ES2324600T3 - Agente para la prevencion y el tratamiento de enfermedades tipo i transmisibles por via sexual. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de fórmula I, II o III:** ver fórmulas** en donde R representa a un grupo de la fórmula IV: ** ver fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Description
Agente para la prevención y el tratamiento de
enfermedades tipo I transmisibles por vía sexual.
Esta invención se relaciona con la prevención y
el tratamiento de enfermedades sexualmente transmisibles, y en
particular se relaciona con el uso de un dendrímero que tiene grupos
terminales naftil disulfonato como agente aplicado tópicamente en
la profilaxis o el tratamiento terapéutico de estas
enfermedades.
La incidencia global, morbilidad, y mortalidad
de enfermedades sexualmente transmisibles (STD) causadas por VIH,
HSV y otros patógenos virales y microbianos se calcula en varios
cientos de millones de individuos alrededor del mundo. Una
propuesta para el control de la transmisión de las STD es el uso
controlado de microbicidas rectales o vaginales aplicados
tópicamente a machos/hembras que inactivan a los patógenos
relevantes. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos microbicidas
tópicos seguros para uso intravaginal o intrarectal para la
prevención y el tratamiento de STD es un objetivo importante para el
desarrollo de nuevos fármacos.
Las Solicitudes Internacionales de Patente Nos.:
PCT/AU95/00350 (WO 95/34595), PCT/AU99/00763
(WO 00/15240 y Witvrouw y colaboradores, (2000), Molecular Pharmacology 58(5): 1100 - 1108 divulgan una nueva clase de agentes polivalentes - los dendrímeros, macromoléculas altamente ramificadas con una envoltura definida de grupos superficiales catiónicos o polianiónicos que han demostrado exhibir un rango de actividad antiviral y antimicrobiana con toxicidad mínima. A diferencia de las estructuras moleculares pequeñas de la mayoría de los antivirales, estos dendrímeros son una clase de compuestos macromoleculares polivalentes altamente ramificados formados por secuencias iterativas de reacción que parten de una molécula nuclear inicial con capas sucesivas o etapas que son añadidas en "generaciones" sucesivas para construir un compuesto polimérico tridimensional altamente ordenado. Los dendrímeros se caracterizan por los siguientes rasgos: i. un núcleo iniciador que puede tener uno o más sitios reactivos y ser una partícula puntual o de tamaño significativo a fin de efectuar la topología de los dendrímeros, ii. Capas de unidades ramificadas de repetición unidas al núcleo iniciador; iii. grupos terminales funcionales (tales como fracciones que contienen grupos catiónicos o aniónicos) unidos a la superficie del dendrímero, opcionalmente a través de grupos de enlazamiento.
(WO 00/15240 y Witvrouw y colaboradores, (2000), Molecular Pharmacology 58(5): 1100 - 1108 divulgan una nueva clase de agentes polivalentes - los dendrímeros, macromoléculas altamente ramificadas con una envoltura definida de grupos superficiales catiónicos o polianiónicos que han demostrado exhibir un rango de actividad antiviral y antimicrobiana con toxicidad mínima. A diferencia de las estructuras moleculares pequeñas de la mayoría de los antivirales, estos dendrímeros son una clase de compuestos macromoleculares polivalentes altamente ramificados formados por secuencias iterativas de reacción que parten de una molécula nuclear inicial con capas sucesivas o etapas que son añadidas en "generaciones" sucesivas para construir un compuesto polimérico tridimensional altamente ordenado. Los dendrímeros se caracterizan por los siguientes rasgos: i. un núcleo iniciador que puede tener uno o más sitios reactivos y ser una partícula puntual o de tamaño significativo a fin de efectuar la topología de los dendrímeros, ii. Capas de unidades ramificadas de repetición unidas al núcleo iniciador; iii. grupos terminales funcionales (tales como fracciones que contienen grupos catiónicos o aniónicos) unidos a la superficie del dendrímero, opcionalmente a través de grupos de enlazamiento.
Estos compuestos macromoleculares se sintetizan
a partir de bloques de construcción monoméricos con ramificaciones
múltiples o estructuras tipo árbol, y la superficie exterior de la
molécula trasporta una cantidad de grupos funcionales que conducen
al reconocimiento por parte de un receptor biológico.
La preparación de dendrímeros es conocida, y es
descrita manera de ejemplo en las patentes estadounidenses Nos.:
4.289.872 y 4.410.688 (que describen dendrímeros con base en capas
de unidades de lisina), así como en las patentes estadounidenses
Nos.: 4.507.466. 4.558.120. 4.568.737 y 4.587.329 (que describen
dendrímeros con base en otras unidades que incluyen poliamidoamina
o dendrímeros PAMAM).
En ensayos antivirales o antimicrobianos, un
subconjunto de estas estructuras dendrímeras han mostrado
inesperadamente una actividad excepcional contra un amplio espectro
de microorganismos asociados con enfermedades sexualmente
trasmisibles, que los convierten en agentes de escogencia para el
desarrollo de un microbicida rectal o vaginal para la profilaxis y
el tratamiento de enfermedades sexualmente trasmisibles.
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siguiente)
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De acuerdo con la presente invención, se provee
un compuesto de fórmula I, II, o III:
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en donde R representa un grupo de
fórmula
IV:
o una sal farmacéuticamente
aceptable del
mismo.
Las sales de adición básica farmacéuticamente
aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales metálicas
tales como sales de aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio,
sodio y zinc, así como sales orgánicas elaboradas a partir de
aminas orgánicas tales como
N,N'-dibenciletilendiamina, cloroprocaina,
dietanolamina, etilendiamina, diciclohexilamina, meglumina
(N-metilglucamina) y procaína, aminas cuaternarias
tales como colina, y sales de sulfonio y de fosfonio.
Los compuestos particularmente preferidos de la
presente invención son los compuestos denominados aquí como
SPL-7013, SPL-7304 y
SPL-7320 cuyas estructuras consisten del dendrímero
de polilisina, del dendrímero de poliamidoamina (PAMAM), y del
dendrímero de polipropilén imina, andamios respectivamente con los
grupos activos de superficie que consisten de 32 grupos ácidos
naftil disulfónicos como sales de sodio. Cada uno de los grupos
funcionales de superficie de naftil-disulfonato está
unido al andamio del dendrímero ramificado con un enlace
amido-metilenoxi a los 32 grupos terminales.
La presente invención también proporciona una
composición farmacéutica tópica para tratamiento profiláctico o
terapéutico de enfermedades trasmitidas sexualmente en un paciente
humano, que comprende un compuesto de la fórmula I, II, o III
anterior o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo junto con
al menos un portador o diluyente tópico, farmacéuticamente
aceptable.
En otro aspecto, la presente invención también
provee un método para tratamiento profiláctico o terapéutico de
enfermedades trasmitidas sexualmente en un paciente humano, que
comprende la administración tópica al paciente de una cantidad
efectiva de un compuesto de la fórmula I, II, o III anterior o una
sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En aún otro aspecto, la invención contempla el
uso de un compuesto de la fórmula I, II, o III anterior o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo en la fabricación de un
medicamento para administración tópica en el tratamiento
terapéutico o profiláctico de enfermedades sexualmente trasmitidas
en un paciente humano.
Los compuestos de la fórmula I, II, o III
anterior o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo son
compuestos nuevos que han demostrado inesperadamente una actividad
excepcional contra un amplio espectro de patógenos asociados con
enfermedades sexualmente trasmitidas.
Como se describió anteriormente, los compuestos
SPL-7013, SPL-7304 y
SPL-7320 son compuestos preferidos de la presente
invención, y se ha encontrado que exhiben una actividad antiviral
significativa, particularmente contra vectores virales y
microbianos de las enfermedades sexualmente trasmisibles más
comunes.
