MXPA03008909A - Agente para la prevencion y tratamiento de las enfermedades-i sexualmente transmitidas. - Google Patents

Agente para la prevencion y tratamiento de las enfermedades-i sexualmente transmitidas.

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MXPA03008909A
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Abstract

El uso de un dendrimero de polilisina, poliamidoamina o polipropilenimina que tiene grupos terminales de disulfonato de naftilo como un agente localmente aplicado en profilaxis o tratamiento de las enfermedades sexualmente transmitidas.

Description

AGENTE PARA LA PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE LAS ENFERMEDADES-I SEXUALMENTE TRANSMITIDAS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a la prevención y tratamiento de enfermedades sexualmente transmitidas, y en particular, se refiere al uso de un dendrímero que tiene grupos terminales de disulfonato de naftilo como un agente localmente aplicado en profilaxis o tratamiento terapéutico de estas enfermedades.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La incidencia global, morbidez, y mortalidad de las enfermedades sexualmente transmitidas (EsST) originadas por VIH, VSH, y otros patógenos microbianos y virales se estima en cien millones de individuos a nivel mundial. Un procedimiento para el control, la transmisión de EsST es el uso de microbicidas rectales, o vaginales controlados por el/la hombre/mujer, localmente aplicados, que inactiva los patógenos relevantes. Por consecuencia, el desarrollo de nuevos microbicidas locales, seguros para el uso intrarectal o intravaginal para la prevención y tratamiento de EsST es un objetivo importante para el nuevo desarrollo del fármaco. Las Solicitudes de Patente Internacional Nos. PCT/AU95/00350 (WO 95/34595) y PCT/AU99/00763 (WO 00/15240), los contenidos de las cuales se incorporan en la presente para referencia, describen una nueva clase de agentes polivalentes - los dendrímeros, macromoléculas altamente ramificadas con una envoltura definitiva de grupos de superficie catiónica o polianiónicas, los cuales se han mostrado por exhibir un rango de actividad antimicrobiana y antiviral con toxicidad mínima. Diferentes a las estructuras moleculares pequeñas de la mayoría de los antivirales, estos dendrímeros son una clase de compuestos macromoleculares altamente ramificados, polivalentes, formados por las secuencias de reacción repetida comenzando desde una molécula de núcleo inicial con capas o etapas sucesivas que se agregan en "generaciones" sucesivas para elaborar un compuesto polimérico, altamente ordenado, de tres dimensiones. Los dendrímeros se caracterizan por las siguientes características: i. un núcleo iniciador que puede tener uno o más sitios reactivos y ser similar en punto o de tamaño significante a fin de efectuar la topología final del dendrímero; ii. capas de unidades de repetición ramificadas al núcleo iniciador; ii i. grupos terminales funcionales (tales como porciones que contienen catiónicas o aniónicas) unidos a la superficie del dendrímero, opcionalmente a través de grupos de enlace. Estos compuestos macromoleculares se sintetizan de bloques de elaboración monomérica con estructuras similares a una ramificación o múltiples ramificaciones, y la superficie externa de la molécula lleva un número de grupos funcionales que conducen al reconocimiento por un receptor biológico. La preparación de dendrímeros se conoce bien, y se describe a manera de ejemplo en las Patentes de E.U Nos. 4,289,872 y 4,410,688 (que describen los dendrímeros a base de capas de unidades de lisina), así como también las Patentes de E.U. Nos. 4,507,460, 4,558, 120 y 4,568,737 y 4,587,329 (que describen los dendrímeros a base de otros unidades que incluyen dendrímeros de poliamidoamina o PAMAM) En la prueba antimicrobiana y antiviral, un subgrupo de estas estructuras de dendrímero han mostrado inesperadamente actividad excepcional contra un amplio espectro de microorganismos asociados con las enfermedades sexualmente transmitidas, que los hace agentes de elección para el desarrollo de un microbicida rectal o vaginal para la profilaxis y tratamiento de las enfermedades sexualmente transmitidas. ?? - 5 - o un sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Las sales de adición base farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales metálicas tales como sales de aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio y zinc, así como también sales orgánicas hechas de aminas orgánicas tales como ?,?'-dibencil-etilenodiamina, cloroprocaína, dietanolamina, etilenodiamina, diciclohexilamina, meglumina (N-metilglucamina) y procaína, aminas cuaternarias tales como sales de colina, de sulfonio y fosfonio. Los compuestos particularmente preferios de la presente invención son los compuestos referidos en la presente como SPL-7013, SPL-7304 y SPL-7320, las estructuras de los cuales consisten de cimbras de dendrímero de polilisina, dendrímero de poliamidoamina (PA AM), y dendrímero de polipropilenimina respectivamente con los grupos de superficie activa consistiendo de 32 grupos de ácido disulfonico naftilo tales como sales de sodio. Cada uno de los grupos de superficie funcional de naftilo-disulfonato se une a la cimbra de dendrímero ramificada con un enlace de amido-metilenooxi a los 32 grupos terminales. La presente invención también proporciona una composición farmacéutica local para el tratamiento terapéutico o profiláctico de las enfermedades sexualmente transmitidas en un paciente humano, que comprende un compuesto de la Fórmula I, II, o III anterior o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en asociación con al menos un diluyente o vehículo local, farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la presente invención también proporciona un método para el tratamiento terapéutico o profiláctico de las enfermedades sexualmente transmitidas en un paciente humano, el cual comprende la administración local al paciente de una cantidad eficaz de un compuesto de la Fórmula I, II, o II I anterior o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Todavía en otro aspecto, la invención proporciona el uso de un compuesto de la Fórmula I, II, o III anterior o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en la elaboración de un medicamento para la administración local en el tratamiento terapéutico o profiláctico de las enfermedades sexualmente transmitidas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓ N Los compuestos de la Fórmula I, II, y III, y sus sales farmacéuticamente aceptables son compuestos nuevos que han mostrado inesperadamente actividad excepcional contra un amplio espectro de patógenos asociados con las enfermedades sexualmente transmitidas. Según se describe anteriormente, los compuestos SPL-7013, SPL-7304, y SPL-7320 son los compuestos preferidos de la presente invención, y se han encontrado que exhiben actividad antiviral significativa, particularmente contra los vectores microbianos y virales de las mayoría de las enfermedades sexualmente transmitidas comunes. SPL-7013 exhibe una actividad antiviral de amplio espectro con alta eficacia y toxicidad animal o de célula mínima contra los vectores de varias de las enfermedades sexualmente transmitidas rectal o vaginalmente. Se ha determinado alta actividad contra el virus-2 de Herpes genital (VHS-2) tanto en las pruebas de célula in vitro y en in vivo en una prueba de modelo de animal (ratón) como en las pruebas de célula in vitro contra el virus-1 de Herpes (VHS-1 ) y virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH-1 , y VIH-2). También se ha mostrado por ser activa contra el agente causante de verrugas genitales, virus de Papiloma Humano (VPH), y contra el vector bacteriano de la uretritis no específica, Chlamydia trachomatis. En las pruebas de célula, SPL-7013 también ha mostrado actividad contra las cepas virales de virus-2 de Herpes resistentes a los agentes antivirales en base a nucleósido modificado actualmente utilizados. Además, SPL-7304 y SPL-7320 muestran alta actividad contra VHS-1 , VHS-2, VIH-1 , y VIH-2. Además, SPL-7013, SPL-7304, y SPL-7320 es activo en los ensayos de transmisión de VIH independiente de CD4 y dependiente de CD4, y es eficaz en la prevención de fusión y unión del VIH-1 . Todos los compuestos se han mostrado que no inhiben el crecimiento de diversas especies de Lactobaclllus benéfico. Además, SPL-7013, SPL-7304, y SPL-7320 han mostrado que son eficaces en la prevención de la infección de células monoculares sanguíneas periféricas humanas (CsMSP) ya sea con VIH-1 oJo o SIV 89.6pd. De acuerdo con lo anterior, estos compuestos son útiles en el tratamiento terapéutico y profilaxis de las enfermedades sexualmente transmitidas como agentes microbicidas locales pretendidos para aplicación a la mucosa rectal o vaginal a fin de proteger contra las infecciones sexualmente transmitidas. La presente invención también proporciona una composición farmacéutica local para el tratamiento terapéutico o profiláctico de la enfermedad sexualmente transmitida en un paciente humano, que proporciona un compuesto de la Fórmula I, II o III o sal del mismo según se describe anteriormente, en asociación con al menos un diluyente o vehículo local, farmacéuticamente aceptable. La formulación de tales composiciones se conoce bien por personas expertas en esta materia. Los diluyentes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, materiales de relleno, vehículos sólidos, soluciones acuosas, revestimientos, agentes antifúngicos y antibacterianos, agentes retardadores o reforzadores de absorción, e isotónicos, agentes retardadores o reforzadores de actividad convencionales y lo similar. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la materia, y se describe, a manera de ejemplo, en Remington's Pharmaceutícal Sciences, 18a Edición, ack Publishing Company, Pensilvania, EUA. Excepto hasta ahora, a medida que cualquier diluyente y/o vehículo farmacéutico es incompatible con el ingrediente activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Los ingredientes activos complementarios que tienen actividad antimicrobiana y antiviral también pueden inborporarse en las composiciones de esta invención. Es especialmente ventajoso formular composiciones en forma de unidad de dosis para facilidad de administración y uniformidad de dosis. La forma de unidad de dosis, según se utiliza en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos humanos a tratar; cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada del ingrediente activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente y/o vehículo farmacéutico requerido. Las especificaciones para las nuevas formas de unidad de dosis de la invención se dictan por y directamente dependientes de (a) las características únicas del ingrediente activo y el efecto terapéutico particular a lograrse, y (b) las limitaciones inherentes en la materia de composición tal como un ingrediente activo para el tratamiento particular. Según se describe previamente, la presente invención también proporciona un método para el tratamiento terapéutico o profiláctico de las enfermedades sexuaimente transmitidas en un paciente humano mediante administración local al paciente de una cantidad eficaz de un compuesto de la Fórmula I, II o III o una sal del mismo según se describe anteriormente. Además, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la Fórmula I, II o III o una sal del mismo según se describe anteriormente en la elaboración de un medicamento para la administración local en tal tratamiento terapéutico o profiláctico de las enfermedades sexuaimente transmitidas.
