JP2003522185A - 薬理活性抗ウイルスペプチドおよびそれらの使用法 - Google Patents
薬理活性抗ウイルスペプチドおよびそれらの使用法Info
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Abstract
Description
明は、広範囲のウイルスに対して活性を示すペプチド、前記ペプチドを含む医薬
品組成物、および前記ペプチドを用いてウイルス感染を予防および/または治療
する方法に関する。
る。これらのペプチドの例は、Beaulieuらに対して発行された米国特許
第5,700,780号;Schlesingerらに対して発行された米国特
許第5,104,854号;Freidingerらに対して発行された米国特
許第4,814,432号;Dutiaら、Nature 321:439(1
986);およびDohenら、Nature 321:441(1986)に
開示されている。しかし、当業者に知られている多くの既知抗ウイルスペプチド
は、極めて疎水性であり、故に、生物学的利用能があまり高くない。さらに、こ
れらの既知の抗ウイルスペプチドの多くは、それらの特異的な作用メカニズムの
ため、数タイプのウイルスに対してしか活性を示さない。加えて、これらの合成
ペプチドの多くは、初期ウイルス感染の予防に有効ではないか、または局所塗付
した時、機能しない。
、アシクロビルである。アシクロビルは、単純性疱疹ウイルス・タイプI(HS
V−1)、単純性疱疹ウイルス・タイプII(HSV−2)、および水痘−帯状
疱疹ウイルス(VZV)に対してインヴィトロおよびインビボ阻害活性を有する
合成プリンヌクレオシド類似体である。細胞培養において、アシクロビルの最も
高い抗ウイルス活性は、HSV−1に対してであり、HSV−2、VZVの順で
効力が落ちる。しかし、アシクロビルの使用は、禁忌されることがある。その上
、一部の単純性疱疹ウイルスは、アシクロビルに対して耐性になってきた。
全ウイルス(HIV)の伝染防止を助けることができる抗ウイルス化合物に向け
て、相当な研究がなされている。こうした製品に対する需要は高く、HIV感染
を予防する適切な抗ウイルスおよび/または殺ウイルス化合物は、先進国および
発展途上国の両方でおおいに役立つであろう。
て必要である。局所的に塗付することができ、ウイルス感染の予防に有効な抗ウ
イルス薬も依然として必要である。
配列番号17)との比較で、本発明の抗ウイルスペプチド(配列番号1)、(配
列番号3)および(配列番号4)によるHSV−1の用量依存性阻害を示す代表
図である。図1Cは配列番号1および配列番号17の細胞障害効果を示す。
ス阻害を示す代表図である。
号1)によるHSV−1形成の用量依存性阻害を示す代表図である。
イルス感染およびウイルスの伝播を阻害することを説明する図である。
ルス投入量に依存することを説明する図である。
へのウイルス侵入の阻害を説明する図である。
よび用量応答を説明する図である。
ス活性を説明する図である。
での活性を説明する図である。
、本明細書における定義を設ける。
の一部分、あるいはその断片または誘導体を含み、有効量で投与した時、薬理学
的に有効な抗ウイルス薬である。
めにインビボでまたは局所的にウイルス生物に対して有効であるために十分なペ
プチドの量。
して、細胞または細胞内区画に侵入することができるようにするアミノ酸配列を
有するペプチド。
反応しないかまたはその有効性を低下させない非毒性賦形剤を一つ以上含む、哺
乳動物に抗ウイルスペプチドを投与するために許容され得る繕いビヒクル。
い不溶性ペプチド配列の末端残基に取り付けると、水性媒体への溶解度を向上さ
せるであろう。
gerら、「Principles of Biochemistry(生物化
学の原理)」, Worth Publishers(New York, N
ew York)p.113(1983)を参照のこと。本出願におけるすべて
のアミノ酸配列は、各配列の末端における最も左のアミノ残基がアミノ末端残基
であり、各配列の右端の残基がカルボキシル末端残基である、標準命名法を用い
て示す。本明細書に記載するペプチドのアミノ酸は、ペプチド配列の前にlまた
はdで示すように(表1を参照のこと)、左旋性アミノ酸または右旋性アミノ酸
のいずれかであり得る。
な膜通過性ペプチドが当業者においてよく知られている。膜通過性ペプチドは、
