KR100882343B1 - 성전이 질병의 예방및 치료제-ｉ - Google Patents

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Abstract

본 발명은 성전이 질병의 예방 및 치료, 특히, 이들 질환의 예방 및 치료시 국소 적용제로서 사용되는 나프틸 디설포네이트 말단기를 갖는 덴드리머의 용도에 관한 것으로, 본원의 화학식 I, II, 또는 III의 화합물: 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다. 특히 바람직한 본 발명의 화합물은 본 명세서에 SPL-7013, SPL-7304, 및 SPL-7320 로 언급된다.
본 발명은 또한 인간 환자의 성전이 질병의 예방및 치료 요법을 위한 국소용 약학 조성물을 제공하는데, 이는 상기 화학식 I, II, 또는 III의 화합물, 또는 그의 약학적 허용 염을, 하나 이상의 약학적 허용가능한 국소용 담체 또는 희석제와 함께 포함한다.
다른 면으로는, 본 발명은 인간 환자의 성전이 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하며, 이는유효량의 상기 화합물 I, II, 또는 III또는 이들의 약학적 허용염을 국소 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 환자의 성전이 질병의 예방 또는 치료시 국소투여를 위한 약물의 제조에 상기 화합물 I, II, 또는 III, 또는 이들의 약학적 허용염을 사용하는 것에 관한 것이다.

Description

성전이 질병의 예방및 치료제-Ｉ{AGENT FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF SEXUALLY TRANSMITTED DISEASES-I}
본 발명은 성전이 질병의 예방 및 치료, 특히, 이들 질환의 예방 및 치료시 국소 적용제로서 사용되는 나프틸 디설포네이트 말단기를 갖는 덴드리머의 용도에 관한 것이다.
HIV, HSV, 및 다른 바이러스 및 미생물 병원체에 기인한 성전이 질병(sexually transmitted diseases;STDs)의 세계적 영향력, 환자 및 사망자수는 세계적으로 수 억명에 이르는 것으로 추정된다. STDs의 전이를 제어하기 위한 한 방법은 관련 병원체를 불활성화 시키기 위해 국소 적용되는 여성/남성-조절된 질, 또는 직장용 살균제를 사용하는 것이다. 결과적으로, STDs의예방 및 치료를 위해 질내, 또는 직장내 사용되는 신규의 안전한 국소용 살균제의 개발이 신약 개발의 중요한 목표가 되고 있다.
본 발명에 참고로 인용되어 있는 국제 특허 출원 제 PCT/AU95/00350(WO 95/34595) 및 PCT/AU99/00763(WO 00/15240)은 새로운 부류의 다가 제제- 다음이온성(polyanionic) 또는 양이온성 표면 그룹의 명백한 피막(envelope)을 갖는 고분기된(highly branched)고분자이며 최소의 독성하에 일정 범위의 항바이러스및 항미생 물 활성을 나타내는 덴드리머(dendrimers)에 대해 기술하고 있다. 대부분 항바이러스제의 소분자 구조와 달리, 상기 덴드리머는 3차원의 고질서 중합체 화합물을 형성하도록 코어 분자에서 시작하여 연속되는 층 또는 단계가 연속되는 "세대(generations)"에 추가되는 반복 반응 서열에 의해 형성되는 다가의 고분기된 고분자 화합물류이다. 덴드리머는 다음의 특징을 갖는다: i. 하나 이상의 활성점을 가질 수 있으며 점-같거나 상당한 크기를 가짐으로서 덴드리머의 최종 위상을 가능케 하는 초기 코어; ii. 상기 초기 코어에 부착되는 분기된 반복 단위층; iii. 선택적인 연결 그룹에 의해 덴드리머의 표면에 부착되는 기능성 말단기(예를 들면 음이온 또는 양이온 함유부).
상기 고분자 화합물은 다수의 가지 또는 나무-같은 구조를 갖는 단량체 구성단위로 부터 합성되며, 분자의 외부 표면은 생체내 수용체에 의해 인식되도록 하는 다수의 기능기를 보유한다.
덴드리머의 제법은 공지 되었으며, 미국 특허 제4,507,466호, 제4,559,120호, 제4,568,737호, 및 제4,587,329호(폴리아미도아민을 포함하는 다른 유닛을 기본으로 하는 덴드리머 또는 PAMAM덴드리머를 기술함)뿐 아니라 미국 특허 제4, 289,827호 및 제4,410,688호(라이신유닛을 기본으로 하는 덴드리머를 기술함)의 실시예에 기술되어 있다.
항바이러스 및 항미생물 시험시에, 상기 덴드리머 구조의 일부분이 성전이 질환과 관련된 넓은 범위의 미생물에 대하여 예기치 않은 특별한 활성을 보여 주었고, 이로 인해 성전이질환의 예방 및 치료용 질 또는 직장내 살균제의 개발을 위 한 선택제제가 되었다.
발명의 요약
본 발명에 따르면, 하기식 I, II 또는 III의 화합물: 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
Figure 112003036561615-pct00001
Figure 112003036561615-pct00002
Figure 112003036561615-pct00003
상기식에서, R은 하기식 IV 그룹을 나타낸다.
Figure 112008035715137-pct00008
적당한 약학적 허용 가능 염기 부가 염은; 금속염, 예를 들면, 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 및 아연염, 유기아민, 예를 들면, N'N-디벤질-에틸렌디아민, 클로로프로카인(chloroprocaine), 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 디시클로헥실아민, 메글루민(N-메틸글루카민)및 프로카인(procaine), 사차아민, 예를 들면, 콜린, 및 설포늄, 및 포스포늄염으로 제조되는 유기염으로 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
특히 바람직한 본 발명의 화합물은 본 명세서에 SPL-7013, SPL-7304, 및 SPL-7320 로 언급되며, 이들 구조는 각각 폴리라이신 덴드리머, 폴리아미도아민(PAMAM) 덴드리머, 및 폴리프로필레니민덴드리머골격과, 나트륨 염으로서 32 나프틸 디설폰산 그룹으로 구성된 표면 활성기로 이루어진 구조를 갖는다. 각각의 나프틸-디설포네이트 표면 기능기는 분기된 덴드리머 골격에 부착되며, 32 말단기에 아미도-메틸렌옥시 결합을 갖는다.
본 발명은 또한 인간 환자의 성전이 질병의 예방및 치료 요법을 위한 국소용 약학 조성물을 제공하는데, 이는 상기 화학식 I, II, 또는 III의 화합물, 또는 그의 약학적 허용 염을, 하나 이상의 약학적 허용가능한 국소용 담체 또는 희석제와 함께 포함한다.
다른 면으로는, 본 발명은 인간 환자의 성전이 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하며, 이는유효량의 상기 화합물 I, II, 또는 III또는 이들의 약학적 허용염을 국소 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 환자의 성전이 질병의 예방 또는 치료시 국소투여를 위한 약물의 제조에 상기 화합물 I, II, 또는 III, 또는 이들의 약학적 허용염을 사용하는 것에 관한 것이다.
화학식 I, II 및 III의 화합물, 및 이들의 약학적 허용 가능염은 성전이 질병과 관계된 넓은 범위의 병원체에 대해 기대하지 않은 특별한 활성을 보여주는 신규의 화합물이다.
전술한 바와 같이, 화합물 SPL-7013, SPL-7304, 및 SPL-7320은 본 발명의 바람직한 화합물이며, 특히 가장 일반적인 성전이 질병의 바이러스 및 미생물 매체에 대응하여 상당한 항바이러스 활성을 나타내었다.