Una variedad de vías de administración locales se encuentran disponibles. El modo particular seleccionado dependerá, por supuesto, de la condición particular a tratar y la dosis requerida para la eficacia terapéutica o profiláctica. Los métodos de esta invención, generalmente hablando, pueden practicarse utilizando cualquier modo de administración que sea medicinalmente aceptable, significando cualquier modo que produzca los niveles terapéuticos o profilácticos del componente activo de la invención sin originar efectos contrarios clínicamente inaceptables. Tales modos de administración incluyen las vías vaginales, rectales, y transdérmicas. Las formulaciones adecuadas para la administración local, particularmente vaginal o rectal, incluyen soluciones, suspensiones, geles, lociones y cremas así como también unidades discretas tales como supositorios y suspensiones microencapsuladas. Otros sistemas de suministro pueden incluir los sistemas de suministro de liberación sostenida que pueden proporcionarse para la liberación lenta del componente activo de la invención, incluyendo geles, cremas, supositorios o cápsulas de liberación sostenida. Varios tipos de los sistemas de suministro de liberación sostenida, se encuentran disponibles. Estos incluyen, pero no se limitan a: (a) sistemas erosiónales en los cuales, el componente activo se contiene dentro de un aglomerante, y (b) sistemas difusionales en los cuales, el componente activo se permeabiliza a una velocidad controlada a través de un polímero. El componente activo de la presente invención se administra en cantidades terapéuticamente o profilácticamente eficaces. Una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz significa aquélla cantidad necesaria, al menos en parte, para lograr el efecto deseado, o para retardar el inicio de, inhibir el avance de, o interrumpir en conjunto, el inicio o avance de la condición particular a tratar. Tales cantidades dependerán, por supuesto, de la condición particular a tratar, la severidad de la condición y los parámetros del paciente individual incluyendo edad, condición física, tamaño, peso y tratamiento concurrente. Estos factores se conocen bien por aquellos expertos en la materia y pueden denominarse con no más de experimentación rutinaria. Generalmente se prefiere aquella dosis máxima a utilizarse, es decir, la dosis de seguridad más alta de acuerdo al juicio de sondeo médico. Sin embargo, se entenderá por aquellos expertos en la materia; que una dosis inferior o dosis tolerable puede administrarse por razones médicas, razones psicológicas o por virtualmente otras razones. Generalmente, en los intervalos a determinar por el tratamiento o profilaxis de los estados patogénicos, las dosis intra-rectales o intra-vaginales del componente activo serán de aproximadamente 0.01 mg/kg por día a 1000 mg/kg por día. Las dosis pequeñas (0.01 -1 mg) pueden administrarse inicialmente, seguidas por el aumento de dosis hasta aproximadamente 1000 mg/kg por día. En el caso de que la respuesta en un sujeto sea insuficiente en tales dosis, pueden emplearse dosis aún más altas (o dosis mayores eficaces por una vía de suministro más localizada, diferente) al grado que lo permita la tolerancia del paciente. Las múltiples dosis por día pueden contemplarse para lograr niveles sistémicos adecuados de los compuestos. En un aspecto particularmente preferido, la presente invención proporciona el uso de SPL-7013, SPL7304 y SPL7320 como un microbicida rectal o vaginal de amplio espectro útil en la prevención y tratamiento de las enfermedades sexualmente transmitidas microbianas. SPL-7013, SPL7304 y SPL7320 son solubles en agua y pueden utilizarse en solución, o formularse en un vehículo adecuado en la forma de gel, loción , crema o supositorio o suspensión microencapsulada en solventes no acuosos o acuosos, junto con reforzadores o retardadores de su actividad, agentes para su absorción retardada o mejorada en la aplicación local, o agentes para mejorar la adhesión a las capas mucosales o epiteliales vaginales/rectales. A lo largo de toda esta especificación y las reivindicaciones que siguen, al menos que el contexto lo requiera de otra forma, la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "comprendiendo", se entenderá que implica la inclusión de una etapa o etapas establecidas o grupos de enteros pero no la exclusión de cualquier otra etapa o etapas o entero o grupo de enteros. Además, las características de la presente invención serán aparentes de los siguientes Ejemplos que se incluyen a manera de ilustración, no limitación, de la invención. EJEMPLO 1 A. Preparación de BHAIyslys2lys4lys8lysi6 AT F32 1 . N, N'-Di-t-Boc-L-Lisina (DBL) L-Lisina. HCI (1 .83 kg; 10 mol) se disolvió en una solución de hidróxido de sodio (880 g; 22 mol) en agua (20 I) y la solución resultante se diluyó con t-butanol (15 I). Dicarbonato di-t-butilo (4.48 kg; 20.5 mol) se agregó así gota a gota durante 1 hora durante cuyo tiempo, la mezcla de reacción llegó a ser lechosa y se calentó (30-35°C). La mezcla se dejó de agitar durante la noche para dar una solución clara. La solución se extrajo con petróleo (40-60°C) (2 X 10 I) y la fase orgánica se extrajo con solución de NaHC03 sat. (3 X 4 I). Las capas acuosas combinadas se enfriaron en un baño de hielo y se acidificaron cuidadosamente en pH 2 con 1 de solución HS0 . La mezcla túrbida se extrajo así con éter (4 X 1 6 I) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (2 X 8 I), se secaron (MgS04) y se concentraron a una temperatura de baño de <30° para dar una producción cuantitativa de N, N'-di-t-Boc-L-Lisina como un aceite muy viscoso. 2. Ester N,N'-D¡-t-Boc-L-Lisina 4-n itrofen ilo (DBLONp) Una solución de diciclohexilcarbodiimida (DCC) (2.06 kg ; 1 0 mol) en acetato de etilo (5 I) se agregó gota a gota a una solución agitada fría en hielo de Di-t-Boc-L-Lisina (DBL) (3.46 kg; 10 mol) y 4-nitrofenol (NpOH) (1 .39 kg; 10 mol) en acetato de etilo (15 I) bajo nitrógeno. Después de que la adición se completó, la mezcla se permitió calentar a temperatura ambiente y agitarse durante la noche. La suspensión blanca resultante se filtró así y el filtrado se concentró para dar un residuo sólido amarillento. El residuo se recristalizó de éter para dar éster N, N'-di-t-Boc-L-Lisina 4-nitrofenilo como un sólido blanco (producción ca. 60%). Puede aislarse después más producto de las soluciones madre. 3. NHAlys.2HCI Una solución de DCC (41 .2 g ; 0.2 mol) en diclorometano seco (200 mi) se agregó a una solución fría en hielo de DBL (69.2 g; 0.2 mol) y benzihidrilamina (BHA) (36.65 g; 0.2 mol) en diclorometano (600 ml). La mezcla se agitó a 0o por 30 minutos y después a temperatura ambiente por 3 horas. La suspensión resultante se filtró y un tic (pet.éter/EtOAc, 9:1 ) del filtrado no mostró materia prima. El filtrado se lavó con 5% de HCI, agua, NaHC03 sat. y agua; y se secó (MgS04) y se concentró para dar una espuma. Se agregó ácido trifluoroacético (ATF) (400 ml) a una solución agitada de la espuma en diclorometano seco (200 ml) a temperatura ambiente. Hubo evolución de gas inicialmente vigoroso que se detuvo después de ca. 15 minutos; tic (EtOAc) no mostró materia prima.. La solución se agitó por un adicional de 2 horas y después se concentró para dar un aceite castaño. Este aceite se disolvió en acetonitrilo seco (600 ml) y una solución saturada de gas HCI disuelto en etanol absoluto (ca. 360 ml) agregado con remolino. Un sólido blanco pronto comenzó a cristalizarse y la mezcla se dejo mantener por 1 hora a temperatura ambiente para completar la cristalización. La mezcla se filtró y el sólido se lavó con acetonitrilo seco, después se secó para dar BHAIys.2HCI como un polvo blanco (producción ca. 80%). 