局所的に塗付されるか、またはインビボで適用された時のような活性を含む広範
囲の抗ウイルス活性を示すことを意外にも、思いがけなく発見した。膜通過性ペ
プチドから誘導される本発明の抗ウイルスペプチドの例を下の表1に記載するが
、当該記述分野において既知の一切の膜通過性ペプチドを用いることができる。
例えば、Poogaら、FASEB J.,12:67(1998)およびOe
hlkeら、FEBS Lett.,415:196(1997)を参照のこと
。
の膜通過性ペプチドが可溶性であるとはいえ、一部はそうではないが、不溶性膜
通過性モチーフは、以下の方法によって抗ウイルスペプチドに用いることができ
る。抗ウイルスペプチドが製薬上許容され得る水溶性担体に不溶性である場合に
は、溶解性タグを抗ウイルスペプチドに付加させることができる。
いる。本発明は、共有結合した溶解性タグを部分的に含むと共に、以下の配列:
(X−1)n−A−A−V−A−L−L−P−A−V−L−L−A−L−L−A
−P−(X2)m(配列番号14)または(X1)n−P−A−V−L−L−A
−L−L−A−(X2)m(配列番号15)(式中のX1およびX2は、各X1
および各X2が同じまたは異なる電荷のアミノ酸残基であることができる、一つ
以上の荷電アミノ酸残基(例えば、K、R)から選択され;式中のnは、0また
は3から10の値を有し、mは、0または3から10の値を有し、この場合、一
つの実施形態において、m=0またはn=0のいずれかである)を有するような
新規抗ウイルスペプチドに関する。溶解性タグの一つの例は、R−R−K−K(
配列番号16)である。好ましい実施形態において、溶解性タグのすべての荷電
アミノ酸残基は、正電荷のアミノ酸残基である。本発明者は、不溶性膜通過性ペ
プチドが、溶解性タグに結合した時、広範囲のウイルスに対して強い抗ウイルス
活性を示す抗ウイルスペプチドを生ずることを意外にも、思いがけなく発見した
。
ルスペプチドとして機能することができる。表1を参照のこと。さらに、溶解性
タグは、一部の膜通過性ペプチドの溶解性を向上させることができるが、これら
の特定の膜通過性ポリペプチドは、溶解性タグを組み込まずとも抗ウイルスペプ
チドとして適切であり得る。
多様な反応性タグを有することができる。こうしたタグは、本発明の合成ペプチ
ドの検出/取出しに有用である。こうしたタグには、ほんの一例としてビオチン
、ならびに当業者によく知られている他の一切のタグを挙げることができる。配
列番号2、5から12および実施例2は、こうした反応性タグの加入を示してい
る。
有用であることが判った。本発明は、膜通過性モチーフの一つ以上のアミノ酸残
基が欠失しているかまたは他のアミノ酸残基に置換された膜通過性モチーフを含
む新規抗ウイルスペプチドに関する。こうした置換された、または断片の膜通過
性モチーフは、抗ウイルス活性を保持していなければならない。その置換膜通過
性モチーフまたは断片を含む本発明の抗ウイルスペプチドは、以下の実施例に記
載する方法によって抗ウイルス活性について検査することができる。実施例2は
、表1に記載した配列番号3によって示されるような置換膜通過性モチーフを含
む抗ウイルスペプチドが、抗ウイルス活性を保持していることを示している。こ
の誘導体は、両方のプロリンアミノ酸残基がペプチドのカルボキシ末端に位置し
ているという点のみが、配列番号1と異なる。本発明の抗ウイルスペプチドの可
能性ある活性断片を表2に記載する。
液結合法、および望まれる場合には、固相技術などのペプチド合成に一般に用い
られる方法を取り入れた方法によって、調製することができる。こうした方法は
、以下の実施例で説明する。当業者においてよく知られているペプチド合成につ
いてのなんらかの方法、例えば、Schroeder and Lubke,
in 「The Peptides(ペプチド)」,Vol.1,Academ
ic Press,New York,New York,pp.2−128(
1965);「The Peptides: Analysis,Synthe
sis,Biology(ペプチド: 分析、合成、生物学)」,(編集 E.
Grossら),Academic Press,New York,New
York,Vol.1−8,(1979−1987);Stewart and
Young, in「Solid Phase Peptide Synth
esis(固相ペプチド合成)」,2nd Ed.,Pierce Chem.