SPL-7013은 몇가지 가장 중요한 질내 또는 직장내 성전이 질병의 매체에 대하여 고효율 및 낮은 세포 또는 동물 독성을 갖는 넓은 범위의 항바이러스활성을 나타낸다.고활성은 생식기의 허피스바이러스-2(HSV-2)에 대하여 시험관내 세포시험 및 동물(쥐)의 생체내 시험과 허피스 바이러스-1(HSV-1)및 인간면역결핍 바이러스 (HIV-1, 및 HIV-2)의 시험관내 세포시험에서 입증되었다. 이것은 또한 생식기 우췌의 원인 인자, 인간 유두종바이러스(HPV)에 대하여, 및 비-특이성 요도염, 트라코마 클라미디아 에 대하여 활성이 있는 것으로 나타났다. 셀 시험에서, SPL-7013은 최근 사용되는 개선된 뉴클레오사이드계 항바이러스제에 내성이 잇는 허피스 바이러스-2의 바이러스 균주에 대해 활성을 보여 주었다. 추가로, SPL-7304및 SPL-7320은 HSV-1, HSV-2, HIV-1, 및 HIV-2에 대해 높은 활성을 보여준다. 또한, SPL-7013, SPL-7304, 및 SPL-7320은 CD4-의존성 및 CD4-독립성 HIV-1전이 분석 시험에서 활성적이었으며, HIV-1의 부착 및 융합을 예방하는데 효과적이다.모든 화합물은 유익한 여러 종의 유산균의 성장을 저해하지 않는 것으로 나타났다. 부가하여, SPL-7013, SPL-7304, 및 SPL-7320은 인간 말초 혈액 단안세포(PBMCs)가 HIV-1 RoJo 또는 SIV 89.6pd로 감염되는 것을 예방하는데 효과적이다.
따라서, 본 화합물들은 질 또는 직장 점막에 적용하여 성전이 감염으로 부터 보호하도록 의도된 국소 살균제로서 성전이 질병의 예방 및 치료에 유용하다.
본 발명은 또한 인간 환자의 성전이 질병을 예방 및 치료하기위하여 상기한 화학식의 화합물 I, II 또는 III와 그 염을, 하나 이상의 약학적 허용가능한 국소용 담체 또는 희석제와 함께 포함한다.
이러한 조성물의 제법은 당 분야의 기술자에게 잘 알려져 있다.적절한 약학적 허용 담체 및/또는 희석제는 일부 또는 모든 통상적 용매, 분산 매질, 부형제, 고형 담체, 수성 용액, 피복제, 항 박테리아 및 항진균제, 등장제, 및 흡수 증가 또는 지연제, 활성 증가 또는 지연제등을 포함한다. 약학 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 이 분야에 공지 되어 있고, 미국 펜실베니아주, 맥 출판사의 레밍톤의 의약 과학(Remington's Pharmceutical Sciences) 18판에 실시예로 기재되어 있다.어떤 통상의 담체 및/도는 희석제가 활성 성분과 배합금기인 경우를 제외하고는 본 발명의 약학 조성물 내에 이들이 사용되는 것으로 고려된다.항바이러스 및 항미생물 활성을 갖는 제제를 포함하는 추가의 활성성분 또한 본 발명의 조성물에 혼입될 수 있다.
투약을 쉽게 하고 투여량을 균알하게 하기 위해 조성물을 투여량 단위 형태로 조제 하는 것이 특히 바람직하다. 여기에서 투여량 단위 형태란 치료되는 인간 주체의 단위 투여량으로 적합한 물리적 분리 단위를 말한다.본 발명의 신규의 투여 단위형태의 구체사항은 (a) 활성성분의 독특한 특성 및 얻어지는 특별한 치료 효과, 및 (b)특정 치료용 활성 성분 같은 조제법 고유의 제한점에 따라 좌우된다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 또한 유효량의 상기 화합물 I, II 또는 III 또는 이들의 약학적 허용염을 국소 투여함으로서 인간 환자의 성전이 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.추가로, 본 발명은 인간 환자의 성전이 질병의 예방 또는 치료시 국소투여를 위한 약물의 제조에 상기 화합물 I, II 또는 III 또는이들의 약학적 허용염을 사용하는 것에 관한 것이다.
다양한 국소 투여 경로가 가능하다. 물론, 선택되는 특정한 형태는 치료시의 특정 조건 및 예방 및 치료 효과에 필요한 투여량에 따라 달라진다. 일반적으로 말해서, 본 발명의 방법은 의학적으로 가능한 어떤 투여 형태 즉, 임상적으로 수용되지 않는 부작용을 일으키지 않고 본 발명 활성 성분의 예방 및 치료 수준을 나타낼 수 있는 어떤 형태를 사용해서도 실행될 수 있다. 이러한 투여 형태는 질, 직장, 및 경피 경로를 포함한다. 특히 질 또는 직장의 국소 투여를 위한 적당한 조제법은 좌약 및 미소 캡슐화된 현탁액 같은 개별 단위 뿐만 아니라 용액, 현탁액, 겔, 로숀, 및 크림을 포함한다. 다른 전달 체계로는 서방성 겔, 크림, 좌약 또는 캡슐을 포함하여 본 발명의 활성 성분을 서서히 방출시키는 서방성 전달 체계를 포함한다. 여러 형태의 서방성 전달 체계가 가능하다. 이들은, (a) 활성 성분이 기질내에 함유되는 침식성 체계, (b) 활성 성분이 중합체를 통해서 제어된 속도로 침투하는 분산 체계를 포함하는데, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 활성 성분은 예방 또는 치료적 유효량으로 투여된다. 예방 또는 치료적 유효량이란 적어도 부분적으로 원하는 효과를 얻을 수 있거나 치료될 특정 상태의 시작을 지연시키거나 진행을 막거나 시작 또는 진행 모두를 중단 시키는 데 필요한 양을 의미한다. 이러한 양은 물론 치료되는 특정 상태, 상태의 심한 정도, 및 나이, 신체 조건, 크기, 몸무게 및 병행 치료를 포함한 환자의 개인 인자에 따라 달라진다.이들 요소들은 당업자에게 공지되어 있으며, 일상 실험 정도로 제시될 수 있다. 일반적으로 최대 투여량, 즉, 건전한 의학적 판단에 따른 최대 유효 투여량이 사용되는 것이 바람직하다. 그러나, 의학적 이유, 정신적 이유, 또는 실제적인 어떤 다른 이유로 더 적은 투여량 또는 내성의(tolerable)투여량도 투약 될 수 있음은 당업자에게 이해될 것이다.
일반적으로, 병원체 상태의 예방 또는 치료에 의해 결정되는 간격에서, 질내- 또는 직장내- 유효 성분 투여량은 하루 약 0.01 mg/kg 내지 하루 약 1000mg/kg 이다. 초기에는 적은 투여량(0.01-1 mg)이 투여되고, 점차 하루 1000mg/kg 까지 증가 될 수 있다. 이러한 투여량으로 환자 주체의 반응이 충분하지 않을 경우에는 더 많은 투여량 (또는 좀더 국소화된 다른 경로를 통함으로서 효과 상 더 많은 투여량)도 환자의 내성이 허락하는 한 사용될 수 있다. 화합물의 적절한 체계적 수준을 얻기 위해 하루에 복수의 투여량도 고려할 수 있다.
본 명세서와 하기 특허 청구범위에 걸쳐, 내용상 다른 것을 필요로 하지 않는다면, "포함한다(comprise)"는 단어 또는 "포함하다" 또는 "포함하는"같은 변형어는 언급된 단계 또는 단계들 또는 정수 또는 그룹의 정수들을 포함함을 의미하나 다른 단계 또는 단계들 또는 정수 또는 그룹의 정수들을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 다른 특성들은 하기 실시예에 의해 분명해 질 것이나 본 발명을 설명하는 범주이고 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
A. BHAlyslys 2 lys 4 lys 8 lys 16 TFA 32 의 제조
1. N, N'-Di-t-Boc-L-Lysine(DBL)
L-Lysine.HCL(1.83kg; 10mol)을 물(20l)중 수산화나트륨(880g; 22mol)용액 에 녹이고 얻은 용액을 t-부탄올(15l)로 희석시켰다. 다음 디-t-부틸 디카보네이트(4.48kg; 20.5mol)를 1 시간동안 적하하여 첨가시켰고 이 시간동안 반응 혼합물이 미온(30-35℃)의 우유빛이 되었다. 이 혼합물을 밤새 교반시켜 맑은 용액을 산출했다. 이 용액을 석유(40-60℃)(2X10l)로 추출하고 그 유기상을 포화 NaHCO3 용액(3X4l)으로 추출했다.결합된 수성 층들을 얼음 베스에서 냉각시키고 1M KHSO4 용액으로 조심스럽게 pH2까지 산성화시켰다. 다음 이 탁한 혼합물을 에테르(4X16l)로 추출하고 결합된 유기층들을 물(2X8l)로 세척하고, 건조(MgSO4)시키고, 30℃ 미만의 베스 온도로 농축시켜 높은 점성의 오일로서 N, N'-Di-t-Boc-L-Lysine 의 정량적 산출물을 얻었다.