4. BHAIyslys2Boc4 Se agregó trietilamina (39.5 ml; 0.283 mol) a una solución agitada de BHAIys.2HCI (54.5 g; 0.14 mol) en DMF seco (300 ml). Una suspensión blanca se formó, la cual se agitó por 15 minutos cuando se agregó DBLONp (262 g; 0.56 mol). La mezcla inmediatamente llegó a ser amarilla y se agitó por 3 horas, manteniendo el pH de la mezcla a 8-9 por adición de trietilamina. La mezcla de reacción se agregó así lentamente a un gran volumen de agua vigorosamente agitada y la mezcla se agitó durante la noche. El precipitado se colectó por filtración y se lavó con agua (3X) y se secó para dar un sólido amarillento. Este sólido se polvorizó y se lavó así sucesivamente con éter hasta que el éter no mostró color amarillo sobre el tratamiento con NaOH acuoso. El sólido restante se secó para dar BHAIyslys2Boc4 como un polvo blanco (producción ca. 70%). 5. BHAIyslys2lys4Boc8 Se agregó ácido trifluroacético (600 mi) a una solución de BHAIyslys2Boc4 (1 16 g; 0.12 mol) en diclorometano seco (600 mi) y hubo una evolución vigorosa inmediata de gas. La solución se agitó por 2 horas y después se concentró par dar un aceite viscoso. Este aceite se disolvió en DMF seco (500 mi) y el pH de la solución se ajustó a 8-9 con trietilamina. DBLÓNp (460 g; 0.99 mol) se agregó así y la solución amarilla se agitó por 2 días a temperatura ambiente con ajuste de pH periódico con trietilamina para mantener el pH arriba de 8. La reacción se precipitó así en agua y se trabajó según se describe anteriormente para dar BHAIyslys2lys4Boc8 como un polvo blanco (producción ca. 100%). 6. BHAIyslys2lys4lys8Boci6 Se agregó ácido trifluoroacético (1 I) a una solución de BHAIyslys2lys4Boc8 (200 g; 0.106 mol) en diclorometano seco (1 I) y hubo una evolución vigorosa inmediata de gas. La solución se agitó por 2 horas y después se concentró para dar un aceite viscoso. Este aceite se disolvió en DMF seco y el pH de la solución se ajustó a 8-9 con trietilamina. DBLONp (782 g; 1.67 mol) se agregó así y la solución amarilla se agitó por 2 horas a temperatura ambiente con ajuste de pH periódico con trietilamina para mantener el pH arriba de 8. La reacción se precipitó así en agua y se trabajó según se describe anteriormente para dar BHAIyslys2lys4lys8Boci6 como un polvo blanco (producción ca. 100%). 7. BHAIyslys2lys4lys8lysi6Boc32 Se agregó ácido tfifluoroacético (1 .6 I) a una mezcla de BHAIyslys2lys4lys8Boci6 (300 g; 0.081 mol) en diclorometano seco (800 mi) y hubo una evolución vigorosa inmediata de gas. La solución se agitó por 2 horas y después se concentró para dar un aceite viscoso. Este aceite se disolvió en DMF seco (1 .2 I) y el pH de la solución se ajustó a 8-9 con trietilamina. DBLONp (1030 g; 2.21 mol) se agregó así y la solución amarilla se agitó por 2 horas a temperatura ambiente con ajuste de pH periódico con trietilamina para mantener el pH arriba de 8. La reacción se precipitó así en agua y se trabajó según se describe anteriormente para dar BHAIyslys2lys4lys8lys 6Boc32 como un polvo blanco (producción ca. 100%). 8. BHAIyslys2lys4lys8lysiGATF32 Se agregó ácido trifluoroacético (168 mi) en una parte a una suspensión del t-butiloxicarbonato (Boc) de BHAIyslys2lys4lys8lysi6Boc32 (20 g) en diclorometano (350 mi) y la reacción se agitó por 14 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró in vacuo, se disolvió en H20 (200 mi) y se congeló en seco para dar BHAiyslys2lys4lys8lysi6ATF32 (1 7.5 g, 83%) como un sólido blanco mate. B. Preparación de SPL 7013 (i) Disodio-[1 -(oximetileno-carboxietil)-3,6-naftaleno-disulfonato].
Disodio 1 -hidroxi-3,6-naftaleno-disulfonato (100 g) se disolvió en sulfóxido de dimetilo (250 mi) y se agregó diisopropiletilamina (60 mi) en una parte. Se agregó bromoacetato de etilo (38 mi) durante un período de 30 min. y la reacción se agitó por 14 horas a temperatura ambiente con la exclusión de humedad. La reacción se vertió lentamente en acetato de etilo (2 L) para dar un (a) residuo/goma aceitoso (a). El sobrenadante se decantó y se agregó acetato de etilo adicional (1 .5 L). Diversas trituraciones seguidas por lavado con acetona del residuo dieron disodio-[1 -(oximetileno-carboxietil)-3,6-naftaleno-disulfonato] (97 g, 78%) como un sólido café. (ii) Ácido 1 -(oximetileno-ca rboxi)-3,6-nafta leno-disulfónico. Se agregó NaOH acuoso (1 34 mi) en una parte a una solución de disodio-[1 -(ox¡metileno-carboxietil)-3, 6-naftaleno-disulfonato] (97 g) en 500 mi de H20. La reacción se agitó por 14 horas a temperatura ambiente y después se pasó a través de una columna (forma acida) I 120. Al secar por congelación las fracciones colectadas dieron ácido 1 -(oximetileno-carboxi)-3,6-naftaleno-disulfónico (67 g , 83%) como un sólido café. (Mi) BHAIyslys2lys4lys8lysi 6[NH-CO-CH20-3,6-Naftil- El ácido 1 -(oximetileno-carboxi)-3,6-naftaleno-disulfónico (47.85 g) se disolvió en DMF (500 mi) y se agregó diisopropiletilamina (1 1 5 mi) en una parte. Esta solución se agregó así a una solución preparada al agregar hexafluorofosfato benzotriazola-1 -il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio (PyBOP; 72 g) en una parte a una solución de BHAIyslys2lys4lys8lysi6AFT32 (15.95 g) en DMF (650 mi). DMF (100 mi) se utilizó para enjuagar el embudo cuentagotas. La mezcla de reacción se agitó por 14 horas a temperatura ambiente y después se diluyó con agua (1 0 L). La solución se bombeó a través de un filtro de profundidad de 1 micrón y a través de un aparato Pall Filtron (Pall Gelman) que contiene 10 kD de membrana. La solución resultante se pasó a través de una columna (forma de sodio) IR120, se bombeó a través de un filtro de profundidad de 0.22 micrones y se secó por congelación para dar SPL-7013 como un sólido blanco m ate en un 75% de producción. Tiempo de retención = 15 min. sobre una columna de HPLC de 15 cm x 4.6 mm ODS-EC a 30°C con la longitud de onda de detección establecida a 240 nm. La muestra se eluyó a una velocidad de flujo de 1 mi por minuto utilizando la elución gradiente detallada abajo: En donde el solvente A = 0.015M de TBAH en 0.01 M de NH4OAc (pH 7.0) y solvente B = 0.01 5 M de TBAH en MeOH. El análisis espectral de masa de SPL7013 indica un peso molecular de 16,580+2 Dalton. El peso molecular promedio esperado previsto por SPL7013, fórmula molecular, C583H577 63 a640287S64 es 16581 .53. C. Preparación de SPL 7304 En una manera similar, SPL7304 se preparó por el acoplamiento PyBOP de ácido 1 -(oximetileno-carboxi)-3,6-naftaleno-disulfónico con dendrímero de poliamidoamina (PAMAM), generación 3 (Starburst®, Sigma-Aldrich Pty. Ltd., Australia). D. Preparación de SPL 7320 En una manera similar, SPL7320 se preparó por el acoplamiento PyBOP de ácido 1 -(oximetileno-carboxi)-3,6-naftaleno-disulfónico con dendrímero de dotriaacontaamina de polipropilenimina, generación 4.0 (Starburst®, Sigma-Aldrich Pty. Ltd. , Australia). EJEMPLO 2 Actividad Biológica de SPL 7013, SPL 7304, y SPL 7320 A. Actividad Contra el Virus de Inmunodeficiencia Humana Las cepas de virus de inmunodeficiencia