CN118127004A - 靶向HSV必需基因的gRNA、CRISPR/Cas基因编辑系统、递送系统及应用 - Google Patents
靶向HSV必需基因的gRNA、CRISPR/Cas基因编辑系统、递送系统及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了靶向HSV必需基因的gRNA、CRISPR/Cas基因编辑系统、递送系统及应用。本发明针对HSV临床株基因组序列,设计并筛选了直接靶向HSV必需基因VP16、ICP27、ICP4或gD的gRNA系列,利用病毒载体或非病毒载体递送核酸酶Cas和靶向病毒基因的gRNA。HSV关键基因靶向的基因编辑可以有效抑制HSV复制和传播感染,gRNA联用鸡尾酒策略显示出优于单靶点编辑的效果。通过本发明方法和病毒载体介导的基因治疗可以有效消除潜伏感染或复发感染的HSV病毒,为病毒性脑炎、单纯疱疹病毒性角膜炎、感染性失明等难治性HSV‑1相关疾病的治疗提供潜在重要手段。
Description
技术领域
本发明专利涉及CRISPR/Cas基因编辑用于基因治疗的方法,特别涉及靶向HSV必需基因的gRNA、CRISPR/Cas基因编辑系统、递送系统及应用。
背景技术
单纯疱疹病毒1(HSV-1)是人类疱疹病毒科的原型成员。流行病学调查表明,单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus 1,HSV-1)在世界范围内非常普遍和流行,流行病学调查显示,全球流行率约为70%,且大多数感染发生在儿童时期。HSV-1是一种具有高度传染性的病毒,主要通过口-口接触传播。尸检研究表明85-90%的个体三叉神经节中存在HSV-1病毒基因组,是唇疱疹、病毒性脑炎和感染性失明的最常见病因。HSV-1通常会在健康或免疫能力正常的个体中引起轻度甚至无症状感染,但在新生儿或免疫功能受损的患者中会导致严重的眼角膜感染和由严重的中枢神经系统(CNS)感染引起的神经脑炎。
HSV感染导致的临床症状包括无临床症状的潜伏感染、口腔溃疡和眼角膜炎症以及严重的中枢神经系统感染造成的神经性脑炎。在北美,HSV-1是引起儿童和成人脑炎最常见的病因。HSV-1是常见的嗜神经性病原体,可以在没有明显临床症状的情况下到达中枢神经系统。HSV-1可感染嗅神经元的末端,并通过神经元的逆行轴突运输进入CNS,最终到达脑中的嗅球。HSV-1也可以从三叉神经节中的神经元重新激活,并通过顺行运输到达皮肤或CNS;进入CNS后,病毒既可以在该组织中处于静止的潜伏状态,也可以激活导致严重的急性坏死性脑炎。单纯疱疹病毒性脑炎(herpes simplex encephalitis,HSE)是HSV-1感染产生的最严重的表现之一,死亡率可高达97%。研究表明,虽然使用抗病毒药物阿昔洛韦(acyclovir,ACV)治疗可降低HSE患者的死亡率,但大部分患者康复后存在永久性神经系统后遗症,包括认知、记忆和行为障碍的症状,并且会增加癫痫的发病率。
HSV-1感染在眼角膜中可引起慢性免疫性炎症性疾病,即单纯疱疹性角膜炎(herpes simplexkeratitis,HSK),该疾病会导致感染者出现不可逆的损伤和失明。在眼部感染期间,病毒从三叉神经节潜伏进入到角膜上皮,通过再激活作用引起炎症反应,患者特征在于角膜混浊和眼球表面新血管形成,由病毒的周期性再激活引起的复发性炎症甚至可能导致失明。研究显示,HVEM是眼部HSV-1感染的免疫发病机制中的重要宿主细胞蛋白质受体。
目前没有用于预防HSV感染的疫苗。原发性的病毒感染和潜伏感染后的再激活都有可能引起程度不同的慢性炎症过程。临床常用的治疗药物是以口服阿昔洛韦为代表的核苷类似物。自20世纪80年代以来,ACV及其衍生物就成为预防和治疗疱疹病毒感染的首选药物。耐药毒株病例的不断出现,也为抗病毒治疗提出了更高的要求。由于HSV-1流行基数大,潜伏感染问题严重,这使得人们不得不重视耐药性问题,同时也提示新型药物的研发迫在眉睫。
单纯疱疹病毒1型(HSV-1)是神经脑炎和感染性失明的主要原因。然而,目前治疗HSV的药物不能消除三叉神经节潜伏HSV病毒或再激活的病毒。因此,开发针对潜在HSV的新治疗策略已成为当务之急。以CRISPR为主的基因组编辑技术代表了一种通过修改或破坏病毒的遗传物质来对抗病毒感染和复制的有前景的方法。
发明内容