Co.,Rockford,IL(1984);Wildら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,89:10537(1992);およびRim
skyら、J.Virol,72:986(1998)を用いることができる。
よび非外皮膜ウイルスに対して抗ウイルス活性を示す。こうした外皮膜ウイルス
の例には、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ベシクロウイルス(VSV)、単
純性疱疹ウイルス(HSV−1およびHSV−2)、および他の疱疹ウイルス、
例えば、水痘−帯状疱疹ウイルス(VZV)、EBV、ウマ疱疹ウイルス(EH
V)、およびヒトサイトメガロウイルス(HCMV)が挙げられるが、それらに
限定されない。非外皮膜ウイルスの例には、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)およ
びアデノウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。
法は、以下の実施例で教示するようなよく知られている細胞培養技術である。こ
うした方法は、当業者によく知られている。Wildら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,89:10537(1992)を参照のこと。
いて、例えば、実施例10に示すようなネズミモデルを用いることによって、示
すことができる。
技術により、ヒトにおいて示すことができる。例えば、Kilbyら、Natu
re Medicine 4;1302(1998)を参照のこと。
物などに本ペプチドを局所投与することによって、抗ウイルス薬として用いられ
るだろう。本ペプチドは、一つ以上の製薬上許容され得る担体を含むビヒクル中
で投与することができ、その割合は、ペプチドの化学的特性の中の溶解度、選択
される投与経路および標準生物学的投与によって決定される。本ペプチドの処方
に適するビヒクルまたは担体は、標準的な製薬テキストに記載されている。「R
emington’s Pharmaceutical Sciences(レ
ミントンの製薬科学)」,18th Ed.,Mack Publishing
Company,Easton,PA(1990)を参照のこと。
は0.1から10%、好ましくは5%の抗ウイルスペプチドを含有する製薬上許
容され得るビヒクル中で処方することができる。こうした製剤は、溶液、クリー
ムまたはローションの形態であり得る。本発明の抗ウイルスペプチドは、皮膚ま
たは口腔または生殖腔の一部のウイルス感染を治療するために用いることもでき
る。本抗ウイルスペプチドは、より多種多様なウイルスを治療するために、独自
でまたは組合せて用いることができる。こうした局所塗付は、手袋、コンドーム
および当業者に知られている他のバリヤーなどの着用者を保護するためのバリヤ
ー材に施すことができる。
によって、単独で、または製薬上許容され得るビヒクルもしくは担体と併用で投
与することができる。注射による投与には、バッファーまたは保存薬、ならびに
溶液を等張性にするために足る量の製薬上許容され得る塩もしくはグルコースな
どの他の溶質を含有することもできる、無菌水性ビヒクル中の溶液で、抗ウイル
スペプチドを用いることが好ましい。本発明の抗ウイルスペプチドは、当業者に
おいてよく知られている治療上許容され得る塩の形態で得ることができる。
るために選択される特定の抗ウイルスペプチド(複数を含む)に依存するであろ
う。さらに、治療を受ける特定の宿主によって変化するであろう。一般に、本抗
ウイルスペプチドは、一切の有害なまたは有毒性の副作用を生じることなく、選
択したウイルス(複数を含む)に対して抗ウイルス薬として有効な結果を一般に
生じるだろう濃度水準で、最も好ましくは投与される。
しない限り、本明細書中で用いるすべての技術および科学用語は、本発明の当業
者が一般に説明するものと同じ意味を有する。本明細書中に記載するものと類似
のまたは同等のあらゆる方法および材料が発明の実施に用いることができるが、
好ましい方法および材料を記載した。別様に言及しない限り、本明細書中で用い
るまたは考察する技術は、当業者によく知られている標準的な方法である。これ
らの材料、方法および実施例は、説明のためのものであって、制限するためのも
のではない。本明細書に引用するすべての参考文献は、参照により取り入れる。
and Vis.Sci.30:2474(1989))に記載されているよう
な、Vero細胞を成長させ、HSV−1 KOSの高力価株を調製するための
手順を用いた。Vero細胞は、5%の仔ウシ血清および5%のウシ胎仔血清(
標準培地)を補充したカーボネート緩衝DMEM中で保持した。一部の研究につ
いては、細胞を、25mMのHepesで緩衝した血清を含まないDMEM(p
H7.4)に切り換え、実験的処理の前に30分間その培地に適応させた。Ve