humana utilizadas fueron VIH-1 (H IB)1 y VIH-2 (ROD)2. Las medidas de la actividad de citotoxicidad y actividad retroviral se llevaron a cabo en paralelo. Se basaron en la viabilidad de las células MT-4 que se habían infectado con VIH y después se expusieron a diversas concentraciones de los compuestos de prueba. Después de que las células MT-4 se permitieron proliferar por 5 días, el número de células viables se cuantificó por un procedimiento de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) colorimétrico en base a tetrazolio en microbandejas de 96 cavidades.3 En todos estos ensayos, la entrada viral (multiplicidad viral de infección, MOI) fue 0.01 , o 100 veces el 50% de dosis infectiva de cultivo celular (DICC50). El 50% de la concentración antiviralmente inhibidora (EC50) se definió como la concentración de compuesto requerida para proteger el 50% de las células infectadas por virus contra la citopaticidad viral. El 50% de la concentración citotóxica (CC5o) se definió como la concentración de compuesto requerida para reducir la viabilidad de células infectadas falsas al 50%. El símbolo > se utiliza para indicar la concentración más alta a la cual se prueban los compuestos y todavía se encontraron no citotóxicos. Los valores de CC50 y EC50 promedio para diversos experimentos separados se presentan según se definen anteriormente. Como regla, los valores individuales no se desviaron por más de 2 pliegues arriba o debajo de los valores CC50 y EC50. SI es el índice de selectividad antiviral CC50/EC50. Tabla. Actividad de VIH IIB=VIH-1 ROD=VIH-2 EC9o=Concentración Eficaz para reducir la placa viral 90%. (i) Métodos para los Ensayos de Inhibición de Transmisión de VIH independiente de CD4 y dependiente de CD4, Fusión y Unión de VIH, e inhibición de sp-Crecimiento Lactobacillus. Células y virus: IH-1 iiiB, y las estirpes de célula HeLa CD4 LTR ß-gal, GHOST X4/R5, y HL2/3 se obtuvieron de Investigación de NIH SIDA y Programa de Reactivo de Referencia (Bethesda, MD), y se mantuvieron según se recomienda. Las células ME180 se obtuvieron de la Colección de Cultivo Tipo Americano ( anassas, VA). Almacenamiento y Manejo de Material de Prueba: Los compuestos se solubilizan típicamente en 100% de DMSO y se almacenan a -80°C hasta que se prueban, al menos que los solventes alternativos y condiciones de almacenamiento se especifiquen por el promotor. Las cepas congeladas se descongelan a temperatura ambiente, se pre-calientan por 15 min. a 37°C y se arremolinaron antes de la preparación de soluciones de trabajo en el medio de cultivo de tejido. Durante todas las etapas de la dilución de compuesto y manejo, los compuestos se protegen de la luz incidental por cubiertas opacas y por almacenamiento y dilución en plásticos de cultivo de tejido de color ámbar u opacos. Adicionalmente, la exposición de luz de las cubiertas de cultivo de tejido de flujo laminar y ambiental incidental se controla al reducir la iluminación fluorescente total en el laboratorio al 50%. La concentración de DMSO final es 0.25% en la concentración de prueba más alta. Ensayo de Inhibición de Transmisión de VIH Independiente de CD4: Las células ME180, una estirpe de célula epitelial cervical. X4 positiva, CD4 negativa, se mantiene en RP I 1640 complementadas con 10% de suero de bovino fetal, glutamina y antibióticos. Veinticuatro horas antes del ensayo, las células E180 se tripsonizaron, se lavaron y se sembraron en láminas de microconcentración de fondo plano de 96 cavidades a una densidad de 2 x 103 células por cavidad. En el día del ensayo, las células H9 crónicamente infectadas con ei SK1 clínico aislado de VIH-1 (H9-SK1 ) se tratan con mitomicina C frescamente elaborada (200 9/?t??) por 60 minutos a 37°C. Esta concentración de mitomicina C es suficiente para dar como resultado la muerte celular, pero permite que la transmisión de virus ocurra. Después del tratamiento de mitomicina C, las células H9-SK1 se lavan tres veces con medio de cultivo de tejido. Los compuestos de prueba se agregan a la monocapa ME180 seguidos por 2 x 104 de células H9-SK1. Las células ME180 se co-cultivan con células H9- SK-1 y el material de prueba por 4 horas, y las células H9-SK1 se remueven al lavar la monocapa E180 tres veces con PBS. A las 24 y 48 horas de la iniciación de post ensayo, las cavidades se lavan nuevamente tres veces con PBS para asegurar la remoción de las células H9-SK1 , y el cultivo continuó en el medio libre de material de prueba. A los seis días de post-co-cultivación, ios sobrenadantes se colectan y se evalúan por la expresión de antígeno p24 por ELISA. La viabilidad de célula se valor por , la reducción de tinte XTT. Los compuestos que se consideran como activos en la primer prueba, se vuelven a probar con o sin la adición de mucina. La prueba en la presencia de mucina se lleva a cabo por la adición de 200 µg/ml de mucina de puerco (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a las reacciones de transmisión . Los intervalos de transmisión y lavado sin el reemplazo de mucina o compuesto se llevan a cabo según se describe anteriormente. Todas las determinaciones se realizan en triplicado con dilución de ½ Log™ serial de los materiales de prueba. Ensayo de Inhibición de Transmisión de VIH Dependiente de CD4: El ensayo de inhibición de transmisión de VIH independiente de CD4 se lleva a cabo esencialmente según se describe para el ensayo de transmisión independiente de CD4 excepto para el uso de la estirpe de célula GHOST(3) X4/R5 CD4 positiva. Esta estirpe de célula se deriva de la estirpe de célula de OSH (osteosarcoma humano) que es negativo para el receptor de núcleo de VIH y expresión CD4. La estirpe de célula se elabora para expresar T4 (CD4), R5 y X4 por medio de vectores retrovirales no seleccionables y construcción VIH-2 LTR hGFP con un marcador seleccionable de higromicina. Las estirpes de célula se manejan y se cultivan según se describen anteriormente para el ensayo de inhibición de VIH independiente de CD4, con la excepción de que 2.5 x 104 de GHOST(3) X4/R5 y 5 x 102 de células H9/SK1 tratadas de mitomicina C se utilizan en el ensayo. La adición de compuestos, el tratamiento de mitomicina C y el lavado de post-transmisión para remover las células H9/SK-1 se realizan según se describen anteriormente para permitir la compatibilidad de los dos ensayos antivirales. La replicación de virus se valora a las 24 horas de post infección, permitiendo 3 lavados, por medida de p24 asociada de célula por ELISA para asegurar una ronda única de infección en la presencia de CD4. La toxicidad de compuesto y la viabilidad de célula se valoran por la reducción de tinte XTT. Los compuestos que se consideran como activos en la primer prueba se vuelven a probar con o sin la adición de mucina. La prueba en la presencia de mucina se lleva a cabo por la adición de 200 µ9/??? de mucina de puerco (Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO) en el medio de cultivo de tejido a las reacciones de transmisión. Los intervalos de transmisión y lavado sin reemplazo de mucina o compuesto se llevan a cabo según se describen anteriormente. Todas las determinaciones se realizan en triplicado con dilución ½ Log™ serial de los materiales de prueba. Ensayo de Lactobacillus: Lactobacillus crispatus y Lactobacillus jensenii se obtuvieron de la Colección de Cultivo de Tejido Tipo Americano