为了解决现有技术中的不足,本发明旨在提供靶向HSV必需基因的gRNA、CRISPR/Cas基因编辑系统、递送系统及应用。
本发明设计并筛选了一系列直接靶向HSV必需基因VP16、ICP27、ICP4或gD的gRNA,VP16(2gRNA),ICP27(2gRNA),ICP4(2gRNA)or gD(4gRNA),并具体提供基于CRISPR-Cas基因编辑抗HSV感染的新技术、方法和递送策略。
本发明的技术方案如下:
本发明第一方面提供一种靶向HSV病毒必需基因的gRNA,所述gRNA选自SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.10所示核苷酸序列中的一种或以上。
进一步地,所述gRNA选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示核苷酸序列中的一种或以上;
优选地,所述gRNA为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7所示核苷酸序列的组合物。
本发明第二方面提供一种靶向HSV病毒必需基因的gRNA表达载体,其包含所述gRNA;
优选地,所述表达载体为病毒载体或非病毒载体;
所述病毒载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体或病毒样颗粒(VLP);
所述非病毒载体为质粒或mRNA。
本发明第三方面提供一种CRISPR/Cas基因编辑系统,其包含所述gRNA,以及Cas蛋白;
优选地,所述Cas蛋白为化脓性链球菌来源的SpCas9蛋白、脑炎双球菌Cas9、嗜热链球菌Cas9、金黄色葡萄球菌Cas9、氨基酸球菌Cpf1、谷氨酸棒杆菌Cpf1、金黄色葡萄球菌微型Cas9(saCas9)、口腔纤毛菌C2c2的一种或多种;
优选地,所述Cas蛋白为化脓性链球菌来源的SpCas9蛋白。
本发明第四方面提供所述CRISPR/Cas基因编辑系统的递送系统,所述递送系统包括:
1)所述的gRNA表达载体;
2)Cas蛋白表达载体;
优选地,所述Cas蛋白表达载体为病毒载体或非病毒载体;
所述病毒载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体或病毒样颗粒(VLP);
所述非病毒载体为质粒或mRNA。
本发明第五方面提供一种靶向精准剪切HSV基因组核酸的试剂盒,其包括:
1)所述gRNA,或所述的gRNA表达载体;
2)Cas蛋白表达载体,或表达的Cas重组核酸酶蛋白;
优选地,所述Cas蛋白为化脓性链球菌来源的SpCas9蛋白、脑炎双球菌Cas9、嗜热链球菌Cas9、金黄色葡萄球菌Cas9、氨基酸球菌Cpf1、谷氨酸棒杆菌Cpf1、金黄色葡萄球菌微型Cas9(saCas9)、口腔纤毛菌C2c2的一种或多种;
优选地,所述Cas蛋白为化脓性链球菌来源的SpCas9蛋白;
优选地,所述Cas蛋白表达载体为病毒载体或非病毒载体;
所述病毒载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体或病毒样颗粒(VLP);
所述非病毒载体为质粒或mRNA。
本发明第六方面提供所述gRNA,或所述的gRNA表达载体,或所述CRISPR/Cas基因编辑系统,或所述递送系统,或所述试剂盒在制备预防和/或治疗HSV感染相关疾病的药物中的应用,或在制备预防和/或治疗抗HSV药物中的应用。
进一步地,所述HSV感染相关疾病为HSV-1型或HSV-2型相关疾病;
所述抗HSV药物为抗HSV-1药物或HSV-2药物;
优选地,所述HSV感染相关疾病包括病毒性脑炎、单纯疱疹病毒性角膜炎和感染性失明。
本发明第七方面提供一种药物组合物,其包括所述CRISPR/Cas基因编辑系统的递送系统。
本发明第八方面提供一种抑制HSV复制和/或HSV病毒必需基因表达的方法,所述方法包括:在HSV感染前或感染后,将所述CRISPR/Cas基因编辑系统的递送系统转染目的细胞,细胞表达的Cas-gRNA形成的核糖核蛋白复合物靶向的精准剪切破坏HSV基因组,阻断病毒复制和传播。
本发明的有益效果为:
本发明提供一种利用CRISPR-Cas基因组编辑技术抗单纯疱疹病毒感染的新技术,针对HSV临床株基因组序列,设计并筛选了一系列直接靶向HSV必需基因VP16、ICP27、ICP4或gD的gRNA,利用基因治疗病毒载体或非病毒载体递送核酸酶Cas9和靶向病毒基因的gRNA。HSV关键基因靶向的基因编辑可以有效抑制HSV复制和传播感染,每一个gRNA单独介导均能有效的抑制HSV病毒复制,其中的aVP16-2、aICP27-2、aICP4-2或agD-1的gRNA单独编辑抑制HSV病毒复制较同组效果更好,gRNA两两组合的基因编辑能更有效的抑制HSV病毒复制,aVP16-2、aICP27-2、aICP4-2和agD-1四种gRNA混合基因编辑(命名Cocktail)抑制HSV病毒复制效果优于单gRNA介导的基因编辑,gRNA联用鸡尾酒策略显示出优于单靶点编辑的效果。动物实验中病毒载体递送的CRISPR-Cas9/gRNA在体基因编辑可有效阻断HSV复制和传播。
本发明应用gRNA混合基因编辑(Cocktail)的方法,不论是预防策略,或治疗策略Cocktail均能有效的抑制HSV病毒复制,以及组织间传播。HSV感染后gRNA混合基因编辑(Cocktail)治疗的时间越早,抑制效果越明显。目前治疗HSV的药物不能消除三叉神经节潜伏的HSV病毒或病毒复发,通过本发明方法和病毒载体介导的基因治疗可以有效消除潜伏感染或复发感染的HSV病毒,为难治性HSV-1相关疾病的治疗提供潜在重要手段。
附图说明
图1为CRISPR基因编辑的HSV靶基因的筛选及gRNA的设计图;
图2为CRISPR Cas9/gRNA质粒的鉴定图;
图3为Cas9/gRNA单质粒转染及抗HSV复制效果图;
图4为Cas9/gRNA单质粒转染编辑后的细胞上清病毒滴度测定;
图5为Cas9/gRNA质粒优化双质粒联用策略设计及抗HSV复制效果图;
图6为优筛的四类gRNA联用(Cocktail)策略及细胞水平抗HSV复制效果图;
图7为Cocktail联用策略编辑后的细胞上清病毒滴度测定;
图8为Cocktail多靶点编辑预防和治疗效果比较;
图9为基因递送Cas9/gRNA慢病毒的包装制备及抗HSV效果图;
图10为LV-Cas9/gRNA对照病毒不能抑制HSV复制;
图11为LV-Cas9/gRNA单病毒在体抗HSV复制效果图;
图12为LV-Cas9/gRNA病毒联用(Cocktail)策略抗HSV复制;
图13为LV-Cas9/gRNA病毒联用(Cocktail)剂量效应;
图14为LV-Cas9/gRNA病毒联用(Cocktail)治疗HSV感染效果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本发明进行详细说明。如未特别说明,均为本领域的常规技术。所述试剂或材料,如未特别说明,均来源于商业渠道。
本发明设计并筛选了一系列直接靶向HSV必需基因VP16、ICP27、ICP4或gD的gRNA,VP16(2种gRNA),ICP27(2种gRNA),ICP4(2种gRNA)or gD(4种gRNA)。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,本发明应用载体递送Cas9/gRNA至目的细胞,实现对靶向基因的编辑,载体包括常用的病毒载体和非病毒载体,其中病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、病毒样颗粒(VLP)等;非病毒载体包括质粒、mRNA等。
在一个具体实施方案中,本发明构建了10种携带SpCas9和相应gRNA的慢病毒载体核心质粒,接着包装制备了基因递送CRISPR编辑系统的慢病毒载体。首先在细胞实验上筛选了10种SpCas9/gRNA的抑制HSV效果,感染H129-GFP病毒后2天,对照组(NC和Vec)组病毒迅速增殖、几乎所有的细胞均表达绿色荧光蛋白,而靶向切割4种基因的10种gRNA组荧光比例均有不同程度的下降;通过检测细胞上清HSV病毒滴度,实验组病毒滴度均显著低于对照组,筛选出agD-1,aICP4-2,aVP16-2,aICP27-2四种gRNA组的抑制效果最明显,从而作为包装慢病毒载体的备选。
此外,联合gRNA策略(“鸡尾酒”策略)明显显示出优于单gRNA基因编辑的效果。本发明测试了靶向编辑4种基因的Cas9/gRNA联用能否达到更好的抑制HSV效果。将不同浓度(0.5μg,1μg,2μg)的gRNA质粒联用(Cocktail)转染细胞,然后HSV-GFP病毒按MOI=0.01和MOI=0.001分别感染转染后的细胞,发现Cocktail组在低剂量即表现出明显的抑制HSV复制效果,而且存在明显的剂量效应,随着Cas9/gRNA质粒的量增多,抑制病毒增殖的效力越强这些结果表明靶向编辑4种基因的Cas9/gRNA联合策略能高效地抑制HSV病毒复制和增殖,而且表现出明显的剂量效应。