SPL-7013 exhibe una actividad
antiviral de amplio espectro con alta eficiencia y mínima toxicidad
celular o animal contra vectores de varias de las más importantes
enfermedades sexualmente transmisibles rectal o vaginalmente. Se ha
determinado una alta actividad contra el virus tipo 2 del Herpes
genital (HSV-2) tanto en análisis de células in
vitro como in vivo en un análisis de un modelo animal
(ratón) y en análisis in vitro de células contra el virus
tipo 1 del Herpes (HSV-1) y en virus de
Inmunodeficiencia Humana (VIH-1, y
VIH-2). Se ha demostrado también que es activo
contra el agente causal de las verrugas genitales, el Virus del
Papiloma Humano (HPV), y contra el vector bacteriano de la uretritis
no específica, Chlamydia trachomatis. En análisis celular,
SPL-7013 ha demostrado también actividad contra
cepas virales del virus tipo 2 del Herpes resistente a los agentes
antivirales actualmente utilizados basados en nucleósidos
modificados. Además, SPL-7304 y
SPL-7320 muestran una alta actividad contra
HSV-1, HSV-2, VIH-1
y VIH-2. Además, SPL-7013,
SPL-7304, y SPL-7320 son activos en
los ensayos de trasmisión del VIH dependientes de CD4 e
independientes de CD4, y son efectivos en la prevención de la unión
y fusión del VIH-1. Todos los compuestos han
demostrado no inhibir el crecimiento de diferentes especies
benéficas de Lactobacilos. Además, SPL-7013,
SPL-7304, y SPL-7320 han demostrado
ser efectivas en la prevención de infección de células monoculares
humanas de sangre periférica (PBMC) ya sea con
VIH-1 RoJo o SIV 89.6pd.
Por lo tanto, estos compuestos son útiles en
profilaxis y en tratamiento terapéutico de enfermedades sexualmente
trasmisibles como agentes microbicidas tópicos para aplicación a la
mucosa vaginal o rectal para proteger contra infecciones sexualmente
trasmisibles.
La presente invención también proporciona una
composición farmacéutica tópica para tratamiento profiláctico o
terapéutico de enfermedades sexualmente trasmisibles en un paciente
humano, que incluye un compuesto de fórmula I, II, o III o una sal
del mismo como se describió anteriormente, junto con al menos un
portador o diluyente tópico farmacéuticamente aceptable.
La formulación de tales composiciones es bien
conocida por las personas capacitadas en esta materia. Los
portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables adecuados
incluyen a cualquiera y a todos los solventes convencionales,
medios de dispersión, rellenos, portadores sólidos, soluciones
acuosas, recubrimientos, agentes antibacterianos y antihongos,
agentes isotónicos, reforzadores o retardadores de absorción,
agentes reforzadores o retardadores de actividad y similares. El
uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente
activas es bien conocido en el arte, y es descrito, por ejemplo en
el Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ava Edición, Mack
Publishing Company, Pensilvania, EUA. Excepto en la medida en que
cualquier portador y/o diluyente convencional sea incompatible con
el ingrediente activo, se contempla el uso de los mismos en las
composiciones farmacéuticas de la presente invención. Los
ingredientes suplementarios activos que incluyen agentes que tienen
actividad antiviral o antimicrobiana pueden ser incorporados
también en las composiciones de esta invención.
Es especialmente conveniente formular
composiciones en forma de dosis unitarias para facilidad de
administración y uniformidad de la dosis. La forma de dosificación
unitaria como se la utiliza aquí se refiere a unidades físicamente
discretas adecuados como dosis unitarias para los individuos humanos
que van a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad
predeterminada de ingrediente activo calculada para producir el
efecto terapéutico deseado junco con el portador y/o diluyente
farmacéuticamente requerido. Las especificaciones para las nuevas
formas unitarias de dosificación de la invención están dictadas y
dependen directamente de (a) las características únicas del
ingrediente activo y del efecto terapéutico particular que se desea
lograr, y (b) de las limitaciones inherentes en el arte de la
elaboración de compuestos tal como un ingrediente activo para el
tratamiento particular.
Como se describió previamente, la presente
invención también provee un método para el tratamiento profiláctico
o terapéutico de enfermedades trasmisibles sexualmente en un
paciente humano por medio de administración tópica al paciente de
una cantidad efectiva de compuestos de fórmula I, II, o III o sales
de los mismos como se describió anteriormente. Además, la presente
invención provee el uso de un compuesto de fórmula I, II, o III o
una sal del mismo como se describió anteriormente en la fabricación
de un medicamento para administración tópica en tal tratamiento
profiláctico o terapéutico de enfermedades sexualmente
trasmisibles.
Una variedad de rutas de administración tópica
están disponibles. El modo particular seleccionado dependerá, desde
luego, de la condición particular que está siendo tratada y de la
dosis requerida para lograr eficacia profiláctica o terapéutica.
Los métodos de esta invención, generalmente hablando, se pueden
practicar utilizando cualquier forma de administración que sea
médicamente aceptable, lo cual significa cualquier forma que
produzca niveles profilácticos o terapéuticos del componente activo
de la invención sin causar efectos clínicamente adversos
inaceptables. Tales formas de administración incluyen rutas vaginal,
rectal, y transdérmica. Las formulaciones adecuadas para
administración tópica, particularmente vaginal o rectal, incluyen
soluciones, suspensiones, geles, lociones y cremas así como
unidades discretas tales como supositorios y suspensiones
microencapsuladas. Otros sistemas de suministro pueden incluir
sistemas de suministro de liberación continuada que pueden permitir
la liberación lenta del componente activo de la invención,
incluyendo geles de liberación continuada, cremas, supositorios, o
cápsulas. Se encuentran disponibles muchos tipos de sistemas de
liberación continuada. Estos incluyen, pero no se limitan a: (a)
sistemas de erosión en los cuales el componente activo está
contenido dentro de una matriz, y (b) sistemas de difusión en los
cuales el componente activo permea a una velocidad controlada a
través de un polímero.
El componente activo de la presente invención se
administra en cantidades profiláctica o terapéuticamente efectivas.
Una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva significa
aquella cantidad necesaria para obtener el efecto deseado, al menos
parcialmente, o para retrasar el inicio, inhibir el progreso, o
detener completamente el inicio el progreso de la condición
particular que está siendo tratada, la severidad de la condición y
los parámetros individuales del paciente incluyendo la edad, la
condición física, el tamaño, el peso y un tratamiento simultáneo.
Estos factores son bien conocidos por aquellos ordinariamente
capacitados en el arte y pueden ser abordados no más que con
experimentación de rutina. Se prefiere generalmente utilizar una
dosis máxima, esto es, la dosis más alta segura de acuerdo con un
juicio médico sólido. Aquellos ordinariamente capacitados en el
arte comprenderán, sin embargo, que se puede administrar una dosis
menor o una dosis tolerable por razones médicas, razones
psicológicas o virtualmente por cualquier otra razón.
Generalmente, a intervalos que estarán
determinados por la profilaxis o el tratamiento de estados
patogénicos, las dosis intravaginal o intrarectal del componente
activo serán aproximadamente de 0,01 mg/kg por día hasta 1.000
mg/kg por día. Se pueden administrar inicialmente dosis pequeñas
(0,01 - 1 mg), seguido por dosis mayores aproximadamente hasta de
1.000 mg/kg por día. En el evento de que la respuesta en un
individuo sea insuficiente en tales dosis, se pueden emplear
inclusive dosis más altas (o dosis efectivas más altas por medio de
una ruta de suministro diferente, más localizada) hasta el grado en
que la tolerancia del paciente lo permita. Se pueden contemplar
múltiples dosis por día para lograr los niveles sistémicos
apropiados de los compuestos.
En un aspecto particularmente preferido, la
presente invención permite el uso de SPL-7013,
SPL-7304 o SPL-7320 como un
microbicida vaginal o rectal de amplio espectro, útil en la
prevención y el tratamiento de enfermedades virales y microbianas
sexualmente trasmisibles. SPL-7013,
SPL-7304 y SPL-7320 son solubles en
agua y se los puede utilizar en solución, o se los puede formular
en un vehículo adecuado en la forma de gel, loción, crema o
supositorio o suspensión microencapsulada en solventes acuosos o no
acuosos, junto con reforzadores o retardadores de su actividad,
agentes para su mejor absorción o absorción retardada para
aplicación tópica, o agentes para mejorar la adhesión al epitelio
vaginal/rectal o a las capas mucosas.
