CN107485716B

CN107485716B - 可运载功能性分子进入hsv可感染细胞的载体及药物

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Publication number: CN107485716B
Application number: CN201610406259.5A
Authority: CN
Inventors: 秦克锋; 李冬冬
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-06-12
Filing date: 2016-06-12
Publication date: 2020-05-22
Anticipated expiration: 2036-06-12
Also published as: CN107485716A

Abstract

本发明公开一种可运载功能性分子进入HSV可感染细胞的载体及药物，导向载体（HSV载体）可运载功能性分子穿过细胞膜导向进入HSV可感染宿主细胞内，用于基础研究与临床应用；人工合成HSV载体‑RRi融合多肽药物，可特异高效地进入宿主细胞内抑制HSV的复制，治愈实验性单纯疱疹性角膜炎，可用于包括疱疹性角膜炎、口唇疱疹、疱疹性脑炎和生殖器疱疹等疱疹性疾病的治疗。

Description

可运载功能性分子进入HSV可感染细胞的载体及药物

技术领域

本发明属于多肽药物的制备与抗病毒应用，尤其是一种可运载功能性分子进入HSV可感染细胞的载体及药物。

背景技术

造成广泛感染并引起严重疾病的人类疱疹病毒主要有单纯疱疹病毒（HSV）1型与2型（HSV-1，HSV-2）和带状疱疹病毒（VZV）。其中，HSV-1主要引起口唇疱疹、单纯疱疹性角膜炎和脑炎；HSV-2主要引起生殖器疱疹包括阴茎炎、阴囊炎、宫颈糜烂并可能与宫颈癌有关；VZV主要引起带状疱疹和带状疱疹性角膜炎。

单纯疱疹病毒（HSV）是一种有囊膜的DNA病毒，人是其唯一的自然宿主。HSV在囊膜表面含有多种糖蛋白（gB、gD、gH和gL等），在病毒与宿主细胞膜融合过程中起主导作用。糖蛋白gD位于HSV的囊膜表面，序列高度保守，已知各病毒株gD序列的同一性>98%。HSV进入宿主细胞，首先需要gD与细胞表面的下列三个疱疹病毒受体中至少一个结合，1）疱疹病毒进入介体A（HveA， HVEM）；2）结合素1（nectin1），也称为疱疹病毒进入介体C（HveC）；又称为脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白1，3）依赖于3-O-磺基转移酶3（3-OST-3）活性的硫酸乙酰肝素。与疱疹病毒受体结合后，gD会改变构象，然后与gH和gL互动形成复合物，此步骤为HSV与细胞的半融合，最后，gB与gH/gL复合物相互作用，在细胞膜构建一个穿入小孔，病毒衣壳从该小孔进入细胞。病毒衣壳进入细胞浆后，就会附着到细胞核膜上，12个UL6穿孔蛋白，在核膜上构建成一个衣壳孔，衣壳从该孔向细胞核内排入HSV单链DNA。HSV蛋白的表达分为三个阶段，即极早期（IE, α）、早期（E, β）和晚期（L, γ）。HSV首先产生宿主关闭蛋白UL41（VHS），以降解宿主mRNA，关闭宿主蛋白合成，使病毒的复制得以进行，晚期蛋白则包括病毒的衣壳和囊膜蛋白。糖蛋白gD基因的启动子被早期基因产物US12（ICP47）蛋白激活，但gD的表达需要DNA的复制，所以直到晚期gD才大量产生。因此，gD被称为延期的早期（βγ）基因。类似于其他HSV糖蛋白，包含信号肽的gD前体在粗面内质网（rER）合成，并立即获得高甘露糖寡糖链，N-连结到天冬氨酸（D）残基。随后，gD转移到高尔基体作寡糖修整而成熟，再被输送到细胞膜。研究表明，gD前体的信号肽在翻译后被切除，成熟的gD不含有信号肽，进入高尔基体，然后到达细胞膜，在病毒出芽时形成病毒囊膜并包装病毒颗粒。但gD前体信号肽在何部位与时间段被切除并无具体报道。基于对其它信号肽的研究发现，含有信号肽序列的蛋白前体被翻译后，信号肽使正在翻译的核糖体附着到粗面内质网（rER）膜上，以完成蛋白分子的合成。信号肽进一步引导蛋白插入内质网膜中，埋在膜中的信号肽酶将信号肽切除，不含信号肽的成熟蛋白分子则延着信号肽引导的途径穿过内质网膜，进入高尔基体。