2. N, N'-Di-t--Boc-L-Lysine 4-니트로페닐 에스테르(DBLONp)
에틸 아세테이트(5l)중의 디시클로헥실카보디이미드(DDC)(2.06kg; 10mol) 용액을 질소 존재하에 에틸 아세테이트(15l) 내의 Di-t-Boc-L-lysine(DBL)(3.46kg;
10mol) 및 4-니트로페놀(NpOH)(1.39kg: 10mol) 얼음 온도 교반 용액에 적하하여 첨가시켰다. 첨가가 완료된 후 혼합물을 실온으로 따뜻하게 하고 밤새 교반시켰다.형성된 흰색 현탁액을 여과시키고 여과물을 농축시켜 황색빛의 고형 잔류물을 얻었다. 잔류물을 에테르로 부터 재결정화시켜, 흰색 고형의 N-N'-di-t-Boc-L-lysine 4-니트로페닐 에스테르(수율 약 60%)를 얻었다. 더 많은 산출물이 이 후에 모용액으로 부터 분리 될 수 있다.
3. BHAlys.2HCl
건조 디클로로메탄(200ml)내의 DCC(41.2g; 0.2mol)을 디클로로메탄(600ml)내의 DBL(69.2g; 0.2mol) 및 벤즈히드릴아민(BHA)(36.65g; 0.2mol)얼음 온도 용액에 첨가시켰다.이 혼합물을 0℃에서 30분간 교반시키고 이어서 실온에서 3시간동안 교반시켰다.생성된 현탁액을 여과시켰고 여과물의 tlc(pet.ether/EtOAc, 9:1)는 개시 물질을 보이지 않았다. 여과물을 5% HCI, 물, 포화 NaHCO3 및 물을 씻고 다음 건조(MgSO4)시키고, 농축시켜 기포체를 얻었다
트리플루오로아세트산(TFA)(400㎖)을 건조 디클로로메탄(200㎖)내의 교반된 기포체 용액에 첨가하였다. 초기에 격렬한 가스 분출이 있었고 약 15분 후 멈췄다. Tlc(EtOAc)는 개시물질을 보이지 않았다.용액을 2시간 동안 추가 교반한 후 농축 시켜 황색유를 얻었다. 이 오일은 건조 아세토니트릴(600㎖)에 용해시키고 무수 에탄올(약 300㎖)에 용해된 HCL가스의 포화 용액을 교반하면서 첨가시켰다. 곧 흰색 고형물이 결정화하기 시작하였고 혼합물을 실온에 1시간 방치하여 결정화를 완결시켰다. 혼합물을 여과 시키고 고형물을 건조 아세트니트릴로 씻은 후 건조시켜 BHAlys.2HCl의 흰색 분말을 얻었다(수율 약 80%).
4. BHAlyslys 2 Boc 4
트리에틸아민(39.5㎖;0.283mol)을 건조DMF(300㎖)내의 BHAlys.2HCl (54.4g;0.14mol)의 교반용액에 첨가시켰다. DBLONp(262g;0.56mol)을 첨가시켜 15분 교반하여 흰색 현탁액을 형성시켰다. 혼합물은 즉시 황색이 되고 트리에틸아민을 첨가하여 pH를 8-9로 유지하면서 3시간 동안 교반하였다. 반응화합물을 격렬하게 교반되는 많은 용량의 물에 천천히 부가시키고 혼합물을 밤새 교반하였다. 여과시켜 침전물을 얻고 물로 세척하고(3회) 건조시켜 황색 고형물을 얻었다. 이 고형물을 분말화하고 수성 NaOH로 처리할 때 에테르가 황색을 보이지 않을 때까지 에테르로 연속 세척하였다. 남든 고형물을 건조 시켜 흰색분말의 BHAlyslys2Boc4를 얻었다(수율 약70%).
5. BHAlyslys 2 lys 4 Boc 8
트리플루오로아세트산(600㎖)을 건조 디클로로메탄(600㎖)내의 BHAlyslys2Boc4 (446g;0.12mol) 용액에 첨가시켰고 즉식 격렬한 가스 분출이 있었다. 용액을 2시간 교반하고 농축시켜 점성오일을 얻었다. 이 오일을 건조 DMF(500㎖)에 용해시키고 트리에틸아민으로 pH를 8-9로 조절하였다. 다음 DBLONp(460g;0.99mol)를 첨가하고 트리에틸아민으로 pH가 8이상 되도록 주기적으로 조절하면서 실온에서 2일간 교반시켰다. 이어 반응물이 물내에 침전되고 전술한 작업 후 흰색 분말의 BHAlyslys2lys4Boc8를 얻었다(수율 약100%).
6. BHAlyslys 2 lys 4 lys 8 Boc 16
건조 디클로로메탄(1l) BHAlyslys2lys4Boc8(200g;0.106mol) 용액에 트리플루오로아세트산(1l)을 첨가시켰고 즉식 격렬한 가스 분출이 있었다. 용액을 2시간 교반하고 농축시켜 점성오일을 얻었다. 이 오일을 건조 DMF에 용해시키고 트리에틸아민으로 pH를 8-9로 조절하였다. 다음 DBLONp(782g;1.67mol)를 첨가하고 황색용액을 트리에틸아민으로 pH가 8이상 되도록 주기적으로 조절하면서 실온에서 2일간 교반시켰다. 이어 반응물이 물내에 침전되고 전술한 작업 후 흰색 분말의 BHAlyslys2lys4lys8Boc16를 얻었다(수율 약100%).
7. BHAlyslys 2 lys 4 lys 8 lys 16 Boc 32
건조 디클로로메탄(800㎖)내의 BHAlyslys2lys4lys8Boc16(300g;0.081mol) 혼합 물에 트리플루오로아세트산(1.6l)을 첨가시켰 즉시 격렬한 가스 분출이 있었다.용액을 2시간 교반하고 농축시켜 점성오일을 얻었다. 이 오일을 건조 DMF(1.2l)에 용해시키고 트리에틸아민으로 pH를 8-9로 조절하였다. 다음 DBLONp(1030g;2.21mol)를 첨가하고 트리에틸아민으로 pH가 8이상 되도록 주기적으로 조절하면서 황색 용액을 2일간 교반시켰다. 이어 반응물이 물내에 침전되고 전술한 작업 후 흰색 분말의 BHAlyslys2lys4lys8lys16Boc32를 얻었다(수율 약100%).
8. BHAlyslys 2 lys 4 lys 8 lys 16 TFA 32
플리플루오로아세트산(168㎖)를 디클로로메탄(350㎖)내의 t-부틸옥시카보네이트(Boc)보호된 폴리라이신 코어 BHAlyslys2lys4lys8lys16Boc 32 (20g)현탁액에 일부로 첨가하고 반응물을 주변온도에서 14시간 교반하였다. 반응 혼합물을 진공에서 농축 시키고 H2O(200㎖)에 용해 시키고 냉동건조시켜 회백색의 BHAlyslys2lys4lys8lys16TFA32(17.5g, 83%)를 얻었다.
B. SPL 7013의 제조
(ⅰ) 디소디움-[1-(옥시메틸렌-카르복시에틸)-3, 6-나프탈렌-디설포네이트]
디소디움 1-히드록시-3, 6-나프탈렌-디설포네이트(100g)을 디메틸 설폭사이드(250㎖)에 녹이고 디이소프로필에틸아민(60㎖)를 일부에 첨가하였다. 에틸브로모아세테이트(38㎖)를 30분 동안 첨가하고 습기배제 상태의 주변온도하에 반응물을 14시간 교반하였다. 반응물을 에틸아세테이트(2L)에 천천히 부어 오일성의 잔류물/검을 산출하였다. 상층액을 따라 내고 추가의 에틸아세테이트(1.5L)를 첨가하였다. 잔류물 몇단계 분쇄후 아세톤으로 씻어 갈색 고형물인 디소디움-[1-(옥시메틸렌-카르복시에틸)-3, 6-나프탈렌-디설포네이트] (97g, 78%)를 얻었다.
(ⅱ) 1-(옥시메틸렌-카르복시)-3, 6-나프탈렌-디설폰산
수성 NaOH (134㎖)를 물 500㎖내의 디소디움-[1-(옥시메틸렌-카르복시에틸)-3, 6-나프탈렌-디설포네이트]용액(97g)에 일부로 첨가하였다. 반응물을 주변온도에서 14시간 교반하고 IR120(산성형)칼럼을 통과 시켰다. 수득된 부분을 냉동 건조시켜 갈색 고형물인 1-(옥시메틸렌-카르복시)-3, 6-나프탈렌-디설폰산 (67g, 83%)를 얻었다.
