ácido aurintricarboxílico (ATA) da una interacción específica con este epítopo de la molécula CD4 y fue usado como control positivo. La interacción de OKT4A mAb-CD4 fue completamente inhibida por ATA en una concentración de 25 \mug/ml. Los polipéptidos cargados negativamente según la invención (y también el sulfato de dextrano) no influyó en esta interacción en concentraciones de hasta 100 \mug/ml, a partir de lo cual se puede concluir que las sustancias activas según la invención no enlazan con este epítopo del receptor de CD4.
De forma persistente, las células HUT-78 infectadas por VIH-1 y un anti-gp120 mAb específico, que reconoce la región V3 de gp120 y que juega un papel importante en la formación de células gigantes, fueron usadas en la investigación de la interacción directa de los polipéptidos cargados negativamente con el gp120 vírico. El sulfato de dextrano inhibió la unión de anti-gp120 mAb a gp120 de cierto modo que es dependiente de la concentración, las cantidades implicadas siendo aquellas iguales a las cantidades que tienen una acción antivírica. Los polipéptidos cargados negativamente según la invención también inhiben la interacción anti-gp120-mAb-gp120 de un modo que es dependiente de la concentración. No obstante, la concentración que se necesita para una inhibición del 50% es muchas veces (por ejemplo 100 veces) superior al IC_{50}, a partir de lo cual se puede concluir que la protección de gp120 probablemente no es el único mecanismo de acción de los compuestos según la inven-
ción.
El mecanismo de acción de los compuestos según la invención se basa en prevenir la fusión del virus con las células y con un compuesto a partir de la fusión de células infectadas con células no infectadas. Muy probablemente, la interacción de los compuestos con proteínas de fusión víricas (como GP41 en el caso del VIH) es esencial aquí. Este mecanismo de acción nunca ha sido descrito antes.
Procedimiento para y resultados de otros experimentos sobre la acción anti-vírica y anticoagulante
Se hace referencia a las Tablas anexas 1, 2, 3 y 4.
La actividad antivírica de dos sustancias según la invención (Aco-HSA y Suc-HSA) contra virus que causan la inmunodeficiencia está comparada con la actividad del sulfato de dextrano, otro compuesto antivírico polianiónico. Conclusión: las sustancias según la invención son activas contra el VIH-1, VIH- 2, FIV y SIV.
La prueba anti-VIH-1 ha sido ya anteriormente descrita.
VIH-2 (LAV-2_{ROD}) (obtenido por el Dr. L. Montagnier, París, Francia) fue aislado del medio sobrenadante de células MOLT-4 infectadas de forma persistente por LAV-2_{ROD}. La prueba anti-VIH-2 es idéntica a la prueba anti-VIH-1.
FIV-48 y FIV-113 fueron aislados de glóbulos rojos mononucleares periféricos de gatos salvajes seropositivos. La prueba anti-FIV se efectuó usando el método de Egberink et al. (Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1990) 87: 3087-3091).
Los timocitos de gato estimulados por mitogenes fueron colocados en placas en pocillos de 1.6 cm^{2} (10^{6} células por ml) con varias concentraciones de las sustancias que deben ser evaluadas. Después de la incubación durante 1 hora a 37ºC, se añadió FIV en una cantidad correspondiente a 6x10^{6} cpm de actividad de transcriptasa inversa (RT). Después de la incubación durante 1 hora a 37ºC, el medio fue reemplazado por un medio fresco que contenía varias concentraciones de las sustancias que debían ser evaluadas. La actividad de RT en el sobrenadante fue determinada después de la incubación durante 4 y 6 días a 37ºC (ver Tabla 2).
La actividad antivírica de dos sustancias según la invención (Aco-HSA y Suc-HSA) contra virus de ADN está comparada con la actividad de sulfato de dextrano, otro compuesto polianiónico antivírico. Conclusión: las sustancias según la invención no tienen actividad contra el virus de ADN evaluado, a diferencia del sulfato de dextrano.
Prueba Anti-CMV: se cultivaron fibroblastos de pulmón humano embrionario (HEL) en un medio MEM al cual se añadió el 10% de suero fetal de ternera, 1% de L-glutamina y 0.3% de bicarbonato sódico. Las células fueron infectadas con 100 Pfu (unidades de formación de plagas) de citomegalovirus humanos (CMV, cepa AD169 y cepa Davis). Al mismo tiempo, las sustancias que debían evaluarse fueron añadidas en varias concentraciones. La formación de plagas de virus y la muerte celular provocada por el virus fue determinada como se describe por Snoeck et al. (1988) 32, 1839-1844 (ver Tabla 2).
La actividad antivírica de dos sustancias según la invención (Aco-HSA y Suc-HSA) contra virus de ARN está comparada con la actividad del sulfato de dextrano, otro compuesto antivírico polianiónico. Conclusión: Las sustancias según la invención no tienen actividad contra el virus de ARN evaluado salvo por gripe. Por el contrario, el sulfato de dextrano tiene una actividad sólo contra los virus VSV y Sindbis.