ro細胞は、ミクロタイタープレートのウエル(0.28cm2)に、1日後に
使用するために3.5×104細胞/ウエル(8×104細胞/ウエル)、また
は3日後に使用するために1×104細胞/ウエル(2×105細胞/ウエル)
のいずれかで接種された。
40μLの培地に、37℃で1時間、感染させた。指示した場合を除き、40μ
Lの培地中でのペプチド処理は、感染の1時間前から1時間後まで続いた。吸着
時間終了時点で、培養物に100μLの標準培地を再供給した。2日後、プラー
ク形成の点数付けを行い、1ウエルにつき点数付けされたプラーク数を、ペプチ
ド不在の状態で数えた数に対して正規化した。接眼マイクロメータを用いて、最
も大きいプラークの直径(L)およびそれに対して90°角での直径(S)を測
定することによって、プラークサイズ(π/2×L×S)を決定した。プラーク
が、10未満の円型細胞を含んでいたか、ウエルの側面に接触していた場合を除
いて、最初の40の点数付けプラークの各々のサイズを測定した。
培養物を3回凍結(−80℃)融解(37℃)した。ピペット操作を繰り返すこ
とによって細胞を懸濁させ、ミクロタイタープレートをベックマンTJ−6型卓
上遠心分離器内で10分間、700xgで回転させた。ウイルスを含有する上清
を標準培地中で、連続的に希釈し、Vero細胞について力価測定した。Gra
uら、Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.30:2474
(1989)によって教示されているように、クリスタルバイオレットを用いて
単層を染色した後、プラークを数えた。
識して、比放射能 0.01cpm/pfuにした。簡単に言うと、Vero細
胞を5.0の感染多重度で感染させ、感染の6時間後に、[32P]−オルトホ
スフェート(0.5mCi/mL)を添加した。感染の18時間後、細胞および
培地を別々に回収した。細胞を3回の凍結融解サイクルに付し、細胞破壊片を2
000xgで10分間、遠心分離することによってペレット化した。Visal
liら、Virus Res.29:167(1993)によって教示されてい
るように、凍結融解上清は、培地と混合し、ウイルスは、26%のスクロース密
度勾配クッションによる遠心分離によってペレット化した。使用にあたって、ウ
イルスペレットをPBSに再懸濁させた。ミクロタイタープレート内の集密Ve
ro細胞を血清を含まないDMEMに移し、氷を用いて冷却して、4℃で保持し
た。30分後、ペプチドを添加し、60分後、細胞を2時間、32P−ウイルス
(2×104cpm/ウエル)と共にインキュベートした。標識付けした後、細
胞を氷冷培地ですすいだ。その後、結合した32Pは、PBS中、1%のDSD
および1%のTriton X−100を用いて定量的に抽出し、ベックマンL
S5801液体シンチレーション・カウンターで数えた。
ープレート内の集密Vero細胞培養物をHepesで緩衝した、血清を含まな
いDMEMに移し、30分間、氷を用いて4℃に冷却し、40μLの培地中、4
℃で1時間、hrR3で感染させた。氷冷培地ですすぐことによって、未付着ウ
イルスを除去した。EBと呼ばれる抗ウイルスペプチド配列番号1、もしくはス
クランブルドバージョンの膜通過性ペプチドR−R−K−K−L−A−A−L−
P−L−V−L−A−A−P−L−A−V−L−Aに付着したRRKKテトラペ
プチド(配列番号16)を含むコントロールペプチド((配列番号17)(EB
Xと呼ばれる)での処理、またはペプチドを含まない培地での擬似処理を、前述
したように血清を含まないDMEM中で行った。ウイルスの侵入を、培養物を3
7℃に変えることによって開始させた。一切の残存細胞外ウイルスを不活性化す
るために、培養物をPBSですすぎ、低pHのクエン酸バッファー(Highl
anderら、J.Virol.61:3356(1987)によりクエン酸
40mM、KCl 10mM、NaCl 135mM、pH3.0)に23℃で
、1分間さらした。クエン酸塩をPBSですすぎ落とし、培養物が23℃で30
分間、5xのPBS中、0.5%のグルタルアルデヒドで固定されるまで培養物
を血清補充DMEM中で保持して、2μMのMgCl2、1.3mMのK4Fe
(CN)6および1.3mMのK3Fe(CN)6を含有する1xのPBS中の
X−gal(Fisher Biotech;BP1615−1)を用いて23
℃で1時間または一晩、β−ガラクトシダーゼ活性について染色し、青いlac
Z+細胞の存在を点数付けした。
の血清を含まないDMEM(pH7.4)中、37℃で、1時間、多様な濃度の
EBまたはEBXとともにインキュベートした。血清補充DMEMを用いて処理
ウイルスを200倍に希釈し、約1時間後に、1日前にVero細胞(3.5x
104細胞/ウエル)を播いたミクロタイターウエルに関する感染性について検
定した。40または100マイクロリットル量の希釈ウイルスを1または2時間
、37℃で吸着させ、lacZ+細胞を8時間後に点数付けした。一部の実験で