ⅲ) BHAlyslys 2 lys 4 lys 8 lys1 6 [NH-CO-CH 2 O-3, 6-나프틸-(SO 3 Na) 2 ] 32 -SPL 7013
1-(옥시메틸렌-카르복실)-3, 6-나프탈렌-디설폰산(47.85g)을DMF(500㎖)에 용해시키고 디이소프로필에틸아민(115㎖)를 일부 첨가하였다. 다음 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP;72g)을 DMF(650㎖)내의 BHAlyslys2lys4lys8lys16TFA32(15.95g) 용액에 일부 가하여 제조된 용액에 이 용액을 첨가하였다. DMF(100㎖)는 적하깔대기를 씻는데 사용되었다. 반응물을 주변온도에서 14시간 교반한 다음 물 (10L)로 희석시켰다. 용액을 1 마이크론 두께의 필터를 통하고 14kD막을 포함한 Pall Filton장치(Pall Gelman)를 관통하여 펌핑하였다. 생성된 용액을 IR 120(나트륨형) 컬럼을 통과시키고, 0.22 마이크론 두께의 필터를 통해 펌핑한 후 냉동건조시켜 회백색의 고형물인 SPL-7013을 얻었다.(수율 75%). 검출파장 240nm로 30℃에서 ODS-EC 15㎝×4.6㎜ HPLC컬럼상에 보존시간은 15분이 었다. 샘플은 하기의 점진적 용출로써 분당 1㎖의 유속으로 용출시켰다:
시간 분 %A %B
0 90 10
2 90 10
20 10 90
30 10 90
31 90 10

상기표에서 용매A는 0.1M NH4OAc(pH7.0) 내의 0.015M TBAH 이고 용매B는 MeOH내의 0.015M TBAH이다.
SPL7013의 질량 스펙트럼 분석에서 분자량이 16,580±2 Dalton인 것으로 나타났다. 분자식 C583H577N63Na64O287S64의 SPL7013에 의해 기대되는 기대평균분자량은 16581.53이다.
C. SPL 7304의 제조
비슷한 방법으로 1-(옥시메틸렌-카르복시)-3, 6-나프탈렌-디설폰산과 폴리아미도아민(PAMAM)덴드리머, 3세대 (오스트레일리아, sigma-Aldrich Pty사, StarburstR)와의 PyBOP커플링에 의해 SPL7304를 제조하였다.
D. SPL 7320의 제조
비슷한 방법으로 1-(옥시메틸렌-카르복시)-3, 6-나프탈렌-디설폰산과 플리프 로틸레니민 도트리아콘타아민, 제4세대 (DAB-Am-32, 오스트레일리아, sigma-A;drich Pty사)와의 PyBSP커플링에 의해 SPL7320를 제조하였다.
실시예 2
SPL7013, SPL7034, 및 SPL 7320의 생리활성
A. 인간 면역결핍 바이러스에 대한 활성
사용된 인간 면역결핍 바이러스 균주는 HIV-1(ⅢB)1및 HIV-2(ROD)2 였다, 항-레트로바이러스 활성 및 세포독성을 동시에 측정하였다. HIV로 감염되고 다양한 농도의 시험화합물에 노출된 MT-4세포의 생존도를 기초로 하였다. MT-4세포를 5일동안 증식시키고 생존세포의 수를 96-웰 미세트레이 내에서 테트라졸리움-계 비색계의 3-(4, 5-디메틸티아졸-2-일)-2, 5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT)공정으로 측량하였다3.
모든 분석시험에서, 바이러스 유입(바이러스 감염다중도(viral multiplicity of infection, MOI)은 50% 세포배양 감염 투여량(CCID50)의 0.01, 또는 100배였다. 50% 항바이러스 억제농도(EC50)는 바이러스 세포 변성에 대응하여 바이러스 감염된 세포의 50%를 보호하는데 필요한 화합물 농도로 정의된다. 50% 세포독성 농도(CC50)는 모의-감염 세포의 생존율을 50%까지 감소시키는데 필요한 화합물 농도로 정의된다. 기호 ＞는 화합물을 시험하여 여전히 비-세포독성을 갖는 최고농도를 가리키는데 사용된다. 몇번의 개별 시험에서 평균 EC50 및 CC50값이 상기 정의한 대로 제시된다. 규칙적으로, 개별값은 EC50 및 CC50값의 2배 이상 또는 이하로 벗어나지 않았다. SI는 항바이러스 선택지수 CC50/EC50이다.
HIV의 활성
화합물 특징 EC50㎍/㎖ EC90㎍/㎖ CC50㎍/㎖ SI
SPL-7013 ⅢB 0.45 0.954 ＞125 ＞280
ROD 3.26 4.86 ＞50 ＞17
SPL-7304 ⅢB 0.15 ＞88 ＞652
ROD 0.8 ＞50 ＞63
SPL-7320 ⅢB 0.164 ＞88 ＞537
ROD 1.153 ＞50 ＞47
III=HIV-1 ROD=HIV-2
EC90=바이러스 플라크를 90%감소시키는 유효농도
(ⅰ) CD4-의존성 및 CD4독립성 HIV전이억제 분석시험, HIV부착 및 융합, 및 유산균 SP. 성장 억제
세포 및 바이러스:
HIV-1 ⅢB및 HeLa CD4LTR β-gal, GHOST X4/R5, 및 HL 2/3 세포라인은 NIH의 AIDS Research and Reagent Program(메릴렌드주, 베데스다)에서 얻어 제안된대로 보관시켰다. ME180 세포는 American Type Cultcre Collection(버지니아주, 마나사스)에서 얻었다.
시험물질 관리 및 보관:
제공자에 의해 대체용 용매나 보관조건에 대해 다른 명시가 없는한 화합물을 통상적으로 100% MDSO내에 용해시키고 시험시까지 -80℃로 저장시켰다. 냉동된 저장물은 실온에서 해동시키고, 37℃에서 15분간 예비 보온후 조직 배양배지 내에서 시험용액의 제조전에 회전시켰다. 화합물 희석 및 취급의 모든 단계중에 불투명한 덮개를 사용하고, 불투명하거나 호박색의 조직배양 플라스틱을 사용함으로써 화합물을 우발적인 빛으로부터 보호하였다. 추가로 방 및 층류흐름 조직배양 후드에 대한 우발적 빛노출은 전체 실험실내 형광빛을 50% 감소시킴으로써 조절하였다. 최종 DMSO농도는 최고시험 농도에서 0.25%이다.
CD4-독립성 HIV전이억제 분석시험:
ME180 셀, CD4음성, X4양성 경부 상피세포계를 10% 소태아 혈청, 글루타민 및 항생제 보충된 RPM1 1640에 유지시킨다. 분석시험 24시간 전에 ME180셀을 웰당 2X103셀의 농도로 트립소나이징하고 세척하고 평평한 바닥의 마이크로타이터 플레이트내에 웰당 2X103 셀의 밀도로 접종한다. 분석시험일에, HIV-1(H9-SK1)의 SK1 임상 분리물로 만성감염된 H9셀을 새로 제조된 마이토마이신 C(200㎍/㎖)로 37℃에서 60분간 처리한다. 마이토마이신 C의 농도는 셀죽음을 가져오기에 충분하나 바이러스 전이를 가져온다. 마이토마이신 C처리후 H9-SK1을 조직 배양배지로 세번 씻는다. 시험화합물은 ME180 단일층에 가해지고 이어 2×104 H9-SK1 셀이 부가된다. ME180 셀은 H9-SK-1셀 및 시험물질과 함께 4시간동안 공-배양되고 ME180 단일층을 PBS로 세번 세척함으로써 H9-SK1셀을 제거 한다. 분석시험 개시후 24시간 및 48시간에 웰을 PBS로 세번 세척하여 H9-SK1셀을 확실히 제거하고 시험물질 없는 배양액 내에서 배양을 지속시킨다. 공-배양후 6일에, 상층액을 수집하여 ELISA에 의해 p24항원 발현을 측정한다. 세포 생존율을 XTT색소 환원 시험으로 측정한다. 첫번 시험에 활성 인 것으로 판단되는 화합물은 점액소의 추가가 있거나 없는 상태에서 재시험한다. 점액소가 있는 상태에서의 시험은 200㎍/㎖의 돼지점액소(미주리주, 세인트루이스, Sigma Chemocal사)를 전이반응에 첨가시킴으로서 수행된다. 점액소 또는 화합물의 치환없이 전이 간격이나 세척을 전술한대로 수행한다. 모든 결정은 시험물질의 시리얼 1/2Log10 희석물로 3중으로 수행된다.