针对CRISPR编辑系统的治疗效果如何问题,本发明做了先感染HSV病毒后用CRISPR编辑系统治疗的实验,分别在提前12小时、6小时和1小时感染HSV-GFP病毒,然后转染Cas9/gRNA-cocktail质粒,发现在HSV病毒急性感染的高速增殖阶段(病毒增殖12小时)Cas9/gRNA干预有一定抑制效果但不明显,如果HSV感染后更早干预-病毒增殖6小时组和病毒增殖1小时组CRISPR治疗均能显著的降低HSV病毒增殖,而且越早干预越好。
本发明利用包装的慢病毒在体开展了动物实验,在体实验中Cas9/gRNA联用(Cocktail)策略能高效地抑制病毒增殖和传播。在未做任何干预的对照组(NC),以及慢病毒空载对照组(Vec)中在小鼠V1脑区注射H129-GFP后5天病毒已高效的增殖,并沿神经环路传播到LGd等脑区,感染的神经元被荧光蛋白高亮标记,慢病毒空载给药无治疗效果。当用携带表达Cas9/gRNA的慢病毒单独治疗时均表现出抑制病毒复制(注射部位荧光细胞少)和病毒传播(LGd脑区无标记)的效果,相较LV-aICP4和LV-aICP27两组的效果优于LV-gD和LV-aVP16。Cas9/gRNA联用(Cocktail)治疗效果相对最好,在注射部位V1观察不到或仅有少量细胞被感染标记,而且也呈现剂量效应。另外重要的本发明也验证了“先感染后治疗”的实验,在小鼠V1脑区先感染H129-GFP,1天后给药慢病毒Cocktail治疗发现能有效地抑制HSV复制传播,效果优于单慢病毒给药。
靶向HSV四个关键基因VP16,ICP27,ICP4,gD的CRISPR基因编辑能有效地抑制HSV在裂解性复制周期的复制和增殖,而且Cas9/gRNA联用(Cocktail)策略更高效,可以想见利用CRISPR基因组编辑技术清除潜伏感染状态、病毒滴度低得多的latent HSV病毒,抑制作用可能更显著。
综上,本发明的Cas9/gRNA基因组编辑能高效的抑制HSV在预防水平和治疗水平的感染和传播,特别在动物活体实验中作用明显,相较对照组Cas9/gRNA不管是单独给药,或是Cocktail联合给药HSV的增殖显著被抑制,标记的神经细胞数量相较对照组存在指数级的下降。另外Cas9/gRNA联用(Cocktail)治疗手段并未观察到相关的毒副作用,说明该策略的安全性。这项使用CRISPR基因组编辑来消除HSV感染的方法为难治性HSV-1相关疾病的潜在治疗提供新的手段,尤其是当传统治疗方法无效时。
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1:CRISPR基因编辑的HSV靶基因的筛选及gRNA的设计合成
HSV病毒必需基因VP16、ICP27、ICP4和gD被选择为CRISPR/Cas9策略编辑的潜在靶点。本实施例设计并靶向了4个病毒必需基因,并开发了与Cas9结合的引导RNA,以测试它们抑制HSV-1复制的能力。
基于选定基因的靶位点序列设计sgRNA,并通过CRISPR DESIGN系统筛选(http://crispr.mit.edu/).sgRNA寡核苷酸序列如表1所示,共设计了10个gRNA:VP16靶向(2gRNA,序列见SEQ ID NO.1和2)、ICP27靶向(2gRNA,序列见SEQ ID NO.3和4),ICP4靶向(2gRNA,序列见SEQ ID NO.5和6)和gD靶向(4gRNA,序列见SEQ ID NO.7-10)(图1,表1)。构建并验证了携带SpCas9和gRNA的慢病毒载体的相应10个核心质粒(图1)并包装了相应的慢病毒。
表1CRISPR/Cas9编辑的HSV1基因和设计的sgRNA序列
实施例2:CRISPR Cas9/gRNA慢病毒核心质粒的构建