A través de esta descripción y de las
reivindicaciones acompañantes, a menos que el contexto requiera
otras cosa, la palabra "incluye" (en singular o en plural), o
variaciones tales como "que incluye", se entenderá que
implican la inclusión de una etapa establecida o etapas o enteros o
grupo de enteros pero no la exclusión de ninguna otra etapa o
etapas o entero o grupo de enteros.
Otras características de la presente invención
serán evidentes a partir de los siguientes Ejemplos que se incluyen
a manera de ilustración, no limitante, de la invención.
Se disolvió L-Lisina. HCl (1,83
kg; 10 moles) en una solución de hidróxido de sodio (880 g; 22
moles) en agua (201) y se diluyó la solución resultante con
t-butanol (151). Se añadió luego
Di-t-butil bicarbonato (4,48 kg;
20,5 moles) gota a gota por 1 hora durante la cual la mezcla de
reacción se volvió lechosa y se calentó (30 - 35ºC). Se agitó la
mezcla durante la noche para producir una solución clara. Se extrajo
la solución con petróleo (40 - 60ºC) (2 X 101) y se extrajo la fase
orgánica con solución saturada de NaHCO_{3} (3 X 41). Se
enfriaron las capas acuosas combinadas en un baño de hielo y se
aciduló cuidadosamente hasta pH 2 con solución de KHSO_{4} 1 M.
Se extrajo luego la mezcla turbia con éter (4 X 161) y se lavaron
las capas orgánicas combinadas con agua (2 X 81), se secó
(MgSO_{4}) y se concentró con una temperatura del baño de <30º
para producir un rendimiento cuantitativo de
N,N'-di-t-Boc-L-Lisina
como un aceite muy viscoso.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió gota a gota una solución de
diciclohexil carbodiimida (DCC) (2,06 kg; 10 moles) en acetato de
etilo (51) a una solución agitada enfriada con hielo de
Di-t-Boc-L-lisina
(DBL) (3,46 kg; 10 moles) y 4-nitrofenol (NpOH)
(1,39 kg; 10 moles) en acetato de etilo (151) bajo atmósfera de
nitrógeno. Después de completar la adición, se le permitió a la
mezcla calentarse hasta temperatura ambiente y se la agitó durante
la noche. Se filtró luego la suspensión blanca resultante y se
concentró el filtrado para producir un residuo amarillento sólido.
Se recristalizó el residuo a partir de éter para producir
N,N'-di-t-Boc-L-lisina
4-nitrofenil éster como un sólido de color blanco
(rendimiento aproximado del 60%). Se puede aislar luego más del
producto a partir de los licores madre.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió una solución de DCC (41,2 g; 0,2
moles) en diclorometano seco (200 ml) a una solución enfriada sobre
hielo de DBL (69,2 g; 0,2 moles) y benzhidrilamina (BHA) (36,65 g;
0,2 moles) en diclorometano (600 ml). Se agitó la mezcla a 0º
durante 30 minutos y luego a temperatura ambiente durante 3 horas.
Se filtró la suspensión resultante y una tlc (éter de
petróleo/EtOAc, 9:1) del filtrado no mostró material de partida. Se
lavó el filtrado con HCl al 5%, agua, NaHCO_{3} saturado y agua;
luego se secó (MgSO_{4}) y se concentró para producir una
espuma.
Se añadió ácido trifluoroacético (TFA) (400 ml)
a una solución agitada de la espuma en diclorometano seco (200 ml)
a temperatura ambiente. Hubo inicialmente una evolución vigorosa de
gas que paró aproximadamente después de 15 minutos; la tlc (EtOAc)
no mostró material de partida. Se agitó la solución durante 2 horas
adicionales y luego se concentró para producir un aceite parduzco.
Se disolvió este aceite en acetonitrilo seco (600 ml) y se disolvió
una solución saturada de HCl gaseoso en etanol absoluto
(aproximadamente 360 ml) añadido con formación de remolino. Comenzó
a cristalizar pronto un sólido de color blanco y se dejó a la mezcla
permanecer durante 1 hora a temperatura ambiente hasta
cristalización completa. Se filtró la mezcla y se lavó el sólido con
acetonitrilo seco, luego se secó para producir BHAlys.2HCl como un
polvo de color blanco (rendimiento aproximado del 50%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió trietilamina (39,5 ml; 0,283 moles) a
una solución agitada de BHAlys.2HCl (54,4 g; 0,14 moles) en DMF
seco (300 ml). Se formó una suspensión de color blanco que fue
agitada durante 15 minutos cuando se añadió DBLONp (262 g; 0,56
moles). La mezcla se volvió inmediatamente amarilla y fue agitada
durante 3 horas, manteniendo el pH de la mezcla en 8 - 9 por medio
de la adición de trietilamina. Se añadió luego la mezcla de reacción
lentamente a un gran volumen de agua vigorosamente agitada y se
agitó la mezcla durante la noche. Se recogió el precipitador por
medio de filtración y se lo lavó con agua (3X) y se lo secó para
producir un sólido de color amarillento. Se convirtió el polvo este
sólido y luego se lo lavó sucesivamente con éter hasta que el éter
no mostró color amarillo por tratamiento con NaOH acuoso. Se secó el
sólido restante para producir BHAlyslys_{2}Boc_{4} como un
polvo de color blanco (rendimiento aproximado del 70%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió ácido trifluoroacético (600 ml) a una
solución de BHAlyslys_{2}Boc_{4} (116 g; 0,12 moles) en
diclorometano seco (600 ml) y hubo una inmediata evolución vigorosa
de gas. Se agitó la solución durante 2 horas y el concentrado para
producir un aceite viscoso. Se disolvió este aceite en DMF seco (500
ml) y se ajustó el pH de la solución en 8 - 9 con trietilamina. Se
añadió luego DBLONp (460 g; 0,99 moles) y se agitó la solución
amarilla durante 2 días a temperatura ambiente con ajuste periódico
del pH con trietilamina para mantener el pH por encima de 8. Se
precipitó luego la reacción en agua y se la trabajó como se
describió anteriormente para producir
BHAlyslys_{2}lys_{4}Boc_{8} como un polvo de color blanco
(rendimiento aproximado del 100%).
\newpage
Se añadió ácido trifluoroacético (11) a una
solución de BHAlyslys_{2}lys_{4}Boc_{8} (200 g; 0,106 ml) en
diclorometano seco (11) y hubo una inmediata evolución vigorosa de
gas. Se agitó la solución durante 2 horas y el concentrado para
producir un aceite viscoso. Se disolvió este aceite en DMF seco y se
ajustó el pH de la solución en 8 - 9 con trietilamina. Se añadió
luego DBLONp (782 g; 1,67 moles) y se agitó la solución amarilla
durante 2 días a temperatura ambiente con ajuste periódico del pH
con trietilamina para mantener el pH por encima de 8. Se precipitó
luego la reacción en agua y se la trabajó como se describió
anteriormente para producir
BHAlyslys_{2}lys_{4}lys_{8}Boc_{16} como un polvo de color
blanco (rendimiento aproximado del 100%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió ácido trifluoroacético (1,61) a una
mezcla de BHAlyslys_{2}lys_{4}lys_{8}Boc_{16} (300 g; 0,081
ml) en diclorometano seco (800 ml) y hubo una inmediata evolución
vigorosa de gas. Se agitó la solución durante 2 horas y el
concentrado para producir un aceite viscoso. Se disolvió este aceite
en DMF seco (1,21) y se ajustó el pH de la solución en 8 - 9 con
trietilamina. Se añadió luego DBLONp (1030 g; 2,21 moles) y se
agitó la solución amarilla durante 2 días a temperatura ambiente con
ajuste periódico del pH con trietilamina para mantener el pH por
encima de 8. Se precipitó luego la reacción en agua y se la trabajó
como se describió anteriormente para producir
BHAlyslyslys_{2}lys_{4}lys_{8}lys_{16}Doc_{32} como un
polvo de color blanco (rendimiento aproximado del 100%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió ácido trifluoroacético (168 ml) en una
porción a una suspensión del núcleo de polilisina protegido con
t-butiloxicarbonato (Boc) de
BHAlyslys_{2}lys_{4}lys_{8}lys_{16}Boc_{32} (20g) en
diclorometano (350 ml) y se agitó la reacción durante 14 horas a
temperatura ambiente. Se concentró la mezcla de la reacción al
vacío, se la disolvió en H_{2}O
(200 ml) y se liofilizó para producir BHAlyslys_{2}lys_{4}lys_{8}lys_{16}TFA_{32} (17,5 g, 83%) como un sólido blancuzco.