La actividad de las sustancias contra el virus polio, virus Coxsackie, VSV, Sindbis, Virus Semliki Forest, reovirus, virus para-influenza, HSV-1, HSV-2 y VMW fue determinada de la siguiente manera:
Cultivos de células confluyentes (células Vero, células HeLa y células de riñón de conejo endógenas) fueron inoculados con los distintos virus hasta 100 veces el CCID_{50} (50% de la dosis infecciosa del cultivo celular) con varias concentraciones de las sustancias que deben evaluarse. Después de 1 hora el medio fue reemplazado por un medio en el que sólo las sustancias que deben evaluarse están además presentes en varias concentraciones. La muerte celular provocada por los virus fue determinada después de 1 a 2 días post infección por VSV; después de 2 días por el virus Coxsackie, virus Semlili Forest y virus polio; después de 2 a 3 días por el virus del HSV-1, HSV-2 y Sindbis; y después de 6 días por el virus parainfluenza y reo-virus.
La actividad de las sustancias que deben evaluarse contra el virus Sendai y virus de la gripe fue determinada midiendo la fusión de la membrana vírica con células fantasma de eritrocitos y liposomas y con células BHK-21 o células LLC-MK_{2}D. Para este propósito se usó el método de desenfriamiento por R_{15} según está descrito por Hoekstra et al. (1984), Biochemistry 23, 5675-5681 y Wildschut et al. en Molecular Mechanisms of Membrane Fusion, (S. Ohki, D. Doyle, T.D. Flanagan, S.W. Hui y E. Mayhew, editors) 1988, Plenum Press, Nueva York, págs. 441-450.
En resumen: virus de gripe y virus Sendai fueron marcados por R_{15}. Esto resultó en un auto-enfriamiento rápido del 70% de la fluorescencia. 35 \mul de una suspensión concentrada del virus marcado por R_{15} fueron introducidos en una cubeta que contenía liposomas y células fantasma de eritrocitos de varias células (en un tampón HEPES) y el aumento de la fluorescencia (desenfriamiento) provocado por la fusión fue medido en línea (excitación 560 nm, emisión 590 nm). El mismo procedimiento se efectuó con varias concentraciones de las sustancias que debían evaluarse.
Otros compuestos antivíricos polianiónicos como sulfato de dextrano y heparina tienen una actividad anticoagulante seria como efecto secundario negativo significante. Las sustancias según la invención no tienen este efecto secundario. Sólo la Aco-HSA tiene una actividad anticoagulante ligera con altas concentraciones de, por ejemplo, 100 \mug/ml (es decir más de 10,000 x la concentración antivírica).
TABLA 1
31
TABLA 2
32
TABLA 3
33
TABLA 4
35
Los compuestos fueron disueltos en PBS de pH 7.2 y 30 \mul fueron añadidos a 270 \mul de plasma.
Como control, 30 \mul de PBS fueron añadidos a 270 \mul de plasma, lo que resultó en un valor APTT de 38.0 seg.
APTT = tiempo de tromboplastina parcial activada (segundos)
APTT fue determinada electromecánicamente usando métodos estándar.

Claims (10)

1. Proteína o polipéptido modificado que comprende una proteína o polipéptido donde los grupos amino y/u otros grupos funcionales básicos han sido reaccionados con un reactivo que reemplaza los grupos amino y/u otros grupos funcionales básicos por uno o más grupos funcionales, donde:
(a) los grupos funcionales están seleccionados a partir de grupos cis-aconitato, los grupos cis-aconitato siendo derivados de anhídrido cis-aconítico,
(b) la proteína o polipéptido modificado tiene una carga negativa neta adicional de tal manera que la prolongación del tiempo de retención del derivado de la proteína o polipéptido, comparado con el de la proteína o polipéptido no convertido en derivado, es al menos de 9 minutos, y
(c) la proteína o polipéptido modificado contiene una estructura de polipéptido polianiónico.
2. Proteína o polipéptido modificado según la reivindicación 1, donde la proteína o polipéptido modificado se ha obtenido a partir de ácidos poliamínicos y proteínas de plasma modificadas.
3. Método para la preparación de proteínas o polipéptidos modificados, donde los grupos amino y/u otros grupos funcionales básicos de las proteínas o polipéptidos están derivatizados con un agente reactivo que reemplaza los grupos amino y/u otros grupos funcionales básicos por uno o más grupos funcionales, donde:
(a) los grupos funcionales están seleccionados a partir de grupos de cis-aconitato,
(b) el agente reactivo es anhídrido cis-aconítico,
(c) la proteína o polipéptido modificado tiene una carga negativa neta adicional de tal manera que la prolongación del tiempo de retención del derivado de la proteína o polipéptido, comparado con el de la proteína o polipéptido no convertido en derivado, es al menos de 9 minutos, y
(d) las proteínas o polipéptidos adquieren una estructura de polipéptido polianiónico.
4. Método según la reivindicación 3, donde la proteína o polipéptido modificado se ha obtenido a partir de ácidos poliamínicos y proteínas de plasma modificadas.
5. Preparaciones farmacéuticas para tratar o curar infecciones del VIH, estas preparaciones contienen proteínas o polipéptidos modificados según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
6. Preparaciones farmacéuticas según la reivindicación 5, donde la infección por VIH es una infección por VIH-1.
7. Preparaciones farmacéuticas para tratar o curar la gripe, estas preparaciones contienen proteínas o polipéptidos modificados según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
8. Uso de una proteína o polipéptido modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de infecciones por VIH.
9. Uso según la reivindicación 8, donde la infección por VIH es una infección por VIH-1.
10. Uso de una proteína o polipéptido modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la gripe.
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