CD4-의존성 HIV전이 억제 분석시험:
CD4-의존성 HIV전이 억제 분석시험은 CD4양성 GHOST(3)X4/R5세포계를 사용하는 것을 제외하고는 CD4-독립성 전이 분석시험에서 기술한 대로 수행된다. 세포계는 HIV코어셉터 및 CD4발현에 음성인 HOS(human osteosarcoma)세포계에서 유래된다. 세포계는 비-선택성 역바이러스 벡터와 HIV-2 LTR hGFP 콘스트럭트와 마이그로마이신 선택성 마커를 통하여 T4(CD4), R5및 X4를 발현하도록 설계된다. 분석시험에서 2.5×104GHOST(3)X4/R5 및 5×102 마이토마이신C 처리된 H9/SK-1셀을 사용하는 것을 제외하고는, 세포계는 CD4-독립성 HIV 억제 분석시험에서 기술한 바와같이 처리되고 배양된다. 화합물의 부가, 마이토마이신C처리 및 H9/SK-1 셀을 제거하기 위한 전이 후 세척은 두 항바이러스 분석시험의 비교를 위해 전술한 대로 수행한다. 바이러스 복제는 CD4 존재하의 단일라운드 감염을 확실히 하기위해 감염 후 24시간에 3번의 세척후에, ELISA에 의한 셀-연합된 p24의 측정함으로 평가한다. 화합물 특성 및 셀 생존율은 색소환원 시험으로 측정된다. 첫번시험에서 활성으로 판단된 화합물은 점액소가 있거나 또는 없는 상태에서 재시험된다. 점액소 존재하의 시험 은 조직배양배지내의 200㎍/㎖의 돼지 점액소(미주리주, 세인트 루이스 , Sigma Chemical사)를 전이 반응에 부가함으로써 수행된다. 점액소 또는 화합물의 치환없이 전이 간격이나 세척을 전술한 대로 수행한다. 모든 결정은 시험물질의 시리얼 1/2Log10으로 3중으로 수행된다.
유산균 분석시험:
Lactobacillus crispatus 및 Lactobacillus jensenii를 American Type Tissue Culture Collection 에서 수득하여 Lactobacilli MRS broth (펜실베니아주, 피츠버그, Fisher Scientific, Difco)에서 증식시켰다. 이 배지는 혐기성 조건하에 Lactobacilli를 효과적으로 증식시킨다. 감수성 분석시험을 위해 간균스톡을 생성시키고 15% 글리세롤내에서 -80℃로 냉각시킨다. L.crispatus 및 L.jensenii성장에 대한 화합물의 효과를 측정하기 위해, 10㎖의 MRS배지를 글리세롤 박테리아스톡으로부터 천자로 접종 시킨다. 배양물을 Gas Pak CO2백에 넣고 37℃에서 24시간동안 보온시킨다. 다음날 유산균 배양물을 670nm의 파장에서 0.06의 OD로 희석시킨다. 화합물은 희석되고 96웰 평저 플레이트내에 배치하고 Lactobacillus sp.를 가한다. 정제어로서 시판용 페니실린/스트렙토마이신 각각 1.25U/㎖ 및 1.25㎍/㎖의 높은 시험농도로 사용된다. 플레이트는 Gas Pak CO2백 내에서 37℃에서 24시간동안 보온되고 분자기기 플레이트 분석기로 490nm에서 광학밀도를 측정함으로써 박테리아 성장을 결정한다. 모든 결정은 높은 시험농도로부터 6½log 희석으로 3중으로 수행된다.
바이러스 부착 분석시험:
이 분석시험은 셀과 반응하고 바이러스 부착을 막는 화합물, 및/또는 부착/융합 복합체의 형성에 작용하는 화합물을 검색하기 위한 것이다. 부착 분석시험은 HeLa CD4 LTR β-gal셀은 필요한 선택성 항생물질로 통상적으로 배양된다. 분석시험의 24시간 전에 셀을 트립신 처리 및 계수하고 1×104셀을 배지내의 0.2㎝웰에 넣는다. 24시간에 배지는 제거되고 배지내의 화합물이 셀상에 배치되고 37℃에서 15분간 보온된다. 다음 공지된 HIV ⅢB균주의 타이터를 웰에 가하고 1시간동안 계속 보온한다. 보온 후 웰을 배지로 3번 세척하고 40내지 48시간동안 배양을 계속한다. 분석시험 끝에 배지는 제거되고 셀을 분해시키고 β-갈락토시다아제 효소활성을 검색하기 위해 단일 용액을 사용하는 단일 단계 화학발광법에 따라 제조사 (메사츄세츠주, 베드포드소재 Tropix Gal-screenTM)의 지시에 의한 화학 발광에 의해 β-갈락토시다아제 효소발현이 결정된다. 화합물 독성은 XTT색소환원 시험으로 시스터 플레이트 내에서 점검된다. 모든 결정은 시험물질의 시리얼 ½Log10 희석물로 3중으로 수행된다. 1시간의 바이러스 흡착간격은 충분히 짧아서, 활성 트리-포스페이트 형(AZT-TTP)로 포스포릴레이션이 필요한 AZT는 분석시험중에 활성이 아니다.
융합 분석시험:
융합 분석시험은 별도의 셀에 발현된 CD4및 HIV-1 Env에 의해 매개된 셀-셀 융합을 막는 화합물의 능력을 측정한다. 이 분석시험은 gp120/CD4 상호작용의 저해 물질 및 X4 코어셉터의 저해물질에 모두 민감하다. 먼저, 5×103 HeLa CD4 LTR β-gal셀을 마이크로타이터 웰에 넣고 밤새 보온 시킨다. 다음날 배지를 제거하고 HeLA CD4 LTR β-gal 셀을 새로운 배지에서 시험화합물과 함께 37℃로 1시간 보온 시킨다. 보온 후 5×103 HL⅔이 추가되고 다음 40 내지 48시간 보온을 계속한다. 40내지 48시간에 화학발광법(메사츄세츠주, 베드포드, Trapix 소재 Tropix Gal-screenTM)에 의해 β-갈락토시다아제 효소 발현이 결정된다. 화합물 독성은 XTT 색소환원법에 의해 시스터 플레이트에서 점검된다. 모든 결정은 시험물질의 시리얼 ½Log10 희석으로 3중으로 수행된다.
P24 항원 ELISA:
ELISA키트는 Coulter Electronics에서 구입되며, 상청액 및 셀-연합 p24 항원의 검출은 제조사의 지시에 따라 수행된다. 셀-연합 p24의 경우, 셀 용해물은 25내지 50㎕의 CouHer제공의 바이러스 용해 완충액 내의 웰 내용물의 분해에 의해 생성되며, 1회의 냉동/해동 후에 분석시험한다. 연속범위의 표준 p24항원 커브내의 흡광도를 확인하기 위해 모든 p24결정은 샘플의 시리얼 희석후에 제공된다. 분자기기 Vmax 플레이트 분석기를 사용하여 450㎚에서 분광분석에 의해 데이타가 얻어진다. 최종 농도는 분자기기 Soft Max Software패키지를 사용하여 광학밀도로부터 계산하며 pg/㎖ p24항원으로 표시된다.