(200 ml) y se liofilizó para producir BHAlyslys_{2}lys_{4}lys_{8}lys_{16}TFA_{32} (17,5 g, 83%) como un sólido blancuzco.
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Se disolvió
1-hidroxi-3,6-naftaleno-disulfonato
disódico (100 g) en dimetil sulfóxido (250 ml) y se añadió
diisopropiletilamina (60 ml) en una porción. Se añadió bromoacetato
de etilo (38 ml) durante un periodo de 30 min y se agitó la
reacción durante 14 horas a temperatura ambiente excluyendo la
humedad. Se vertió lentamente la reacción en acetato de etilo (2 L)
para producir un residuo aceitoso/goma. Se decantó el sobrenadante y
se añadió acetato de etilo adicional (1,5 L). Varias trituraciones
seguidas por lavado con acetona del residuo produjeron
[1-(oximetilen-carboxietil)-3,6-naftaleno-disulfonato]
disódico (97 g, 78%) como un sólido de color marrón.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió NaOH acuoso (134 ml) en una porción a
una solución de
[1-(oximetilen-carboxietil)-3,6-naftaleno-disulfonato]
disódico (97 g) en 500 ml de H_{2}O. Se agitó la reacción durante
14 horas a temperatura ambiente y luego se la pasó a través de una
columna IR120 (forma ácida). La liofilización de las fracciones
recolectadas produjo el ácido
1-(oximetileno-carboxi)-3,6-naftaleno-disulfónico
(67 g, 83%) como un sólido de color marrón.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió el ácido
1-(oximetileno-carboxi)-3,6-naftaleno-disulfónico
(47,85 g) en DMF (500 ml) y se añadió diisopropiletilamina (115 ml)
en una porción. Se añadió luego esta solución a una solución
preparada por medio de la adición de
benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidin-fosfonio
hexafluorofosfato (PyBOP; 72 g) en una porción a una solución de
BHAlyslys_{2}lys_{4}lys_{8}lys_{16}TFA_{32} (15,95 g) en
DMF (650 ml). Se utilizó DMF (100 ml) para enjuagar el embudo. Se
agitó la mezcla de reacción durante 14 horas a temperatura ambiente
y luego se diluyó con agua (10 L). Se bombeó la solución a través de
un filtro de 1 micra de profundidad y a través de un aparato Pall
Filtron (Pall Gelman) que contenía una membrana de 10 kD. Se pasó la
solución resultante a través de una columna IR120 (forma sódica),
se la bombeó a través de un filtro de 0,22 micras de profundidad y
se la liofilizó para producir SPL-7013 como un
sólido blancuzco con un rendimiento del 75%. Tiempo de retención =
15 min sobre una columna de HPLC ODS-EC de 15 cm x
4,6 mm a 30ºC con la longitud de onda de detección programada en
240 nm. Se eluyó la muestra con una velocidad de flujo de 1 ml por
minuto utilizando el gradiente de elución detallado a
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de la masa espectral de SPL7013
indica un peso molecular de 16.580 \pm 2 Daltons. El peso
molecular promedio esperado para SPL7013, fórmula molecular,
C_{593}H_{577}N_{63}Na_{64}O_{287}S_{64} es de
16.581,53.
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Se preparó SPL7304 en una forma similar por
medio del acoplamiento PyBOP del ácido
1-(oximetileno-carboxi)-3,6-naftaleno-disulfónico
con el dendrímero poliamidoamina (PAMAM), generación 3 (Starburst®,
Sigma-Aldrich Pty. Ltd., Australia).
\vskip1.000000\baselineskip
En forma similar, se preparó SPL7320 por medio
del acoplamiento PyBOP del ácido
1-(oximetileno-carboxi)-3,6-naftaleno-disulfónico
con el dendrímero polipropilenimina dotriaconta amina, generación
4.0 (DAB-Am-32,
Sigma-Aldrich Pty. Ltd., Australia).
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Las cepas utilizadas del virus de
inmunodeficiencia humana fueron VIH-1
(IIIB)^{1} y VIH-2 (ROD)^{2}. Se
llevaron a cabo en forma paralela las mediciones de actividad
anti-retroviral y de citotoxicidad. Ellas se
basaron en la viabilidad de las células MT-4 que
habían sido infectadas con el VIH y luego se las expuso a
diferentes concentraciones de los compuestos de prueba. Después de
que se les permitió proliferar a las células MT-4
durante 5 días, se cuantificó el número de células viables por medio
de un procedimiento colorimétrico con base en tetrazolio con
bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
(MTT) en microcubetas de 96 pozos.^{3}
En todos estos ensayos, el ingreso de virus
(multiplicidad viral de la infección, MOI) fue de 0,01, o 100 veces
el 50% de la dosis infectiva del cultivo celular (CCID_{50}). El
50% de la concentración antiviralmente inhibitoria (EC_{50}) se
definió como la concentración de compuesto requerida para proteger
el 50% de las células infectadas con el virus contra citopaticidad
viral. El 50% de la concentración citotóxica (CC_{50}) fue
definida como la concentración del compuesto requerida para reducir
la viabilidad de las células infectadas en forma falsa en un 50%.
El símbolo > es utilizado para indicar la concentración más alta
a la cual los compuestos fueron analizados y fueron encontrados aún
no citotóxicos. Los valores promedio EC_{50} y CC_{50} para
varios experimentos separados se presentan como se definió
anteriormente. Como norma, los valores individuales no se desviaron
más de 2 veces por encima o por debajo de los valores de EC_{50} y
CC_{50}. SI es el índice de selectividad antiviral
CC_{50}/EC_{50}.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron las líneas celulares
HIV-1IIIB, y las HeLa CD4 LTR b-gal,
GHOST X4/R5, y HL2/3 a partir del NIH AIDS Research and Reference
Reagent Program (Bethesda, MD), y se las mantuvo como se recomendó.
Se obtuvieron las células ME180 a partir del American Type Culture
Collection (Manassas, VA).
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Los compuestos se solubilizan típicamente en
100% de DMSO y se almacenan a -80ºC hasta el ensayo, a menos que el
patrocinador especifique solventes y condiciones de almacenamiento
alternativas. Se descongelan las existencias congeladas a
temperatura ambiente, se precalientan durante 15 min a 37ºC y se
agitan con agitación tipo vórtice antes de la preparación de las
soluciones de trabajo en medio de cultivo tisular. Durante todas
las etapas de dilución y manipulación del compuesto, se protegen los
compuestos de la incidencia de la luz por medio de recubrimientos
opacos y por medio de almacenamiento y dilución en plásticos opacos
para cultivo de tejidos o coloreados en color ámbar.