HSV-1 gD由US6区编码，gD基因编码含394个氨基酸残基的gD前体蛋白，其氨基酸序列如下：

前25个氨基酸残基为信号肽序列。应用Phobious Signal Peptide Prediction软件分析，序列N-末端1-7为带正电荷荷的碱性氨基末端；8-18为疏水序列，以中性氨基酸残基为主，能够形成一段d螺旋结构，是信号肽的主要功能区；19-25为带负电荷的C末端，是信号序列切割位点。

HSV感染分为原发和复发两种类型，绝大多数成年人都接触过HSV，人群中HSV-1的血清抗体阳性率为50~90%，但大部分不出现临床症状。原发感染后，HSV潜伏在三叉神经节，三叉神经任何一支支配区的皮肤、粘膜等靶组织的原发性HSV感染均可导致HSV潜伏在三叉神经节的感觉神经元。

单纯疱疹性角膜炎（Herpes simplex keratitis，HSK）是目前眼科最严重的常见角膜病，为主要的致盲原因之一，近年来有明显上升和加剧趋势。由于该病反复发作，重症病例增多，严重危害视功能。

由于单纯疱疹病毒在角膜上皮细胞内复制增殖导致角膜炎症溃疡，因此，对HSK的治疗目的，是抑制病毒在角膜内的复制，减轻炎症反应引起的角膜损害。目前，HSK主要使用抗病毒药物进行治疗。常用抗病毒药物为无环鸟苷（Acyclovir，ACV），是一种鸟嘌呤类似物，可被HSV胸腺嘧啶激酶（Thymidine Kinase, TK）催化转变成一磷酸无环鸟苷（ACV-MP），在细胞酶的催化下转变成三磷酸无环鸟苷（ACV-TP）。ACV-TP竞争性与病毒DNA链结合，使HSV的DNA聚合酶失活，从而抑制HSV的复制。由于HSV的DNA聚合酶与真核生物细胞核内α，β，δ和ε 4种主要的DNA聚合酶不同，因而ACV不影响宿主细胞核中DNA聚合酶的活性。但是，HSV的DNA聚合酶与人类线粒体的DNA聚合酶γ相似，对其活性有中等程度的抑制。另外，ACV局部滴用角膜穿透性不够好，同时日益增多的HSV DNA聚合酶突变毒株，出现了对ACV的效应的扺抗性。针对HSV糖蛋白gC和gD的单克隆抗体，经动物试验和临床试用，证明对HSK有治疗效果。

在所有原核和真核细胞中，均有核糖核苷酸还原酶（RR）。核糖核苷酸还原酶催化所有4个核糖核苷酸中氢和2’-羟基的置换反应。该酶属于原核和真核生物的I类基团还原酶，为DNA合成所必需。类似大多数核糖核苷酸还原酶，HSV-1和HSV-2的核糖核苷酸还原酶是α2β2蛋白结构。其中，α2代表2个R1亚单位，β2代表2个R2亚单位，R1含有酶的催化位点，而R2提供置换反应所需的基团。HSV-1的R1和R2的分子量分别为136 kDa和38 kDa，由相邻的UL39和UL40编码。HSV与哺乳动物宿主的核糖核苷酸还原酶完全不同。酶反应试验证明，合成多肽（YAGAVVNDL）模拟HSV-1核糖核苷酸还原酶R2 羧基C-末端的9个氨基酸残基序列，能干扰HSV -1核糖核苷酸还原酶R1和R2亚单位之间的相互作用，从而抑制病毒核糖核苷酸还原酶的活性，是RR抑制剂（RRi）。但是，在细胞培养试验中，该RR抑制剂并不能降低HSV病毒颗粒的产量，其原因是该抑制剂无法有效地穿过细胞膜，进入细胞内发挥作用，因此还未能制成药物用于临床。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可运载功能性分子进入HSV可感染细胞的载体及药物。

本发明的技术解决方案是：一种可运载功能性分子进入HSV可感染细胞的载体，其特征在于:

（a）氨基酸序列为LGAVILFVVIVGLHGVRS的多肽；

（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且可运载功能性分子进入HSV可感染细胞的由（a）衍生的多肽。