y crecieron en brote MRS de LactobaciHi (Difco, Fisher Scientific, Pittsburg, PA). Este medio permite el crecimiento eficaz de los Lactobacilli bajo condiciones anaeróbicas. Las cepas de bacilos se producen y se congelan en 15% de glicerol a -80°C para utilizarse en el ensayo de sensibilidad. Para valorar el efecto de los compuestos sobre el crecimiento de L. crispatus y L. jensenni, 10 mi de medio MRS se inocula con un esfuerzo de la cepa bacteriana de glicerol. El cultivo se coloca en una bolsa Gas Pak C02 y se incuba por 24 horas a 37°C. Al siguiente día, los cultivos de lactobacillus se diluyen en un OD de 0.06 a una longitud de onda de 670 nm. Los compuestos se diluyen y se colocan en una lámina de fondo plano de 96 cavidades y se agrega Lactobacillus sp. La solución de Penicilina/Estreptomicina comercialmente disponible a una concentración de prueba alta de 1 .25 U/ml y 1 .25 µg/ml, respectivamente, se utilizan como el control positivo. Las láminas se incuban nuevamente por 24 horas a 37°C en una bolsa Gas Pak C02 y el crecimiento bacteriano se determinó por la medida de densidad óptica a 490 nm en un lector de lámina de dispositivos moleculares. Todas las determinaciones se realizan con 6 ½ log de diluciones de una concentración de prueba alta en triplicado. Ensayo de Unión de Virus: Este ensayo se diseña para detectar los compuestos que interactúan con la unión de virus de bloque y célula, y/o los compuestos que interactúan con el complejo de unión/fusión formador. El ensayo de unión se realiza con las células HeLa CD4 LTR ß-gal. Las células HeLa CD4 LTR ß-gal se cultivan rutinariamente con los antibióticos de selección requerida. Veinticuatro horas antes de la iniciación del ensayo, las células se tripsinizan, se cuentan y 1 x 10* células se colocan en una cavidad de 0.2 cm en medio con antibióticos de selección. A las 24 horas, el medio se remueve y el compuesto en el medio se coloca sobre las células y se incuba por 15 min. a 37°C. Una concentración conocida de la cepa IIIB de VIH se agrega así a las cavidades y la incubación continua por 1 hora. Al final de la incubación, las cavidades se lavan 3 veces con el medio y el cultivo se continua por 40 a 48 horas. Al término del ensayo, el medio se remueve y la expresión de enzima ß-galactosidasa determinada por quimioluminiscencia por instrucciones de los fabricantes (Tropix Gal-screen™, Bedford Mass), por un método quimioluminescente de etapa única utilizando una sección única para destruir por lisinas las células y detectar la actividad de enzima de ß-galactosidasa. La toxicidad de compuesto se monitorea sobre lámina hermana por la reducción de tinte XTT. Todas las determinaciones se realizan en triplicado con ½ Log10 de dilución serial de los materiales de prueba. El intervalo de absorción de virus de 1 hora es lo suficientemente corto que AZT, que requiere fosforilación en su forma de tri-fosfato activo (AZT-TTP), no es activo en este ensayo. Ensayo de Fusión: El ensayo de fusión valora la habilidad de los compuestos de bloquear la fusión de célula a célula mediada por V1H-1 Env y CD4 expresada en células separadas. Este ensayo es sensible para inhibidores tanto de la interacción de gp120/CD4 como inhibidores del receptor de núcleo X4. Primero, las células 5 x 103 HeLa CD4 LTR ß-gal se colocan en cavidades de microcoentración y se incuban durante la noche. Al siguiente día, el medio se remueve y las células HeLa CD4 LTR ß-gal se incuban por 1 hora a 37°C en el medio fresco con el compuesto de prueba. Siguiente al la incubación, las células 5 x 103 HL2/3 se agregan y la incubación continúa por 40 a 48 horas, la expresión de la enzima ß-galactosidasa se detecta por quimioluminiscencia (Tropix Gal-screen™, Tropix, Bedford, MA). La toxicidad del compuesto se monitorea sobre una lámina hermana utilizando la reducción de tinte XTT. Todas las determinaciones se realizan en triplicado con ½ Log-?? de dilución serial de los materiales de prueba. ELISA de Antígeno P24: Los equipos ELISA se adquieren de Coulter Electronics, y la detección del sobrenadante o el antígeno p24 asociado por célula se realiza de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para el p24 asociado por célula, los lisatos de célula se producen por lisis del contenido de la cavidad en 25 a 50 µ? de regulador de lisis de virus suministrado Coulter, y se ensayan siguiendo 1 ronda de congelación/descongelación. Todas las determinaciones de p24 se realizan siguiente la dilución serial de las muestras para asegurar las absorciones en el rango lineal de la curva de antígeno p24 estándar. La curva estándar se produce utilizando estándares suministrados del fabricante e instrucciones. Los datos se obtienen por análisis espectrofotométrico a 450 nm utilizando un lector de lámina Molecular Devices Vmax. Las concentraciones finales se calculan de los valores de dénsidad ópticos utilizando el paquete de software Molecular Devices Soft Max y se expresan en antígeno p24 pg/ml. Coloración de XTT para Viabilidad de Célula y Citotoxicidad del Compuesto: Los valores TC50 para los materiales de prueba se derivan al medir la reducción del tinte de tetrazolio XTT (hidróxido 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)carbonil]-2H-tetrazolio) en láminas de microconcentración de réplica que contienen célula y compuesto sin virus. El XTT se metaboliza por la oxidasa de NADPH de enzima mitocondrial en células metabolíticamente activas a un producto de formazan soluble, permitiendo la citotoxicidad de compuesto y viabilidad de célula de análisis cuantitativa rápida. La solución de XTT se prepara diariamente como una solución concentrada de 1 mg/mL en PBS. La solución de metosulfato fenzina (SMF) se prepara en 15 mg/mL en PBS y se almacena en la oscuridad a -20°C. La solución concentrada de XTT/SMF se prepara inmediatamente antes de utilizarse al diluir la SMF 1 : 100 en PBS y agregar 40 µ? por ml_ de solución de XTT. Cincuenta microlitros de XTT/SMF se agregan a cada cavidad de la lámina y la lámina se incuba por 4 horas a 37°C. La incubación de 4 horas se ha determinado empíricamente por encontrarse dentro del rango de respuesta lineal por reducción de tinte MTS con los números indicados de las células para cada ensayo. Los selladores de lámina adhesiva se utilizan en lugar de tapas, la lámina sellada se invierte varias veces para mezclar el producto de formazan soluble y la lámina se lee a 450 nm con un espectrofotómetro de formato de lámina de 96 cavidades Molecular Devices Vmax. Análisis de Datos Sulfato de dextrano (positivo) y dextrano (negativo) se utilizan como controles para los ensayos de inhibición de transmisión de VIH independiente de CD4 y dependiente de CD4. El tinte de ácido sulfónico Chicago Sky Blue se utiliza como un control positivo para los ensayos de unión y fusión4. La solución de Estreptomicina (10.0 mg/ml) Penicilina (10,000 U/l) comercialmente disponible se utiliza como un control positivo para el ensayo de sensibilidad de Lactobacillus. Para cada compuesto, cuando es adecuado, una IC50 (concentración que inhibe la transmisión o replicación de virus al 50%), . ID50 (concentración que inhibe el 50% de crecimiento de Lactobacilli) TC50 (concentración que da como resultado un 50% de reducción en la viabilidad de célula) y un índice terapéutico (TI: TC50/IC5o o ID50) se calcula por regresión lineal.