は、残存する感染性ウイルスを検定する前に、先ず、一定量の希釈ウイルスを一
晩、4℃で、Hepesで緩衝して血清を補充した60倍過剰量のDMEMに透
析する(Spectra/Por;MWCO 12−14,000)か、または
注射器によって0.22μmの膜(Millex−GV;Millipore)
に通した。
M中の未感染Vero細胞を37℃で1時間、抗ウイルスペプチド配列番号1ま
たはコントロールペプチドEBX(配列番号17)で処理し、PBSですすいで
、23℃で5分間、PBS中0.4%のトリパンブルーで染色し、再びPBSで
すすいで、空気乾燥させた。
(1993)による精製HSV−1 KOSウイルス粒子(2.5x107pf
u/mL)を5から60分間、4または23℃で、25mMのHepesで緩衝
した40μLの血清を含まないDMEM(pH7.4)中の25μMの抗ウイル
スペプチド配列番号1またはコントロールペプチドEBX(配列番号17)で処
理した。一定量(10μL)をピオロホルムポリ−L−リシン被覆グリッドに5
分間、23℃で吸着させた。グリッドをPBSですすぎ、pH〜6に調整した水
中の2%のリンタングステン酸(PTA)で染色して、空気乾燥させた。あるい
は、ウイルスをグリッドに予め吸着させ、その後、ペプチドで処理した。5μL
のPBS中、合計4x109pfu/mLの精製HSV−1 KOSを23℃で
5分間、被覆グリッドに塗付し、25mMのHepesで緩衝した血清を含まな
いDMEMバッファー(pH7.4)でそのグリッドを一回すすいで、37℃で
30分間、同じ培地中5mMのEBまたはEBX 15μLで処理した。抗ウイ
ルスペプチド配列番号1およびEBXの高濃縮溶液のpHは、使用前に、NaO
Hで7.4に再調整した。ペプチド含有溶液の蒸発を防止するために、各グリッ
ドをHiraokaフレキシブル染色プレート内に保持し、0.5mLのポリプ
ロピレン微量遠心分離管から製造された小型ベルジャーをかぶせた。このベルジ
ャーは、その半分が、グリッドの被覆表面に面することを満たすように、十分に
小さく15μLほどの大きさであった。その後、全アセンブリを湿潤チャンバ内
で、30分間、37℃でインキュベートした。処理後、グリッドは、PTAで染
色する前に、DMEMで2回、PBSで1回すすぎ、乾燥させた。グリッドは、
JEOL JEM−1200EX電子顕微鏡において、15,000および40
,000倍の倍率で検査した。
校のバイオテクノロジー・センターで行った。合成は、Meienhoferら
、Int.J.Peptide Protein Res.13:35(197
9)およびFieldsら、Peptide Res.4:95(1991)に
よる改良を伴う、Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:
7129(1963)によって最初に説明された原理に従って、自動合成装置(
Applied Biosystems Model 432A「Synerg
y」)を用いて、25ピコモルスケールで行った。分解したペプチドを冷t−ブ
チルメチルエーテルで沈降させ、水に溶解して、HPLC分析(純度)およびエ
レクトロスプレーイオン化質量スペクトル(分子質量、表1参照)によって検査
した。溶液中のペプチド濃度は、Segel,Biochemical Cal
culations,2nded.John Wiley & Sons,In
c.,New York,NY(1976)によって教示されたように、215
および225nmでの吸光度の読み取りによって決定した。
細胞培養物の感染中に存在する時、有効な抗ウイルス薬であり、図1A(●)、
図1B(●)および図1D(○)に示すようにプラーク形成を阻害し、濃度に依
存して最高8桁までウイルスの収量を低下させた(図1E参照)。コントロール
ペプチドの図1A(○)および図1B(○)EBXと比較して、抗ウイルスペプ
チドEBは、はるかに有効な抗ウイルス薬であり、血清の存在(図1A)または
不在(図1B)に依存して10または100倍低い濃度で感染を阻害した。
Bの細胞障害効果は、抗ウイルス濃度(図1B、(●);IC50=0.7μM
)より100倍高い(図1C、(●);IC50=68μM)濃度でしか見られ
なかった。血清が存在する状態では、細胞障害効果は、最初、EB 200μM
(図1C、(△))で見られた。細胞障害効果は、コントロールペプチドEBX
(配列番号17)には随伴しなかった(図1C、(○))。
ス性のペプチドEBの溶解性の向上に有用であることがわかったが、それ自体は
重要な抗ウイルス活性を一切有さない。血清が存在する状態では、抗ウイルス活
性は、200μMの高き濃度でも、遊離R−R−K−Kテトラマー(配列番号1
6)には随伴しなかった(図1A、(▲))。
を含まない条件のもと、1.3mMのIC50値で、Vero細胞のhrR3感
染を阻害することを発見した(データは、示していない)。高濃度(100倍ま
でモル過剰)であるが、非抗ウイルス濃度の遊離R−R−K−Kペプチド(配列