Adicionalmente, se controla la exposición a la luz de las campanas
para cultivo de tejidos de flujo laminar y una habitación incidental
reduciendo la iluminación fluorescente total en el laboratorio en
un 50%. La concentración final de DMSO es del 0,25% a la
concentración más alta del ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células ME180, una línea de células
epiteliales cervicales CD4 negativas, X4 positivas se mantienen en
RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10%, glutamina y
antibióticos. Veinticuatro horas antes del ensayo, se tripsinisan
las células ME180, se lavan y se siembran en placas de
microtitulación de fondo plano de 96 pozos con una densidad de 2 x
10^{3} células por pozo. El día del ensayo, se tratan las células
H9 infectadas crónicamente con el aislado clínico SKI del
VIH-1 (H9-SK1) con mitomicina C
elaborada en forma reciente (200 \mug/ml) durante 60 minutos a
37ºC. Esta concentración de mitomicina C es suficiente para
provocar la muerte celular, pero permite que ocurra la trasmisión
del virus. Después del tratamiento con mitomicina C, se lavan las
células H9-SK1 tres veces con medio de cultivo para
tejidos. Se añaden los compuestos de prueba a la monocapa de ME180
seguido por 2 x 10^{4} células H9-SK1. Se
cocultivan las células ME180 con células
H9-SK-1 y el material de prueba
durante 4 h, y se remueven las células H9-SK1
lavando la monocapa de ME180 tres veces con PBS. A las 24 y a las
48 h posteriores a la iniciación del ensayo, se lavan nuevamente los
pozos tres veces con PBS para garantizar la remoción de las células
H9-SK1, y se continúa el cultivo en medio libre de
material de prueba. A los seis días después del cocultivo, se
recogen los sobrenadantes y se evalúa la expresión del antígeno p24
por medio de ELISA. La viabilidad de las células se evalúa por medio
de la reducción del color XTT. Los compuestos que se juzgan como
activos en el primer análisis se vuelven a analizar con o sin la
adición de mucina. El análisis en presencia de mucina se lleva a
cabo por medio de la adición de 200 \mug/ml de mucina porcina
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a las reacciones de transmisión.
Los intervalos de trasmisión y de lavado sin reemplazo de mucina o
del compuesto se llevan a cabo como se describió anteriormente.
Todas las determinaciones se realizan por triplicado con dilución
serial ½ Log_{10} de los materiales de prueba.
El ensayo de inhibición de la trasmisión del VIH
independientemente de CD4 se lleva a cabo esencialmente como se
describe para el ensayo de trasmisión independientemente de CD4
excepto por el uso de la línea celular GHOST(3) X4/R5
positiva para CD4. Esta línea celular se deriva de la línea celular
HOS (osteosarcoma humano) que es negativa para el correceptor del
VIH y la expresión de CD4. Se modifica genéticamente la línea
celular para expresar T4 (CD4), R5 y X4 a través de vectores
retrovirales no seleccionables y de una construcción hGFP de LTR
del VIH-2 con un marcador seleccionable de
higromicina. Se manipulan y se cultivan las líneas celulares como
se describió anteriormente para el ensayo de inhibición del VIH
independientemente de CD4, con la excepción de que se utilizan en
el ensayo 2,5 x 10^{4} células GHOST(3) X4/R5 y 5 x
10^{2} células H9/SK-1 tratadas con mitomicina C.
La adición de compuestos, el tratamiento con mitomicina C y el
lavado post-transmisión para remover las células
H9/SK-1 se lleva a cabo como se describió
anteriormente para permitir la comparación de los dos ensayos
antivirales. La replicación del virus se evalúa 24 h después de la
infección, después de 3 lavados, por medio de la medición de p24
asociado a la célula por medio de ELISA para garantizar una sola
ronda de infección en presencia de CD4. La citotoxicidad del
compuesto y la viabilidad celular se evalúan por medio de la
reducción del colorante XTT. Los compuestos que se juzgan como
activos en el primer análisis se vuelven a analizar con y sin la
adición de mucina. El análisis en presencia de mucina se lleva a
cabo por medio de la adición de 200 \mug/ml de mucina porcina
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en el medio de cultivo del
tejido a las reacciones de trasmisión. Los intervalos de trasmisión
y de lavado sin reemplazo de mucina o del compuesto se llevan a
cabo como se describió anteriormente. Todas las determinaciones se
realizan por triplicado con dilución serial ½ Log_{10} de los
materiales del ensayo.
Se obtuvieron el Lactobacillus crispatus
y el Lactobacillus jensenii de la American Type Tissue
Culture Collection y se los cultivó en caldo MRS para Lactobacilos
(Difco, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Este medio permite un
crecimiento eficiente de los Lactobacilos bajo condiciones
anaerobias. Las cepas de Bacilos se producen y se congelan en
glicerol al 15% a -80ºC para ser usadas en el ensayo de
sensibilidad. Para evaluar el efecto de los compuestos sobre el
desarrollo de L. crispatus y L. jensenii, se inoculan
10 ml de medio MRS con un pinchazo de la cepa bacteriana en
glicerol. Se coloca el cultivo en una bolsa Gas Pak de CO_{2} y
se incuba durante 24 h a 37ºC. Al siguiente día se diluyen los
cultivos de lactobacilos hasta un OD de 0,06 a una longitud de onda
de 670 nm. Se diluyen los compuestos y se los coloca en una placa de
fondo plano de 96 pozos y se añade el Lactobacillus sp. Se
utilizan las soluciones comercialmente disponibles de
Penicilina/Estreptomicina con una concentración alta pata análisis
de 1,25 U/ml y 1,25 \mug/ml, respectivamente, como control
positivo. Se incuban nuevamente las placas durante 24 h a 37ºC en
una bolsa Gas Pak de CO_{2} y se determina el crecimiento
bacteriano por medio de la medición de la densidad óptica a 490 nm
en un lector de placas de Molecular Devices. Todas las
determinaciones se llevan a cabo con diluciones 6 ½ log de una
concentración alta para análisis por triplicado.
Este ensayo está diseñado para detectar
compuestos que interactúan con la célula y bloqueen la unión del
virus, y/ compuestos que interactúan con la formación de la
unión/fusión del complejo. El ensayo de unión se lleva a cabo con
células HeLa CD4 LTR \beta-gal. Las células HeLa
CD4 LTR \beta-gal se cultivan rutinariamente con
los antibióticos de selección requeridos. Veinticuatro h antes de la
iniciación del ensayo, se tripsinisan las células, se hace un
recuento y se colocan 1 x 10^{4} células en un pozo de 0,2 cm en
un medio sin selección de antibióticos. A las 24 h se remueve el
medio y se coloca el compuesto en el medio sobre las células y se
incuba durante 15 min a 37ºC. Se añade luego un título conocido de
la cepa IIIB del VIH a los pozos y se continúa la incubación
durante 1 h. Al final de la incubación se lavan los pozos 3 veces
con medio y se continúa el cultivo durante 40 a 48 h. Al final del
ensayo, se remueve el medio y se determina la expresión de la enzima
\beta-galactosidasa por medio de
quimioluminiscencia de acuerdo a las instrucciones de los
fabricantes (Tropix Gal-screen^{TM}, Bedford
Mass.) siguiendo un método de quimioluminiscencia de una sola etapa
utilizando una única solución para lisar las células y detectar la
actividad de la enzima \beta-galactosidasa. Se
monitorea la toxicidad del compuesto sobre una placa hermana por
reducción del colorante XTT. Todas las determinaciones se llevan a
cabo por triplicado con una dilución serial ½ Log_{10} de los
materiales del ensayo. El intervalo de adsorción del virus de 1 h
es lo suficientemente corto para que AZT, que requiere fosforilación
para su forma activa trifosfato (AZT-TTP), no sea
activa en este ensayo.
El ensayo de fusión evalúa la habilidad de los
compuestos para bloquear la fusión célula-célula
mediada por Env del VIH-1 y CD4 expresada sobre
células separadas. Este ensayo es sensible a inhibidores tanto de la
interacción gp120/CD4 coma a los inhibidores del correceptor X4.