RESULTADOS DE LOS ENSAYOS DE TRANSMISIÓN INDEPENDIENTE DE CD4 Y DEPENDIENTE DE CD4 Ensayo de Ensayo de Transmisión Transmisión Independiente de Dependiente de CD4 CD4 ( ? ???) (µ?/???) Compuesto # de Mucina IC50 TC50 TI IC50 TC50 TI Exp. 1 - 0.316 >100 >316 Sulfato de 2 - 1.1 >50 >46 0.158 >50 >316 Dextrano 2 + 0.16 >50 >309 0.158 >50 >316 1 - >100 >100 — •Dextrano 2 - >100 >100 — >100 >100 — 2 + >100 >100 — >100 >100 — 1 - 0.76 >100 >132 SPL7013 2 - 28.5 >100 >3.5 0.39 >100 >256 2 + 1.1 >100 >90.9 0.49 >100 >205 1 - >0.3 >100 >316 SPL7304 2 - 5.0 >100 >20 0.89 >10 >112 2 + 2.8 >100 >36 0.65 >100 >153 1 - >0.3 >100 >316 SPL7320 2 - 0.8 >100 >125 0.68 >100 >147 2 + 0.8 >100 >125 1.15 >10 >87 Resultados de la Prueba de Lactobacillus sp.
Las concentraciones de inicio de Penicilina y Estreptomicina son 1.25 U/ml y 1.25 9 ??1, respectivamente. (i¡) Actividad de SPL7013, SPL7304 y SPL7320 Contra VIH-1 RoJo y SIV 89.6pd MÉTODOS Virus La cepa de virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1 ) RoJo es un aislado pediátrico de paso bajo derivado en los laboratorios del Southern Research Institute (SRI). El SHIV89.6pd se obtuvo de Mark Lewis en SRI y las cepas crecieron en CsMSP humanas para la prueba antiviral. Explosión v aislamiento de CMSP: Las células monoculares sanguíneas periféricas (CsMSP) se obtuvieron de donadores negativos de VIH-1 y hepatitis normal por separación de gradiente hipoopaco de ficol. En resumen, la sangre anti- coagulada se diluyó 1 : 1 con salina regulada por fosfato Dulbecco sin Ca++ y Mg++ (PBS) y se estratificó sobre 14 mL de medio de separación de Linfocitos en un tubo centrífugo de 50 mi. Los tubos se centrifugaron así por 30 minutos a 600 X g. Los PBIs en banda se aspiraron suavemente de la interfase resultante y por consecuencia se lavaron 2X con PBS mediante centrifugación de velocidad baja. Las células mononucleares se contaron, la viabilidad se determinó por la exclusión de tinte Trypan Blue y se volvieron a suspender en RPMI 1640 de medio complementado con 15% de FBS (calor inactivado), 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 µ9/p??_ de estreptomicina, y 10 9/?t?1_ de gentamicina con 2 µ9/??1_ de fitohemaglutina (FHA) a 1 X 106 células/mL. Las células se cultivaron por 48 a 72 horas a 37°C, 5% de C02. Siguiente a la incubación, las células se colectaron por centrifugación, se lavaron y se volvieron a suspender en RPMI 1640 complementado con 15% de FBS (calor inactivado), 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 1 00 µg/mL de estreptomicina, y 10 µ9/?t?? de gentamicina con 20 U/mL de IL-2 recombinante (R & D Systems, Minneapolis, MN). IL-2 se incluyó en el medio de cultivo para mantener la división celular iniciada por la estimulación mitogénica de FHA. Las células se cultivaron en IL-2 por 72 horas y después se utilizaron para cambio viral. Ensayo de CMSP: Las células mononucleares sanguíneas periféricas de un mínimo de 2 donadores, que se han explotado con FHA e IL-2, se contaron, la viabilidad se determinó por la exclusión de tinte Trypan Blue y se mezclaron en proporciones iguales. Los donadores agrupados se utilizaron para minimizar la variabilidad observada entre los donadores individuales lo cual se da como resultado de las diferencias cualitativas y cuantitativas en infección de VIH y respuesta global al FHA e IL-2 de poblaciones de linfocito primarias. Las células se volvieron a suspender a 1 x 106 células/mL en RPMI 1640 sin fenol rojo complementado con 15% de Suero de Bovino Fetal (calor inactivado), 2 m de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 µ9/G??_ de estreptomicina, 10 µ9/???_ de gentamicina e IL- 2 (20 U/mL, R&D Systems, inneapolis, N). Cincuenta microlitros de células se distribuyeron así en las 60 cavidades de una lámina de cultivo de microconcentración de fondo redondo de 96 cavidades en un formato estándar desarrollado por el departamento de Investigación de Enfermedad Infecciosa de Southern Research Institute. Cada lámina contiene cavidades de control de célula (células solamente), cavidades de control de virus (células más virus), y cavidades experimentales (fármaco más células más virus). Los compuestos serialmente diluidos se agregan a la lámina de microconcentración seguidos por la cepa pre-concentrada adecuada de VIH-1 o SHIV-1. Todas las muestras se ensayaron en triplicado con una lámina de replicado sin virus para la determinación de toxicidad de compuesto. El volumen final por cavidad fue 200 µL·. El ensayo se incubó por 6 días en una atmósfera humidificada a 37°C, 5% de C02, después de lo cual se colectaron los sobrenadantes, para análisis de actividad de TA y láminas hermanas analizadas para viabilidad de célula mediante reducción de tinte TS. Las cavidades también se examinaron microscópicamente y se notaron algunas anormalidades. Coloración de MTS para viabilidad de célula: Al término del ensayo, las láminas de ensayo se colorearon con el tinte en base a tetrazolio soluble MTS (CelITiter® Reagent Promega, Madison, Wl) para determinar la viabilidad de célula y cuantificar la toxicidad del compuesto. El MTS se metaboliza por las enzimas de mitocondria de las células metabólicamente activas a un producto de formazan soluble, permitiendo el rápido análisis cuantitativo de viabilidad de célula y citotoxicidad de compuesto. Este reactivo es una solución estable única que no requiere la preparación antes de utilizarse. Al término del ensayo de CMSP 20 µ?_ de reactivo MTS se agregó por cavidad, y las cavidades se incuban por 4 horas a 37°C. Los senadores de lámina adhesiva T se utilizaron en lugar de las tapas, la lámina sellada se invirtió varias veces para mezclar el producto de formazan soluble y la lámina se leyó espectrofotométricamente a 490 nm con un lector de lámina Molecular Devices Vmax. Ensayo de Transcriptasa Inversa: La actividad de transcriptasa inversa se midió en sobrenadantes libres de célula. El trifosfato de timidina concentrado (NEN) (TTF) se volvió a suspender en H20 destilada a 5 Ci'/mL. Poly rA y oligo dT se prepararon como una solución concentrada que se mantuvo a -20°C. El regulador de reacción de TA se preparó fresca en una base diaria y consiste de 125 µ?, 1 .0 M de EGTA, 125 µL· de dHzO, 1 10 µ? de 10% de SDS, 50 µ? de 1 .0M de Tris (pH 7.4), 50 µ? de 1 .0 M de DTT, y 40 µ? de 1.0 M de MgCI2. Estas tres soluciones se mezclaron juntas en una proporción de 2 partes de TTF, 1 parte de polyrA:oligo dT, y 1 parte de regulador de reacción. Diez microlitros de esta mezcla de reacción se colocó en una lámina de microconcentración de fondo redondo y 15 µL· de virus que contiene el sobrenadante se agregó y se mezcló. La lámina se incubó a 37°C en un baño de agua con un soporte sólido para prevenir la sumersión de la lámina y se incubó por 60 minutos. Siguiente a la reacción, el volumen de reacción se manchó en piezas de papel DE81 , se lavó 5 veces por 5 minutos cada uno en un 5% de regulador de fosfato de sodio, 2 veces por 1 minuto cada uno en agua destilada, 2 veces por 1 minuto cada uno en 70% de etanol, y después se secó. Se agregó Opti- Flúor O a cada muestra y la radioactividad incorporada se cuantificó utilizando un contador de escintilación líquida Microbetaplus Wallac 1450. Análisis de Datos: IC50 (50% de inhibición de replicación de virus), TC50 (50% de reducción en viabilidad de célula) y un índice terapéutico (TI, IC5o/TC5o) se proporcionan. AZT se ha utilizado como uh compuesto de control positivo relevante para los ensayos individuales. Los resultados de las evaluaciones antivirales realizadas se resumen en la siguiente tabla: Breve Descripción de la Actividad Antiviral de los Compuestos en CsMSP B. Actividad Contra Virus de Herpes -VHS-1 y VHS-2 (i) Ensayo de reducción de placa de Virus Método General Las cepas estándares de VHS G (VSH-2) y F (VHS-1 ) se utilizaron en las pruebas. La entrada de virus para una lámina de 6 cavidades fue de 100 pfu/cavidad. La estirpe de célula susceptible VHS, células Vero, se utilizaron en el ensayo de reducción de