番号16)は、抗ウイルスペプチドEBの活性と競合することはできず、抗ウイ
ルスペプチドEBによるhrR3感染の阻害を再現することはできないことも発
見した(データは、示していない)。
ために、中央のプロリン残基をカルボキシ末端に移動させた、EBPPと呼ばれ
る修飾抗ウイルスペプチド(配列番号3)を試験した。このEBPPペプチド(
表1)は、プラーク(図1D)および収量低下アッセイ(データは、示していな
い)の両方で、元のEBペプチドの2倍、活性であった。
ように、活性について検査した。図2に示すように、ビオチン化EBは、本質的
にEBと同じほど有効であった。従って、ペプチドのビオチン化は、活性に対し
てごくわずかな効果しか生じなかった。
を上に記載したように測定した。その結果を以下の表3に示す。図1Eに示すよ
うに、「LALA」と呼ばれる抗ウイルスペプチド配列番号4は、EBと類似し
た抗ウイルス活性を示す。
たようにウイルス生産について検定した。本発明の抗ウイルスペプチドEB(配
列番号1)の抗ウイルス活性を、現行のHSV抗ウイルス性ヌクレオシド標準物
質アシクロビルの抗ウイルス活性と比較した。HSVで感染させる1時間前に、
二つのペプチドをVero細胞に添加した。図3が示すように、アシクロビルは
、低投薬量で最高の活性を示すが、高濃度、すなわち有効成分の10μMを越え
る濃度では、EBが、最も大きな抗ウイルス活性を示した。
ことが測定された。図4Aに示すように、EBは、感染1時間後に始まって継続
的に存在する時に比べ、感染中および感染1時間前および1時間後に存在する時
、実質的に有効であった(各々、IC50=5.5μM、(○) 対 IC50 =24、(●))。さらに、吸着前および吸着中に存在する時、EBは、プラー
クサイズに対して効果を生じなかった。EBペプチドが、感染後継続的に存在し
た時、プラークの拡大は、用量に依存する形で阻害された(図4A,(△);I
C50=12μM)。個々のプラークを確実に測定できるようにするために、細
胞培養物を非常に低い多重度(moi<0.01)で感染させ、プラークサイズ
を非常に早期に(感染1日後)顕微鏡で測定した。図4Bに示すように、未処理
のコントロールウエルでは、プラークサイズが広く分布し(黒棒;平均:66,
000±6200μm2)、これに対して、感染1時間後、EBの増加濃度が追
加されたことによって、分布は、より小さいサイズのクラスに向かって累進的に
シフトした(例えば、25μMのEBは、平均プラークサイズを70%有意に低
下させて、6900±2600μm2にした;t=6.88;影つき棒)。対照
的に、たとえプラークの数が感染後の処理に比べて猛烈に減少したが、感染後1
時間未満のEBの存在は、プラークサイズに対して効果を生じなかった。従って
、6および12μMのEB(68,000±11,000μm2)で一時的な処
理を施した後の混合平均プラークサイズは、コントロールと区別がつかなかった
。EBは、ウイルス感染の初期段階で作用し、感染後に添加した時プラークサイ
ズを低下させるように見えた。
示した。有効に視覚化するために必要なため、高濃度の精製ウイルス粒子を25
μMのEBとともにインキュベートし、被覆グリッドに吸着させて、PTAで染
色した。結果は、ほぼすべての粒子が比較的数少ない大きな凝集体中に見られる
ことを示した。対照的に、未処理ウイルス、すなわち25μMのEBXで処理し
たウイルス粒子は、ほぼすべて、個々に、均質に、グリッド表面に分散している
のがわかった。凝集体の中のPTA染色された個々のウイルス粒子は、視覚的に
コントロール粒子と区別がつかなかった。このことは、EBがウイルス粒子にお
いて全体的な構造的異常を誘導しなかったことを示す。EB誘導凝集体は、室温
ならびに4℃で急速に(<5分)形成された。
エルの投入量のhrR3で培養物を感染させ、8時間後にlacZ+細胞を点数
付けした。得られたIC50値は、図5に示すように、各々、0.66、1.2
および11μMであった。
入量より上では、この投入量より下の場合より、ウイルス力価の増大にともない
IC50が大きく増大した。もしEBが単に、高いウイルス投入量でより効率的
に(すなわち低いIC50で)作用するはずの凝集剤として作用するのならば、
IC50とウイルス力価の間に逆の相関が予想されよう。従って、これらの実験
では、ウイルスの凝集は、EBの抗ウイルス活性に対していかなる重大な貢献も
なしていない。さらに、EBの抗ウイルス活性がウイルスの濃度に強く依存して
いるという事実は、本発明の抗ウイルスペプチドがウイルスの成分と相互作用し
ているということを示唆している。
チドの抗ウイルス作用(複数を含む)がウイルスの吸着にも、ウイルスの凝集に
も関係しないが、ウイルス侵入の阻害には関係することを示した。これらの研究
において、hrR3ウイルスは、血清を含まないDMEMに氷冷した25μMの
EBまたはEBXを添加する前に、4℃で1時間、予め細胞に吸着させた。4℃
でさらに1時間後、培養物を37℃にシフトさせて、ウイルスの侵入を開始させ