셀 생존율 및 화합물 세포독성율 측정을 위한 XTT염색법:
시험 물질의 TC50값은 바이러스 없이 셀 및 화합물을 함유하는 리플리케이트 마이크로타이터 플레이트 내의 테트라졸리움 색소 XTT(2, 3-비스(2-메톡스-4-니트로-5-셀포페틸)-5-[(페틸아미노)카르보닐]-2H-테트라졸리움 하이드록사이드의 환원을 측정함으로써 유도된다. XTT는 대사성 활성 셀 내에서 미토콘드리아 효소 NADPH산화제에 의해 용해성 포르마잔 생성물로 대사 됨으로써 셀 생존율 및 화합물 세포독성도의 신속한 정략 분석을 가능케 한다. XTT용액은 PBS내 1㎎/㎖의 스톡으로서 매일 제조된다. 페나진 메토설페이트(PMS)용액은 PBS내 15㎎/㎖로 제조되고 암실에 -20℃로 저장된다. XTT/PMS스톡은 PMS를 PBS로 1:100 희석시키고 XTT용액의 mL당 40㎕를 가함으로써 사용전에 즉시 제조된다. XTT/PMS 50마이크로리터를 플레이트의 각 웰에 가하고 플레이트를 37℃에서 4시간 보온한다. 4시간의 보온시간은 각 분석시험에 대해 규정된 셀의 수와 MTS색소 환원법의 연속적 반응 범위 내에서 경험적으로 결정되었다. 접착성 플레이트 뚜껑대신 봉함제를 사용하고, 봉함된 플레이트를 서너번 뒤집어 용해성 포르마잔 생성을 혼합하고 플레이트는 450㎚에서 분자기기 Vmax96웰 플레이트형 분광 판독기로 판독된다.
데이타 분석
CD4-의존성 및 CD4-독립성 HIV전이억제 분석시험에 대한 대조용 덱스트란 셀페이트 (양성) 및 덱스트란(음성)이 사용된다. 설폰산 염료가 부착 및 융합 분석시험4에 대한 정제어(positive control)로 사용된다. 시판용 페니실린(10, 000U/㎖) 스트렙토마이신 (10.0㎎/㎖)용액이 유산균 감수성 분석시험에 대한 정제어로 사용 된다. 각 화합물에 대해 적절하게 IC50(바이러스 복제 또는 전이를 50%까지 억제하는 농도), ID50(Lactobacilli의 50%성장을 억제하는 농도), TC50(세포 생존율을 50% 감소시키는 농도) 및 치료지수(TI: TC50/IC50 또는 ID50)은 연속 감소(regression)에의해 계산된다.
CD4-의존성 및 CD4-독립성 전이 분석시험
독립성 전이 분석시험 (㎍/ml) 의존성 전이 분석 시험(㎍/ml)
화합물 실시예.# 점액소 IC50 TC50 TI IC50 TC50 TI
덱스트란셀페이트 1 - 0.316 >100 >316
2 - 1.1 >50 >46 0.158 >50 >316
2 + 0.16 >50 >309 0.158 >50 >316
덱스트란 1 - >100 >100 -
2 - >100 >100 - >100 >100 -
2 + >100 >100 - >100 >100 -
SPL7013 1 - 0.76 >100 >132
2 - 28.5 >100 >3.5 0.39 >100 >256
2 + 1.1 >100 >90.9 0.49 >100 >205
SPL7304 1 - <0.3 >100 >316
2 - 5.0 >100 >20 089 >10 >112
2 + 2.8 >100 >36 0.65 >100 >153
SPL7320 1 - <0.3 >100 >316
2 - 0.8 >100 >125 0.68 >100 >147
2 + 0.8 >100 >125 1.15 >10 >87

Lactobacillus sp.시험결과
화합물 단위 L.crispatus(ID50) L jensenii (ID50) 비고
페니실린/ 스트렙토마이신 Dilution1 1:150, 00 1:180, 000 대조화합물
SPL7013 ㎍/㎖ >100 >100
SPL7304 ㎍/㎖ >100 >100
SPL7320 ㎍/㎖ >100 >100
1 페니실린 및 스트렙토마이신의 초기농도는 각각 1.25U/㎖ 및 1.25㎍/㎖ 이다.
부착 및 융합억제 분석시험 결과
부착 분석시험(㎍/㎖ s) 융합 분석시험(㎍/㎖
화합물 IC50 TC50 TI IC50 TC50 TI
Cicago Sky Blue 0.66 >10 >15 0.79 >10 >12
0.09 >10 >111 0.62 >10 >16
SPL7013 0.57 >100 >175 0.71 >100 >141
SPL7304 <0.32 >100 >312 <0.32 >100 >312
0.036 >1 >2778 0.56 >1 >178
SPL7320 <0.32 >100 >312 0.49 >100 >204
0.049 >1 >2041
ⅱ) HIV-1 RoJo 및 SIV 89.6pd에 대한 SPL 7013 , SPL 7304, 및 SPL7320의 활성 방법
바이러스
인간 면역결핍 바이러스형1(HIV-1)균주 RoJo는 Southern Research Institute(SRI)에서 유래된 낮은 계대 패디아트릭 분리물이다. SHIV89.6pd는 SRI의 Mark Lewis에서 얻고 스톡은 항바이러스 시험을 위해 인간 PBMC내에 증식되었다.
PBMC분리 및 블래스팅
말초성 혈액 단안성 셀(PBMCs)는 피콜 하이팩 그래디언트 분리에 의해 일반 간염 및 HIV-1 음성 공여균으로부터 얻었다. 간략히, 항-응고된 혈액을 Ca++ 및 Mg++없는 Dulbecco's포스페이트 완충된 식염수(PBS)로 1:1 희석시키고, 50㎖ 원심분리 튜브내에 Lymphocyte 분리배지 14 mL를 층화된 PBLs를 접척면으로부터 서서히 흡입시키고 계속하여 저속 원심분리에서 PBS로 2회 세척하였다. 단안성 셀을 계수하고, 생존율을 Trypan Blue 염료 압출에 의해 결정하고, 2㎍/mL 파이토 테마글루틴(PHA) 와 함께 15% FBA(열불활성), 2mM L-글루타민, 100U/mL 페니실린, 100㎍/mL 스트렙토마이신 및 10㎍/mL 젠타마이신이 부가된 RPMI 1640 배지내에 1×106 cells/mL로 재현탁 시켰다. 셀은 37℃, 5% CO2로 48내지 72시간 배양시켰다. 보온후, 원심분리로 셀을 수집하고, 세척하고, 15% FBS(열불활성), 2mM L-글루타민, 100U/mL 페니실린, 100㎍/mL 스트렙토마이신 및 10㎍/mL 젠타마이신이 20U/mL 재결합 IL-2(미테소타주, 미네아폴리스, R&D Systems)와 함께 부가된 RPMI에 재현탁 시켰다. IL-2는 PHA분열 유발자극에 의해 개시된 셀 분열을 유지하도록 배양배지에 추가 하였다. 셀은 72시간동안 IL-2내에서 배양되고 바이러스 첼린지에 사용되었다.
PBMC 분석시험
최초 2공여균으로부터 얻은 인간 말초성 혈액단안성 셀은 PHA 및 IL-2로 불래스팅되고, 계수되고, Trypan Blue 염류로 생존율이 결정되고 동일비로 혼합되었다. HIV 감염의 정량적 및 정성적 차이 및 기본 림포사이트 개체군의 PHA 및 IL-2에 대한 전반응에 대한 개별 공여균 사이의 생존율을 최소화 하도록 혼합된 공여균을 사용하였다. 셀은 15% Fetal Bovin Serum(열 불활성), 2mM L-글루타민, 100U/mL 페니실린, 100㎍/mL 스트렙토마이신, 10㎍/mL 젠타마이신이 및 IL-2(20U/mL, 미네소타주, 미네아폴리스, R&D Systems)가 부가된 페놀레드 없는 RPMI 1640내에 1×106 셀/mL로재현탁 시켰다. 다음 50 마이크로리터의 셀을 Southern Research Inatitute의 전염병 연구부에 의해 개발된 표준형 96웰 둥근바닥 마이크로타이터 배양 플레이트내의 내부 60웰에 분배하였다. 각 플레이트는 셀 콘드롤 웰
(셀 단독), 바이러스 콘트롤 웰(셀 및 바이러스), 및 실험웰(약물 및 셀 및 바이러스)를 포함한다. 마이크로타이터 플레이트에 연속 희석된 화합물을 추가하고 HIV-1 또는 SHIV-1의 프리-타이터링된 적절한 균주를 가한다. 모든 샘플은 화합물 독성 결정을 휘해 바이러스없이 리플리케이트 플레이트로 3중 분석시험 되었다. 웰당 최종 용적은 200㎕였다. 시험물은 37℃, 5% CO2로 습윤대기중에 6일동안 보온시키고, 상층액을 수집하여 RT활성을 분석하고, MTS색소 환원시험에의한 셀 생존율을 위해 시스터 플레이트를 분석하였다. 또한 셀은 현미경 검사를 하여 모든 비정상 사항을 기록하였다.