producción de virus. Para la prueba de citotoxicidad, una estirpe de célula epitelial, células HeLa-229, se empleó. Los efectos antivirales de los compuestos se determinaron por el ensayo de reducción de placa modificada. Las células confluentes se lavaron con PBS y por consecuencia se infectaron con VHS (100 pfu/cavidad) por 1 hora a 37°C y la inclinación cada 10 min. Después de que se removió el inóculo viral, Jas células infectadas se lavaron con PBS y se sobrepusieron con 0.5% de metilcelulosa en medio de cultivo (volumen igual de 1 % de metilcelulosa mezclada con 2 x de medio de cultivo). Las células se incubaron a 37°C por 2 días para la infección de VHS-2 y 3 días para VHS-1 . Cuando el tamaño de placa fue adecuado, las células se fijaron con 10% de formalina por 10 minutos. Las placas se colorearon por consecuencia con 0.5% de cristal violeta por 10 minutos. El tinte se removió por lavado con agua corriente y se dejó secar en una cubierta de vapor. Las placas se contaron así. Todos los datos se generaron con experimentos duplicados. Los conteos de placa medios en las cavidades de prueba se compararon con conteos de placa medios en cavidades de control. EC50's (concentraciones que dan un 50% de reducción en el conteo de placas del inóculo) se calculó. Las actividades antivirales y las medidas de citotoxicidad se llevaron a cabo en paralelo en la misma cepa de células. El 50% de la concentración citotóxica (CC50) se definió como la concentración de compuesto requerida para reducir la viabilidad de células infectadas falsas al 50% . Método de tratamiento de pre-infección El medio de cultivo se removió de células Vero confluentes en lámina de 6 cavidades y lavó con 1 mi de PBS. 1 mi de medio de cultivo q ue contiene el compuesto en concentración de 0, 0.01 , 0.03 , 0.1 , 0.3, 1 , 3, 10 , y 30 9/??1 se agregó a cada cavidad y se incubó a 37°C por 1 hora. Sig uiente a la pre-incubacíón de las célu las con dendrímero, las células se infectaron así con 1 00 pfu/cavidad ya sea de VHS-1 o VHS-2. Las infecciones se incubaron a 37°C por 1 hora con inclinación cada 1 0 minutos. Después de que se removió el inocu lo, las células infectadas se cubrieron con 1 .5 mi de 0.5% de metilcelulosa diluida con 2 x de medio de cultivo por ensayo de placa. Tratamiento de Células Infectadas Las células Vero confluentes se lavaron con PBS. Las células se infectaron así con 1 00 pfu/cavidad ya sea de VHS-1 o -2 a 37°C por 1 hora. Siguiente a la remoción del inoculo viral , las células infectadas se lavaron una vez con PBS y se cubrieron con 0.5% de metilcelulosa conteniendo dendrímero en concentraciones de 0 , 0.03, 0.1 , 0.3, 1 , 3, 10 , 30, y 1 00 µg¡m\ . Las células se incu baron a 37°C por 2 (VHS-2) o 3 (VSH-1 ) días por ensayo de placa. Citotoxicidad de dendrímero El medio de cultivo se removió de células HeLa-229 confluentes en láminas de 24 cavidades por bomba. Las células se lavaron así una vez con 1 mi de PBS. 1 mi de medio de cultivo que contiene dendrímeros en concentraciones de 0, 1 00, 500, y 1000 µg/ml se agregó a cada cavidad. Las células se incubaron a 37°C en incubadora por 2 días. Al final de la incubación, el medio se removió y las células se lavaron con PBS. 500 µ? de 0.01 % neutral rojo (en PBS) se agregó subsecuentemente a cada cavidad, y se incubó a 37°C por 30 minutos. El tinte se removió así y las células se lavaron dos veces con 1 mi de PBS por cavidad. El tinte se extrajo por adición de 500 µ? de 50% de etanol y 1 % de ácido acético glacial en PBS para cada cavidad y se incubó a temperatura ambiente por 15 minutos con agitación suave a 120-150 rpm. 100 µ? de tinte extraído de cada cavidad se colocó en lámina de 96 cavidades y la absorción a 550 nm se leyó sobre un lector ELISA. Tabla de Actividad contra VHS-1 y VHS-2 INF = Tratamiento de células infectadas (ii) Virus de Herpes-2. Eficacia en un Modelo de Animal La eficacia de SPL-7013 se probó en una prueba de prevención de VHS genital en el modelo de ratón (cepa MS). Una dosis de 15 µ? de 100 mg/ml, o 1 0 mg/ml del compuesto se infiltró en la vagina de 16 animales 20 segundos antes de la infección de VHS-2. SPL-7013 previno la infección y enfermedad en todos los animales probados en comparación a los controles. La mortalidad total en tres días del mismo número de ratones infectados de control se utilizó como un punto fina! de las pruebas. Tabla de infección de tracto genital VHS-2y tratamiento de la enfermedad en el ratón Todos los animales se trataron 20 segundos antes de la infección. C. Virus de Papiloma Humano (VPH). Inh ibición de Absorción de Célula Epitelial Humana. El compuesto se evaluó por su habilidad para inhibir la unión y absorción de partículas similares al virus de papiloma humano a una estirpe de célula epitelial humana. El compuesto se probó en un rango de seis diluciones como inhibidor de la unión y de la absorción de las Partículas Similares al Virus de objetivo de fluorocromo de virus de papiloma (PsSV) de virus de papiloma humano tipo 6b. La PsSV se permitió unirse y tomarse en las células epiteliales en la presencia de SPL-7013. El ensayo de unión y absorción se determinó utilizando citometría de flujo y la inhibición de unión se reportó como un porcentaje con respecto a la unión observada en la ausencia de inhibidor. Las pruebas se realizaron en dos ensayos independientes. Métodos Células. La estirpe de célula de carcinoma epidermoide humana A431 se adquirió de la Colección de Cultivo Tipo Americano en el paso 30 (CRL- 555, Grupo F-13530) y se mantuvo en DME en 10% de FCS. Las PsSV de virus de papiloma humano tipo 6b crecieron y se purificaron de acuerdo a los procedimientos de operación estándares. Las partículas se marcaron con un fluorocromo. El compuesto se volvió a disolver en agua estéril en las concentraciones de 5 mM y se utilizó fresco para el primer ensayo antes de congelarse a -20°C. Se descongeló así para el segundo ensayo. Ensayo de Absorción. Un matraz T75 de células A431 se lavó con 10 mi de PBS/EDTA (0.05%) por 5 minutos a 37°C antes de tratarse con 2 mi de tripsina por un adicional de 5 minutos a 37°C. DMEM/10% de FCS (10 mi) se agregó a las células, las células se centrifugaron a 1000x g por 5 minutos a TA, y se volvieron a suspender en medio completo en 3 x 105 células/ml en un tubo de 15 mi. Las células se incubaron a 37°C por 2 horas con inversión cada 20 minutos a fin de permitir la re-expresión de proteínas de superficie celular. Las células se centrifugaron a 1000 xg por 5 minutos a TA, y se volvieron a suspender en DMEM libre de suero en 3 x 105 células/100 µ?_ y 100 µ?_ de suspensión se colocó en un tubo de 1 .5 mi. El compuesto se agregó a las células en las siguientes seis diluciones en 1 0 µ!_ de PBS: 100 µ?, 1 0 µ?, 1 .0 µ , 100 n , 10 nM, 1 .0 nM. Las células se incubaron con compuesto por 30 minutos a 37°C antes de que las PsSV (200 ng) marcadas se agregaran. Como un control positivo, solamente PsSV se agregaron a las células y el control negativo fue de células con PsSV agregadas pero incubadas en hielo. Las células se mezclaron y se incubaron a 37°C por 2 horas. Las células se lavaron una vez con 1 mi de PBS y se fijaron en regulador FACS (P13S/4% de paraformaldehído). El análisis se llevó a cabo sobre una máquina FACS Coulter. Análisis Los resultados se analizaron con WinLisT. Se utilizó un difusor inicíalmente anterior/lateral para analizar el tamaño de células y se dieron entrada a las células vivas. Las intensidades fluorescentes medias (IF ) de esta entrada se generaron y se utilizaron para mayores análisis. La absorción se reportó como el porcentaje con respecto a la unión observada para PsSV sola (100%) contra las células con PsSV incubadas en hielo (0%). Resultados SPL-7013. La inhibición máxima de la absorción (26% de absorción) se observó en 1 µ? sin mayor inhibición en las concentraciones más altas. Este compuesto todavía ha mostrado la inhibición de absorción en 1 µ? y 10 nM. La absorción viral aumentó después de este punto con concentración reductora de SPL-7013.