sgRNA是根据所选基因的靶点序列设计的,并通过CRISPR设计系统(http://crispr.mit.edu/)进行筛选。sgRNA寡核苷酸序列如表1。使用BsmBI对空载体lentiCRISPRv2载体(addgene,#52961,序列见SEQ ID NO.11)进行消化,并将退火的寡核苷酸克隆到单导RNA支架上,获得CRISPR Cas9/gRNA慢病毒核心质粒。然后在HEK293T细胞中用包装质粒生产lentiCRISPR-sgRNA病毒,如以前描述的方法(Cold Spring Harb Protoc.2018Apr 2;2018(4))。简而言之,将上述len-tivirus构建体与三种慢病毒包装载体(pGAG/POL、pREV和pMD2.G)共同转染到293T细胞中,2至3天后收集上清液,获得靶向病毒。生产的五种慢病毒(LV-vec,LV-agD-1,LV-aVP16-2,LV-aICP4-2,LV-aICP27-2)病毒储备的滴度均为1×108PFU/ml。
实施例3:CRISPR Cas9/gRNA质粒的鉴定
质粒构建好后,送测序公司测序,测序结果成功。同时,用质粒作为模板扩增目的片段,反应体系和PCR程序如下:
PCR程序:
PCR程序结束后,配制1%琼脂糖凝胶,以180V在TAE电泳液中跑胶23min,结果见图2。十个质粒的目的片段大小一致,鉴定正确。
实施例4:Cas9/gRNA单质粒转染及抗HSV复制效果
收集对数生长期的BHK细胞,以密度为1×106个/mL接种六孔板。待细胞贴壁后,将细胞培养基更换为400μL Opti-MEM无血清培养基。准备1.5mL无菌EP管,分别加入2μgCas9/gRNA单质粒,50μL Opti-MEM培养基轻柔摇匀混合,在室温下温育5min。再向无菌EP管中分别加入4μL Lipofectamine 2000试剂,50μL Opti-MEM培养基,轻柔摇匀混合,在室温下静置15min。吸取质粒与Lipofectamine 2000混合液100μL至板孔中,混匀,于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。转染24h后,弃细胞上清。每孔以MOI=0.1加100μLHSV 129-EGFP感染,吸附1h后弃病毒液,加2mL含2%血清的DMEM培养基,于35℃,3%CO2细胞培养箱中培养48h。用荧光显微镜观察细胞,并拍照。
收集病毒上清,通过蚀斑法测病毒滴度。取对数生长期的BHK细胞,以密度为2×105个/mL接种12孔板,待细胞贴壁。将病毒上清以10倍稀释6次,依次吸取100μL稀释的病毒上清加入孔板中,吸附1h后弃病毒液,加入等体积混合的4%DMEM培养基和1%的琼脂糖溶液。静置,待琼脂糖浓度后置于35℃,3%CO2细胞培养箱中培养24h,于荧光显微镜观察并数斑。结果如图3所示,与对照组相比Cas9/gRNA单质粒转染后绿色荧光蛋白的表达量降低。
此外,与对照组相比,HSV的滴度是Cas9/gRNA有效性的另一种量度,如图4,在Cas9/gRNA转染组中显示了HSV滴度的显着降低。其中,agD-1,aICP4-2,aICP27-2和aVP16-2对HSV的增殖具有最佳的抑制作用,因此选择了这些Cas9/gRNA质粒进行后续实验和慢病毒包装。
实施例5:Cas9/gRNA质粒优化双质粒联用策略设计及抗HSV复制效果
选取案例4中对HSV复制效果抑制效率最高的四种Cas9/gRNA质粒agD-1,aICP4-2,aICP27-2,aVP16-g2两两组合(agD-g1+aICP4-g2;agD-g1+aICP27-g2;agD-g1+aVP16-g2;aICP27-g2+aICP4-g2;aVP16-g2+aICP4-g2;aICP27-g2+aVP16-g2;)后一起转染BHK细胞,24小时后以MOI=0.1进行感染,吸附1h后弃病毒液,加2mL含2%血清的DMEM培养基,于35℃,3%CO2细胞培养箱中培养48h。用荧光显微镜观察细胞,并成像。结果如图5所示,与对照组相比优化的双质粒组联合转染后绿色荧光蛋白的表达量降低。
实施例6:优筛的四类gRNA联用(Cocktail)策略及细胞水平抗HSV复制效果
将四种质粒混合后按浓度梯度转染BHK细胞,每种质粒各转染0.5μg、1μg和2μg,24H后分别以MOI=0.001和MOI=0.01感染HSV H129-EGFP,在48小时后成像细胞荧光表达情况,并测定上清病毒滴度。结果如图6和7。从HSV滴度或报告基因绿色荧光蛋白的表达丰度的来看,Cocktail策略都可以有效抑制HSV的增殖,HSV感染MOI=0.01或0.001,在2d.p.i可以看到明显的趋势。此外,不同剂量组之间没有检测到病毒滴度的明显的统计差异,表明在这组实验中,Cocktail策略没有剂量作用。