Primero, se colocan 5 x 10^{3} células HeLa CD4 LTR
\beta-gal en pozos de microtitulación y se incuba
durante la noche. Al día siguiente se remueve el medio y se incuban
las células HeLa CD4 LTR b-gal durante 1 h a 37ºC en
medio fresco con el compuesto de prueba. Después de la incubación,
se añaden 5 x 10^{3} células HL2/3 y se continúa la incubación
durante 40 a 48 h. a las 40 a 48 h se detecta la expresión de la
enzima \beta-galactosidasa por medio de
quimioluminiscencia (Tropix Gal-screen^{TM}
Tropix, Bedford, MA). Se monitorea la toxicidad del compuesto sobre
una placa hermana utilizando reducción del colorante XTT. Todas las
determinaciones se llevan a cabo por triplicado con dilución serial
½ Log_{10} de los materiales del ensayo.
Los kits para ELISA se adquieren con Coulter
Electronics, y la detección del sobrenadante o del antígeno p24
asociado a la célula se lleva cabo de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. Para p24 asociado a la célula, los lisados
celulares se producen por medio de lisis de los contenidos del pozo
en 25 a 50 \mul del amortiguador de lisis suministrado por
Coulter, y analizados después de 1 ciclo de
congelación/descongelación. Todas las determinaciones de p24 se
llevan a cabo después de una dilución serial de las muestras para
garantizar absorbancias en el rango lineal de la curva estándar del
antígeno p24. Se produce la curva estándar utilizando las
instrucciones y estándares suministrados por el fabricante. Los
datos se obtienen por medio de análisis espectrofotométrico a 450
nm utilizando un lector de placas Vmax de Molecular Devices. Las
concentraciones finales se calculan a partir de los valores de
densidad óptica utilizando el paquete de software Soft Max de
Molecular Devices y expresado en \mug/ml de antígeno p24.
Los valores de TC_{50} para los materiales del
ensayo se derivan midiendo la reducción del colorante tetrazolio
XTT (hidróxido de
2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)carbonil]-2H-tetrazolio)
en placas de microtitulación por duplicado que contienen células y
compuesto sin virus. XTT se metaboliza por medio de la enzima
mitocondrial NADPH oxidasa en células metabólicamente activas hasta
un producto soluble de formazán, permitiendo el análisis
cuantitativo rápido de la viabilidad de las células y la
citotoxicidad del compuesto. La solución de XTT se prepara
diariamente como un patrón de 1 mg/mL en PBS. La solución de
metosulfato de fenazina (PMS) se prepara a razón de 15 mg/mL en PBS
y se almacena en la oscuridad a -20ºC. El patrón de XTT/PMS se
prepara inmediatamente antes de usarlo por medio de la dilución
1:100 del PMS en PBS y añadiendo 40 \mul por mL de solución de
XTT. Se añaden cincuenta microlitros de XTT/PMS a cada pozo de la
placa y se incuba la placa durante 4 h a 37ºC. Se ha determinado
empíricamente que la incubación durante 4 h está dentro del rango
de respuesta lineal para la reducción del colorante MTS con los
números indicados de células para cada ensayo. Se utilizan
selladores adhesivos de placa en lugar de las tapas, se invierte la
placa sellada varias veces para mezclar el producto soluble de
formazán y se lee la placa a 450 nm con un espectrofotómetro para
formato de placa de 96 pozos Vmax de Molecular Devices.
Se utilizan sulfato de dextrano (positivo) y
dextrano (negativo) como controles para el ensayo de inhibición de
la trasmisión del VIH independiente de CD4 y dependiente de CD4. Se
utiliza el colorante de ácido sulfónico Chicago Sky Blue como
control positivo para los ensayos de unión y de fusión^{4}. Se
utiliza una solución comercialmente disponible de Penicilina
(10.000 U/ml) Estreptomicina (10,0 mg/ml) como control positivo para
el ensayo de sensibilidad de Lactobacilos. Para cada compuesto, en
cada caso, se calcula un IC_{50} (concentración que inhibe la
replicación del virus o la trasmisión en un 50%), ID_{50}
(concentración que inhibe 50% del crecimiento de Lactobacilos)
TC_{50} (concentración que resulta en un 50% de reducción en la
viabilidad celular) y se calcula un índice terapéutico (TI:
TC_{50}/IC_{50}o BD_{50}) por medio de regresión lineal.
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El virus de inmunodeficiencia humana tipo 1
(VIH-1) cepa RoJo en un aislado pediátrico de pasaje
bajo derivado en los laboratorios de Southern Research Institute
(SRI). El SHIV89.6pd se obtuvo a partir de Mark Lewis en SRI y de
cepas cultivadas en los PBMC humanos para análisis antiviral.
Se obtuvieron células monoculares de sangre
periférica (PBMC) de donantes normales negativos para hepatitis y
VIH-1 por medio de separación en gradiente Ficoll
Hypaque. En resumen, se diluyó 1:1 sangre anticoagulada con
solución salina amortiguada con sulfato de Dulbecco sin Ca^{++} y
Mg^{++} (PBS) y se formó una capa sobre 14 mL de medio de
separación de Linfocitos en un tubo de centrífuga de 50 ml. Se
centrifugaron luego los tubos durante 30 minutos a 600 x g. Se
aspiraron suavemente los PBL que formaron bandas de la interfaz
resultante y posteriormente se lavó 2 veces con PBS por medio de
centrifugación a baja velocidad. Se hizo un recuento de las células
mononucleares, se determinó la viabilidad por medio de exclusión del
colorante Trypan Blue y se resuspendió en medio RPMI 1640
suplementado con 15% de FBS (inactivado con calor),
L-glutamina 2 mM, 100 U/mL de penicilina, 100
\mug/mL de estreptomicina, y 10 \mug/mL de gentamicina con 2
\mug/mL de fitohemaglutinina (PHA) a razón de 1 X 10^{6}
células/mL. Se cultivaron las células durante 48 a 72 h a 37ºC, 5%
de CO_{2}. Después de la incubación, se recolectaron las células
por medio de centrifugación, se las lavó y resuspendió en RPMI 1640
suplementado con 15% de FBS (inactivado con calor),
L-glutamina 2 mM, 100 U/mL de penicilina, 100
\mug/mL de estreptomicina, y 10 \mug/mL de gentamicina con 20
U/mL de IL-2 recombinante (R & D Systems,
Minneapolis, MN). Se incluyó IL-2 en el medio de
cultivo para mantener la división celular iniciada por la
estimulación mitogénica de PHA. Se cultivaron las células en
IL-2 durante 72 horas y luego se las utilizó para
reto viral.
\newpage
Se hizo recuento de las células mononucleares de
sangre periférica humana de un mínimo de 2 donantes, que habían
sido destruidas con PHA e IL-2, se determinó la
viabilidad por medio de exclusión con colorante Trypan Blue y se
mezclaron en proporciones iguales. Se utilizaron los donantes
reunidos para minimizar la variabilidad observada entre donantes
individuales que resulta de diferencias cuantitativas y cualitativas
en la infección con VIH y en la respuesta completa al PHA e
IL-2 de poblaciones primarias de linfocitos. Se
resuspendieron las células a razón de 1 x 10^{6} células /mL en
RPMI 1640 sin rojo fenol suplementado con 15% de Suero fetal de
Fetal Bovino (inactivado con calor), L-glutamina 2
mM, 100 U/mL de penicilina, 100 \mug/mL de estreptomicina, 10
\mug/mL de gentamicina e IL-2 (20 U/mL, R&D
Systems, Minneapolis, MN). Se distribuyeron luego cincuenta
microlitros de células en los 60 pozos de una placa de cultivo de
microtitulación de fondo redondo de 96 pozos en un formato estándar
desarrollado por el Infectious Disease Research Department of
Southern Research Institute. Cada placa contiene pozos de control
para células (únicamente células), pozos de control para virus
(células más virus), y pozos experimentales (fármaco más células
más virus). Se añaden compuestos diluidos en forma serial a la
placa de microtitulación seguido por la cepa apropiada pretitulada
del VIH-1 o SHIV-1. Todas las
muestras fueron analizadas por triplicado con una placa de
replicación sin virus para la determinación de la citotoxicidad del
compuesto. El volumen final por pozo fue de 200 \muL. Se incubó el
ensayo durante 6 días en una atmósfera humidificada a 37ºC, 5% de
CO_{2}, después de lo cual se recolectaron los sobrenadantes,
para el análisis de la actividad a RT y se analizaron las placas
hermanas para la viabilidad celular por medio de la reducción del
colorante MTS. Se examinaron también microscópicamente los pozos y
cualquier anormalidad observada.