た。温度シフト後、15分間隔で、低pHのクエン酸バッファーを用いて培養物
を洗浄することによって、細胞外に残存する一切のウイルスを不活性化した。次
に、培養物をすすぎ、固定するまで、ペプチドを含まない血清を補充したDME
Mに戻した。温度シフトの8時間後にβ−ガラクトシダーゼについて染色した。
入は、37℃に変えた15から30分後に開始し、約60分後に6.5mm2あ
たり約340lacZ+細胞(すなわち、1450 lacZ+細胞/ウエル)
のレベルで完了した。EBペプチドで処理した細胞株では、lacZ+細胞の数
を90%より多く減少させた(●)。EBXペプチドは、lacZ+細胞(▲)
の数を有意には減少させなかった。EBおよびEBXをウイルス吸着前に添加し
た時、本質的に同じ結果が得られた(データは、示していない)。ペプチドを各
クエン酸処理直後に添加した時、EBは、もはやlacZ+細胞の成長に対して
一切効果を生じなかった(図6B、(●);図6A、(○)参照)。EBXも、
クエン酸処理直後に添加した時、lacZ+細胞の成長を有意には阻害しなかっ
た(図6B、(▲))。このように、EBは、早期ICP6プロモータからのl
acZ遺伝子の発現に対しては効果を生じなかったが、選択的にウイルスの侵入
を阻害した。
おけるlacZ遺伝子の発現より明確に先行する(図7A)という発見によって
強められる。さらに、hrR3を4℃で1時間、細胞に前吸着させて、未付着ウ
イルスをすすぎ落とし、細胞をさらに1時間、4℃で保持した。次に、培養物を
37℃に切り替える前に、30分間、23℃に変えた。より漸進的な37℃への
変化によって、細胞相が後続の頻繁な培地交換を通して無傷でいることができる
。ウイルス吸着直後、連続的な1時間間隔で、50μMのEBを用いて、1時間
、細胞を処理した。感染後1時間から4時間の間、ウイルス侵入は、70から8
0%阻害された。その後、感染は、もはや有意には阻害されなかった(図7B、
●))。擬似処理後、並行培養物を直ちに固定させ、X−galを用いて染色し
た。これらの培養物において、青い(lacZ+)細胞は、最初、感染の7時間
後に現れ、それらの数は、次の3時間、ほぼ直線的に増加した(図7A、(○)
)。感染後7時間までに、EBは、阻害性ではなくなった。従って、EBは、早
期短期感受性期間中しかウイルス侵入を阻害せず、一旦、ウイルスが細胞に侵入
してしまうと、lacZ遺伝子の発現およびβ−ガラクトシダーゼ活性の発生に
対して効果を生じなかった。図7Bに示すように、EBは、IC50=15μM
(●)で、用量に依存する形で前吸着ウイルスの侵入を阻害したのに対して、E
BXは、殆ど有効ではなかった(IC50 〜100μM;(○))。
ルスの不活性化を導くことがわかった。殺ウイルスアッセイは、hrR3を用い
て行った。最初の実験(図8A)では、EBは、IC50=44μM(●)で、
濃度に依存する形でウイルス粒子の感染を阻害したのに対して、EBXは、阻害
効果を有さなかった(○)。阻害を達成するためにわずかに高い濃度のEBを必
要とする第二の実験では(図10B、(●);IC50=69μM)、処理ウイ
ルス粒子が非可逆的に不活性化されることもわかった。すなわち、EBで処理し
、その後、希釈したウイルス粒子の一定量は、一切の可逆的に結合したEBを捕
捉してしまうことが可能な血清含有培地に一晩透析している間、再び活性化する
ことができなかった(図1、(●);A対Bを参照)。その代わり、透析後に回
収したウイルス粒子(あらゆるEB濃度で31%)は、非透析コントロールと全
く同じように不活性のままであった(図8、(△)対(●))。
EBで処理し、その後、希釈したウイルス粒子のさらなる一定量を、残存する感
染力について検定する前に、0.22μmの膜を通して濾過した。EBが不在ま
たは低濃度(≦3μM)の状態では、80から85%のウイルス粒子が膜上に捕
捉された。しかし、膜への付着を向上させ、および/またはウイルスを凝集させ
るより高濃度のEBに一度だけでもさらされると、残存ウイルス粒子は保持され
た(図8B、(▲))。ウイルス粒子の付着特性におけるこうした変化は、ウイ
ルスの不活性化に求められるEB濃度よりかなり下で誘発された(図8B、(▲
)対(●)、(△))。
PTA染色ウイルス粒子の電子顕微鏡検査法によって、最も厳密なEB処理の効
果を検査した。EB処理ウイルス粒子は、EB処理粒子中のウイルスエンVer
oプの輪郭がさほど多形性でなかったことを除き、本質的には擬似処理ウイルス
粒子と同じように見え、このことは、EBが、ウイルス粒子を安定させたことを
示唆する。5mMで、EBXは、EBと同じ効果を有した。
HSV−1株KOSを、室温で、PBS中、25μMの濃度のEPペプチドまた
はEBXペプチド、いずれかとともに、1時間インキュベートした。次に、本発
明者が以前に記載したように(Brandtら、J.Virol.Meth.3
6,209(1992))、各々10匹のマウスのグループの角膜を犠牲にして
、5.0x105のプラーク形成ユニットを用いて感染させた。