一种以上述载体制备的可抑制宿主细胞内HSV复制的药物，其特征在于：

（a）氨基酸序列为LGAVILFVVIVGLHGVRSYAGAVVNDL的多肽；

（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且可抑制宿主细胞内HSV复制的由（a）衍生的多肽。

本发明提供了一种导向载体（HSV载体），可运载功能性分子穿过细胞膜导向进入HSV可感染宿主细胞内，用于基础研究与临床应用；本发明人工合成HSV载体-RRi融合多肽，可特异高效地进入宿主细胞内抑制HSV的复制，治愈实验性单纯疱疹性角膜炎，可用于包括疱疹性角膜炎、口唇疱疹、疱疹性脑炎和生殖器疱疹等疱疹性疾病的治疗。

附图说明

图1是本发明实施例HSV载体-EE融合多肽免疫荧光染色试验效果图。

图2是本发明实施例HSV载体-RRi融合多肽放射性同位素标记试验效果图。

图3是本发明实施例HSV载体-RRi融合多肽对宿主细胞内HSV-1复制的抑制效果图。

图4是本发明实施例HSV载体-RRi融合多肽对兔实验性单纯疱疹性角膜炎治疗效果图。

具体实施方式

可运载功能性分子进入HSV可感染细胞的载体:

（a）氨基酸序列为LGAVILFVVIVGLHGVRS的多肽；

（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且可运载功能性分子进入HSV可感染细胞的由（a）衍生的多肽，如：LGAVILFVVIVGLHGVRG或LGAVILFVVIVGLHG。

以上述载体制备的可抑制宿主细胞内HSV复制的药物：

（a）氨基酸序列为LGAVILFVVIVGLHGVRSYAGAVVNDL的多肽；

试验：

试验1．免疫荧光染色试验证明载体LGAVILFVVIVGLHGVRS，

LGAVILFVVIVGLHGVRG或LGAVILFVVIVGLHG可携带功能性多肽-多瘤病毒T抗原（EE）-进入宿主细胞。

试验方法：

1.1检测性融合多肽的合成。选用多瘤病毒（Polyoma virus）的谷胺酸-谷胺酸中层T抗原（EE），用作融合多肽是否进入宿主细胞的标记物，这是因为EE是一个含7 个氨基酸残基的短肽，有很强的抗原性，可用单克隆抗体进行检测。人工合成三种融合多肽，氨基酸序列分别为：

HSV载体1-EE：LGAVILFVVIVGLHGVRSEEYMPME；

HSV载体2-EE：LGAVILFVVIVGLHGVRGEEYMPME；

HSV载体3-EE：LGAVILFVVIVGLHGEEYMPME。

融合多肽的前半段（LGAVILFVVIVGLHGVRS或LGAVILFVVIVGLHGVRG），为模拟HSV-1不同病毒株囊膜糖蛋白gD的信号肽序列8-25，含主要功能区域和带负电荷的C末端；而LGAVILFVVIVGLHG则模拟HSV-1gD信号肽序列8-22；融合多肽的后半段（EEYMPME）为多瘤病毒T抗原（EE）。多瘤病毒T抗原（EEYMPME）多肽用作对照。

1. 2 分别将Vero（猴肾上皮）细胞、HeLa（人宫颈癌）、WI-38（人胚肺）细胞、Jurkat（人白血病尤尔卡特细胞）和MOLT-3（人淋巴母细胞）培养于玻片上，与试验方法1.1合成的融合多肽（HSV载体1，2，3-EE）或多瘤病毒T抗原（EE）（100 µg/ml）于37ºC培养2 h。细胞经固定和穿透处理，用抗EE抗体作荧光染色。

结果如图1所示：

（1）荧光显示，融合多肽（HSV载体1，2，3-EE）可进入Vero（猴肾上皮）、HeLa（人宫颈癌）和WI-38（人胚肺）细胞，但不能进入Jurkat（人白血病尤尔卡特细胞）和MOLT-3（人淋巴母细胞）。单纯疱疹病毒（HSV）可感染Vero、HeLa和WI-38细胞，但不能感染Jurkat和MILT-3细胞。因此，该人工合成的融合多肽进入的细胞与HSV的感染谱相同。（2）用作对照的EE多肽不能进入细胞，五种细胞培养结果均如图1Jurkat（人白血病尤尔卡特细胞）和MOLT-3（人淋巴母细胞）的结果一样，无荧光显示。