实施例7:Cocktail多靶点编辑预防和治疗效果比较
为了模仿HSV感染的患者的治疗,首先将细胞感染HSV H129-GFP(MOI=0.01),然后分别在HSV感染后1H,6H和12H与四个gRNA质粒混合共转染。与6H.P.I和12H.P.I.相比,在1H.P.I中施用质粒表达Cas9/gRNA显示出最佳的抑制作用。而Cocktail多靶点编辑预防组在病毒感染前24小时表达Cas9/gRNA同样显示出较好的抑制作用。如图8。
实施例8:基因递送Cas9/gRNA慢病毒的包装制备
1)转染前24h,用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞,以含10%血清的培养基调整细胞密度为1.2x 107细胞/20ml,重新接种于15cm细胞培养皿,37℃、5%CO2培养箱内培养。24h待细胞密度达70%~80%时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要,因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。
2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。
3)向一灭菌离心管中加入:
所制备的各DNA溶液(pGC-LV载体20μg,pHelper 1.0载体15μg,pHelper2.0载体10μg),与相应体积的Opti-MEM混合均匀,调整总体积为2.5ml,在室温下温育5分钟。
4)将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀,取100μl Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4ml Opti-MEM混合,在室温下温育5分钟。
5)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合,轻轻地颠倒混匀,不要振荡。必须在5分钟之内混合。
6)混合后,在室温下温育【静置】15~20分钟,以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。
7)将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中,混匀,于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。
8)培养4~6h后倒去含有转染混和物的培养基,每培养皿细胞中加入含10%血清的细胞培养基10ml,于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48小时。后收上清获得包装好的慢病毒。
之后使用了293T细胞(人肾上皮细胞系)进一步验证设计靶向HSV复制的表达Cas9/gRNA的慢病毒的抑制作用。结果与BHK细胞上的质粒效果一致,结果不仅表明Cas9/gRNA编辑可以有效地抑制不同细胞系中的HSV复制,包装的慢病毒同样有较好效果。如图9。
实施例9:LV-Cas9/gRNA对照病毒不能抑制HSV复制
在第0天,将5×104TU空载慢病毒和PBS注射到成年雄性C57BL/6小鼠(n=3)中。通过腹腔注射(80mg/kg)戊巴比妥钠麻醉动物,并放置在立体定位设备中。在手术和病毒注射过程中,所有动物都用异氟烷(1-1.5%)保持麻醉。用牙科钻头将目标区域坐标:V1(AP,-2.80mm;ML,-2.40mm;和DV,-0.90mm)上方的头骨磨薄,并小心地去除头骨碎片。将微量进样器连接到玻璃微管,尖端直径为10-15mm,用注射器泵以每分钟30nl的速度进行注射。注射完成后,将小鼠额外放置10分钟,然后慢慢退针。在手术后,应用盐酸林霉素和盐酸利多卡因凝胶涂抹缝合伤口以防止炎症并减轻小鼠的疼痛。在5天时,将500个H129-EGFP病毒粒子注射到相同脑区。
分别预先注射了PBS和LV-VEC在初级视觉皮层V1作为对照,然后在5天后注入H129-EGFP的实验结果显示,可以在观察到H129-EGFP注射位点和V1的下游输出区域,如LGD和对侧V1有大量的EGFP表达,说明病的的感染和复制都没有受到抑制。如图10。
实施例10:LV-Cas9/gRNA单病毒在体抗HSV复制效果