傷をつけ、ウイルスを含有する液滴5μLを角膜の上に乗せた。その後、マウス
をおりに戻し、回復させた。KOSで感染させたが、ペプチドにはさらしていな
いコントロールグループも含めた。マウスは、感染後にはペプチドで処理しなか
った。
角膜疾患の重度を測定した。簡単に言えば、血管新生は、次のように点数付けし
た: 0は、血管新生なし;1+は、血管新生を伴う角膜が25%未満;2+は
、血管新生を伴う角膜が25から50%;および3+は、血管新生を伴う角膜が
50%より多い。角膜炎は、次のように点数付けした:0は、角膜混濁なし;1
+は、混濁、一部の虹彩細部が可視;2+は、混濁、虹彩細部が不明瞭;3+は
、角膜が全体的に不透明;4+は、角膜が穿孔され、混濁している。データは、
3つのグループ各々についての各日の平均疾患スコアとして報告する。結果を図
9に示す。
用量依存的阻害を示す代表図である。
下での用量依存的阻害を示す代表図である。
べた実験結果を示す図である。
を示す代表図である。
示す代表図である。
よるHSV−1形成の用量依存性阻害を示す代表図である。
ルスの伝播を阻害することを説明する図である。
ルスの伝播を阻害することを説明する図である。
量に依存することを説明する図である。
害を説明する図である。
害を説明する図である。
る図である。
る図である。
ある。
ある。
である。
である。
Claims (16)
- 【請求項1】 式1 (式1)(X1)n−A−A−V−A−L−L−P−A−V−L−L−A−L
−L−A−P−(X2)m [式中、X1およびX2は、各X1および各X2が同じまたは異なる電荷のアミ
ノ酸残基であることができるように、一つ以上の荷電アミノ酸残基から選択され
、さらに、式中のnは、0または3から10の値を有し、mは、0または3から
10の値を有する。]に一致するペプチド。 - 【請求項2】 m=0またはn=0のいずれかであり、m=0の場合には、
nが4から10の値を有し、n=0の場合には、mが4から10の値を有する、
請求項1に記載のペプチド。 - 【請求項3】 式2 (式2)(X1)n−P−A−V−L−L−A−L−L−A−(X2)m (式中のX1およびX2は、各X1および各X2が同じまたは異なる電荷のアミ
ノ酸残基であることができるように、一つ以上の荷電アミノ酸残基から選択され
、さらに、指揮中のnは、0または3から10の値を有し、mは、0または3か
ら10の値を有する。)に一致するペプチド。 - 【請求項4】 m=0またはn=0のいずれかである、請求項3に記載のペ
プチド。 - 【請求項5】 前記抗ウイルスペプチドおよび製薬上許容され得る担体を含
み、哺乳動物宿主におけるウイルス感染の治療または予防に有効である医薬品組
成物。 - 【請求項6】 前記抗ウイルスペプチドが、溶解性タグをさらに含む、請求
項5に記載の医薬品組成物。 - 【請求項7】 前記抗ウイルスペプチドが、配列番号1から15、配列番号
18から30、それらの断片およびそれらの誘導体から成る群から選択され、前
記抗ウイルスペプチドが配列番号14、配列番号15、その断片または誘導体で
ある場合には、式中のX1およびX2は、各X1および各X2が同じまたは異な
る電荷のアミノ酸残基であることができるように、一つ以上の荷電アミノ酸残基
から選択され、さらに式中のnが、0または3から10の値を有し、mが0また
は3から10の値を有する、請求項5に記載の医薬品組成物。 - 【請求項8】 前記抗ウイルスペプチドが、配列番号1から13から成る群
から選択される、請求項7に記載の医薬品組成物。 - 【請求項9】 前記抗ウイルスペプチドが、配列番号14から15から成る
群から選択される、請求項7に記載の医薬品組成物。 - 【請求項10】 前記抗ウイルスペプチドが、配列番号14であり、式中、
m=0およびnが4から10の値を有する、請求項7に記載の医薬品組成物。 - 【請求項11】 前記組成物が、外皮膜ウイルスからの感染の治療または予
防において有効である、請求項5に記載の医薬品組成物。 - 【請求項12】 前記組成物が、ヒト免疫不全ウイルス、単純性疱疹ウイル
スおよびサイトメガロウイルスから成る群から選択される一つ以上のウイルスか
らの感染の治療または予防において有効である、請求項11に記載の医薬品組成
物。 - 【請求項13】 一つ以上の単純性疱疹ウイルスからの感染の治療または予
防において有効である、請求項12に記載の医薬品組成物。 - 【請求項14】 前記組成物が、非外皮膜ウイルスからの感染の治療または
予防において有効である、請求項5に記載の医薬品組成物。 - 【請求項15】 有効量の請求項5に記載の医薬品組成物を動物に投与する
ことを含む、温血動物におけるウイルス感染を治療または予防する方法。 - 【請求項16】 有効量の請求項10に記載の医薬品組成物を動物に投与す
ることを含む、温血動物におけるウイルス感染を治療または予防する方法。
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