结论：载体LGAVILFVVIVGLHGVRS，LGAVILFVVIVGLHGVRG或LGAVILFVVIVGLHG可运送功能多肽导向进入病毒可感染的宿主细胞，但不能进入病毒不能感染的细胞。

试验2：放射性同位素标记试验证明，载体LGAVILFVVIVGLHGVRS可携带HSV核糖核酸还原酶抑制剂（RRi），进入宿主细胞。

试验方法：

2.1含核糖核酸还原酶抑制剂融合多肽的合成。人工合成氨基酸序列为LGAVILFVVIVGLHGVRSYAGAVVNDL的融合多肽，称为HSV载体-RRi。该多肽的前半段（LGAVILFVVIVGLHGVRS）是作为载体的模拟HSV糖蛋白gD信号肽序列8-25，后半段（YAGAVVNDL）为HSV核糖核苷酸还原酶抑制剂（RRi）。合成多肽RRi（YAGAVVNDL）用作对照。在核糖核苷酸还原酶抑制剂（RRi）的氨基酸序列中，有一个酪氨酸残基（Y），可用作作碘-125（¹²⁵I）的标记位点。

2. 2用氯胺T法将¹²⁵I标记在含酪氨酸的多肽RRi和HSV载体-RRi上，加入培养基（100 nM）与各种细胞（Vero、HeLa、Jurkat和MOLT-3）在37°C培养1 h。通过测定¹²⁵I的放射活性，计算出各个多肽在培养基和不同细胞内的浓度，以确定HSV载体运送核苷酸还原酶抑制剂（RRi）的能力。

试验结果如表1及图2。

表1

结果：表1和图2（**，P<0.01，有显著性差异）显示，多肽HSV载体-RRi或RRi在细胞培养基的浓度均为~100 nM。以细胞培养基中多肽浓度为100%，计算各个多肽进入各种细胞内的浓度。RRi进入细胞的百分比为0-13.2，基本上不进入细胞。HSV载体-RRi进入细胞的百分比，Vero细胞为275.5±19.8，HeLa细胞为165.5±17.0，MOLT-3细胞为8.5±0.9，Jurkat细胞为43.4±4.7。HSV载体-RRi融合多肽进入的细胞与HSV-1的感染谱相同。

结论：该试验进一步证实，载体LGAVILFVVIVGLHGVRS可导向运载高浓度核糖核酸还原酶抑制剂（RRi）进入HSV可感染的宿主细胞，但不进入HSV不能感染的细胞。

试验3：人工合成的融合多肽（HSV载体-RRi），可特异高效地抑制宿主细胞内HSV的复制。

3.1抑制单纯疱疹病毒复制的试验：

3.1.1 50%抑制剂量（IC₅₀）的确定

试验方法：

（1）．将HSV-1 KOS毒株感染生长于96孔板的Vero细胞，感染复数（MOI）为0.2空斑形成单位（PFU）/细胞，吸附1 h后移除病毒，加入梯度浓度的合成多肽HSV载体-RRi（LGAVILFVVIVGLHGVRSYAGAVVNDL）或RRi（YAGAVVNDL），并设无多肽HSV-1对照（n=6/每一浓度）。病毒感染36 h后，各孔取5 µl上清作病毒感染试验，以确定病毒的半数组织培养感染剂量（TCID₅₀），并计算各多肽的50%抑制剂量 IC₅₀。

结果：如图3A所示。

图3中A显示，HSV载体-RRi融合多肽的 IC₅₀= 5 µM；核糖核苷酸还原酶（RRi）的35%抑制剂量 =500 µM，表明 HSV载体-RRi融合多肽对HSV-1的抑制效应比RRi本身的抑制效大于100倍。

（2）. 抑制HSV-1复制的时间效应

试验方法：将HSV-1 KOS毒株感染生长于96孔板的Vero细胞，感染复数（MOI）为0.2空斑形成单位（PFU）/细胞，吸附1 h后移除病毒，加入浓度为7.8 µM的合成多肽HSV载体-RRi或RRi，并设无多肽HSV-1对照（n=6/每一浓度）。病毒感染后0，24，36，48，60 h时，各孔取5 µl上清作病毒感染试验，以确定病毒的半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）。