Al final del ensayo, se colorearon las placas
con el colorante MTS soluble con base en tetrazolio (CellTiter®
Reagent Promega, Madison, WI) para determinar la viabilidad de las
células y cuantificar la toxicidad del compuesto. Se metaboliza MTS
por medio de las enzimas de la mitocondria de células
metabólicamente activas hasta un producto soluble de formazán,
permitiendo el análisis cuantitativo rápido de la viabilidad de las
células y la citotoxicidad del compuesto. Este reactivo es una
solución única estable que no requiere de preparación antes de
usarla. Al final del ensayo de la PBMC se añadieron 20 \muL del
reactivo MTS por pozo, y se incubaron los pozos durante 4 h a 37ºC.
Se utilizaron selladores adhesivos de placa en lugar de las tapas,
se invirtió la placa sellada varias veces para mezclar el producto
soluble de formazán y se leyó la placa espectrofotométricamente a
490 nm con un lector de placas Vmax de Molecular Devices.
Se midió la actividad de la transcriptasa
inversa en sobrenadantes libres de células. Se resuspendió
trifosfato de timidina Tritiada (NEN) (TTP) en H_{2}O destilada a
razón de 5 Ci/mL. Se prepararon Poli rA y oligo dT como solución
patrón que fue mantenida a -20ºC. Se preparó amortiguador de
reacción a RT en forma fresca diariamente y consiste de 125 \muL
de EGTA 1,0 M, 125 \muL de dH_{2}O, 110 \muL de SDS al 10%, 50
\muL de Tris 1,0 M (pH 7,4), 50 \muL de DTT 1,0 M, y 40 \muL
de MgCl_{2} 1,0 M. Estas tres soluciones fueron mezcladas juntas
en una proporción de dos parte de TTP, 1 parte de poli rA:oligo dT,
y 1 parte de amortiguador de reacción. Se colocaron diez
microlitros de esta mezcla de reacción en una placa de
microtitulación de fondo redondo y se añadieron 15 \muL del
sobrenadante que contenía al virus y se mezcló. Se incubó la placa a
37ºC en un baño de agua con un soporte sólido para evitar que se
sumergiera la placa y se incubó durante 60 minutos. Después de la
reacción, se colocó el volumen de reacción en piezas de papel DE81
1, se lavó 5 veces durante 5 minutos cada vez en un amortiguador de
fosfato de sodio al 5%, 2 veces durante 1 minuto cada vez en agua
destilada, 2 veces durante 1 minuto cada vez en etanol al 70%, y
luego se secó. Se añadió Opti-Fluor O a cada
muestra y se cuantificó la radioactividad incorporada utilizando un
contador de centelleo líquido Wallac 1450 Microbetaplus.
Se suministran IC_{50} (50% de inhibición de
la replicación del virus), TC_{50} (50% de reducción en la
viabilidad de las células) y un índice terapéutico (TI,
IC_{50}/TC_{50}). Se ha utilizado AZT como compuesto relevante
de control positivo para
los ensayos individuales. Los resultados de las evaluaciones antivirales realizadas se resumen en la siguiente tabla:
los ensayos individuales. Los resultados de las evaluaciones antivirales realizadas se resumen en la siguiente tabla:
Se utilizaron cepas estándar G del HSV
(HSV-2) y F (HSV-1) en los ensayos.
La aportación de virus para una placa de 6 pozos fue de 100
pfu/pozo. La línea celular susceptible al HSV, las células Vero,
fueron utilizadas en el ensayo de reducción de rendimiento del
virus. Para el ensayo de citotoxicidad, se empleó una línea de
células epiteliales, células Hela-229.
Los efectos antivirales de los compuestos se
determinaron por medio del ensayo de reducción de placa modificada.
Se lavaron las células confluentes con PBS y posteriormente se las
infectó con HSV (100 pfu/pozo) durante 1 h a 37ºC e inclinando cada
10 min. Después de remover el inóculo viral, se lavaron las células
infectadas con PBS y se las cubrió con metilcelulosa al 0,5% en
medio de cultivo (un volumen igual de metilcelulosa al 1% mezclada
con 2 x medio de cultivo). Se incubaron las células a 37ºC durante 2
días para la infección con HSV-2 y durante 3 días
para la infección con HSV-1. Cuando se adecuó el
tamaño de la placa, se fijaron las células con formalina al 10%
durante 10 min. Se colorearon luego las placas con cristal violeta
al 0,5% durante 10 min. Se removió el colorante lavando con agua
corriente y dejando secar en una campana extractora. Se hizo luego
recuento de las placas.
Todos los datos se generaron a partir de
experimentos por duplicado. Se compararon los recuentos promedio en
placa en los pozos del ensayo con los recuentos promedio en placa en
los pozos de control.
Se calcularon los EC_{50} (concentraciones que
producen una reducción del 50% en el recuento en placa del
inóculo). Se llevaron a cabo en paralelo actividades antivirales y
mediciones de citotoxicidad en la misma cepa de células. La
concentración citotóxica del 50% (CC_{50}) fue definida como la
concentración de compuesto requerida para reducir la viabilidad de
las células infectadas en forma simulada en un 50%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se removió el medio de cultivo de las células
confluentes Vero en una placa de 6 pozos, y se lavó con 1 ml de
PBS. Se añadió 1 ml de medio de cultivo que contenía al compuesto en
una concentración de 0, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, y 30
\mug/ml a cada pozo y se incubó a 37ºC durante 1 h. Después de la
preincubación de las células con dendrímero, se infectaron luego
las células con 100 pfu/pozo ya sea de HSV-1 o de
HSV-2. Se incubaron las infecciones a 37ºC durante
1 h con inclinación cada 10 min. Después se removió el inóculo, se
recubrieron las células infectadas con 1,5 ml de metilcelulosa al
0,5% diluida con 2 x medio de cultivo para el ensayo en placa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se lavaron las células confluentes Vero con PBS.
Se infectaron luego las células con 100 pfu/pozo ya sea de
HSV-1 o de HSV-2 a 37ºC durante 1 h.
Después de la remoción del inóculo viral, se lavaron las células
infectadas una vez con PBS y se las cubrió con metilcelulosa al 0,5%
que contenía al dendrímero en concentraciones de 0, 0,03, 0,1, 0,3,
1, 3, 10, 30, y 100 \mug/ml. Se incubaron las células a 37ºC
durante 2 (HSV-2) ó 3 (HSV-1) días
para el ensayo en
placa.
placa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se removió el medio de cultivo de las células
confluentes Hela-229 en placas de 24 por medio de
una bomba. Se lavaron luego las células una vez con 1 ml de PBS. Se
añadió luego a cada pozo 1 ml de medio de cultivo que contenía
dendrímeros en concentraciones de 0, 100, 500, y 1000 \mug/ml. Se
incubaron las células en una incubadora a 37ºC durante 2 días. Al
final de la incubación, se removió el medio y se lavaron las células
con PBS. Se añadieron posteriormente 500 \mul de rojo neutro al
0,01% (en PBS) a cada pozo, y se incubó a 37ºC durante 30 min. Se
removió luego el colorante y se lavaron las células dos veces con 1
ml de PBS por pozo. Se extrajo el colorante por medio de la
adición de 500 \mul de etanol al 50% y ácido acético glacial al
1% en PBS a cada pozo y se incubó a temperatura ambiente durante 15
min con agitación suave a 120 - 150 rpm. Se colocaron 100 \mul
extraídos de colorante de cada pozo en una placa de 96 pozos y se
leyó la absorbancia a 550 nm sobre un lector de ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la eficacia de
SPL-7013 en un ensayo de prevención del HSV genital
en el modelo de ratón (cepa MS). Se instiló una dosis de 15 \mul
de 100 mg/ml, o 10 mg/ml del compuesto dentro de la vagina de 16
animales 20 seg antes de la infección con HSV-2.