D. Infección de Chlamydia trachomatis. Eficacia de SPL-7013 en un Modelo de Animal. Las ratonas hembras (cepa MS) se trataron ya sea en el tracto genital inferior o superior con un 15 mL de infiltración de 100 mg/mL de solución de SPL-7013, 20 segundos antes de la infección con C. trachomatis. La infección de tracto genital inferior se define por el aislamiento del organismo mediante cultivo de las muestras de succionador genital en los días 3 o 6 post cambio. Para la infección de tracto genital superior, la definición es el aislamiento del organismo mediante cultivo del tejido de tracto genital superior colectado en el día 10 post cambio. Los ratones tratados por regulador de fosfato PBS se utilizaron como controles.
Efectos sobre la Infección de Tracto Genital de C. trachomatis en Ratones Anímales Protegidos Contra La Infección Grupo No. de Tiempo Tracto Tracto animales Inferior {%) Superior (%) Grupo 1. SPL-7013 16 -20 seg. 8 (50%)a 8 (50%) PBS 15 -20 seg. 1 (7%) 2 (13%) Grupo 2. SPL-7013 16 -20 seg. 6 (38%) 8 (50%)a PBS 16 -20 seg. 1 (7%) 1 (6%) Las personas expertas en la materia apreciarán que pueden hacerse variaciones y modificaciones a la invención según se describe ampliamente en la presente, diferentes a aquellas descritas específicamente sin alejarse del espíritu y alcance de la invención, se entenderá que esta invención se extiende para incluir tales las variaciones modificaciones.
Popovic, M. ; Sarngadharan, .G. ; Read, E; Gallo, R.C. Detection, isolation, and continous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS. Science (1984), 224:497-500. Clavel, E; Guyader, M.; Guetard, D.; Salle, M.; ontagnier, L ; Alizon, H. Molecular cloning and polymorphism of the human immunodeficiency virus type 2. Nature (1986), 324:691 -695. Pauwels, R.; Balzarini, J.; Baba, M.; Snoeck, M.R.; Schols, D.; Herdewijn, R; Desmyter, J, De Clercq, E. Rapid and automated tetrazolium-based colorimetric assay for the detection of antí-HIV compounds. J. Virol. Methods (1988), 20:309-321 . Clanton et al., J. AIDS. (1992), 5:771 .

Claims (1)

  1. H 25 ?? donde R representa un grupo de la Fórmula IV IV o un sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 2. Un compuesto según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha sal farmacéuticamente aceptable se selecciona de las sales metálicas tales como sales de aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio y zinc, y sales orgánicas con aminas orgánicas tales como ?,?'- dibencil-etilenodiamina, cloroprocaína, dietanolamina, etilenodiamina, j5 diciclohexilamina, meglumina (N-metilglucamina) y procaína, o aminas cuaternarias tales como sales de colina, de sulfonio y fosfonio. 3. El compuesto SPL-7013 en la presente o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 4. El compuesto SPL-7304 en la presente o una sal 2Q farmacéuticamente aceptable del mismo. 5. El compuesto SPL-7320 en la presente o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 6. Una composición farmacéutica local para tratamiento terapéutico o profiláctico de las enfermedades sexuaimente transmitidas en un paciente humano, que comprende un compuesto según las reivindicaciones 1 a 5, en asociación con al menos un diluyente o vehículo local, farmacéuticamente aceptable. 7. Un método para el tratamiento terapéutico o profiláctico de las enfermedades sexualmente transmitidas en un paciente humano, el cual comprende la administración local al paciente de una cantidad eficaz de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 8. Un método según la reivindicación 7, caracterizado porque dicha enfermedad es una enfermedad sexualmente transmitida vaginal o rectalmente seleccionada de VHS-1 , VHS-2, VIH-1 , VIH-2 e infección de VPH, e infección Chla ydia trachomatis. 9. El uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la elaboración de un medicamento para la administración local en el tratamiento terapéutico o profiláctico de las enfermedades sexualmente transmitidas en un paciente humano.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10179159B2 (en) 1999-10-22 2019-01-15 Scott Wepfer Topical anesthetic formulation
CN1778967B (zh) * 2004-11-25 2010-11-10 中国科学院化学研究所 抑制hiv-1反式激活蛋白与反式激活应答序列rna结合用的聚酰胺-胺型树状化合物
NZ567203A (en) * 2005-10-18 2010-06-25 Starpharma Pty Ltd Microbicidal dendrimer composition delivery system for treatment and prevention of sexually transmitted infections
AU2006336176B2 (en) 2006-01-20 2013-08-22 Starpharma Pty Limited Modified macromolecule
ES2558875T3 (es) 2006-03-22 2016-02-09 Starpharma Pty Limited Composición anticonceptiva
ES2834916T3 (es) * 2006-08-11 2021-06-21 Starpharma Pty Ltd Agente terapéutico dirigido de dendrímero de polilisina
WO2008017122A1 (en) * 2006-08-11 2008-02-14 Starpharma Pty Ltd Polylysine dendrimer contrast agent
JP2008202025A (ja) * 2007-01-22 2008-09-04 Honda Motor Co Ltd プロトン伝導性高分子
JP2008270177A (ja) 2007-03-23 2008-11-06 Honda Motor Co Ltd プロトン伝導体
IT1395137B1 (it) 2009-08-05 2012-09-05 Spider Biotech S R L Nuovi peptidi antipatogeni
US8251452B2 (en) * 2009-11-13 2012-08-28 Hill Jason D Gaming chairs
DK2709633T3 (da) * 2011-05-16 2019-11-11 Starpharma Pty Ltd Fremgangsmåde til behandling eller profylakse af bakteriel vaginose
JP6419701B2 (ja) 2012-09-13 2018-11-07 スターファーマ・ピーティーワイ・リミテッド 眼の感染症の治療または予防方法
US20210030785A1 (en) * 2016-05-05 2021-02-04 Starpharma Pty Ltd. Method of prophylaxis of zika virus infection
CN110305188B (zh) * 2018-03-23 2020-03-13 广州朗圣药业有限公司 一种预防hiv感染的新化合物及其制备方法
WO2020014750A1 (en) * 2018-07-19 2020-01-23 Starpharma Pty Ltd Therapeutic dendrimer

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4289872A (en) * 1979-04-06 1981-09-15 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units
US4410688A (en) * 1981-04-29 1983-10-18 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound
US4568737A (en) * 1983-01-07 1986-02-04 The Dow Chemical Company Dense star polymers and dendrimers
US4507466A (en) * 1983-01-07 1985-03-26 The Dow Chemical Corporation Dense star polymers having core, core branches, terminal groups
US4558120A (en) * 1983-01-07 1985-12-10 The Dow Chemical Company Dense star polymer
US4587329A (en) * 1984-08-17 1986-05-06 The Dow Chemical Company Dense star polymers having two dimensional molecular diameter
AUPM623994A0 (en) * 1994-06-15 1994-07-07 Biomolecular Research Institute Limited Antiviral dendrimers
AUPO104496A0 (en) * 1996-07-17 1996-08-08 Biomolecular Research Institute Limited Angiogenic inhibitory compounds
US6676946B2 (en) * 1997-03-27 2004-01-13 Institut Pasteur Multiple antigen glycopeptide carbohydrate vaccine comprising the same and use thereof
AUPP584298A0 (en) * 1998-09-14 1998-10-08 Starpharma Limited Antimicrobial and antiparasitic agents
US7572459B2 (en) * 1998-09-14 2009-08-11 Starpharma Pty Ltd. Anionic or cationic dendrimer antimicrobial or antiparasitic compositions
AUPP584398A0 (en) * 1998-09-14 1998-10-08 Starpharma Limited Inhibition of toxic materials or substances
US7030097B1 (en) * 1999-07-14 2006-04-18 Cornell Research Foundation, Inc. Controlled nucleic acid delivery systems
CA2391954A1 (en) * 1999-11-18 2001-05-25 Exxon Chemical Patents, Inc. Method for the synthesis of molecular sieves
US6893506B2 (en) * 2002-03-11 2005-05-17 Micron Technology, Inc. Atomic layer deposition apparatus and method

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