在第0天,将5×104TU实验组的分别表达agD-1,aICP4-2,aICP27-2,aVP16-g2的慢病毒注射到成年雄性C57BL/6小鼠(n=3)中。通过腹腔注射(80mg/kg)戊巴比妥钠麻醉动物,并放置在立体定位设备中。在手术和病毒注射过程中,所有动物都用异氟烷(1-1.5%)保持麻醉。用牙科钻头将目标区域坐标:V1(AP,-2.80mm;ML,-2.40mm;和DV,-0.90mm)上方的头骨磨薄,并小心地去除头骨碎片。将微量进样器连接到玻璃微管,尖端直径为10-15mm,用注射器泵以每分钟30nl的速度进行注射。注射完成后,将小鼠额外放置10分钟,然后慢慢退针。在手术后,应用盐酸林霉素和盐酸利多卡因凝胶涂抹缝合伤口以防止炎症并减轻小鼠的疼痛。在5天时,将500个H129-EGFP病毒粒子注射到相同脑区。
预先注射分别表达agD-1,aICP4-2,aICP27-2,aVP16-g2的慢病毒在初级视觉皮层V1,然后在5天后注入H129-EGFP,可以在观察到H129-EGFP注射位点V1的下游输出区域LGD和对侧V1都没有的EGFP表达,说明病的的感染和复制都受到明显抑制。如图11。
实施例11:LV-Cas9/gRNA病毒联用(Cocktail)策略抗HSV复制
在第0天,将5×104TU实验组的分别表达agD-1,aICP4-2,aICP27-2,aVP16-g2的慢病毒均匀混合制剂注射到成年雄性C57BL/6小鼠(n=3)中。通过腹腔注射(80mg/kg)戊巴比妥钠麻醉动物,并放置在立体定位设备中。在手术和病毒注射过程中,所有动物都用异氟烷(1-1.5%)保持麻醉。用牙科钻头将目标区域坐标:V1(AP,-2.80mm;ML,-2.40mm;和DV,-0.90mm)上方的头骨磨薄,并小心地去除头骨碎片。将微量进样器连接到玻璃微管,尖端直径为10-15mm,用注射器泵以每分钟30nl的速度进行注射。注射完成后,将小鼠额外放置10分钟,然后慢慢退针。在手术后,应用盐酸林霉素和盐酸利多卡因凝胶涂抹缝合伤口以防止炎症并减轻小鼠的疼痛。在5天时,将500个H129-EGFP病毒粒子注射到相同脑区。
可以在观察到H129-EGFP注射位点V1的下游输出区域LGD和对侧V1都没有的EGFP表达,说明病毒的的感染和复制都受到明显抑制。如图12。
实施例12:LV-Cas9/gRNA病毒联用(Cocktail)剂量效应
在第0天,将1×105TU实验组的分别表达agD-1,aICP4-2,aICP27-2,aVP16-g2的慢病毒均匀混合制剂注射到成年雄性C57BL/6小鼠(n=3)中。通过腹腔注射(80mg/kg)戊巴比妥钠麻醉动物,并放置在立体定位设备中。在手术和病毒注射过程中,所有动物都用异氟烷(1-1.5%)保持麻醉。用牙科钻头将目标区域坐标:V1(AP,-2.80mm;ML,-2.40mm;和DV,-0.90mm)上方的头骨磨薄,并小心地去除头骨碎片。将微量进样器连接到玻璃微管,尖端直径为10-15mm,用注射器泵以每分钟30nl的速度进行注射。注射完成后,将小鼠额外放置10分钟,然后慢慢退针。在手术后,应用盐酸林霉素和盐酸利多卡因凝胶涂抹缝合伤口以防止炎症并减轻小鼠的疼痛。在5天时,将500个H129-EGFP病毒粒子注射到相同脑区。
可以在观察到H129-EGFP注射位点V1的下游输出区域LGD和对侧V1都没有的EGFP表达,说明病毒的的感染和复制都受到明显抑制。并且和只注射5×104TU的实验组相比,注射位点已观察不到神经元被病毒感染,说明LV-Cas9/gRNA病毒联用(Cocktail)具有剂量效应。如图13。
实施例13:LV-Cas9/gRNA病毒联用(Cocktail)治疗HSV感染效果
在第0天,将500个H129-EGFP病毒粒子注射到相同脑区注射到成年雄性C57BL/6小鼠(n=3)中。通过腹腔注射(80mg/kg)戊巴比妥钠麻醉动物,并放置在立体定位设备中。在手术和病毒注射过程中,所有动物都用异氟烷(1-1.5%)保持麻醉。用牙科钻头将目标区域坐标:V1(AP,-2.80mm;ML,-2.40mm;和DV,-0.90mm)上方的头骨磨薄,并小心地去除头骨碎片。将微量进样器连接到玻璃微管,尖端直径为10-15mm,用注射器泵以每分钟30nl的速度进行病毒注射。注射完成后,将小鼠额外放置10分钟,然后慢慢退针。在手术后,应用盐酸林霉素和盐酸利多卡因凝胶涂抹缝合伤口以防止炎症并减轻小鼠的疼痛。在5天时,将5×104TU实验组的分别表达agD-1,aICP4-2,aICP27-2,aVP16-g2的慢病毒均匀混合制剂注射到相同脑区。