셀 생존율 결정을 위한 MTS착색
분석검사 말기에 셀 생존율을 결정하고 화합물 독성을 정량화 하기위해 테트라졸리움-계 염료 MTA(위트콘신주, 메디슨, Celltiter R Reagent Promega)로 착색하였다. MTS는 대사 화성셀의 미토콘드리아 효소에 의해 용해성 포르마잔 생성물로 대사되어, 셀 생존율 및 화합물 세포독성의 빠른 정량분석을 가능케 한다. 이 시약은 사용전 제조를 요하지 않는 단일 안정화 용액이다. PBMC 분석시험 말기에, 20㎕의 MTS시약을 웰마다 가하고, 웰을 37℃로 4시간 보온시켰다. 뚜껑대신 T접착성 플레이트 봉함제를 사용하고, 봉함된 플레이트를 서너번 뒤집어서 용해성 포르마잔 생성물을 혼합시키고 플레이트는 분자기기 Vmax 플레이트 판독기로 490㎚에서 분광광학적으로 판독했다.
역전사 효소 분석 시험
역전사 활성은 셀-없는 상층액에서 측정하였다. 삼중수소화된 티미딘 트리포스페이트(NEN)(TTP)를 증류수에 5Ci/mL로 재현탁 시켰다. 스톡용액으로 poly/rA 및 oligo dT를 제조하여 -20℃로 유지시켰다. RT반응 완충액은 매일 새로 제조되었으며 125㎕ 1.0M EGTA, 125㎕ dH2O, 110㎕ 10% SDS, 50㎕ 1.0M Tria(pH 7.4), 50㎕ 1.0M DTT, 및 40㎕ 1.0M MgCl2로 이루어진다. 2파트의 TTP, 1파트의 poly rA : oligo dT, 및 1파트의 반응완충액의 비율로 이들 세용액을 혼합하였다. 이들 반응 혼합물 10마이크로리터를 둥근바닥 마이크로타이터 플레이트내에 배치하고 15㎕의 바이러스 함유 상층액을 가하고 혼합하였다. 플레이트가 침수되는것을 막도록 고상 지지체를 사용하여 플레이트를 37℃의 수조내에 보온시키고, 60분간 보온했다.
반응 후, 반응물 용적을 DE 81페이퍼에 점표시하고, 각각 5% 소디움 포스페이트 완충액 내에서 5분간 5회, 각각 증류수내에서 1분간 2회, 각각 70% 에탄올 내에서 1분간 2회 세척한 후 건조시켰다. 각 샘플에 Opti-Fluor O를 가하고 Wallac 1450 Mocrobetaplus 액상 섬광계수기를 사용하여 통합된 방사활성을 정량화 하였다.
데이타 분석
IC50(50%, 바이러스 복제 억제), TC50(50% 셀 생존률 감소) 및 치료지수(TI, IC50/TC50)이 제공된다. AZT는 각 분석 시험시 상대적 정제어 화합물로 사용되었다.
수행된 항바이러스 측정결과는 하기표에 요약되었다:
PBMC내 화합물의 항 바이러스 활성 요약
화합물 HIV-1 RoJo 감염된 PBMCs(㎍/㎖) SHIV 89.6pd 감염된 PBMCs(㎍/㎖)
IC50 TC50 TI IC50 TC50 TI
SPL7013 6.1 >100 >16 0.25 >100 >400
SPL7304 13.2 >100 >7.6 0.92 >100 >109
SPL7320 2.6 >100 >39 0.29 >100 >345
AZT(㎛) 0.005 >1 >200 0.002 >1 >500

B. 허피스 바이러스-HSV-1 및 HSV-2 저항 활성
(ⅰ) 바이러스 플라크 감소 분석시험
일반적 방법
이 시험에서는 HSV 표준균주 G(HSV-2) 및 F(HSV-1)을 사용하였다. 6-웰 플레이트에 대한 바이러스 주입량은 100pfu/well이었다. HSV민감성 셀라인, Vero셀이 바이러스 수율 감소 분석시험에 사용되었다. 세포독성 시험에서는 상피성 셀라인, Hela-229셀이 사용되었다.
화합물의 항비이러스 효과는 수정된 플라크 감소 분석시험으로 결정되었다. 융합성셀을 PBS로 세척하고 이어서 37℃에서 1시간동안 HSV(100pfu/well)로 감염시키고 매10분마다 틸팅했다. 바이러스 종균이 제거된 후, 감염된 셀을 PBS로 세척하고, 배양배지내 1% 메틸셀룰로오스 (2배의 배양배지와 혼합된 1% 메틸셀룰로오스와 동량)로 중층하였다. 셀을 HSV-2 감염에 대해 37℃로 2일, HSV-1에 대해 3일 보온 시켰다. 플라크 크기가 충분하면, 셀을 10% 포르말린으로 고정시켰다. 이어서 플라크를 10분간 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 채색하였다. 수돗물로 염료를 씻어내고 연기후드내에서 건조시켰다. 다음 플라크를 계수하였다.
모든 데이타는 중복시험에서 얻었다. 시험웰내의 평균 플라크 수를 대조웰 내의 평균 플라크 수와 비교하였다.
EC50(종균 플라크수의 50% 감소농도) 항바이러스 활성 및 세포독성 측정은 동일한 셀균주 내에서 병행하여 수행되었다. 50% 세포독성 농도 (CC50)은 모의-감염된 셀의 생존율을 50% 감소시키는데 필요한 화합물 농도로 정의하였다.
전-감염 처리방법
배양배지를 6-웰 플레이트내의 융합성 Vero셀로부터 제거하고, 1ml PBS로 세척하였다. 0, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 및 30㎍/㎖의 화합물 농도를 갖는 1ml 배양배지를 각 웰에 가하고 37℃에서 1시간 보온하였다. 텐드리머로 셀을 예비-보온한 후, 100pfu/well의 HSV-1 또는 HDV-2 중 하나로 셀을 감염시켰다. 감염물을 매 10분당 틸팅하면서 37℃로 1시간 보온시켰다. 종균이 제거된 후 플라크 분석시험을 위해 2배의 배양배지로 희석된 1.5ml의 0.5% 메틸셀룰로오스로 감염된 셀을 카버하엿다.
감염된 셀의 처리
융합성 Vero셀을 PBS로 세척하였다. 다음 셀을 100pfu/well의 HSV-1 또는 -2 중 하나로 37℃에서 1시간 감염시켰다. 바이러스 종균이 제거된 후, 감염된 셀을 PBS로 1회 세척하고 0, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 및 100㎍/㎖농도의 덴드리머 함유 0.5% 메틸셀룰로오스로 카버하엿다. 플라크 분석시험을 위해 셀을 HSV-2에 대해 2일 또는HSV-1에 대해 3일동안 37℃로 보온하였다.
덴드리머의 세포독성
24-웰 플레이트내의 융합성 Hela-229로부터 펌프로 배양배지를 제거하였다. 다음 셀을 1㎖의 PBS로 1회 세척하였다. 0, 100, 500 및 1000㎍/㎖ 농도의 덴드리머를 함유한 1ml의 배양배지를 각 웨에 가하였다. 셀을 2일간 37℃보온기에서 보온시켰다. 보온 말기에, 배지를 제거하고 셀을 PBS로 세척하였다. 이어서 500㎕의 0.01% 회적색(PBS내)을 각 웰에 가하고 37℃로 30분간 보온하였다. 다음 염료를 제거하고 셀을 웰당 1ml PBS로 2회 세척하였다. 염료는 PBS내 500㎕의 50% 에탄올 및 1% 빙상 아세트산을 각 웰에 가함으로써 추출하였고, 120-150 rpm으로 서서히 교반하면서 실온에서 15분간 보온하였다. 각 웰로부터 추출된 100㎕ 염료를 96-웰 플레이트에 배치하고 ELISA 판독기로 550㎚에서 흡광도를 판독하였다.