结果：如表2、图3B所示。

表2和图3中B显示在培养基中加入的不同多肽，在不同时间点对HSV-1病毒滴度的效应。加入核糖核酸还原酶抑制剂（RRi）与不加入任何多肽的HSV-1的细胞培养中，任何时间点病毒的滴度（TCID50），均在同一水平，表明RRi本身对细胞内感染的HSV无抑制作用。将HSV载体-RRi与RRi对HSV-1的抑制效应相比较，在感染后24 h，前者的抑制效应为后者的25倍，36 h时为105倍，48 h时为156倍，60 h时为1,208倍。

结论：HSV载体-RRi融合多肽可长时间高效地抑制细胞内单纯疱疹病毒1型的复制。

表2

试验4．融合多肽（HSV载体-RRi）可特异地治愈实验性兔单纯疱疹病毒性角膜炎（HSK）。

材料与方法：

4.1材料：治疗用药：HSV载体-RRi（融合多肽）；阳性药物：无环鸟苷（ACV，8ml/8mg，商品名为阿昔洛韦）滴眼液；HSV-1病毒混悬液；家兔15只；灭菌刀片。

4.2实验方法

（1）病毒的制备

Vero细胞培养成单层后，加入HSV-1（McKrae毒株）吸附1 h，置37°C和5%CO₂培养箱内增毒，待出现75%以上细胞病变时收获，调整滴度为10⁶TCID₅₀/mL。

（2）药物的配制

治疗用药的配制：精密称取HSV载体-RRi粉末2 mg，融解于50μL DMSO中，加入生理盐水中稀释成50 mL，分装，-80℃保存。

（3）HSK动物模型的建立

试验动物适应性饲养一周，检查其双眼均未见异常，开始参照上皮划痕法造模：家兔20％乌拉坦腹腔注射麻醉，用刀片将家兔角膜（以划透上皮层为准）造成“井”字划痕，用微量取样器取50 μL的病毒混悬液滴入创伤的结膜囊内，闭眼按摩1 min，连续三天滴入病毒混悬液，每天两次。

（4）实验分组

将感染成功的家兔分为以下3组，每组5只：1）模型组（5只）；2）HSV载体-RRi药物治疗组（融合多肽组，5只）；3）阳性药物对照组（ACV组，5只）。

（5）给药方法

均在造模3d后开始给药，ACV：3 h/1次，每次5-6滴，滴入结膜囊内闭眼按摩1 min，每天给药4次。HSV载体-RRi（融合多肽）：3 h/1次，每次5-6滴，滴入结膜囊内闭眼按摩1min，每天给药4次。

4.3眼科观察

每日检查外眼情况，行裂隙灯检查和病变拍照。

按照表3所示病毒性角膜炎动物模型症状分级及评分标准对各组动物角膜炎进行评分。

表3

结果：HSV感染病毒性角膜炎模型及治疗组症状评分结果见表4。

图4是HSV载体-RRi融合多肽对兔实验性单纯疱疹性角膜炎治疗效果图。

表4

表4和图4显示，在用HSV病毒诱发病毒性角膜炎后第四天，ACV组（1mg/ml）和融合多肽治疗组（0.04mg/ml）开始给药。给药后第一天，动物角膜炎的症状明显得以改善，而未治疗模型组症状继续加重。虽然融合多肽组的治疗效果跟ACV组相同，但ACV组的用药浓度是融合多肽组的25倍。提示融合多肽能更有效地进入宿主细胞抑制病毒的复制。

结论：融合多肽（HSV载体-RRi）对实验性单纯疱疹性角膜炎有显著疗效。

序列表

<110>秦克锋李冬冬

<120>可运载功能性分子进入HSV可感染细胞的载体及药物

<160>5

<210>1

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

LGAVILFVVIVGLHGVRS 18

<210>2

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

LGAVILFVVIVGLHGVRG 18

<210>3

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

LGAVILFVVIVGLHG 15

<210>4

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

LGAVILFVVIVGLHGVRSYAGAVVNDL 27

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>5

YAGAVVNDL 9

Claims

1.一种可运载功能性分子进入HSV可感染细胞的载体，其特征在于：所述载体是氨基酸序列为LGAVILFVVIVGLHGVRS、LGAVILFVVIVGLHGVRG或LGAVILFVVIVGLHG的多肽。

2.一种以权利要求1所述载体制备的可抑制宿主细胞内HSV复制的药物，其特征在于：所述药物是氨基酸序列为LGAVILFVVIVGLHGVRSYAGAVVNDL的多肽。