与两个对照组相比,可以在观察到H129-EGFP注射位点V1和对侧V1很少的EGFP表达,并且下游输出区域LGD没有EGFP表达,说明病毒的的感染和复制都受到较强抑制。如图14。
Claims (10)
1.一种靶向HSV病毒必需基因的gRNA,其特征在于,所述gRNA选自SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.10所示核苷酸序列中的一种或以上。
2.根据权利要求1所述的gRNA,其特征在于,所述gRNA选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示核苷酸序列中的一种或以上;
优选地,所述gRNA为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7所示核苷酸序列的组合物。
3.一种靶向HSV病毒必需基因的gRNA表达载体,其特征在于,其包含权利要求1或2所述gRNA;
优选地,所述表达载体为病毒载体或非病毒载体;
所述病毒载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体或病毒样颗粒;
所述非病毒载体为质粒或mRNA。
4.一种CRISPR/Cas基因编辑系统,其特征在于,其包含权利要求1或2所述gRNA,以及Cas蛋白;
优选地,所述Cas蛋白为化脓性链球菌来源的SpCas9蛋白、脑炎双球菌Cas9、嗜热链球菌Cas9、金黄色葡萄球菌Cas9、氨基酸球菌Cpf1、谷氨酸棒杆菌Cpf1、金黄色葡萄球菌微型SaCas9、口腔纤毛菌C2c2的一种或多种;
优选地,所述Cas蛋白为化脓性链球菌来源的SpCas9蛋白。
5.权利要求4所述CRISPR/Cas基因编辑系统的递送系统,其特征在于,所述递送系统包括:
1)权利要求3所述的gRNA表达载体;
2)Cas蛋白表达载体;
优选地,所述Cas蛋白表达载体为病毒载体或非病毒载体;
所述病毒载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体或病毒样颗粒;
所述非病毒载体为质粒或mRNA。
6.一种靶向精准剪切HSV基因组核酸的试剂盒,其特征在于,其包括:
1)权利要求1或2所述gRNA,或权利要求3所述的gRNA表达载体;
2)Cas蛋白表达载体,或表达的Cas重组核酸酶蛋白;
优选地,所述Cas蛋白为化脓性链球菌来源的SpCas9蛋白、脑炎双球菌Cas9、嗜热链球菌Cas9、金黄色葡萄球菌Cas9、氨基酸球菌Cpf1、谷氨酸棒杆菌Cpf1、金黄色葡萄球菌微型SaCas9、口腔纤毛菌C2c2的一种或多种;
优选地,所述Cas蛋白为化脓性链球菌来源的SpCas9蛋白;
优选地,所述Cas蛋白表达载体为病毒载体或非病毒载体;
所述病毒载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体或病毒样颗粒;
所述非病毒载体为质粒或mRNA。
7.权利要求1或2所述gRNA,或权利要求3所述的gRNA表达载体,或权利要求4所述CRISPR/Cas基因编辑系统,或权利要求5所述递送系统,或权利要求6所述试剂盒在制备预防和/或治疗HSV感染相关疾病的药物中的应用,或在制备预防和/或治疗抗HSV药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述HSV感染相关疾病为HSV-1型或HSV-2型相关疾病;
所述抗HSV药物为抗HSV-1药物或HSV-2药物;
优选地,所述HSV感染相关疾病包括病毒性脑炎、单纯疱疹病毒性角膜炎和感染性失明。
9.一种药物组合物,其特征在于,其包括权利要求5所述CRISPR/Cas基因编辑系统的递送系统。
10.一种抑制HSV复制和/或HSV病毒必需基因表达的方法,其特征在于,所述方法包括:在HSV感染前或感染后,将权利要求5所述CRISPR/Cas基因编辑系统的递送系统转染目的细胞,细胞表达的Cas-gRNA形成的核糖核蛋白复合物靶向的精准剪切破坏HSV基因组,阻断病毒复制和传播。
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