HSV-1 및 HSV-2 저항성
화합물 처리 EC50(㎍/ml) CC50(㎍/ml)
SPL-7013 PT/HSV-2 0.61 〉1000
SPL-7013 PT/HSV-1 0.93 〉1000
SPL-7013 INF/HSV-2 3.59 〉1000
SPL-7013 INF/HSV-1 4.59 〉1000
SPL-7304 PT/HSV-2 0.4 〉1000
SPL-7304 PT/HSV-1 3 〉1000
SPL-7304 INF/HSV-2 54.4 〉1000
SPL-7304 INF/HSV-1 50.4 〉1000
SPL-7320 PT/HSV-2 0.6 〉1000
SPL-7320 PT/HSV-1 2.2 〉1000
SPL-7320 INF/HSV-2 33.3 〉1000
SPL-7320 INF/HSV-1 16.4 〉1000
PT=전-감염처리(Pre-infection treatment)
INT=감염셀의 처리(Treatment of infected cells)
(ⅱ)동물모델에서 허피스 바이러스-2 효능
쥐(균주MS)모델의 생식기의 HSV 예방시험에서 SPL-7013의 효능을 시험하였다. 100㎎/㎖, 또는 10㎎/㎖ 화합물의 15㎕ 투여량이 HSV-2 감염전 20초에 16마리 동물에 투여되었다. 대조시험에 비해 SPL-7013은 시험된 모든 동물의 감염및 질병을 예방하였다. 3일내 전체 사망수가 대조감염된 쥐의 수와 같은 때를 시험의 종료시점으로 하였다.
쥐의 HSV-2 생식기 감염 및 질병치료
농도(mg/ml) 동물수 질멸 및 감염으로부터 보호된 동물
질병(%) 감염(%)
100 11 11/11(100%) 11/11(100%)
100 12 12/12(100%) 12/12(100%)
10 12 11/12(97%) 10/12(83%)
PBS 대조시험 12 0/12(0%) 0/12(0%)
모든 동물은 감염전 20초에 처리 되었다.
C. 인간 상피세포의 인간 파필로마바이러스(HPV)흡착 방지
화합물에 대하여 인간 파필로마 바이러스 바이러스-모양 입자가 인간 상피세포에 결합및 흡착하는 것을 방지하는 능력을 측정하였다.
인간 파필로마바이러스 타입 6b의 파필로마바이러스 플루오로크롬-부속된 바이러스-모양 입자(VLPs) 의 결합및 흡착을 막는 억제제로서 화합물을 6희석물의 범위에서 시험하였다. VLPs는 SPL-7013의 존재하에 상피세포 내에 결합 및 흡착되도록 하였다. 결합 및 흡착 분석시험은 유동 세포 계측법으로 측정되고 결합억제는 억제제 부재하에 관찰된 결합에 대한 백분율로 표시하였다.이 시험은 두개의 독립 시험으로 수행하였다.
방법
셀. 인간 에피더모이드 암 셀라인 A431을 [American Type Collection at passage 30(CRL-1555, Batch F-13530)]에서 구입하고 10% FCS 내의 DMEM에 유지시 켰다.
인간 파필로마 바이러스 타입 6b VLP는 표준 작업공정에 따라 증식되고 순화되엇다. 입자들은 형광색소로 표시하였다.
화합물을 멸균수 내에 5mM의 농도로 재-용해시키고 -20℃로 냉동 시키기전 첫번 분석시험에 새로 사용하였다. 다음 두번째 시험을 위해 해동시켰다.
흡착 분석시험
A431셀의 T75 플래스크를 37℃에서 2㎖의 트립신으로 5분간 처리하기 전에 37℃에서 10㎖의 PBS/EDTA(0.05%)로 5분간 세척하였다. DMEM/10% FCS(10㎖)를 셀에 가하고, RT에서 셀을 5분간 1000x g로 원심분리시키고, 15㎖튜브내에서 전체배지에 3×105 cells/㎖로 재현탁시켰다. 셀을 매 20분마다 뒤집으면서 37℃로 2시간 보온시켜 셀 표면 단백질이 재발현되게 하였다. 셀을 RT에서 5분간 1000xg로 원심분리하고 혈청-없는 DMEM에 3×105 cells/100μL로 재현탁 시키고 100μL의 현탁액을 1.5㎖ 튜브에 넣었다. PBS 10μL 내에 다음 6 희석물로 화합물을 셀에 가하였다. ; 100μM, 10μM, 1.0μM 100nM, 10nM, 1.0nM.
VLP(200ng)을 추가한 것으로 표시하기전 셀을 37℃로 30분간 보온시켰다. 정제어로는 단지 VLPs를 셀에 추가하였고, 부의제어로는 셀에 VLPs를 추가하나 얼음에 항온배양시켰다. 셀을 혼합하고 37℃로 2시간 보온시켰다. 셀을 1㎖ PBS로 1회 세척하고 FACS완충액(P13S/4% 파라포름알데히드)에 고정시켰다. Coulter FACS기로 분석하였다.
분석
WinLisT를 사용하여 결과를 분석하였다. 초기에 전면/측면 스캐터를 사용하여 셀크기를 분석하고 라이브 셀들은 게이팅시켰다. 이 게이트의 평균형광강도 (MFI)가 산출되었고 추가분석에 사용하였다. 흡착은 VLPs 단독에서 관찰된 결합(100%) 대 얼음에 항온 배양된 VLPs 처리된 셀(0%)에 대한 백분율로 표시하였다.
결과
SLP-7013. 더 높은 농도에서 더 이상 억제됨이 없이 최대 흡착억제(26% 흡착)가 1μM에서 관찰되었다. 이 화합물은 1μM 및 10nM에서 여전히 흡착억제를 보였다. 이 지점후로는 SPL-7013의 농도가 감소하고 바이러스 흡착이 증가하였다.
D. 클라미디아 트라코마티스 감염. 동물모델에서 SPL-7013의 효능
C.트라코마티스 감염 20초 전에 암컷쥐(MS 균주)의 질 상부 또는 하부로에 SPL-7013 100㎎/mL용액 15μL를 주입하였다. 질의 하부로 감염은 첼린지 후 3-6일에 수집된 질의 스와브 샘플로부터 배양함에 의한 생체 분리로 정의된다. 질의 상부로 감염의 경우, 그 정의는 첼린지 후 10일에 수득된 질상부로 조직으로부터 배양함에 의한 생체 분리를 말한다. 포스페이트 완충액 PBS 처리된 쥐는 대조시험에 사용되었다.
쥐의 C.트라코마티스 생식로 감염의 영향
감염으로부터 보호된 동물
그룹 통물수 시간 하부로(%) 상부로(%)
그룹 1
SPL-7013 16 -20 sec 8(50%)a 8(50%)
PBS 15 -20 sec 1(7%) 2(13%)
그룹 2
SPL-7013 16 -20 sec 6(38%) 8(50%)a
PBS 16 -20 sec 1(7%) 1(6%)

당업자는 본발명의 정신 및 범위를 벗어남이 없이 본발명에 구체적으로 기술된 사항외에 본발명에 광범위하게 기술된 바에 의해 본발명의 변경 및 수정이 가능함을 이해 할 수 있을것이다. 본발명은 이러한 모든 변경 및 수정을 포함하는 범위인 것으로 이해되어야 한다.
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Claims (9)

  1. 하기 화학식 I, II, 또는 III의 화합물 또는 그의 약학적 허용염.
    화학식 I
    Figure 112008035715137-pct00005
    화학식 II
    Figure 112008035715137-pct00006
    화학식 III
    Figure 112008035715137-pct00007
    상기식에서 R은 하기 화학식 IV 그룹을 나타낸다
    화학식 IV
    Figure 112008035715137-pct00009
  2. 제1항에 있어서, 상기 약학적 허용염은 금속염 및 유기아민 또는 사차아민, 및 설포늄 및 포스포늄 이온과의 유기염에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 금속염은 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 또는 아연염이고; 상기 유기아민은 N, N'-디벤질 에틸렌 디아민, 클로로프로카인, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 디시클로헥실아민, 메글루민(N-메틸글루카민), 또는 프로카인이고; 상기 사차아민은 콜린인 화합물.
  4. 본원의 SPL-7013화합물 또는 그것의 약학적 허용염.
  5. 본원의 SPL-7304화합물 또는 그것의 약학적 허용염.
  6. 본원의 SPL-7320화합물 또는 그것의 약학적 허용염.
  7. HSV-1, HSV-2, HIV-1, HIV-2, 및 HPV 감염, 및 클라미디아 트라코마티스 감염에서 선택되는 인간환자의 질 또는 직장내 성 전이 질병의 예방 또는 치료를 위한 국소용 약학적 조성물에 있어서, 상기 청구항 제1항 내지 제6항 중 어느 하나에 따른 화합물을 하나 이상의 약학적 허용 가능한 국소용 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
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