SPL-7013 Evitó la infección y la enfermedad en todos
los animales analizados comparados con los controles. La mortalidad
total en tres días del mismo número de ratones de control infectados
fue utilizada como punto final de los ensayos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó el compuesto por su habilidad para
inhibir el enlazamiento y la absorción de partículas del tipo del
virus del papiloma humano a una línea de células epiteliales
humanas.
Se analizó el compuesto en un rango de seis
diluciones como inhibidor del enlazamiento y de la absorción de
Partículas del Tipo del Virus del Papiloma etiquetado con
fluorocromo (VLP) del virus del papiloma humano tipo 6b. Se le
permitió a los VLP enlazarse y ser absorbidos dentro de las células
epiteliales en presencia de SPL-7013. Se determine
el ensayo de enlazamiento y absorción utilizando citometría de flujo
y se reportó la inhibición del enlazamiento como un porcentaje con
respecto al enlazamiento observado en ausencia del inhibidor. Los
análisis fueron llevados a cabo en dos ensayos independientes.
Células. Se adquirió la línea celular A431 de
carcinoma epidermoide humano del American Type Culture Collection en
el pase 30 (CRL-1555, Lote F-13530)
y se mantuvo en DMEM en FCS al 10%.
Se cultivaron VLP tipo 6b del virus de papiloma
humano y se purificó de acuerdo con procedimientos estándar de
operación. Se marcaron las partículas con un fluorocromo.
Se redisolvió el compuesto en agua estéril hasta
las concentraciones de 5 mM y se lo utilizó fresco para el primer
ensayo antes de ser congelado a -20ºC. Se lo descongelo luego para
el segundo ensayo.
Se lavó un frasco T75 de células A431 con 10 ml
de PBS/EDTA (0,05%) durante 5 minutos a 37ºC antes de ser tratado
con 2 ml de tripsina durante otros 5 minutos a 37ºC. Se añadió
DMEM/FCS al 10% (10 ml) a las células, se centrifugaron las células
a 1000 x g durante 5 minutos a RT, y se las resuspendió en medio
completo a razón de 3 x 10^{5} células/ml en un tubo de 15ml. Se
incubaron las células a 37ºC durante 2 horas con inversión cada 20
minutos para permitir la reexpresión de las proteínas de la
superficie de la célula. Se centrifugaron las células a 1000 x g
durante 5 minutos a RT, y se las resuspendió en DMEM libre de suero
a razón de 3 x 10^{5} células/ 100 \muL y se colocaron 100
\muL de suspensión en un tubo de 1,5 ml. Se añadió el compuesto a
las células con las siguientes seis diluciones en 10 \muL de PBS:
100 \muM, 10 \muM, 10 \muM, 100 nM, 10 nM, 1,0 nM.
Se incubaron las células con el compuesto
durante 30 min a 37ºC antes de añadir los VLP marcados (200 ng).
Como control positivo se añadieron únicamente los VLP a las células
y el control negativo fue de células con los VLP añadidos pero
incubados sobre hielo. Se mezclaron las células y se incubó a 37ºC
durante 2 horas. Se lavaron las células una vez con 1 ml de PBS y
se las fijó en amortiguador FACS (P13S/paraformaldehido al 4%). Se
llevó a cabo el análisis sobre una máquina Coulter para FACS.
Se analizaron los resultados utilizando WinLisT.
Se utilizaron inicialmente barrido lateral/hacia adelante para
analizar el tamaño de las células y se cerraron las células vivas.
Se generaron intensidades promedio de fluorescencia (MFI) de esta
puerta y se las utilizó para análisis adicionales. Se reportó la
absorción como el porcentaje con respecto al enlazamiento observado
únicamente para los VLP (100%) versus las células con los VLP
incubados sobre hielo (0%).
SPL-7013. Se observó una
inhibición máxima de absorción (26% de absorción) en 1 \muM sin
inhibición adicional a concentraciones más altas. Este compuesto ha
mostrado aún una inhibición de la absorción en 1 \muM y en 10 nM.
Se incrementó la absorción viral después de este punto con
disminución de la concentración de SPL-7013.
\vskip1.000000\baselineskip
Se trataron ratones hembra (cepa MS) ya sea en
el tracto genital inferior o en el superior con una instilación de
15 \muL de una solución de 100 mg/mL de SPL-7013,
20 segundos antes de la infección con C. trachomatis. Se
define la infección del tracto genital inferior por medio del
aislamiento del organismo por cultivo de muestras de frotis vaginal
recolectadas los días 3 ó 6 después del reto. Para infección del
tracto genital superior la definición es aislamiento del organismo
por cultivo del tejido del tracto genital superior recolectado el
día 10 después del reto. Se utilizaron como controles ratones
tratados con amortiguador de fosfato PBS.
\vskip1.000000\baselineskip
Las personas capacitadas en este arte se darán
cuenta que se pueden hacer variaciones y modificaciones a la
invención como se describió aquí ampliamente, diferentes a aquellas
descritas específicamente aquí sin apartarse del espíritu y el
alcance de la invención. Se entiende que esta invención se amplia
para incluir a todas esas variaciones y modificaciones.
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(HTLV-III) from patients with AIDS and
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\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
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Claims (8)
1. Un compuesto de fórmula I, II o III:
en donde R representa a un grupo de
la fórmula
IV:
o una sal farmacéuticamente
aceptable del
mismo.
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en donde dicha sal farmacéuticamente aceptable es seleccionada
de sales metálicas tales como sales de aluminio, calcio, litio,
magnesio, potasio, sodio y zinc, y de sales orgánicas con aminas
orgánicas tales como N,N'-dibenciletilendiamina,
cloroprocaina, dietanolamina, etilendiamina, diciclohexilamina,
meglumina (N-metilglucamina) y procaína, o aminas
cuaternarias tales como colina, y sales de sulfonio y de
fosfonio.
3. El compuesto SPL-7013 de
acuerdo con la reivindicación 1, que incluye una estructura del
dendrímero de polilisina con grupos activos de superficie que
consisten de 32 grupos ácidos naftil disulfónicos y en donde cada
uno de dichos grupos naftil disulfónicos está unido a la estructura
del dendrímero con un enlace amido-metilenoxi a 32
grupos terminales o a una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo.
4. El compuesto SPL-7304 de
acuerdo con la reivindicación 1, que incluye una estructura del
dendrímero de poliamidoamina con grupos activos de superficie que
consisten de 32 grupos ácidos naftil disulfónicos y en donde cada
uno de dichos grupos naftil disulfónicos está unido a la estructura
del dendrímero con un enlace amido-metilenoxi a 32
grupos terminales o a una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo.
5. El compuesto SPL-7320 de
acuerdo con la reivindicación 1, que incluye una estructura del
dendrímero de polipropilenimina con grupos activos de superficie
que consisten de 32 grupos ácidos naftil disulfónicos y en donde
cada uno de dichos grupos naftil disulfónicos está unido a la
estructura del dendrímero con un enlace
amido-metilenoxi a 32 grupos terminales o a una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo.
6. Una composición farmacéutica tópica para
tratamiento profiláctico o terapéutico de enfermedades sexualmente
trasmisibles en un paciente humano, que incluye un compuesto de
acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, junto con al
menos un portador o diluyente tópico farmacéuticamente
aceptable.
7. El uso de un compuesto de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la fabricación de un
medicamento para administración tópica en el tratamiento
profiláctico o terapéutico de enfermedades sexualmente trasmisibles
en un paciente humano.
8. Un uso de acuerdo a la reivindicación 7 en
donde dicha enfermedad es una enfermedad sexualmente transmisible
en forma vaginal o rectal seleccionada entre las infecciones
HSV-1, HSV-2, VIH-1,
VIH-2 y HPV, y un infección por Chlamydia
trachomatis.
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